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Medicine

Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Abstract

Anastasis (« ressusciter à la vie » en grec) est un phénomène de récupération cellulaire récemment découverte par lequel mourir cellules peut inverser les processus de mort cellulaire avancé qui sont généralement considérées comme intrinsèquement irréversibles. Promotion anastasis pourraient blesser dans le sauvetage de principe ou de conserver des cellules qui sont difficiles à remplacer comme cardiomyocytes ou neurones, facilitant ainsi la récupération de tissu. À l’inverse, supprimant l’anastasis dans les cellules cancéreuses, en apoptose après traitements anticancéreux, peut assurer la mort des cellules cancéreuses et réduire les risques de récidive. Toutefois, ces études ont été entravés par le manque d’outils pour suivre le destin des cellules subissant anastasis animaux vivants. Le défi consiste à identifier les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire malgré leur apparence morphologiquement normaux après récupération. Pour surmonter cette difficulté, nous avons développé la drosophile et les systèmes mammaliens biocapteur CaspaseTracker qui peuvent d’identifier et de suivre en permanence l’anastatique cellules in vitro ou in vivo. Nous présentons ici en vivo de protocoles pour la génération et l’utilisation du système dual biocapteur CaspaseTracker pour détecter et pister anastasis chez Drosophila melanogaster après exposition transitoire à des stimuli de mort cellulaire. Tandis que les biocapteurs classiques et protocoles peuvent marquer des cellules mort cellulaire par apoptose activement en cours, le biocapteur CaspaseTracker peut marquer définitivement les cellules qui ont récupéré après activation de la caspase - une caractéristique de l’apoptose des stades, et en même temps identifier les processus apoptotique active. Ce biocapteur permet également de suivre la récupération des cellules qui ont tenté d’autres formes de mort cellulaire qui impliqués directement ou indirectement l’activité caspase. Par conséquent, ce protocole permet de suivre en permanence le sort de ces cellules et leur progéniture, facilitant les études futures des fonctions biologiques, les mécanismes moléculaires, les conséquences physiologiques et pathologiques et implications thérapeutiques de Anastasis. Nous discutons également les contrôles appropriés pour distinguer les cellules subissant anastasis de ceux qui affichent non-apoptotic caspase activité in vivo.

Introduction

Mort programmée de cellules, telles que l’apoptose, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie normale en éliminant les cellules indésirables, blessés ou dangereux dans les organismes multicellulaires1,2,3. La perte de l’équilibre entre la mort cellulaire et la survie peut conduire à des conséquences mortelles comme le cancer, insuffisance cardiaque, auto-immunité et dégénérescence4,5,6,7,8. L’activation de bourreau caspases a traditionnellement été considérée comme le « point de non retour » dans l’apoptose9,10,11, telle qu’elle déclenche rapide et massive de destruction cellulaire12, 13,14,15,16. Contestant ce dogme général, nous avons démontré que les cellules primaires mourants cultivées et des cellules cancéreuses peuvent récupérer non seulement après l’activation de la caspase, mais aussi suivant cellule important poinçons de mort dont la membrane plasmique blebbing, rétrécissement de la cellule, fragmentation mitochondriale, libération de mitochondrial du cytochrome c dans le cytosol, nucléaire et condensation de la chromatine, dommages à l’ADN, fragmentation nucléaire, exposition de surface cellulaire de la phosphatidylsérine (PS) et la formation de corps apoptotiques 17 , 18 , 19 , 20 , 21. nous proposons cette anastasis est un phénomène de récupération cellule intrinsèques, comme les cellules mourantes peuvent récupérer après le retrait de cellule mort des stimuli17,18,19,20, 21. on a inventé le terme « Anastasis » (Αναστάσης)18, qui signifie « s’élevant à vie » en grec, à décrire ce phénomène de récupération cellule inattendu. Notre observation d’anastasis est confirmée par récentes études indépendantes qui révèlent également la récupération des cellules après phosphatidylsérine externalisation22,23,24, limitée mitochondriale externe membrane perméabilisation25, activation de lignée mixte comme kinase (MLKL) et cellule rétrécissement26.

Caractériser les mécanismes régulant l’anastasis aura des implications de physiologiques, pathologiques, thérapeutiques ou de paradigme. Anastasis pourrait représenter un mécanisme de cytoprotecteurs jusque-là inconnues sauver ou préserver les cellules postmitotiques importantes et les tissus qui sont difficiles à remplacer et éventuellement compte d’inversion de l’insuffisance cardiaque par décharge ventriculaire avec ventriculaire gauche aider les dispositifs (LVAD)27,28, récupération des cellules photoréceptrices après exposition transitoire de lumière excessive29,30,31, ou la réparation des neurones après lésion de cerveau32. Si donc promouvoir anastasis pourrait améliorer la récupération de cellules et de tissus. À l’inverse, l’anastasis pourrait être une tactique inattendue d’échappement utilisée par les cellules cancéreuses de survivre à la thérapie cellulaire-induisant la mort, causant le cancer récidive17,18. Par conséquent, supprimant anastasis en mourant de cellules cancéreuses pendant et après que le traitement du cancer pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir le cancer en empêchant leur rechute.

Au cours du processus de l’anastasis, nous avons trouvé que certaines cellules récupérées acquis des altérations génétiques permanentes et a subi une transformation oncogénique, probablement en raison de dommages à l’ADN engagées au cours de l’apoptose18,20,21 . Inverser le processus de mort des cellules endommagées de l’ADN pourrait être un mécanisme de la tumorigenèse, potentiellement qui sous-tend l’observation qui répète la lésion tissulaire augmente le risque de cancer dans une variété de tissus, comme une lésion thermique chronique dans l’oesophage provoquée par par la consommation de boissons très chaudes33,34,35, atteinte hépatique due à l’alcoolisme36,37, évolution de la tumeur après génotoxique du cancer therapy38, 39,40et le développement de nouveaux cancers des tissus normaux qui surviennent pendant les intervalles entre les cycles de traitement anticancéreux41,42,43,44 . Si true, ciblant l’anastasis pourrait prévenir ou arrêter le développement du cancer et la progression. Nous avons trouvé que la famine induite par les cellules germinales mourants subissent anastasis réalimenté Drosophila19.  Si anastasis se produit dans les cellules germinales avec altération de l’ADN, ça pourrait être responsables de l’observation qui prolonge le stress environnemental favorise le développement des maladies génétiques. Par exemple, famines contribuent à l’apparition de maladies héréditaires transgénérationnel comme le diabète et les maladies coronariennes,45. Par conséquent, compréhension anastasis pourrait conduire à des stratégies de prévention des maladies héréditaires causée par ce mécanisme potentiel.

Pour exploiter la découverte de l’anastasis et dirigez-la à développer des thérapies innovantes, il est essentiel d’étudier la cause et la conséquence de l’anastasis animaux vivants. Toutefois, il est techniquement difficile de repérer les cellules anastatique in vivo, car les cellules qui recouvré des processus de mort cellulaire apparaissent morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales, et il n’y a aucun marqueur biologique de l’anastasis identifiés encore17,18,21. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment mis au point un nouveau en vivo caspase biocapteur désigné « CaspaseTracker »19, pour repérer les cellules qui survivent l’apoptose après activation de caspases19,46, le caractéristique de l’apoptose10,14. Il distingue les biocapteurs « temps réel » caspase tels que SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 et iCasper52 détectant l’activité en cours de caspase, le biocapteur CaspaseTracker dispose en plus de la possibilité d’étiqueter en permanence des cellules cette activité de caspase express même éphémère. Le biocapteur CaspaseTracker permet donc, suivi à long terme de l’anastasis après le renversement de caspase-mediated cell death processus in vivo.

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Protocol

1) préparation du biocapteur CaspaseTracker mouches

  1. Anesthésier les mouches avec du CO2et utiliser un pinceau pour transférer les femelles vierges de 7 à 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 et 7 à 10 G-Trace53 Gal4 journaliste jeunes mouches mâles (ou vice versa) dans le même flacon avec alimentation mouche et la pâte de levure fraîche.
    Remarque : Croix de mouches Gal4 Caspase-sensibles (DQVD) et G-Trace produira des mouches de descendance CaspaseTracker. Croix de Caspase -danssensibles (DQVA)19 Gal4 et mouches G-Trace fournira les mouches de contrôle négatif (Voir discussion). Levure fraîche pâte sert de source de protéines pour améliorer la production d’oeufs, ce qui augmente le nombre de descendants. Choisissez les femelles vierges et les jeunes mouches mâles selon leurs phénotypes54.
  2. Incuber les mouches à 18 degrés Celsius (o-C) au cours de la Croix pendant 3 à 7 jours et puis transférez les mouches dans un nouveau flacon de mettre en place une nouvelle croix à 18 ° C. Continuer à incuber le flacon d’origine à 18 ° C jusqu'à ce que la progéniture vole eclose.
    Remarque : Transférer les mouches de parent à nouveaux flacons pour éviter le surpeuplement de la progéniture dans le flacon d’origine. Mouches de parent peuvent produire la progéniture avec des aliments frais et pâte de levure d’abord 2 ou 3 aiguilles, et puis la productivité diminuera sensiblement avec le temps. Élever des mouches 18 ° C peut réduire le signal non spécifique du biocapteur CaspaseTracker (Voir discussion).
  3. Sélectionnez progéniture vole avec des phénotypes correcte54 pour les expériences suivantes.
    Remarque : Les transgènes de caspase sensibles Gal4 et G-Trace ici sont situés dans le deuxième chromosome, équilibré avec équilibreur de CyO. Sélectionnez la progéniture d’aile non bouclés (sans CyO), qui a les deux transgènes de Gal4 et G-Trace de caspase-dépendantes.

2) demande d’Induction de mort cellule transitoire de biocapteur CaspaseTracker mouches

  1. Le transfert de 10 à 20 nouvellement éclos femelle vole à nouveau dans une cuvette avec des aliments frais de mouche et la pâte de levure fraîche pour 1 jour à 18 ° C pour permettre la production de œufs chambre par ovogenèse.
    Remarque : Garder la femelle avec les mouches mâles pourrait améliorer la chambre de ponte.
  2. Pour provoquer l’oeuf chambres d’apoptose par choc hypothermique, transfert la femelle vole à nouveau flacon vide, qui est ensuite placé à-7 ° C pendant 1 h.
    NOTE: choc hypothermique blesse des cellules en provoquant la rupture de la membrane plasmique55,56.
  3. Pour provoquer l’oeuf chambres d’apoptose par la famine de protéine, transférer les mouches femelles dans un nouveau flacon avec 8 % de sucrose et de 1 % des aliments agar à 18 ° C pendant 3 jours.
    Remarque : Famine de protéine (non protéique alimentaire) peut déclencher des oeufs chambres pour subir l’apoptosis57,58,59 et autophagie60,61. Interrupteur vole à nouveau dans une cuvette avec de la nourriture de 8 % de sucrose et 1 % d’agar chaque jour pour maintenir les conditions optimales de saccharose aliments mouche.
  4. Transférer les mouches stressées à une cuvette de nouveau avec des aliments frais de mouche et la pâte de levure fraîche pendant 3 jours à 18 ° C, pour leur permettre de récupérer. Disséquer les affamés et les mouches de faim-récupéré pour obtenir des œufs chambres à ovaires comme décrit62.
    Remarque : Pour disséquer la drosophile pour obtenir des ovaires, anesthésier les mouches avec du CO2et 2 paires de pinces permet de supprimer la tête de mouche et utilisez la pince pour tirer sur la base de l’abdomen pour retirer les ovaires des mouches.

3) fixation et coloration des oeufs disséqués Chambers pour l’imagerie

  1. Transférer les chambres oeuf disséqué avec autour de 0,5 mL tamponné phosphate salin (PBS) à tubes à centrifuger 1 mL. Laissez les oeufs se sédentariser.
    Remarque : Enduire les pointes de pipette en plastique avec 1 % albumine sérique bovine (BSA) dissous dans l’eau ou PBS pour empêcher les chambres de l’oeuf à coller sur la surface en plastique des conseils. Exécutez les procédures suivantes dans l’obscurité, afin d’éviter le photoblanchiment de la protéine fluorescente rouge (DP, également connu sous le nom de DsRed) et la protéine fluorescente verte (GFP) dans les chambres de l’oeuf.
  2. Supprimer les PBS en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pour fixer les chambres de le œuf à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 à 30 min.
    Remarque : Appliquer la rotation douce dans ce domaine et les étapes suivantes de l’incubation.
  3. Retirer le paraformaldéhyde en pipettant également et ensuite lavé la couveuse avec 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton X-100) pour 3 fois.
    Remarque : La fixation prolongée pourrait réduire les signaux DP et GFP.
  4. Incuber les chambres de l’oeuf avec PBST pendant 1 à 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C, avec légère rotation pour permeabilize les chambres de l’oeuf.
    NOTE: PBST peut aussi éviter les oeufs chambres s’en tenir à la surface en plastique non-BSA.
  5. Supprimer le PBST en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL de 10 μg/mL de colorant bleu de Hoechst nucléaire dans du PBST aux oeufs chambres pour 1 à 2 h à température ambiante sur la tache pour le noyau.
    Remarque 1 : Éviter une incubation prolongée avec un colorant nucléaire car cela va augmenter le signal non spécifique.
    Note 2 : Une approche alternative pour colorer le noyau sans Hoechst est d’ajouter 200 μL anti-blanchiment montage agent au DAPI (voir documentation) et incuber une nuit63, avant de monter les tissus sur la lamelle de verre, tel que décrit au protocole 3,8.
    NOTE3: effectuer la coloration et les procédures suivantes dans l’obscurité, afin d’éviter le photoblanchiment.
  6. Enlever le colorant nucléaire en pipettant également et ensuite appliquer 0,5 mL PBST pour laver les chambres de le œuf dans les tubes à centrifuger 1 mL pour 3 fois, avec 10 à 20 min d’incubation avec légère rotation entre chaque étape de lavage.
  7. Supprimer tous les PBST avec fine pipette et appliquez ensuite 200 agent de montage anti-blanchiment μL (voir documents) à incuber les chambres de le œuf à température ambiante pendant 3 h, ou toute la nuit à 4 ° C jusqu'à ce que les chambres de le œuf coulent au fond du tube.
    Remarque: les tissus qui ont totalement absorbé l’agent montage coulent au fond du tube.
  8. Monter les chambres des oeufs colorés en transférant leur avec 200 μL anti-blanchiment montage agent sur une lame de verre préalablement nettoyé pour l’imagerie de pipetage, couvrir les chambres de le œuf avec une lamelle de verre préalablement nettoyé de 20 x 20 mm et sceller la lamelle couvre-objet sur lame de verre en mettant vernis à ongles au bord de la lamelle couvre-objet.
    Remarque 1 : Un nettoyage préalable de la lame de verre et de la lamelle couvre-objet avec de l’eau, soit 70 % éthanol.
    Note 2 : Appliquer la gelée de pétrole entre la lame de verre et de la lamelle couvre-objet pour éviter de détruire les chambres de l’oeuf par surcompression.
  9. Les chambres de l’oeuf à l’aide de fluorescence ou microscope confocal, utilisez un 20 x, NA 0,8 d’image objectif Plan-Apochromat, avec excitation légère longueur d’onde de 405 nm pour la coloration des noyaux (détecteur d’émission ~ 461 nm), 561 nm pour les DP (en cours ou récentes caspase activity) signal ( détecteur d’émission ~ 590 nm) et 488 nm pour le signal de la GFP (ancien caspase activity) (détecter des émissions ~ 518nm).
    Remarque : Voir nos protocoles publiés pour microscopie20,,64.

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Representative Results

Microscopie des cellules vivantes Time-lapse est une méthode fiable pour tract anastasis dans des cellules cultivées20, mais il est difficile d’identifier les cellules qui ont subi l’anastasis chez les animaux, parce que les cellules récupérés apparaissent morphologiquement indiscernables des cellules saines normales qui n’ont pas tenté de mort cellulaire. Par exemple, les cellules humaines de cancer du col utérin HeLa affichent des caractéristiques morphologiques de l’apoptose1,2,14, tels que le rétrécissement de la cellule, condensation nucléaire et la membrane plasmique blebbing en réponse à la mort cellulaire stimulus de 1µM staurosporine17 (Figure 1 a, Fig. 1 b i et ii). Après avoir enlevé le stimulus de mort cellulaire et l’incubation dans un milieu frais, les cellules mourantes inverser le processus de mort cellulaire par anastasis17,18, tel qu’indiqué par récupération morphologique (Figure 1 b iii-iv), suivie de prolifération (Figure 1 b v-vi). Nos études antérieures ont aussi utilisé des biocapteurs caspase « temps réel », comme les ApoAlert (NES-hanane-YFP-NLS) pour démontrer l’inversion de l’apoptose après activation des caspases18,20. Ce biocapteur se localise dans le cytosol dans les cellules saines (Figure 1, 1-D j’ai). Lors de l’activation de caspases déclenchée par la cellule mort relance 3,7 % d’éthanol, ce biocapteur YFP-basée est clivé par des caspases et transloqué au noyau, où il s’accumule et la fluorescence nucléaire résultante de sa balise YFP identifie les cellules avec en cours activité de la caspase (Figure 1 C, 1 D ii et iii). Les cellules mourantes affichent également des caractéristiques morphologiques de l’apoptose au cours de l’éthanol-induction1,14,18,20, telles que la fragmentation des mitochondries tubulaires, nucléaires condensation, rétrécissement de la cellule et la membrane plasmique blebbing (Figure 1 , ii-iii). Fait intéressant, après le retrait du stimulus de mort cellulaire, les mêmes cellules peuvent récupérer et retrouver la morphologie normale (Figure 1 , iv-viii). Notamment, la fluorescence nucléaire de la ApoAlert (biocapteur clivée) est allée dans l’heure dans les cellules récupérées (Figure 1 iv à viii), peut-être en raison des processus semblables qui éliminent les composants endommagés dans anastatique cellules18 , comme clivé caspase-3, PARP et CISD générée pendant l’apoptosis. Par conséquent, une nouvelle stratégie est nécessaire pour anastasis de suivi sur une période plus longue, surtout en vivo.

Pour suivre le destin des cellules anastatique, nous avons développé le système de biocapteur CaspaseTracker chez les mammifères, dont les étiquettes en permanence les cellules après être clivé par activité de caspase bourreau. Ce biocapteur est composé d’un rtTA caspase-sensibles (transactivateur de tétracycline-contrôlée inversée) et un journaliste Cre-LoxP-based rtTA activité (Figure 2 a-B). Dans les cellules saines sans activité de caspase, le transactivateur rtTA65 est attaché à la membrane plasmique d’ancrage (Lyn11)66,67, signal d’exclusion de noyau (NES) de Kinase de Kinase de carte (MAPKK)68, et oestrogène récepteur variante (ERT2)69 par caspase-CLIVABLES lieurs de70 (hanane) dérivé de PARP (Figure 2 a, 2 b). Comme rtTA captif ne peut effectuer des transferts du cytosol vers le noyau, il est impossible d’activer le journaliste rtTA. Toutefois, lors de l’activation en réponse à un stimulus de mort cellulaire, caspases cliver les linkers hanane, libérant la rtTA de translocation dans le noyau (Figure 2 b). Une fois dans le noyau, la rtTA se lie à l’élément de réponse de tet (TRE) et l’expression transitoire de déclencheurs de recombinase Cre, qui mène à un événement de recombinaison irréversible qui supprime la cassette de codon d’arrêt entre le promoteur de l’ACG et les séquences codantes pour protéine fluorescente rouge (DsRed). Cela se traduit par l’expression permanente de DsRed (Figure 2 b), qui sert le marqueur fluorescent permanent de ces cellules qui peuvent rester en vie après que qu’ils ont connu l’activité caspase, ainsi que leur progéniture (Figure 2).

Pour tester le biocapteur de CaspaseTracker chez les mammifères, nous introduit dans les cellules HeLa par transfection transitoire, traités les cellules avec un stimulus de mort cellulaire (staurosporine 1µM) et surveiller la récupération des cellules par microscopie confocale Time-lapse de cellules vivantes comme nous l’avons décrit le20. Doxycycline (concentration finale de 1 µg/mL), ce qui est essentiel pour permettre rtTA activité65,71, a été ajouté au milieu de culture cellulaire pour allumer le biocapteur tout au long de l’expérience. En réponse à la stimulation de la mort cellulaire, les cellules traitées affichent des caractéristiques de l’apoptose, y compris le rétrécissement de la cellule et la membrane plasmique blebbing comme prévu (Figure 2D i-iii). Après avoir enlevé le stimulus de mort cellulaire, rincer l’Anastase de cellule couche une fois et ajoutant un milieu culture frais, peut être observée dans les cellules mourantes, comme indiqué par leur retour à une morphologie normale (Figure 2D iv-vii). Diagnostique, n’a récupéré les cellules express la DsRed marqueur fluorescent pendant et après l’anastasis (Figure 2D iv-vii), distinguer les cellules non recyclée (Figure 2D iv-vii) et les hématies pas exposé à un stimulus de mort cellulaire (Figure 2E). Cela démontre l’application et l’utilité de la CaspaseTracker chez les mammifères comme nouvel outil d’identification et d’étiquetage en permanence les cellules anastatique remet d’activation des caspases roman et fournit un moyen de suivre et d’étudier leur sort à long terme.

Pour détecter et pister anastasis animaux vivants, les animaux transgéniques de biocapteur CaspaseTracker sont nécessaires. Par conséquent, nous avons tout d’abord utilisé Drosophila melanogaster comme un système de modèle19, car comme c’est un important organisme génétiquement tractable pour l’étude du développement animal et maladies humaines72,73,74 ,,75. Tel que modifié depuis le biocapteur de CaspaseTracker chez les mammifères, le biocapteur double drosophile peut identifier et distinguer les « récentes/en cours » du « passé » activité de la caspase. Ce biocapteur double se compose une caspase sensibles Gal419, et le reporter de Gal4 G-Trace53 (Figure 3 a). Dans les cellules sans activité de caspase, le facteur de transcription de levure Gal4 est attaché à un domaine d’ancre (mCD8) de membrane plasmique via un linker caspase-CLIVABLES (DQVD), dérivé de DIAP1 (Figure 3 b), ayant une mutation 21NN/GV22 à prévenir la dégradation de Gal4 par la règle N-end par clivage de la caspase de l’éditeur de liens afterAsp2076et une mutation de D135R d’abolir la fonction inhibiteur de caspase drICE dans le domaine de BIR177. Gal4 captif ne translocation à noyau sans clivage par caspase pour le libérer, le reporter de Gal4 G-Trace reste inactif dans les cellules ayant aucune activité de caspase19. Lors de l’activation de la caspase, cependant, les caspases activés fendent l’éditeur de liens DQVD, libérant Gal4 de translocation dans le noyau pour activer le G-Trace journaliste (Figure 3 a)19. GAL4 lie au particulier en amont activation de séquences (SAMU) pour déclencher la transcription transitoire et l’expression de DP, qui sert ensuite comme journaliste fluorescent de l’activité de la caspase récents ou actuels jusqu'à la Gal4 (caspase) activité s’arrête et puis DP protéine est dégradé. GAL4 déclenche aussi l’expression de la recombinase FLP du transgène, conduisant à un événement de recombinaison qui supprime la cassette de codon stop entre un promoteur d’ubiquitine (Ubi) et une séquence codante pour noyau ciblé GFP (nucGFP). Cela se traduit par l’expression permanente de nucGFP, qui sert de marqueur permanent de ces cellules qui ont connu l’activité caspase et rester en vie.

Pour tester la Drosophila CaspaseTracker biocapteurs pour la détection de l’apoptose et l’anastasis en vivo, CaspaseTracker les mouches femelles ont été soumis à un stress physiologique (Figure 3), tels que le froid de choc19, qui peut efficacement déclencher la mort cellulaire, notamment l’apoptose, comme indiqué par activation de la caspase, condensation nucléaire et cellule rétrécissement19,78et également nécrose due à froid qui provoque la perte de l’intégrité membranaire et fuite du cytoplasme contenu55,56. Comme prévu, le CaspaseTracker n’était pas activé dans le œuf chambres des mouches de contrôle où la mort des cellules liées au stress n’a pas étée induite (Figure 3D). En revanche, les chambres de l’oeuf de mouches stressées un jour après le choc hypothermique a montré non seulement rétrécissement de cellules apoptotiques caractéristique et condensation nucléaire, mais aussi DP et GFP expression, indiquant la présence de ces dernières ou en cours (DP +) et dernière caspase (GFP +) activité (Figure 3E). Cependant, trois jours après son retour de le mouches stressées à l’état normal non-soulignant, GFP, mais sans DP, expression a été détectée dans l’alvéole d’oeufs récupérés (Figure 3F). Ceci indique que chambres de œuf qui avaient exprimé la caspase activité suite à un stress ont pu surmonter le processus de mort cellulaire et survivre.

Pour tester davantage réversibilité des processus de mort cellulaire dans le œuf chambres19, CaspaseTracker mouches femelles ont été soulignés par la famine de protéines après avoir alimenté 8 % de saccharose à 1 % d’agar pendant 3 jours. Des études antérieures ont démontré que famine de protéine peut déclencher l’apoptose induite par la caspase et autophagie dans les tissus somatiques et des cellules germinales, y compris les œufs chambres57,60,,61. Comme prévu, CaspaseTracker a été activé dans les chambres de le œuf après 3 jours de jeûne protéine (Figure 3). Les chambres mourant d’oeuf exposé fois apoptotic morphologies et expression des DP et GFP biocapteur marqueurs, indiquant les récentes ou en cours (DP +) et sortant (GFP +) activité de caspase (Figure 3). Pour démontrer que CaspaseTracker permet de suivre des cellules récupérées qui a déjà souffert a activation de la caspase après un stimulus de la mort, les mouches après le jeûne ont été transférées à la normale nourriture mouche contenant des protéines. Comme prévu, les chambres de l’oeuf récupéré ces mouches réalimenté n’ont pas le reporter de caspase transitoire de DDP, n’indiquant aucune activité de caspase récentes ou en cours (Figure 3 H). Cependant, les chambres de l’oeuf chez ces mouches après que allégement du stress en les retournant à l’alimentation normale affichée le reporter de caspase GFP (Figure 3 H), ce qui indique que les cellules dans ces chambres oeuf avaient inversé le processus de mort cellulaire initiée à un moment donné après activation de la caspase. Vérification que l’activité de biocapteur CaspaseTracker est déclenchée par la caspase a été obtenue en remplaçant la séquence de clivage DQVD avec la séquence de DQVA, lequel caspase ne parvient pas à s’attacher et qui abolir l’activité biocapteur (Figure 3 b, 3I ).

Après que la CaspaseTracker Drosophila récupérés de la famine de protéine, nous avons constaté que plusieurs types de cellules dans les chambres de l’oeuf, comme les cellules somatiques (follicule) et des cellules germinales (cellules nourricières et ovocytes), affiche seulement GFP, mais pas de DP (Figure 3J )19, ce qui indique que ces cellules peuvent subir anastasis après l’activation des caspases. Fait intéressant, la GFP a également appelé les cellules dans la germarium (Figure 3J)19, qui contient des cellules souches, ainsi que ses chambres oeuf associés dans la même chaîne ovariole. Par conséquent, ces chambres d’oeuf de GFP-positif peuvent provenir de cellules souches qui ont récupéré la mort de la cellule après l’activation de la caspase. Ce qui est important, les affamés et réalimentée les mouches femelles pondent des œufs fertiles qui peuvent produire des GFP-exprimant la progéniture mouches19, suggérant que potentiellement les cellules inversé les processus de mort cellulaire après que activation de la caspase peut retrouver la fonction apparemment normale. Les études à venir sont nécessaires pour déterminer si des mouches de descendance qui survivent par suite de l’anastasis présentent des séquelles permanentes.

Figure 1
Figure 1 . Récupération de HeLa cellules après l’induction de mort cellulaire.
(A) le diagramme schématique de l’approche pour induire la mort cellulaire et permettent par la suite mourir les cellules pour récupérer après le retrait de l’inducteur de mort cellulaire.
(B) microscopie DIC Time-lapse de cellules vivantes des cellules HeLa saines (j’ai), le même groupe de cellules après le traitement avec la staurosporine 1µM (ii) et ensuite lavé et autres incubés avec milieu de culture fraîche pour enlever la staurosporine ( III-vi). Flèche blanche indique une cellule en division.
(C) le schéma de la protéine de fusion caspase biocapteur NDA-hanane-YFP-NLS et la localisation subcellulaire des YFP pendant l’induction de mort cellulaire et après anastasis.
(D) la microscopie confocale Time-lapse de cellules vivantes d’une seule cellule HeLa exprimant la protéine de fusion de biocapteur caspase NDA-hanane-YFP-NLS avant (j’ai), pendant l’exposition 3,7 % d’éthanol (ii - iii) et après retrait d’éthanol depuis le milieu de culture (iv - viii). Montré ici sont des images de la caspase biocapteur seulement (fluorescence verte, rangée du haut) ; fusionner des images du noyau coloré Hoechst (fluorescence bleue) et de mitochondries (fluorescence rouge) (rangée du milieu), et des images dans la rangée du milieu encore fusionné avec images DIC (rangée du bas). Les flèches blanches dans la rangée du haut indiquent nucléaire YFP localisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Système de biocapteur mammifères CaspaseTracker.
(A) schéma de principe de la rtTA caspase-sensibles.
(B) schéma de principe du système biocapteur rtTA CaspaseTracker chez les mammifères.
(C) Organigramme d’utiliser le système de biocapteur rtTA CaspaseTracker pour détecter anastasis. Triangle rouge/jaune (supplément inducteur de mort cellulaire) et vert/bleu (inducteur de lavage hors) symboles sont comme dans la Figure 1 a.
(D) microscopie confocale en Time-lapse de cellules vivantes d’un amas de cellules HeLa exprimant le biocapteur de rtTA CaspaseTracker mammifères avant (j’ai) et Pendant l’exposition à la staurosporine 1µM (ii - iii) et après avoir enlevé staurosporine depuis le milieu de culture (iv - vii). Fusion d’images des signaux DIC et DsRed. Flèches indiquent la cellule 1 (jaune) et cellule 2 (vert).
(E) la microscopie confocale en Time-lapse de cellules vivantes des cellules HeLa exprimant le biocapteur non traitées. Fusion d’images des signaux DIC et DsRed. Flèches blanches indiquent les cellules en division.
Doxycycline (1ug/mL) était présent dans le milieu au cours des expériences sur des panneaux (D) et (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Drosophila Système de CaspaseTracker de biocapteur double. (Adopté avec la permission de Tang et al., 2015 de rapports scientifiques, 9:9015 19 ).
(A) schéma de principe du système Drosophila CaspaseTracker Gal4 biocapteur.
(B) schéma de principe de la caspase-sensibles (DQVD) et de la caspase-indépendante de contrôle (DQVA) Gal4.
(C) schéma de drosophile ovaire et diagramme de flux d’induction mort cellulaire chez les mouches âgées de 1 jour, suivie de la récupération de 3 jours à l’état normal. Drosophila image fournie par Darren Obbard.
Les image confocale représentative (D) des chambres ovule par l’ovaire d’une mouche femelle biocapteur nourris avec nourriture mouche normale pendant 6 jours (non traitée).
(E) image confocale représentant des chambres de l’oeuf de l’ovaire d’une mouche de biocapteur femelle froid choqué placé à-7 ° C pendant 1 h et puis passer à condition de culture normale pour 1 jour (choc hypothermique, CS).
(F) comme panneau E sauf les mouches choqués froids étaient passés à condition de culture normale pendant 3 jours (récupéré après CS).
(G) image confocale représentant d’oeuf chambers de l’ovaire d’un biocapteur femelle affamé volent nourris avec 8 % de saccharose à 1 % d’agar sans protéines pendant 3 jours (Starved).
(H) comme panneau G sauf le mouches traitées sont passés à une alimentation normale mouche pendant 3 jours après le traitement de famine de protéine (re-nourri).
(I) comme panneau G sauf montrant la famine de caspase danssensible mouches femelles biocapteur de CaspaseTracker (DQVA), qui a servi de témoin négatif.
(J) image confocale représentant des chambres de œufs d’une femelle affamées et réalimenté drosophile. Les flèches indiquent des GFP nucléaire exprimé dans les cellules nourricières (noirs), les ovocytes (blancs) et les cellules folliculaires (jaunes) des chambres de le œuf et dans le germarium (vert). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Conséquences physiologiques, pathologiques et thérapeutiques de l’anastasis. (Adopté avec la permission de Tang et al., F1000Res 2017, 06:43 21 ). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le système de double biocapteur CaspaseTracker est un outil unique qui permet de détecter ces dernières et novateur ou activité de la caspase en cours et le suivi des cellules qui ont renversé la mort cellulaire traitent et survivent après avoir connu caspase activité in vivo. Alors que l’activité de la caspase a été traditionnellement considérée comme une caractéristique de l’apoptose, croissant des études révèlent que non-apoptotic caspase activité joue un rôle potentiel dans les fonctions des cellules normales variés, tels que la régulation de l’activité neuronale79, 80, apprentissage et mémoire81,82,83,84, suppression de necroptotic cellule mort85,86, spermatide individualisation87, 88, microARN traitement89, prolifération de cellules90et destin cellulaire91le patterning. En plus de l’apoptose et l’anastasis, le système de biocapteur CaspaseTracker peut donc détecter non-apoptotic caspase activité, qui est présente dans le cerveau et lobes optiques, cardia, intestin, Malpighi tubules, trachée, muscles et autres tissus de Drosophile19,46,,64. Ce signal de biocapteur pourrait représenter aussi l’activité anastatique actuels ou passés durant le développement embryonnaire ou homéostasie normale dans ces tissus. Etudier à anastasis après stress environnementaux induisant la mort cellulaire transitoire dans les animaux vivants, il est essentiel de choisir des tissus avec des cellules qui ne présentent aucune activité de biocapteur de caspase dans des conditions physiologiques normales, mais qui peuvent être induites à subir la caspase activation par induction de mort cellulaire transitoire. Œuf chambres sont idéales pour cet effet, parce qu’ils n’ont en général aucune activité de caspase du germarium à l’étape 10 durant l’ovogenèse58,59,92.

Exposer des femelles drosophile aux stress environnementaux transitoires, comme la famine de protéine et choc hypothermique, peut efficacement déclencher activation de la caspase et mort cellulaire dans le œuf chambres19,57,58, 78. Étapes critiques au sein du protocole comprennent évitant d’induction de mort cellulaire prolongé aux mouches. Les conditions optimisées de famine (8 % de saccharose à 1 % d’agar pour 3 jours) de la protéine et choc par le froid (1 h à-7 oC) pour les mouches femelles peuvent déclencher des processus de mort caspase-lancée de cellules dans les chambres de le œuf et leur permettre de récupérer après que les mouches stressées sont retournés au condition normale19. Un traitement prolongé avec un stimulus de mort cellulaire peut déclencher plusieurs oeufs chambres pour suivre le processus de mort cellulaire, mais le taux de récupération est également réduit, sans doute parce que les chambres oeuf mourant l’expérience des dégâts irréparables.

Une autre étape critique dans le présent protocole est de réduire le signal de fond CaspaseTracker dans les chambres de le œuf en traversant, d’élever et de maintenir que la CaspaseTracker vole à basse température, tels que 18 oC. Alors que la majorité des chambres des œufs de façon optimale élevés mouches n’affichent pas l’activité caspase dans le germarium par étape 10 durant l’ovogenèse58, environ 1 % des chambres de l’oeuf pourrait montrer l’activité de la caspase biocapteur sans induction de mort cellulaire19 . Cela peut refléter le taux d’attrition normale en raison d’erreurs innées ou peut être déclenché involontairement durant l’ovogenèse par des conditions de laboratoire standard. Gal4 présente moins d’activité chez les mouches à basse température93, élever des mouches à 18 oC, plutôt qu’à température ambiante, peut réduire le signal endogène qui active le système de CaspaseTracker. Alternativement, passant des mouches à une température plus élevée, tels que 29 oC, peut augmenter la sensibilité du système CaspaseTracker, due à l’augmentation de l' activité de Gal493et potentiellement d’autres endogène dépendant de la température enzymatique activités.

Il est important de distinguer les cellules CaspaseTracker-positif qui subissent des processus de mort cellulaire ou anastasis de cellules qui présentent une activité de caspase non-apoptotique. Les cellules apoptotiques expriment DP (marqueur transitoire pour l’activité de la caspase en cours ou récentes) et souvent la GFP (permanent maker pour des activités passées de caspase) dans le traitement d’induction de l’apoptose, comme ceux-ci meurent les cellules ont une activité caspase en cours que Gal4 Cliver-activé, qui a ensuite active le transitoire (DP activité dépendante de Gal4) et permanent (Gal4 déclenchée FLPase-FRT médiée par GFP) journalistes du système G-Trace. L’apoptose de ces cellules peut être confirmé par les caractéristiques morphologiques et biochimiques tels nous condensation nucléaire détectée par coloration avec colorants nucléaires14,19,58et le clivage de caspase détectés par immunomarquage19,94. Les cellules qui ont déjà subi anastasis affichent permanente expression de la GFP en raison de l’événement de recombinaison FLPase par l’intermédiaire du système G-Trace. Ces cellules expriment sans DP car ils n’ont aucune activité de caspase-continu, ni d’autres caractéristiques de l’apoptose,19. Ces cellules présentent également une morphologie nucléaire normale. Les cellules ont en cours non-apoptotic caspase activité souvent preuve d’expression tant DP et GFP et avoir une morphologie nucléaire normale19.

Il peut être difficile de distinguer les cellules qui ont connu anastasis de ces cellules qui avaient passé non-apoptotic caspase, parce que toutes deux affichent uniquement la GFP et n’ont aucune marque distinctive de la mort cellulaire. Des expériences de contrôle attentif doit donc être inclus19. Pour obtenir des exemples, pour étudier l’anastasis dans les chambres de le œuf, il est essentiel d’examiner l’expression de la GFP en recouvrement a souligné mouches et mouches non sollicités (témoin négatif). Mouches récupérés devraient montrer plus de cellules exprimant le GFP que mouches atones, si anastasis a eu lieu après l’activation de la caspase. Il est également important de distinguer les signaux fluorescents CaspaseTracker non spécifique auto-fluorescence, telle qu’observée dans la cuticule, pigments et corps gras19. Nous avons généré contrôle négatif biocapteur mouches par mutation du site de clivage de caspase du biocapteur (DQVD) à une séquence non-CLIVABLES (DQVA) et rendant ainsi le biocapteur de contrôle ne répond pas à l’activité de caspase19. Le signal détecté dans la caspase sensible (DQVD) mais pas dans les mouches de biocapteur de contrôle négatif (DQVA) est le signal d’intérêt, déclenchée par l’activité de la caspase plutôt auto-fluorescence.

Notre actuel Drosophila double CaspaseTracker biocapteur peut identifier les cellules avec activité de caspase « récente » par l’expression de DP et ayant une activité caspase « passé » par l’expression de la GFP,19. Nous notons que la DP n’est pas un indicateur d’activité de la caspase « temps réel », car il faut quelques heures de temps de réponse de Gal4 de conduire l’expression de DP en réponse à l’activité de la caspase. Pour ajouter une fonction « temps réel », la drosophile CaspaseTracker biocapteur peut être combiné avec l’iCasper récemment développés biocapteur52, un « temps réel » et « dark à vif » en vivo biocapteur qui ne montre que son signal rouge sombre quand il est clivée par des caspases.

En dehors de l’apoptose, CaspaseTracker pourrait également être activée au cours d’autres types de mort cellulaire comme cellules peuvent passer les voies de mort cellulaire au cours de leur parcours qui directement ou indirectement implique l’activation de caspases, tels que l’autophagie après famine95,96, nécrose de la membrane de plasma froid induite par le choc rupture19,55,56,78et induite par la staurosporine necroptosis97, 98. Nos études actuelles et précédentes ont démontré que les biocapteurs CaspaseTracker peuvent marquer des cellules récupérées de ces cellules mort inductions in vitro ou in vivo17,18,19 , 20 , 21. comme ces inductions de mort cellulaire seules pourraient actionner simultanément de multiples voies de mort cellulaire dans les mêmes cellules, la récupération de ces cellules en train de mourir donne à penser qu’anastasis est un phénomène de récupération cellule générales qui peut inverser la mort cellulaire différente processus, y compris l’apoptose, autophagie, nécrose et necroptosis, individuellement ou simultanément.

Le biocapteur de CaspaseTracker en vivo facilitera la poursuite de la fonction encore inconnue, des mécanismes et implications thérapeutiques d’anastasis ()Figure 4)21. Pour faire apparaître la signature moléculaire de l’anastasis, nous avons effectué des études d’expression microarray gène du génome entier de temps pour analyser les cellules du foie primaire de souris au cours de l’inversion de l’apoptose induite par l’éthanol et intéressant, a constaté des changements frappants dans transcription de gènes impliqués dans des voies multiples, y compris apoptotiques, anti-oxydation, réponse aux dommages de l’ADN, modification d’histone, angiogenèse, migration cellulaire et transformation18,21. Cette conclusion est étayée par notre étude de validation de la récupération de cellules cancéreuses du foie humain HepG2 de l’apoptose18,21et également une récente étude indépendante de RNA-séquençage des cellules HeLa dans la récupération de l’apoptose99. Fait intéressant, régulation de certains facteurs apoptotiques anastatique cellules sont également observées dans le renversement de l’insuffisance cardiaque, la progression tumorale et le cancer récidive100,101,102, suggérant la participation potentielle de l’anastasis. Afin d’étudier le potentiel physiologique, pathologique et thérapeutique de l’anastasis, il est important d’identifier les cellules anastatique et suivre leur sort chez de petits animaux, car cela permettra des études mécanistiques et thérapeutiques. Notre drosophile et les mammifères CaspaseTracker biocapteurs seront des outils utiles pour tester les contributions potentielles d’anastasis en développement normal, l’homéostasie, récupération de tissu, évolution de la tumeur, récidive du cancer et la métastase. Conclusions de ces études vont accroître notre compréhension du rôle naturel de l’anastasis et offrent un potentiel d’identifier révolutionnaires nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies incurables par la médiation de la mort cellulaire et la survie par le contrôle d’anastasis.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Darren Obbard Drosophila image dans la Figure 3 et vidéo manuscrit ; J. Marie Hardwick, Wade Gibson et Heather M. Lamb pour une analyse précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) et NCI K22 accordent CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang était un h et Kay Curci Foundation Fellow de la Fondation de recherche de Sciences de la vie (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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Médecine numéro 132 Anastasis apoptose autophagie biocapteurs caspase CaspaseTracker nécrose necroptosis mort programmée de cellules inversion de l’apoptose
Détection de Anastasis <em>In Vivo</em> par CaspaseTracker biocapteur
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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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