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Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

Anastasis (그리스어 "생활에 상승")은 그것에 의하여 일반적으로 본질적으로 가역 적인 것으로 간주 하는 단계의 세포 죽음 프로세스에 뒤집을 수 있는 세포 죽어 최근에 발견 된 세포 복구 현상. Anastasis 홍보 수 원리 구조 또는 보존 부상을 cardiomyocytes 등 신경, 조직 복구를 촉진 함으로써 대체 하기 어려운 세포. 반대로, 억제 anastasis 암 세포에 항 암 치료 후 apoptosis를 겪고 수 있습니다 암 세포 죽음 고 재발의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구 anastasis 살아있는 동물에서 받아야 하는 셀의 운명을 추적 하기 위한 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 복구 후 그들의 형태학 상으로 정상적인 외관에도 불구 하 고 세포 죽음 프로세스를 반전 하는 셀을 식별 하는 도전이입니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 초파리 및 식별 하 고 영구적으로 anastatic 세포 생체 외에서 또는 vivo에서추적할 수 있는 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했습니다. 여기, 우리는 생성 및 감지 하 고 세포 죽음 자극에 과도 노출 후에 초파리 melanogaster anastasis 추적 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템의 사용에 대 한 vivo에서 프로토콜을 제시. 기존의 바이오 센서 프로토콜 수 레이블 셀 적극적으로 겪고 apoptotic 세포 죽음, 그러나 CaspaseTracker 바이오 센서 caspase 활성화-단계의 apoptosis의 각 인 후 회복 된 셀 라벨 영구적으로 수 고 동시에 활성 apoptotic 프로세스를 식별 합니다. 이 바이오 센서는 직접 또는 간접적으로 관련 된 caspase 활동 세포 죽음의 다른 형태를 시도 하는 셀의 복구를 추적할 수도 있습니다. 따라서,이 프로토콜을 수 있습니다 이러한 세포와 생물 학적 기능, 분자 메커니즘, 생리 및 병리학 결과 및 치료 의미의 미래 연구를 촉진 하는 그들의 자손의 운명을 지속적으로 추적 anastasis입니다. 우리는 또한 그 비 apoptotic caspase 활동 비보를 표시 하는 anastasis 받아야 하는 셀을 구별 하는 적절 한 컨트롤을 논의.

Introduction

프로그램 된 세포 죽음, apoptosis 등, 다세포 생물1,2,3, 부상, 원치 않는 또는 위험한 셀을 제거 하 여 배아 개발 및 정상적인 항상성에서 중요 한 역할. 생존 세포의 죽음 사이의 균형의 손실 암, 심장 마비, 면역, 등 변성4,5,6,,78치명적인 결과가 발생할 수 있습니다. Caspases는 전통적으로 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis9,,1011, 그것으로 간주 되어 사형 집행의 활성화 트리거 신속 하 고 대규모 세포 파괴12, 13,14,,1516. 우리는 교양된 죽어가는 기본 세포와 암 세포는 원형질 막 blebbing, 셀 수축를 포함 하 여 죽음 특징 caspase 활성화, 하지만 또한 다음과 같은 중요 한 세포 뿐만 아니라 복구할 수 있습니다 입증이 일반적인 정설에 도전, 미토 콘 드 리아 조각화, cytosol, 핵 chromatin 응축이, DNA 손상, 핵 분열에 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 의 릴리스 세포 phosphatidylserine (PS)의 표면 노출 및 apoptotic 시체의 형성 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 우리 제안 그 anastasis은 기본 셀 복구 현상으로 죽어가는 세포 세포 죽음 자극17,,1819,20, 의 제거 후 복구할 수 있습니다 21. 우리가 만들어낸 용어 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 의미 "상승 생활" 그리스어,에이 예기치 않은 셀 복구 현상 설명. Anastasis의 우리의 관찰은 추가 phosphatidylserine 외부화22,23,24, 미토 콘 드 리아 제한 후 세포의 복구를 또한 공개 최근 독립적인 학문에 의해 지원 되는 외부 멤브레인 permeabilization25, 혼합된 계보 니 같은의 활성화 (MLKL), 그리고 세포 수축26.

Anastasis 규제 메커니즘을 특성화 하는 것은 패러다임 변화 생리, 병리학, 그리고 치료 의미 있을 것 이다. Anastasis 구출 또는 왼쪽 심 실 심 실 역 중요 한 postmitotic 세포와 대체, 하기 어려운 조직 및 가능 하 게 심장 마비 반전에 대 한 계정 보존 이전에 알려지지 않은 cytoprotective 메커니즘을 나타내는 수 있습니다. 뇌 부상32후 장치 (LVADs)27,28, 과도 한 빛29,,3031, 과도 노출 또는 뉴런의 수리 후 포토 리셉터 세포의 복구를 지원 합니다. Anastasis 홍보 세포 및 조직 복구를 향상 시킬 수 있도록 하는 경우. 반대로, anastasis 생존 세포 죽음을 유도 하는 치료, 암 재발17,18을 일으키는 암 세포에 의해 사용 되는 예기치 않은 탈출 전술 수 있습니다. 따라서, 억제 anastasis 동안 암 세포 죽어 그리고 암 치료 그들의 재발을 방지 하 여 암을 치료 하는 새로운 치료 전략 수 있습니다.

Anastasis의 과정에서 우리는 일부 복구 된 셀 영구 유전 변경 취득 종양 전이 겪었다, apoptosis18,20,21 동안 DNA 손상으로 인해 발생 한 발견 . DNA 손상 된 세포의 죽음 과정 반전 수 tumorigenesis의 메커니즘, 식도에 만성 열 상해 유도 같은 조직, 다양 한 암 위험 증가 잠재적으로 조직 상해를 반복 관찰을 기본 차적인 암 치료38, 후 매우 뜨거운 음료33,,3435, 알코올 중독36,37인 한 간 손상, 종양 진화의 소비에 의해 3940,,및 새로운 암 항 암 치료41,42,,4344 의 주기 사이 간격 동안 발생 하는 정상 조직에서의 개발 . True 이면 방지 수 anastasis 타겟팅 또는 암 개발 및 진행을 체포. 우리는 죽어가는 세균 세포 기아 유도 다시 먹이 초파리19anastasis 수술을 발견 했다.  Anastasis 생식 세포 DNA 손상에서 발생 하면, 그것은 유전 질병의 개발을 촉진 하는 환경 스트레스를 장기간 관찰에 대 한 계정 수 있습니다. 예를 들어 기근 transgenerational 상속 질병 당뇨병, 관상 심장 질환45등의 개발에 기여 한다. 따라서, 이해 anastasis 전략 개발이 잠재적인 메커니즘으로 인 한 상속 질병의 예방에 대 한 발생할 수 있습니다.

Anastasis의 발견을 활용 하 고 혁신적인 치료법 개발을 직접, 원인 anastasis 살아있는 동물에서의 결과 공부 하 고 필수적 이다. 그러나, 그것은 기술적으로 확인 하 고 anastatic 셀에 추적 vivo에서, 세포 죽음 과정에서 발견 된 셀 표시 정상적인 건강 한 세포 형태학 상으로 구별할 고 아무 biomarker anastasis의 도전 확인 아직17,,1821. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 새로운 비보에 caspase 바이오 센서를 식별 하 여46, caspase의 활성화19,후 apoptosis를 생존 하는 셀 추적 "CaspaseTracker"19, 지정을 최근 개발 된 apoptosis10,14각 인이 고 "실시간" caspase 바이오 센서 등 배설물12,47, Apoliner48, 캘리포니아-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52에서 구별 는 온가 caspase 활동 감지, CaspaseTracker 바이오 센서 또한 기능을 영구적으로 셀 익스프레스 caspase 활동 정도 능력. 따라서, CaspaseTracker 바이오 센서는 caspase 중재의 세포 죽음 과정 비보후 anastasis의 장기 추적을 하면 수 있습니다.

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Protocol

CaspaseTracker 바이오 센서의 1) 준비

  1. CO2, 파리 anesthetize를 사용 하는 붓 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 같은 유리병에 7 ~ 10 caspase 민감한 Gal4 (DQVD)19 처녀 암컷과 7 10 G-추적53 Gal4 기자 젊은 남성 파리 (또는 반대로) 전송.
    참고: 크로스 (DQVD)에 민감한 Caspase Gal4 및 G-추적 파리의 CaspaseTracker 자손 파리를 생산할 예정 이다. Caspase-에민감한 (DQVA)19 Gal4 크로스 고 G-추적 파리 부정적인 제어 파리 (내용 참조)을 제공 합니다. 신선한 효 모 반죽 그래서 그 자손의 수를 증가 계란 생산을 향상 시키기 위해 단백질 소스 역할을 합니다. 처녀 여성 및 젊은 남성 파리 그들의 고기54에 따라 선택 합니다.
  2. 3 ~ 7 일, 십자가 동안 섭씨 18도 (oC)에서 파리를 품 어 그리고 파리 18 ° c.에 새로운 십자가를 설정 하는 새로운 유리병에 전송 계속 때까지 자손 파리 eclose 18 ° C에서 원래 유리병을 품 어.
    참고: 원래 유리병에 자손의과 밀을 피하기 위해 새로운 튜브에 부모 파리를 전송. 부모 파리 신선한 음식과 처음 2-3 스위치에 효 모 반죽으로 자손을 생산할 수 있는 그리고 생산성 크게 줄어 시간. 파리를 높이 18 ° C CaspaseTracker 바이오 센서의 일반적인 신호를 줄일 수 있습니다 (내용 참조).
  3. 선택 자손 다음 실험에 대 한 올바른 고기54 파리.
    참고: 여기 caspase 민감한 Gal4 및 G-추적 transgenes CyO 분산 균형 두 번째 염색체에 있습니다. Caspase Gal4 민감하고 G-추적의 두 transgenes는 (CyO) 없이 비 곱슬 날개 자손을 선택 합니다.

CaspaseTracker 바이오 센서 파리에 과도 세포 죽음 유도의 응용 프로그램 2)

  1. 10 ~ 20 새로 eclosed 여성 oogenesis 여 계란 약 실 생산을 허용 하도록 18 ° C에서 1 일 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병에 파리를 전송 합니다.
    참고: 남성 파리 여성을 유지 계란 약 실 생산 향상 시킬 수 있습니다.
  2. 차가운 충격, 전송에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버를 유도 하기 위해 여성 1 h-7 ° C에 배치 됩니다 새 빈 유리병 날아갑니다.
    참고: 차가운 충격 유도 플라즈마 막 파열55,56세포 손상.
  3. 유도 단백질 기아에 의해 apoptosis를 받 다 계란 챔버, 전송 여성 파리 18 ° C에서 8% 자당 및 1% 한 천은 식품과 새로운 유리병에 3 일.
    참고: 단백질 기아 (비 단백질 음식) 계란 챔버 apoptosis57,,5859 와 autophagy60,61을 트리거할 수 있습니다. 스위치 이동 8% 자당 및 1% 한 천은 식품 새로운 유리병에 매일 비행 음식을 자당의 최적의 상태를 유지 합니다.
  4. 스트레스 파리를 복구할 수 있도록 18 ° C에서 3 일 동안 신선한 비행 음식과 신선한 효 모 반죽과 새로운 유리병 다시 전송. 굶 어과 설명된62으로 난소에서 계란 챔버를 굶 어-복구 파리를 해 부.
    참고: 난소를 초파리 해 부, anesthetize CO2, 파리 하 고 2 쌍이 집게를 사용 하 여 비행 머리를 제거 하는 집게는 파리의 난소를 제거 하는 복 부의 기지를 사용 하 여.

3) 고정 및 이미징에 대 한 해 부 계란 챔버의 얼룩

  1. 1 mL 원심 분리기 튜브를 0.5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 주위와 함께 해 부 계란 챔버를 전송 합니다. 진정 알 수 있습니다.
    참고: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 물 또는 끝의 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지 하기 위해 PBS에 용 해 된 플라스틱 피 펫 팁 코트. 빨간 형광 성 단백질 (RFP, 일컬어 DsRed)의 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 다음 절차를 수행 및 계란 약 실에서 녹색 형광 단백질 (GFP).
  2. Pipetting, PBS를 제거 한 다음 0.5 mL 4 %paraformaldehyde 실내 온도 20 ~ 30 분 동안 어둠에 계란 챔버를 해결 하기 위해 PBS에 적용.
    참고: 이에 다음 인큐베이션 단계 부드러운 회전을 적용 합니다.
  3. Pipetting, 여는 paraformaldehyde를 제거 하 고 다음 씻어 0.5 mL PBST와 계란 챔버 (PBS + 0.1% 트라이 톤 X-100) 3 번.
    참고: 장시간된 고정 RFP 및 GFP 신호를 줄일 수 있습니다.
  4. 실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 PBST와 계란 챔버를 품 어 또는 달걀 챔버를 permeabilize 부드러운 회전으로 4 ° C에서 하룻밤.
    참고: PBST 비 BSA 코팅된 플라스틱 표면에 붙어 계란 챔버를 방지할 수도 있습니다.
  5. Pipetting, 여는 PBST를 제거 하 고 0.5 mL PBST에 블루 핵 Hoechst 염료의 10 μ g/mL의 핵에 대 한 얼룩을 실 온에서 1 ~ 2 h에 대 한 계란 챔버에 적용.
    NOTE1: 이것은 일반적인 신호 증가 핵 염료와 장기간된 부 화를 하지 마십시오.
    NOTE2: 핵 없이 Hoechst 얼룩을 대체 접근 200를 추가 하는 μ 안티 표백 장착 에이전트 DAPI (자료 참조)와 하룻밤63, 프로토콜 3.8에 설명 된 대로 조직 유리 커버 슬립에 장착 하기 전에 품 어.
    NOTE3: photobleaching을 피하기 위해 어둠에는 얼룩 및 다음 절차를 수행.
  6. Pipetting, 여 핵 염료를 제거 하 고 0.5 mL PBST 3 번, 10 ~ 20 분 부 화 각 세척 단계 사이 부드러운 회전으로 1 mL 원심 분리기 튜브에 계란 약 실을 씻어을 적용 합니다.
  7. 미세 피 펫과 모든 PBST를 제거 하 고 다음 적용 200 μ 안티 표백 장착 에이전트 (참조 자료) 계란 챔버 튜브의 바닥에 침 몰 될 때까지 또는 하룻밤 4 ° C에서 3 시간 실내 온도에 계란 챔버를 품 어를.
    참고: 장착 에이전트 흡수 완전히 조직 관의 바닥에 싱크.
  8. 안티 표백 하는 200 μ와 그들을 전송 하 여 스테인드 계란 챔버 탑재 20 x 20 m m 미리 청소 유리 커버 슬립와 계란 실 커버 하 고 인감 넣어 유리 슬라이드에 커버 슬립, pipetting으로 이미징 미리 청소 유리 슬라이드에 에이전트를 설치 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어.
    NOTE1: 전 유리 슬라이드와 커버 슬립 물 또는 70% 에탄올으로 청소.
    NOTE2: 바 셀 린 유리 슬라이드와 커버 슬립 overcompression에 의해 계란 챔버를 파괴 하지 않으려면 사이 적용 합니다.
  9. 형광 또는 confocal 현미경, 20 배, 나 0.8 사용 하 여 사용 하 여 계란 약 실 이미지 핵 얼룩에 대 한 흥분 빛 파장 405 nm와 계획 Apochromat 목표 (감지 방출 ~ 461 nm), 561 RFP (지속적인 또는 최근 caspase 활동) 신호 (nm 검색 방출 ~ 590 nm), 및 488 nm (caspase 활동) 과거 GFP 신호 (방출 감지 ~ 518nm).
    참고: 현미경20,64에 대 한 우리의 게시 프로토콜을 참조 하십시오.

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Representative Results

시간 경과 라이브 셀 현미경은 배양된 세포20로 anastasis 신뢰할 수 있는 방법, 그것은 복구 된 셀 표시 형태학 상으로 구별할 수 있기 때문에 셀 동물, anastasis 받은 식별 하는 도전 정상적인 건강 한 세포에서 세포 죽음 시도 하지는. 예를 들어 인간의 자궁암 HeLa 세포 세포 죽음에 대 한 응답에서 apoptosis1,,214, 세포 수축 량, 핵 응축 등 플라즈마 멤브레인 blebbing의 형태학 상 특징을 표시 1µM staurosporine17 (그림 1A, 그림 1B i-ii) 자극 신선한 매체에 세포 죽음 자극 및 외피를 제거한 후 죽어가는 세포 세포 죽음 과정으로 반대로 anastasis17,18, 형태학 복구 (그림 1B iii iv)으로 표시 다음 확산 (그림 1B v를-6). 우리의 이전 연구는 또한 caspase 활성화18,20후 "실시간" caspase 바이오 센서, ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) apoptosis의 입증 등을 사용 했다. 이 바이오 센서 (그림 1C, 1d 나) 건강 한 세포에 cytosol에 localizes. Caspase 활성화 세포 죽음 자극 3.7% 에탄올에 의해 트리거됩니다,이 YFP 기반 바이오 센서 caspases에 의해 죽 습 이며 핵, 축적 및 YFP 태그의 결과 핵 형광-셀 식별 translocated caspase 활동 (그림 1 C, 1 D ⅱ-3). 죽어가는 세포는 또한 에탄올 유도1,14,,1820, 관 미토 콘 드리 아, 핵의 분열 등 중 apoptosis의 형태학 상 특징을 표시 응축, 셀 수축, 그리고 원형질 막 blebbing (그림 1D ⅱ-3). 흥미롭게도, 세포 죽음 자극의 제거 후, 같은 셀 수 복구와 정상적인 형태 (그림 1D 4-8 세)를 회복 합니다. 특히, ApoAlert (쪼개진된 바이오 센서)의 핵 형광은 사라 졌 어 요 복구 세포 (그림 1D 4-8 세)에 1 시간 가능 하 게 anastatic에 손상 된 구성 요소를 제거 하는 유사한 과정으로 인해 세포18 쪼개진된 caspase 3, PARP, apoptosis 중에 생성 된 ICAD 등. 따라서, 새로운 전략은 anastasis vivo에서특히 더 긴 시간 프레임 동안 추적 하는 데 필요 합니다.

Anastatic 셀의 운명을 추적 하 우리 영구적으로 사형 집행 caspase 활동에 의해 죽 습 되 고 후 셀 라벨 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 개발 했다. 이 바이오 센서는 caspase 민감한 rtTA (역방향 항생물질 제어는 transactivator), 그리고 rtTA 활동 (그림 2A-B)에 대 한 Cre LoxP-기반 기자로 구성 됩니다. Caspase 활동 없이 건강 한 세포에 transactivator rtTA65 는에 닿는 곳에는 원형질 막 앵커 (린11)66,67, 지도 키 니 아 제 키 니 아 제 (MAPKK)68의 핵 제외 신호 (NES) 및 caspase 쪼갤 (DEVD)70 링커를 통해 에스트로겐 수용 체 변형 (응급실T2)69 PARP (그림 2A, 2B)에서 파생 된. 로 속박 되 rtTA 핵 하는 cytosol에서 이동 수 없습니다, 그것은 rtTA 기자를 활성화할 수 없습니다. 그러나, 활성화 세포 죽음 자극에 대 한 응답에서 시 caspases 핵 (그림 2B)에 이동 하려면 rtTA 자유롭게 DEVD linkers, 다니엘. 일단, 핵에는 rtTA에 바인딩합니다 tet 응답 요소 (TRE) 및 트리거 과도 표현의 Cre recombinase CAG 발기인에 대 한 코딩 시퀀스 사이 정지 codon 카세트를 제거 하는 돌이킬 수 없는 재조합 이벤트에 이르게 빨간 형광 성 단백질 (DsRed)입니다. DsRed (그림 2B), 그들은 그들의 자손 (그림 2C)로 caspase 활동 경험 후 살아 남아 있을 수 있습니다 그 세포의 영구 형광 마커 역할의 영구 식 결과.

포유류 CaspaseTracker 바이오 센서를 테스트 하려면 우리 과도 transfection에 의해 HeLa 세포에 도입, 세포 죽음 자극 (1µM staurosporine)과 세포 치료 및 우리가 시간 경과 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법에 의해 세포의 복구를 모니터링 설명된20. RtTA 활동65,71허용 필수적 이다, doxycycline (1µg/mL 최종 농도), 세포 배양 실험을 통해 바이오 센서에 설정 하에 추가 되었습니다. 세포 죽음 자극에 대 한 응답, 치료 세포는 apoptosis, 세포 수축 등으로 예상된 (그림 2D i-iii) 플라즈마 멤브레인 blebbing의 표시. 세포 죽음 자극을 제거한 후 셀 레이어를 한 번, 그리고 추가 신선한 배양 anastasis rinsing는 정상적인 형태 (그림 2D 4-7 세)에 그들의 반환에 의해 표시 된 죽어가는 세포에서 관찰할 수 있습니다. 진단,만 복구 셀 익스프레스 DsRed 형광 마커 anastasis (그림 2D 4-7 세) 전후 동안 복구 되지 않은 세포 (그림 2D 4-7 세), 그리고 제어 셀에서 그들을 구별 세포 죽음 자극 (그림 2E)에 노출 되지 않습니다. 이 응용 프로그램 및 식별 하 고 영구적으로 caspase 활성화에서 복구 anastatic 셀 라벨 소설 새로운 도구로 포유류 CaspaseTracker의 유틸리티 하 고 추적 하 고 그들의 장기 운명을 연구 하는 방법을 제공 합니다.

감지 하 고 라이브 동물에서 anastasis 추적, CaspaseTracker 바이오 센서 유전자 변형 동물 들은 필요입니다. 따라서, 우리가 먼저 사용 초파리 melanogaster 모델 시스템19, 때문에 그것이 동물 개발 및 인간 질병72,73,74의 연구에 대 한 중요 한 유전으로 그러므로 유기 체 ,75. 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서에서 수정, 초파리 듀얼 바이오 센서 식별 하 고 "최근/에-가"에서 "과거" caspase 활동을 구별할 수 있습니다. 이 듀얼 바이오 센서는 caspase 민감한 Gal419, 그리고 Gal4 기자 G-추적53 (그림 3A)의 구성 됩니다. Caspase 활동 없이 셀에 효 모 녹음 방송 요인 Gal4은 DIAP1에서 파생 된 caspase 쪼갤 링커 (DQVD)를 통해 플라즈마 막 앵커 (mCD8) 도메인에 닿는 곳 (그림 3B), 21NN/GV22 돌연변이 저하를 방지 하는 데 BIR1 도메인77drICE caspase 억제 기능을 폐지 하 고 링커 afterAsp2076, D135R 돌연변이의 caspase 분열 시 N-엔드 규칙에 의해 Gal4의. 테더 Gal4 caspase 그것을 해제 하 여 분열 없이 핵을 이동 수 없습니다, Gal4 기자 G-추적 데 아무 caspase 활동19셀에 비활성 남아 있습니다. 그러나 Caspase 활성화,, 활성화 caspases G 추적 기자 (그림 3A)19를 활성화 하는 핵으로 이동에 Gal4 자유롭게 DQVD 링커를 쪼개 다. 특정에 Gal4 묶는 상류 (caspase) 활동 중지 시퀀스를 트리거 과도 전사 및 RFP의 표현 (UAS) 다음에 Gal4까지 최근 또는 현재 caspase 활동의 형광 기자 역할을 활성화 하 고 RFP 단백질은 다음 저하. 또한 Gal4 핵 타겟팅 GFP (nucGFP)에 대 한 유비퀴틴 (Ubi) 발기인 및 코딩 순서 사이 정지 codon 카세트를 제거 하는 재결합 이벤트로 이어지는 표현의 FLP recombinase는 transgene에서 트리거합니다. 이 nucGFP는 caspase 활동을 경험 하 고 살아 남아 그 셀의 영구 마커 역할의 영구 식에서 결과.

Apoptosis와 anastasis 탐지 하기 위한 초파리 CaspaseTracker 바이오 센서를 테스트 하려면 vivo에서, CaspaseTracker 여성 파리 대상이 됐다 생리 적 스트레스 (그림 3C)와 같은 차가운 충격19, 효율적으로 할 수 있는 트리거 세포 죽음, caspase 활성화, 핵 응축 및 세포 수축19,78및 또한 막 무결성의 손실 및 세포질의 누설을 장난으로 인해 괴로 표시 apoptosis를 포함 하 여 내용55,56 CaspaseTracker은 계란에서 활성화 되지 않은 예상 했던 대로, 챔버 제어 파리의 스트레스와 관련 된 세포 죽음은 되지 않았습니다 유발 (그림 3D). 반면, 스트레스의 계란 약 실 감기 충격 후에 1 일 보여주었다 뿐만 아니라 특성 apoptotic 세포 수축 핵 응축, 하지만 또한 RFP GFP 식, 최근의 존재를 나타내는 또는에-가 (RFP +) 그리고 과거 (GFP +) caspase (그림 3E) 활동입니다. 그러나, 표준 비 스트레스 상태, GFP, 하지만 아무 RFP 스트레스 파리 귀국 후 3 일, 식 복구 된 계란 실 (그림 3 층)에서 발견 되었습니다. 이 caspase 활동 스트레스에 따라 표현 했다 계란 챔버 세포 죽음 과정을 극복 하 고 살아남을 수 있었다 것을 나타냅니다.

추가 테스트 하려면 세포 죽음 과정의 가역 계란 약 실19, CaspaseTracker 여성 파리 3 일 동안 8% 자당 1 %agar 먹이 되 고 후 단백질 기아에 의해 강조 했다. 이전 연구 caspase 중재 apoptosis와 autophagy 체세포와 조직에서 단백질 기아를 실행할 수 있습니다 증명 및 생식 세포, 계란 실57,,6061를 포함 하 여. 예상 했던 대로, CaspaseTracker 단백질 기아 (그림 3)의 3 일 후에 그 실에서 활성화 되었다. 죽어가는 계란 약 실 전시 apoptotic 형태학 및 마커의 RFP 및 GFP 바이오 센서, 최근 또는 온가 나타내는 (RFP +)와 (GFP +) caspase 활동 (그림 3G) 과거 표현. CaspaseTracker 이전 죽음 자극 후 caspase 활성화를 경험 하는 복구 된 셀을 추적할 수 있습니다 입증, 굶 어 파리 다음 정상적인 단백질 포함 된 비행 음식에 옮겨 졌다. 예상 대로,이 다시 먹이 파리의 복구 된 계란 챔버 RFP 과도 caspase 기자, 아니 최근 또는 지속적인 caspase 활동 (그림 3 H)을 나타내는 부족 합니다. 그러나, 이러한 계란 약 실에서 나타내는 GFP caspase 기자 (그림 3 H), 셀 표시 일반 음식에 그들을 반환 하 여 스트레스를 덜어이 파리에서 계란 약 실 후에 시작 된 세포 죽음 과정 반전 했다 caspase 활성화입니다. CaspaseTracker 바이오 센서 활동 caspase에 의해 트리거됩니다 확인 DQVA는 caspase 쪼개 다 수 고는 바이오 센서 활동 (그림 3B, 3I 폐지의 순서와 분열 시퀀스 DQVD를 대체 하 여 얻은 ).

CaspaseTracker 초파리 단백질 기아에서 복구 후 우리는 여러 종류의 달걀 실 체세포 (여 포) 세포 등에서 세포 및 생식 세포 (간호사 전지와 oocytes), GFP, 하지만 하지 RFP (그림 3J 표시 발견 )19, 나타내는 이러한 셀 caspase 활성화 후 anastasis를 받을 수 있습니다. 흥미롭게도,는 GFP는 또한 germarium (그림 3J)19, 동일한 ovariole 체인의 연결된 계란 챔버와 함께 줄기 세포를 포함 하는 셀을 표시. 따라서, 이러한 GFP-긍정적인 달걀 챔버 caspase 활성화 후 세포 죽음 과정에서 회복 줄기 세포에서 파생 된 수 있습니다. 중요 한 것은, 굶 어 하 고 다시 먹이 여성 파리 누워 비옥한 계란 GFP 표현 자손 파리19를 생산할 수 있는 제안 하는 잠재적으로 셀 반대로 세포 죽음 과정 후 caspase 활성화 분명히 정상적인 기능을 되 찾을 수 있다. 미래 연구는 anastasis의 결과로 서 살아 나는 자손 파리 전시 영구 sequelae 경우 확인 필요 합니다.

Figure 1
그림 1 . 헬러의 복구 세포 세포 죽음 유도 후.
(A) 세포 죽음을 유도 하 고 이후 죽어가는 세포 세포 죽음 유도의 제거 후 복구를 허용 하는 접근의 회로도.
(나) 건강 한 HeLa 세포의 (B) 시간 경과 라이브 셀 DIC 현미경 검사 법, 1µM staurosporine (ii)와 함께 치료 후 세포의 동일한 그룹 다음 씻어 고 추가 staurosporine ( 를 제거 하려면 신선한 문화 매체와 인 큐베이 팅 iii-6). 흰색 화살표는 나누어 셀을 나타냅니다.
(C) 회로도 caspase 바이오 센서 융합 단백질 NES DEVD YFP-NLS, 그리고 세포 죽음 유도 및 그 이후 anastasis YFP의 subcellular 지역화.
(D) 시간 경과 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법 노출 3.7%의 에탄올 (2 세 - 3 세), 고 후 시 (나), 전에 caspase 바이오 센서 융합 단백질 NES DEVD YFP NLS를 표현 하는 하나의 헬러 세포의 문화 매체 (4 - 8 세)에서 에탄올을 제거합니다. (녹색 형광, 맨 위 행); caspase 바이오 센서만의 이미지는 여기 표시 된 Hoechst 스테인드 핵 (파란색 형광)와 미토 콘 드리 아 (레드 형광)의 이미지를 병합 (가운데 행), 가운데 행에 이미지 추가 DIC 이미지 (아래쪽 행) 병합. 맨 윗줄에 흰색 화살표 핵 지역화 YFP 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템.
(A) 회로도 caspase 민감한 rtTA의.
(B) 회로도 포유류 CaspaseTracker rtTA 바이오 센서 시스템의.
(C) anastasis 검출을 CaspaseTracker rtTA 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 순서도. 빨간색/노란색 삼각형 (세포 죽음 유도 적용) 그린/블루 (떨어져 세척 유도) 기호는 그림 1A에서.
((나), 전에 포유류 CaspaseTracker rtTA 바이오 센서를 표현 하는 HeLa 세포의 클러스터의 D) 시간 경과 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법 그리고 노출 1µM staurosporine (2 세 - 3 세), 그리고 후에 제거 동안 문화 매체 (4 - 7 세)에서 staurosporine. 병합 된 이미지의 DIC와 DsRed 신호입니다. 화살표 및 2 (녹색) 셀 셀 1 (노란색)를 나타냅니다.
(E) 시간 경과 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법 치료 바이오 센서 표현 HeLa 세포의. 병합 된 이미지의 DIC와 DsRed 신호입니다. 흰색 화살표는 나누어 셀을 나타냅니다.
Doxycycline (1ug/mL) (D) 와 (E)패널에 표시 된 실험을 통해 매체에 존재 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 초파리 CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템입니다. (허가 탕 외., 과학 보고서 2015 년 9: 9015 채택 19 ).
(A) 회로도 초파리 CaspaseTracker Gal4 바이오 센서 시스템의.
(B)는 caspase 구분 (DQVD) 및 caspase 구분 제어 (DQVA)의 회로도 Gal4.
(C) 초파리 난소, 그리고 순서도 1-하루-오래 된 파리, 정상적인 상태에서 3 일 복구 뒤에 세포 죽음 유도 회로도 대런 Obbard에서 제공 하는 초파리 이미지
(D) 대표 confocal 이미지는 여성 바이오 센서의 난소에서 계란 챔버의 6 일 (치료)에 대 한 일반 비행 음식을 먹이.
(감기 충격된 여성 바이오 센서 파리의 난소에서 계란 챔버의 E) 대표 confocal 이미지-7 ° C 1 시간에서 놓이고 (찬 충격, CS) 1 일에 대 한 일반 문화 조건으로 전환.
(F) 같은 차가운 충격된 파리를 제외 하 고 패널 E 3 일 (CS 후 복구)에 대 한 일반 문화 조건에 전환 되었다.
(굶 어 여성 바이오 센서의 난소에서 챔버 비행에 그의 G) 대표 confocal 이미지 3 일간 (Starved) 단백질 없이 한 천 1%에서에서 8% 자당으로 먹인 다.
(H) 같은 치료 파리를 제외 하 고 패널 G 단백질 기아 치료 (다시 먹이) 후 3 일에 대 한 일반 비행 음식에 전환 되었다.
(I) 보여주는 caspase에 에기아 부정적인 제어를 역임 중요 한 CaspaseTracker (DQVA) 여성 바이오 센서 파리를 제외 하 고 G 패널 처럼.
(굶 어 하 고 다시 먹이 여성 초파리에서 계란 챔버 J) 대표 confocal 영상. 화살표는 간호사 셀 (검정), oocytes (흰색)에 여 포 세포 (노란색) 계란 약 실, 그리고 germarium (녹색)에서 표현 하는 핵 GFP를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . Anastasis의 생리, 병 리 및 치료 연루입니다. (채택 하는 허가 탕 외., F1000Res 2017, 6시 43분 21 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

CaspaseTracker 듀얼 바이오 센서 시스템은 소설과 최근의 탐지를 허용 하는 독특한 도구 또는 지속적인 caspase 활동, 세포 죽음을 반대 해야 하는 셀을 추적 하 고 프로세스 caspase 활동에서 vivo에서발생 후 생존. Caspase 활동 apoptosis의 특징으로 전통적으로 생각 되었습니다, 하는 동안 성장 연구 공개 비 apoptotic caspase 활동 신경 활동79, 의 규칙 등의 다양 한 정상적인 세포 기능에 잠재적인 역할을 합니다. 80, 학습 및 메모리81,,8283,84, necroptotic 세포 죽음85,86, spermatid 개별화87의 억제 88,89, 셀 확산90및 세포 운명91패턴화 처리 예측에 관한. Apoptosis와 anastasis, CaspaseTracker 바이오 센서 시스템 따라서 두뇌 및 광 엽, cardia, 창 자, 말 tubules, 기관, 근육, 그리고 의 다른 조직에 존재 하는 비 apoptotic caspase 활동을 검색할 수 있습니다. 초파리19,,4664. 이 바이오 센서 신호 또한 배아 개발 또는이 조직에서 정상 항상성 중 현재 또는 과거 anastatic 활동을 대표할 수 있었다. 살아있는 동물에 죽음 유도 환경 스트레스 과도 셀 후 anastasis를 연구, 그것은 조직 세포는 정상적인 생리 적인 조건 하에서 없습니다 caspase 바이오 센서 활동을 전시 하지만 그 caspase을 유도 될 수 있다를 선택 하는 중요 한 변이 세포 죽음을 유도 하 여 활성화입니다. 왜냐하면 그들은 일반적으로 10 단계로 germarium에서 아무 caspase 활동 oogenesis58,,5992동안 계란 약 실이이 목적에 이상적입니다.

여성 초파리 과도 환경 스트레스에 노출, 단백질 기아와 찬 충격 등 효율적으로 실행할 수 caspase 활성화 및 계란 약 실19,,5758에서 세포 죽음 78. 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 파리에 장기 세포 죽음 유도 피하고 포함 됩니다. 단백질 기아 (3 일 동안 한 천 1%에서에서 8% 자당)와 차가운 충격 (1 시간-7 oC에서) 여성 파리의 최적화 조건 caspase 활성 세포 죽음 과정 계란 약 실에서 수 고 스트레스 파리에 반환 된 후 복구 하도록 허용 표준 상태19. 세포 죽음 자극과 장기간된 치료 세포 죽음 과정에 더 많은 계란 챔버를 실행할 수 있지만 복구 율 또한 감소 된다, 아마도 죽어가는 계란 약 실 경험 수리 넘어 대규모 피해 때문에.

이 프로토콜에 추가 중요 한 단계를 건너, 모금과 CaspaseTracker 등 18 oc. 낮은 온도에서 날아 유지 하 여 계란 약 실에서 CaspaseTracker 배경 신호를 줄일 수 있다 대부분 계란 약 실에서의 최적의 reared 파리 oogenesis58동안 caspase 활동 단계 10 통해 germarium에 표시 되지 않습니다, 그리고 계란 챔버의 약 1%는 세포 죽음 유도19 없이 caspase 바이오 센서 활동 전시 수 있습니다. . 이 타고 난 오류로 인해 정상적인 감손 율을 반영 될 수 있습니다 또는 표준 실험실 조건으로 oogenesis 동안 실수로 발생할 수 있습니다. Gal4 저온93에서 파리에 있는 더 적은 활동을 표시로 파리 18 oC에서 보다는 실내 온도에, 높이 CaspaseTracker 시스템을 활성화 하는 내 생 적인 신호를 줄일 수 있습니다. 또는, 29 oC와 같은 더 높은 온도에 파리를 스위칭 증가할 수 있다 CaspaseTracker 시스템의 감도 인해 Gal4 활동93및 잠재적으로 다른 내 생 온도 의존 효소 증가 활동입니다.

그것은 세포 죽음 과정 또는 비 apoptotic caspase 활동을 전시 하는 셀에서 anastasis 받을 CaspaseTracker-긍정적인 세포를 구별 하는 것이 중요. Apoptotic 세포 표현 RFP (-또는 최근 caspase 활동에 대 한 과도 표식), apoptosis 유도의 처리에서 자주 GFP (과거 caspase 활동에 대 한 영구 메이커)로 세포 죽어이 지속적인 caspase 활동 그 쪼개 활성화 Gal4 다음 활성화 변이 (Gal4 활동 종속 RFP) 및 영구 (Gal4 트리거 FLPase FRT GFP 중재) G-추적 시스템의 기자. 이러한 세포의 Apoptosis 형태학 및 생화학 증 같은 미국 핵 응축 핵 염료14,,1958와 얼룩에 의해 검출 및 caspase 분열에 의해 감지에 의해 확인 될 수 있다 immunostaining19,94 이미 anastasis 받은 셀 G-추적 시스템의 FLPase 중재 재결합 이벤트로 인해 영구 GFP 식을 표시 합니다. 이 세포 들은 아니 온가 caspase 활동도 apoptosis19의 다른 특징 아니 RFP를 표현 한다. 이 세포는 또한 정상적인 핵 형태학을 표시합니다. 셀에-가 아닌 apoptotic caspase 활동을 자주 RFP 및 GFP 식 표시 하 고 또한 정상적인 핵 형태학19있다.

Anastasis 했다 비 apoptotic caspase 활동, 과거 모두만 GFP를 표시 하 고 세포 죽음의 아무 특징을가지고 있기 때문에 그 세포에서 발생 하는 셀을 구별 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서, 주의 제어 실험 포함된19이어야 합니다. 예를 들면, anastasis 계란 약 실에서 공부를 필수적 이다 GFP 식 강조 복구 파리에 비 강조 했다 파리 (부정적인 제어)을 검사 하. Anastasis caspase 활성화 후 발생 하는 경우 복구 된 파리 강세 파리 보다 더 많은 표현 하는 GFP 셀을 표시 합니다. 그것은 또한 일반적인 자동-형광, 표 피, 안료, 및 지방 기관19에서 관찰로에서 CaspaseTracker 형광 신호를 구별 하는 것이 중요. 부정적인 통제 바이오 센서 파리 caspase 분열 사이트 비 쪼갤 시퀀스 (DQVA)에 바이오 센서 (DQVD)의 변경 및 그로 인하여 제어 바이오 센서 응답 caspase 활동19렌더링 하 여 생성 되었습니다. 신호는 caspase 민감한 (DQVD)에서 발견 하지만 부정적인 컨트롤 (DQVA) 바이오 센서 파리에 자동 형광 보다는 caspase 활동에 의해 발생 하는 관심의 신호.

우리의 현재 초파리 듀얼 CaspaseTracker 바이오 센서는 "최근" caspase 활동, RFP의 식에 의해 셀과 셀 "과거" caspase 활동 GFP19의 표현에 의해 식별할 수 있습니다. 우리 주의 RFP "실시간" caspase 활동 표시기 아니다 Gal4 표현의 RFP caspase 활동에 대 한 응답에서을 운전에 대 한 반응 시간 몇 시간 때문에. "실시간으로" 기능을 추가 하려면 초파리 CaspaseTracker 바이오 센서 결합 될 수 있다 최근에 개발 된 iCasper 바이오 센서52, "실시간"는 및 "어두운 밝은" vivo에서 바이오 센서만 때 빨강 신호를 보여줍니다 caspases에 의해 죽 습.

Apoptosis, 떨어져 CaspaseTracker 수로 세포를 직접 또는 간접적으로 포함 후 autophagy 같은 caspase 활성화 과정 동안 세포 죽음 통로 전환할 수 있습니다 또한 다른 유형의 세포 죽음 동안 활성화 될 기아95,96, 찬 충격 유도 플라즈마 막 파열19,,5556,78, staurosporine 유도 necroptosis97에 의해 괴 사 98. 우리의 현재와 이전 연구 시연 CaspaseTracker 바이오 센서 셀이 셀 죽음 inductions 생체 외에서 또는 vivo에서17,,1819 에서 복구 레이블 수 있습니다. , 20 , 21. 이러한 세포 죽음 inductions 혼자 같은 셀에 여러 세포 죽음 통로 활성화 동시에 수로 죽어가는 세포의 복구는 anastasis은 다른 세포 죽음을 되돌릴 수는 일반 셀 복구 현상 제안 개별적으로 또는 동시에 apoptosis, autophagy, 괴 사, necroptosis를 포함 하 여 처리합니다.

vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서는 아직 알 수 없는 기능, 메커니즘 및 anastasis (그림 4)21의 치료 적 의미의 추구를 촉진 한다. Anastasis의 분자 서명 공개, 에탄올 유도 된 apoptosis의 반전 동안 마우스 기본 간 세포를 분석 하에 눈에 띄는 변화를 발견 흥미롭게도, 시간 코스 전체 게놈 유전자 표현 microarray 연구 수행 프로 생존, 항 산화, DNA 손상 응답, 히스톤 수정, 신생, 세포 마이그레이션 및 변환18,21을 포함 하 여 여러 경로에 관련 된 유전자의 전사 이 apoptosis18,21, 인간 간 암 HepG2 세포의 복구의 우리의 유효성 검사 연구 및 또한 헬러 세포 apoptosis99의 복구의 최근 독립적인 RNA 시퀀싱 연구에 의해 지원 됩니다. 흥미롭게도, anastatic 세포에서 발견 일부 프로 생존 요인의 업 규제도 심장 마비 반전, 종양의 진행, 및 암 재발100,,-101102, 관찰 된다 제안 anastasis의 잠재적인 참여입니다. Anastasis의 생리, 병 리 및 치료 잠재력을 공부,이 기계 및 치료 연구를 활성화 것 이다 anastatic 셀을 식별 하 고 추적 하는 작은 동물, 그들의 운명에 중요 하다. 우리의 초파리 와 포유류 CaspaseTracker 바이오 센서 정상적인 발달, 항상성, 조직 복구, 종양 진화, 암 재발 및 전이에 anastasis의 잠재적인 기여를 테스트 하기 위한 유용한 도구가 될 것입니다. 이러한 연구에서 찾는 anastasis의 자연적인 역할에 대 한 우리의 이해를 증가 하 고 세포 죽음과 anastasis 통제를 통해 생존을 중재 하 여 다루기 힘든 질병에 대 한 혁명적인 새로운 치료 접근을 식별 하는 가능성을 제공.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 초파리 이미지 그림 3C와 비디오 원고;에 감사 대런 Obbard J. 마리 하드 윅, 웨이드 깁슨, 그리고 가치에 대 한 내용은이 원고 헤더 M. 양고기. 이 작품으로는 선생님 에드워드 Youde 기념 친교 (H.L.T.), 박사 월터 Szeto 기념 장학금 (H.L.T.) 지원 되었다 풀브라이트 생명 과학 연구 재단 친교 (H.L.T.), 및 NCI K22 부여 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), 부여 합니다. 호 람 탕 Shurl 및 생명 과학 연구 재단 (2014-2017)의 케이 Curci 재단 연구원 이었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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의학 문제점 132 Anastasis apoptosis autophagy 바이오 센서 caspase CaspaseTracker 괴 사 necroptosis 프로그램 된 세포 죽음 apoptosis의 반전
Anastasis에서 <em>Vivo에서</em> CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지
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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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