Protocol
Todos los experimentos con renacuajos Xenopus laevis se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité de Ética Universidad de Göttingen en la experimentación con animales.
1. La electroporación
- Elija animales de etapas 49-54 de acuerdo con Nieuwkoop y Faber 7.
- Asegúrese de que la configuración de la grabación consiste en un estereomicroscopio con una gran distancia de trabajo y un dispositivo de electroporación que puede aplicar impulsos de tensión de 20 V durante 20 mseg a una frecuencia de al menos 2 Hz. Aplicar los impulsos de tensión a través de dos electrodos de platino con un diámetro aproximado de 200 micras de modo que puedan ser insertados en las fosas nasales de los renacuajos sin causar daños.
- Preparar cristales de un colorante conjugado de dextrano (por ejemplo, calcio verde 10 kDa de dextrano, o Alexa Fluor 647 10 kDa de dextrano) por disolución de la cantidad típicamente entregado de 5 mg en aproximadamente 100 l de agua destilada y dejar que pequeñas gotitas de2 l seco en una hoja de Parafilm.
Nota: Los cristales se secan en menos de un día y se pueden almacenar después a -18 ° C en el congelador durante un período de más de un año. - Anestesiar a los animales por su inclusión en el agua del grifo que contiene 3% tricaína sulfonato de metano durante 1-2 minutos hasta que se alcanza el estado de anestesia quirúrgica caracteriza por la disminución de la frecuencia cardíaca, la pérdida de todos los movimientos y la falta de respuestas a estímulos mecánicos.
- Sumergir el animal anestesiado durante 10 segundos en agua corriente pura.
- Colocar el animal sobre un cojín de gel y fijarlo mediante la colocación de agujas alrededor de ella sin dañarla.
Nota: coloque el animal por meter las agujas a través de su piel. - secar suavemente la zona que rodea las ventanas de la nariz con un pañuelo de papel.
- Colocar el animal bajo el microscopio estereoscópico y se centran en las fosas nasales.
- El uso de fórceps para recoger un cristal de tinte de juego del tamaño del orificio de la fosa nasal, colocarlo en una de las cavidades nasales y esperar hasta que se disuelva por completo, which tarda menos de 1 min. Si los cristales son más pequeños, añadir 2 o 3 en cada cavidad hasta que producen una solución de alta concentrado no translúcido.
- Coloque el cátodo en la piel del renacuajo y el ánodo en una de las ventanas de la nariz.
Nota: esta configuración particular, se aplica a los colorantes citados en el paso 1.3. Para colorantes con una polaridad diferente, los resultados de la tinción se pueden mejorar mediante la colocación del cátodo en las fosas nasales. Si no está seguro acerca de la polaridad del colorante, ambos electrodos se pueden colocar simultáneamente en las fosas nasales (una por cada fosa nasal), y la polaridad alternó entre pulsos individuales de tensión. - Aplicarse a los seis pulsos de 20 V y 20 ms, con aproximadamente 0,5 segundos de intervalo de estímulo.
Nota: Las pequeñas burbujas deben aparecer alrededor del electrodo en la fosa nasal durante la electroporación siempre que los electrodos están en contacto con la piel y la solución en la fosa nasal. Si no se ven burbujas comprobar los cables de conexión y asegúrese de que la electroporación de DevicE está entregando el pulso de voltaje deseado. - Repetir el procedimiento (01.09 a 01.11) para la segunda fosa nasal.
- Transferir el renacuajo electroporación en un vaso de precipitados lleno con agua del grifo a temperatura ambiente. Espere de 5 a 10 minutos hasta que el animal recupera la consciencia, quedando a la natación. Alimentarlo y dejar que se recupere durante al menos 1 día durante el cual el colorante se transporta a lo largo del nervio olfativo al bulbo olfativo.
- Usa los animales a electroporación el plazo de 1-7 días después de la electroporación de los mejores resultados de imagen. Dar por lo menos 24 horas de tiempo para el transporte de tinte y la recuperación antes de exponer.
2. Todo el montaje Preparación
- Anestesiar al animal en el agua del grifo que contiene 3% Tricaína metansulfonato hasta que todos los movimientos se han detenido y ya no responde a los estímulos mecánicos.
- Transferir el renacuajo a un cojín de gel bajo un estereomicroscopio y fijarla firmemente por meter agujas a través de la piel a cada lado de la forebrain.
- Sacrificar el renacuajo por la ruptura de su médula espinal.
- Utilice un bisturí para diseccionar un bloque de tejido que contiene ambas cavidades nasales, los nervios olfatorios y bulbos olfativos (Figura 1A). Hacer la primera incisión cerca de la fosa nasal izquierda, sin tocarlo, y mover la cuchilla de corte hacia adelante junto con el nervio olfativo y bulbo izquierda hasta la frontera telencephalic-diencefálico. Hacer lo mismo en el lado derecho. Aislar la preparación del resto del sistema nervioso haciendo una posterior corte final para el telencéfalo.
- Deshacerse del cuerpo del renacuajo y voltear con cuidado el bloque de tejido boca abajo para que la parte ventral del cerebro preparación orientada hacia arriba.
- Pin el bloque de tejido de nuevo mediante la inserción de dos agujas entre los nervios olfativos.
- Ponga una gota de solución de Ringer Rana (98 mM NaCl, KCl 2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 2 mM, glucosa 5 mM, 5 mM Na-piruvato, HEPES 10 mM, ajustado a pH 7,8, osmoladad de 230 mOsmol / L) en el tejido.
- Retire las meninges que cubren la zona de clasificación axón y los bulbos olfatorios al hacer tres incisiones con unas tijeras finas. Comenzando desde el borde posterior del bloque de tejido, corte caudorostrally estrechamente a lo largo del bulbo olfativo a la izquierda hasta el punto de entrada de los nervios olfativos en los bulbos (la zona de clasificación axón).
- Repita el paso 2.8 para el hemisferio derecho.
- Levante las meninges con fórceps y hacer que el tercer corte, perpendicular a los anteriores en la zona de clasificación axón.
Nota: El lado ventral del bulbo olfatorio es ahora accesible para formación de imágenes y la carga de bolo. - Para mejorar la calidad de imagen en la imagen de luz transmitida, repita el procedimiento para el lado dorsal. Estos pasos adicionales pueden facilitar la navegación de la micropipeta para la carga de bolo, pero no son estrictamente necesarios.
- Transferir la muestra a una cámara de registro lleno de la rana de timbre para su posterior procesamiento y de imagen. Haceure que el lado ventral se enfrenta hacia arriba y segura de la muestra con una red de fibras de nylon se extendió sobre un marco de platino pequeña.
- Para una aplicación más fácil de estímulos colocar las cavidades nasales en la parte superior de una de las fibras de nylon.
3. bolo de carga
- Disolver 50 g del colorante AM de calcio (por ejemplo, Fluo-8 AM) en 20 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contienen 20% de Pluronic F-127 (w / v) para preparar una solución madre de colorante AM. Congelar las soluciones madre en pequeñas alícuotas de 1-2 l de volumen. La solución madre es estable durante al menos medio año, pero evitar los ciclos de congelación y descongelación.
- Use un extractor de micropipeta y tire de pipetas con una resistencia de 5-8 mO y un diámetro de punta de 1-2 micras.
- Disolver la solución madre preparada del colorante en la solución de la rana de Ringer a una concentración de 250 a 500 mM.
- Añadir MK571 para alcanzar una concentración de 500 mM para bloquear los transportadores de resistencia a múltiples fármacos.
- Llene la micropipeta con 10 l de la solución utilizando una punta de pipeta alargada y eliminar todas las burbujas de aire con un movimiento rápido de la micropipeta.
- Montar la micropipeta en el soporte de la pipeta y asegurarse de que la presión se puede aplicar de forma manual con una jeringa o un dispositivo de eyección de drogas neumático y monitorear la presión aplicada con un indicador.
- Si es posible, utilice una configuración de microscopio con la capacidad para excitar el medio de contraste inyectado de manera que el flujo de salida de la punta de la micropipeta se puede visualizar y ajustar nuevamente. Lo ideal es utilizar una configuración de imagen confocal. Utilice un microscopio vertical con un objetivo de inmersión para que el tejido se puede llegar con la micropipeta.
- Coloque la preparación entera de montaje bajo el microscopio, siga el nervio olfativo hasta la bombilla y se centran en el área de interés en el bulbo olfatorio.
- Perfundir solución de Ringer fresco a través de la cámara de registro con el fin de aumentar la viabilidad de la preparación y lavar la filtración colorantedesde la punta de la micropipeta.
- Bajar la pipeta sobre la superficie del bulbo olfatorio, con la punta señalando en la dirección rostral de la preparación.
- Aplicar una pequeña y constante presión positiva (~ 25 hPa) a la micropipeta para evitar la obstrucción de la pipeta y suavemente insertarla en el tejido.
- Una vez que la pipeta ha incumplido las capas de tejido exteriores, moverlo en una dirección rostro-dorsal en la capa de células mitrales. (Tenga en cuenta que un contador de tinción de las neuronas olfativas del receptor mediante electroporación es útil para ajustar la posición de la micropipeta.) Lo ideal es colocar la punta de la pipeta a una distancia de 50-100 micras desde el sitio de grabación deseado.
- Para la tinción de la sensible a la temperatura γ-glomérulo, el objetivo de un área de aproximadamente 50 micras rostral de la posición de la neuropil presináptica de la γ-glomérulo.
- Aplicar una presión positiva en el rango de 100 a 200 hPa. Ajuste la resistencia a la presión en función del tamaño dela punta de la micropipeta. Confirmar la salida de la pipeta mirando para los movimientos de tejidos ligeros visibles bajo iluminación luz brillante cuando se aplica presión por primera vez.
- Mantener una presión constante durante aproximadamente 10 min mientras que la micropipeta permanece en el tejido. Si es posible, compruebe el neurópila mientras tanto para la carga de células bajo iluminación fluorescente como la carga con éxito dará lugar a manchas visibles cuerpos celulares de células con el aumento de intensidad con el tiempo.
Nota: A menudo, la razón de la carga que pierda el taponamiento pipeta debido al tejido de entrar en la punta o racimos de tinte agregados. A veces es posible rescatar la pipeta rompiendo suavemente la punta contra la superficie inferior de la cámara de grabación. Sin embargo, la punta de la pipeta no debe exceder de unos pocos micrómetros. Compensar las aberturas de pipeta más grandes mediante la aplicación de presión más baja durante la carga de bolo. - Después de los 10 min de carga, reducir la presión aplicada a cero y comprobar la tinción.
Nota: El tamaño de la zona manchada varía significativamente y depende de varios parámetros como la cantidad de colorante y la ubicación del sitio de eyección inyectado. Una buena tinción cubre un área de aproximadamente 100 micras x 100 micras. - Si el área manchada es demasiado pequeño o no cubre el sitio de grabación deseado, repita los pasos 3.10 a 3.13. Utilice la misma micropipeta para la siguiente inyección si todavía no se ha obstruido.
- Espere al menos 30 minutos después de la última inyección antes de iniciar cualquier experimento para permitir la absorción de colorante y desesterificación. Continuar para perfundir la cámara de grabación con solución de Ringer fresca en todo momento.
4. Configuración de Medición
- Asegúrese de que la configuración de la medición consiste en un microscopio confocal con suficiente velocidad para grabar tres volúmenes tridimensionales. Elija una velocidad de adquisición de al menos 1 Hz por pila.
Nota: Las configuraciones adecuadas incluyen, por ejemplo, microscopios línea de iluminación de la línea de exploración a gota de la muestra en lugar de punto por pmixto. Un simple realización de una configuración tal se ha descrito anteriormente 6. Otras opciones están girando microscopios de disco. Si no hay tal configuración está disponible, todavía es posible medir las áreas más pequeñas con una configuración normal de punto de exploración. - Establecer los parámetros de medición de manera que se pueda tapar un volumen lo suficientemente grande como para ajustarse al tamaño de un glomérulo.
Nota: El espesor típico de un volumen de grabación está en el intervalo de 20 micras que debe ser cubierta por al menos 5 capas. - Compruebe todas las mediciones presináptica para el blanqueo. Ajustar la potencia del láser hasta que la intensidad media de fluorescencia de las imágenes grabadas no cae en el curso de tiempo de la grabación.
- Limitar el tiempo de medición y el área para las grabaciones en el lado postsináptico para evitar la decoloración tanto como sea posible, aunque para las mediciones superiores a 20-30 blanqueo sec es probable que ocurra.
5. Aplicación de olor y los experimentos de temperatura
- verter 25ml de solución de Ringer fresco (previamente almacenado a 4 ° C) en un tubo de 50 ml. Colocar el tubo en un cubo de hielo.
- Controlar la temperatura de la Ringer enfriada mediante la inserción de la sonda limpia de un termómetro en el tubo. Espere hasta que la temperatura cae por debajo de 1 ° C antes de comenzar el experimento.
- Preparar 50 ml de L-histidina disuelta en solución de Ringer a una concentración de 10 mM.
- Utilice un aplicador de embudo 8 o sistemas de aplicación similares que permiten la entrega de estímulo de forma concomitante a la Ringer perfusión de manera que el flujo de agua en la cámara se mantiene constante e ininterrumpida durante la liberación de la solución de estímulo. Colocar el embudo de tal manera que la salida distal es inferior a 1 mm de distancia del epitelio olfativo.
- Colocar un sensor de temperatura NiCr-Ni conectada a un termómetro digital de cerca al epitelio y la salida del aplicador embudo. Conectar el puerto de salida termómetro a un ordenador para grabar y visualmente disjugar a las variaciones de tensión que reflejan las pequeñas fluctuaciones de temperatura.
- Antes de iniciar el experimento, conectar otro termosensor a un termómetro estándar para establecer el factor de escala de voltaje a la temperatura.
- Encuesta de la temperatura del baño en la cámara de registro y asegurarse de que no sea superior a 22 ° C.
- Iniciar la adquisición de la imagen y aplicar secuencialmente 200-400 l de frío Ringer, L-histidina y Ringer a temperatura ambiente (20-22 ° C) a través de una pipeta electrónica con un intervalo inter de 20 a 30 seg. Para un mejor control de la aplicación del estímulo, suelte el estímulo con una señal de disparo enviada por la configuración de imagen elegido para la pipeta si es posible. Repita el protocolo de aplicación para obtener resultados reproducibles.
- Tome conjuntos de grabaciones más largas con varias rondas de estimulación, ya que son preferibles para el análisis posterior a la formación de imágenes con las imágenes de la actividad de correlación.
Nota: Un compromiso entre el tiempo de grabación y la viabilidad rebanada tienepara ser encontrado. Las mediciones de aproximadamente 2 min cubren 6 aplicaciones de estímulo proporcionan una actividad suficiente para una buena reconstrucción de la red.
6. Procesamiento de Imágenes Uso de la actividad de imágenes Correlación (ACI)
- Procesamiento de imágenes de las grabaciones pre-sinápticos
- En grabaciones con la estimulación por frío solución de Ringer y la histidina, distinguir el sensible a la temperatura γ-neurópila de la vecina glomérulo histidina sensible por sus diferentes perfiles de respuesta (véase Kludt et al. 5).
- Crear una proyección de intensidad máxima en la dirección axial de las grabaciones de la preparación del cerebro en la que se han ORNs a electroporación con dos colorantes diferentes para visualizar la inervación bilateral de la γ-glomérulo.
- Procesamiento de imágenes de las grabaciones post-sinápticos Utilizando imágenes de Actividad de correlación (ACI)
- Seleccione grabaciones con puntos de tiempo suficiente (más de 100 marcos) y una buena cantidad de actividad (por lo menos dos eventos).
Nota: La actividad puede ser o bien espontánea para revelar los procesos de las células mitrales individuales o inducida por varias aplicaciones de estímulos durante la misma grabación para revelar las redes celulares activados por los estímulos olfativos. - Elija grabaciones donde las estructuras medidos se mueven no más de 2-3 píxeles en el curso de tiempo de la grabación.
Nota: Las grabaciones con demasiado movimiento pueden ser rescatados mediante la aplicación de un procedimiento de corrección de desviaciones se describe en Kludt et al 5. - Compruebe si las grabaciones sufren de blanqueo. Si la intensidad media de toda la imagen cae sobre el curso de tiempo de la grabación, la corrección de blanqueo es necesario, de lo contrario omitir los dos pasos siguientes.
- Calcular la tendencia lineal de la curva del tiempo de cada píxel mediante la realización de una regresión lineal.
- Restar el resultado de cada píxel individual para eliminar el Componen linealt del blanqueo.
Nota: Como alternativa apropiado Legendre se puede utilizar como se describe por Bao y Schild 9. - Descargar el script de MATLAB listos para usar junto con una guía paso a paso para obtener imágenes de la actividad de correlación (ACI) como se describe por Junek et al. 6
Nota: Siga los pasos descritos en Junek et al 6, como alternativa al uso de la secuencia de comandos de MATLAB proporcionado.. - Mueva los archivos 'aci.m', 'matVis.m' y 'aci_roiSelector.m' desde el contenedor descargado a la ruta de MATLAB del sistema utilizado para la evaluación de datos.
- Cargar los datos en bruto adquiridos en el paso 5.8 como una variable de espacio de trabajo de usuario de MATLAB organizada como una -matrix [x, y, z, t] con x e y en referencia a las dimensiones laterales, z, la dirección axial y t, el curso temporal .
- Call 'aci' desde la línea de comandos de MATLAB.
- En la interfaz de usuario (UI)que aparece, seleccione "Preparar datos", a continuación, seleccione la variable que contiene los datos y un directorio en el que se guardarán los resultados.
Nota: Para obtener una descripción completa de la interfaz de usuario consulte el manual que acompaña a la secuencia de comandos de ACI. - Desplazarse a través de las capas z-medidos moviendo el deslizador correspondiente en la interfaz de usuario para obtener una visión general del mapa se muestra la varianza.
- Introduzca el tamaño de la región de interés (ROI) en la interfaz de usuario. Para un soma celular mitral ajustar la ROI para abarcar aproximadamente 10 micras en el lateral y 5 micras en la dirección axial. Para un glomérulo, los valores ligeramente más altos de 20 micras lateralmente y 10 micras axialmente son apropiados.
Nota: El tamaño ROI tiene que ser introducido como un número de píxeles, que depende de la escala de pixel elegido para la grabación. - Seleccionar un retorno de la inversión que contiene el γ-glomérulo y regiones adicionales para cada soma visible de las células mitrales de los alrededores haciendo clic con el botón central del ratón sobre el center de la célula / glomérulo.
- Cierre la interfaz de usuario principal que desencadena el cálculo de la correlación de los mapas de todos los rastros de referencia. El resultado se guarda y se muestra automáticamente.
- Seleccione grabaciones con puntos de tiempo suficiente (más de 100 marcos) y una buena cantidad de actividad (por lo menos dos eventos).
Representative Results
La electroporación de las neuronas olfativas del receptor (NRO) se logró con colorantes Alexa Fluor o indicadores de calcio conjugados con moléculas de dextrano para el etiquetado anterógrada a través del transporte axonal activo. Mientras que el primero colorantes proporcionan una tinción brillante de las neuronas sensoriales y sus terminales de los axones de ramificación en la capa glomerular del bulbo, este último permitir la medición de la actividad neuronal en estas células (figuras 1 y 2). En primer lugar, la posición de la termosensible γ-glomérulo y su patrón de inervación se visualizó mediante electroporación Alexa Fluor 647 dextrano y Alexa Fluor 546 de dextrano en el epitelio olfativo izquierda y derecha, respectivamente (Figura 1A). Veinticuatro horas después del procedimiento, los ORNs en las fosas nasales, los dos nervios olfativos y los glomérulos en ambos hemisferios eran visibles bajo microscopía fluorescente. Los diferentes grupos glomerulares fueron identifiable por sus respectivas posiciones, en particular el pequeño grupo que comprende la γ-glomérulo (Figura 1B). Un pequeño número de fibras olfativas contralateral corrió a través del bulbo olfatorio contralateral, cruzó la comisura anterior y terminado en el mismo lado γ-glomérulo (Figura 2A).
Con el fin de registrar las respuestas de calcio de las fibras presinápticas de la γ-glomérulo, calcio verde dextrano se sometió a electroporación en ORNs, de acuerdo con el mismo procedimiento. saltos de temperatura negativos fueron inducidos en la ventana de la nariz a través de la liberación controlada de solución de Ringer enfriada con hielo (0-1 ° C). Un volumen 3D que comprende la γ-glomérulo fue fotografiada con un microscopio confocal línea de iluminación-rápido. Delta TS de -1 ° C fueron suficientes para desencadenar respuestas frías en la γ-glomérulo y sus aferentes, reconocibles como picos reversible en el Delta F / F de Ca2 + trazas (Figura 2B </ strong>, C).
Otras medidas experimentales se llevaron a cabo para medir la actividad inducida por el frío en las células mitrales conectados a la γ-glomérulo a través de sus terminaciones dendríticas ramificadas. Estas fibras postsinápticas y el neurópila rodea se tiñeron con eficacia por la carga de bolo del colorante sensible al calcio Fluo-8 de la mañana, llevaron a cabo pocos días después de Alexa 647 dextrano había sido electroporación en NRO (Figura 3A, B). células mitrales se llenaron con Fluo-08 a.m., y el epitelio olfativo se estimularon dos veces de acuerdo con el siguiente paradigma: Ringer frío, histidina (10 mM) y a temperatura ambiente Ringer, aplicados posteriormente. Dos rastros de referencia se tomaron de las regiones de interés en el volumen registrado, una de responder exclusivamente a temperatura baja, el otro, a histidina solamente. Actividad de formación de imágenes de correlación (ACI) 6 se calcula en base a la referencia seleccionadatraza de visualizar con alto contraste en la morfología dendrítica de las redes postsinápticos correspondientes ya sea a la temperatura o la señal de Ca2 + histidina-sensible (Figura 3C, D). Finalmente, mapas termosensibles y sensibles a la quimioterapia eran un código de colores y superpuestos uno encima del otro, que muestra cómo la temperatura y la información química se transporta desde los glomérulos individuales a las neuronas de segundo orden olfativas (Figura 3E). Para una descripción de la integración y el procesamiento de los dos tipos de información en redes de olfativas compartidas, consulte Kludt et al. 5
Figura 1: Visión general de la electroporación ORN y el bolo de carga (A) neuronas olfativas del receptor en ambas cavidades nasales de X.. laevis larvas se sometieron a electroporación con colorantes Alexa o Calciucolorantes-m sensible acoplados a moléculas de dextrano. Los indicadores fluorescentes fueron transportados anterogradely hasta que la arborización axonal terminal. 24 horas después de la electroporación, la capa glomerular en ambos hemisferios mostró tinción fluorescente. (B) Representación esquemática de la organización celular del bulbo olfatorio en un hemisferio. La capa glomerular se extiende por la bombilla en grupos: los grupos mediales, pequeños, intermedios y laterales. La información olfativa se transfiere de las neuronas receptoras mitral células a través de las sinapsis excitadoras en glomérulos. células periglomerular y células granulares son neuronas inhibitorias que modulan el procesamiento olfativo y codificación. El γ-glomérulo (cian) se identificó fácilmente como la pequeña neuropil donde ipsilateral (rojo) y fibras olfativas contralaterales (naranja) se fusionaron. (C) de carga de bolo se logró en el entorno de la γ-glomérulo para teñir el neuropilo post-sináptica que consiste principalmente de células mitrales y su dendritic árboles de ramificación considerablemente en la capa glomerular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La electroporación de ORNs revela la conectividad estructural y funcional (A) inervación bilateral de la γ-glomérulo por ipsilateral (verde) y contralaterales (rojo), las neuronas olfativas del receptor (ORNs).. Barra de escala = 50 micras. (B) El bulbo olfatorio después de la electroporación con el calcio colorante sensible al calcio verde dextrano. El intermedial (IMC), medial (MC) y el pequeño grupo (SC) son visibles. La imagen es una proyección máxima de volumen de medición micras de espesor 100. Barra de escala = 50 micras. (C) Vista de primer plano del pequeño grupo. El volumen registrado (12 micras) esrepresentado en una proyección máxima. La imagen representa el nivel de fluorescencia basal en el mapa gris y el código de colores? F / F como una superposición. La respuesta máxima a la estimulación con solución de Ringer frío se representa. El γ-glomérulo reaccionó fuertemente, mientras que los dos glomérulos vecinos permanecen en silencio. El recuadro muestra la traza Delta F / F para la γ-glomérulo correspondiente a la región indicada de interés. La barra azul representa la aplicación de estímulos. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Bolo de carga y ACI se disocian termosensible y redes sensibles a la quimioterapia (A) Los axones de la NRO que terminan en el pequeño grupo se tiñeron mediante electroporación con el no-calcium colorante sensible Alexa 647 dextrano. La línea punteada describe la γ-glomérulo. (B) Imagen de la misma región que en (A) en el segundo canal de medición después de la carga de bolo con el colorante sensible al calcio Fluo-08 a.m.. Algunos cuerpos celulares de células mitrales eran visibles, pero el contraste era limitado. Siguiendo las flechas, dos trazas de respuesta se representaron gráficamente, que se utilizaron para obtener imágenes de la actividad de correlación (ACI). Azul, rojo y negro bares por debajo de los restos representan el inicio de la aplicación de Ringer frío, histidina (10 mM) y la temperatura ambiente en dos colores como control negativo, respectivamente. Los dos Ca 2 + trazas fueron tomadas de diferentes regiones de interés del volumen medido. (C) El resultado de la traza de ACI en (B) destacando las áreas que responden predominantemente a Ringer frío. (D) El resultado de la traza de ACI en (B) destacando las áreas que responden predominantemente a la histidina. (E) Superposición de los dos mapas de ACI. células mitrales que responden a histidine y el glomérulo inervado (rojo) eran fácilmente distinguibles de las células mitrales termosensibles y la γ-glomérulo (cian). Todas las imágenes de esta figura son proyecciones de máxima intensidad de un volumen de 28 micras de espesor. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los métodos presentados en este documento tienen por objeto el procesamiento de registro de la temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis renacuajos. Las manchas de protocolo primeras y las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio y proporciona una preparación de la muestra en la que el sistema olfativo sigue siendo fundamentalmente intacta. Por lo tanto, la activación de la γ-glomérulo sensible a la temperatura se puede controlar y se compara con sus vecinos glomérulos quimio-sensible. La inervación bilateral única de este glomérulo se visualiza mediante la electroporación de células con espectralmente diferentes colorantes. Además, la carga de bolo permite la tinción de las células mitrales que abarcan un gran volumen dentro del bulbo olfatorio. Las señales inducidas por la temperatura de procesamiento de la red neuronal se revela mediante la adopción de medidas de estímulo de calcio con aplicaciones repetidas y, posteriormente, el análisis de los datos de imagen con la actividad de correlación.
El protocolo se destacan dos sofisticada proce tinción mientos, los cuales requieren la manipulación y la práctica prudente con el fin de lograr resultados satisfactorios y reproducibles. Durante la electroporación cualquier lesión de los animales se tiene que evitar, sobre todo cuando la colocación de los electrodos en las fosas nasales. De manera óptima, debe producirse ningún contacto con el epitelio olfativo. Tenga en cuenta que los animales siguen viviendo después del procedimiento de electroporación y su tiempo de recuperación deben tenerse en cuenta. Si la tinción sigue siendo demasiado débil después de una ronda de electroporación, que puede suceder dependiendo de los tipos de tintes utilizados, su intensidad puede ser mejorada mediante el aumento de la concentración de colorante en las fosas nasales. Dado que las moléculas de dextrano acoplado se transportan a través de varios mecanismos, incluyendo el transporte axonal lenta (a una velocidad de 1 a 2 mm / día 10) y difusión pasiva, otra alternativa es esperar 48 horas después de la electroporación antes de sacrificar los animales. Alternativamente, la electroporación se puede repetir después de un día de recuperación.
jove_content "> carga bolo es un paso crítico ya que la cantidad de colorante entrar en las células mitrales es difícil de regular y depende de varios parámetros como el tamaño de la punta de la pipeta y la ubicación de la aplicación. Seguimiento del procedimiento bajo un microscopio de fluorescencia confocal demuestra ser útil para el ajuste de la duración de la aplicación de colorante y por lo tanto la generación de resultados de tinción similares a través de las preparaciones. Además, renacuajos previamente electroporadas se deben utilizar para determinar la mejor posición para la aplicación de colorante mediante la identificación de la posición del pequeño grupo (que comprende la γ-glomérulo). la mayoría paso crítico durante las mediciones es evitar tanto cambio y el blanqueo de la muestra. el cambio se puede evitar colocando cuidadosamente el flujo de dos colores en el microscopio. en cuanto a limitar el blanqueo de la zona de interés, el tiempo de medición se debe reducir a lo esencial .Bolus tinción de carga con colorantes sensibles al calcio sólo proporciona muycontraste limitado, ya que las células sanas generalmente tienen niveles bajos de calcio y por lo tanto muestran la fluorescencia basal débil. La aplicación de imágenes de actividad correlación elude esta limitación mediante la generación de contraste basado en estructuras de actividad y se destacan con señales de calcio similares. Este método de análisis post-adquisición calcula el factor de correlación entre la señal de calcio de una región seleccionada de interés (traza de referencia) y la de cada pixel individual en el volumen 3D. Por lo tanto, los resultados obtenidos dependen fuertemente el patrón de actividad seleccionado como traza de referencia. Si el principal objetivo es visualizar los patrones de inervación de células mitrales, se prefiere una señal de referencia derivada de la actividad neuronal espontánea, y la elección de las células mitrales más activos producirá los mejores resultados. Para revelar las redes de quimio o termo-sensibles de las células mitrales, rastros de referencia sólo contienen respuestas a cualquiera de histidina o Ringer frío deben ser seleccionados. La selección de un glomérulo toda or soma celular mitral como región de interés no siempre puede dar una traza de referencia clara, sobre todo si las estructuras que responden a los dos estímulos diferentes son acostado en uno encima del otro. En tal caso, a menudo es útil para seleccionar un área más pequeña del glomérulo o cuerpo de la célula como región de interés.
En las últimas décadas, la electroporación se ha descrito como un método eficaz para teñir las células individuales o múltiples 11,12. Aquí se utiliza para etiquetar específicamente neuronas receptoras olfativas. Moléculas de dextrano conjugado dan la más alta eficiencia, y para colorantes no sensibles al calcio, el rango de selección es amplio y abarca el espectro completo que se utiliza típicamente en microscopía de fluorescencia 13. Sin embargo, colorantes sensibles al calcio que están sometidas a electroporación con éxito en las neuronas receptoras olfativas son por el momento limitado a dextrano de calcio-verde, y Fluo-4 dextrano si todavía está disponible comercialmente. Además, las grabaciones se dirigen principalmente superficial capas en la superficie ventral de sólo el bulbo olfatorio, ya que la profundidad de penetración de las técnicas de medición rápido es limitada. de dos fotones puede superar en parte esta limitación, pero a menudo carece de velocidad y restringe la cantidad de colorantes sensibles al calcio seleccionables más.
Hemos descrito aquí un protocolo para medir la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfatorio. El neurópila cerebro es escaneada como un volumen tridimensional para visualizar las complejas redes celulares implicados en el procesamiento olfativo de la temperatura. Medición de la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfativo se ha informado muy recientemente 5 y requiere un procedimiento adaptado específicamente la combinación de diferentes técnicas. Un activo importante de las técnicas presentadas anteriormente es que cientos de células se crean imágenes en tres dimensiones en una preparación en donde la mayor parte del sistema olfativo se mantiene intacta. Estas ventajas ponen altas exigencias en las técnicas de tinción, así como el cerebro pla reparación y la proyección de imagen. Por ejemplo, la electroporación de células y carga de bolo golpean grandes cantidades de células en el epitelio olfativo y bulbo, y por lo tanto permiten la visualización de las redes celulares completos. Por otra parte, la entrega de los indicadores químicos a través de la carga de bolo en lugar de fluoróforos genéticamente codificados permite realizar mediciones en un conjunto potencialmente mayor de especies. Otras alternativas como la incubación baño con tintes de AM trabajan principalmente en rodajas que dañan gravemente el bulbo olfatorio, dejando sólo unos pocos cientos de micrómetros de tejido intacto. En comparación, la preparación entera de montaje utilizado en nuestro protocolo asegura por ejemplo que la inervación bilateral de la γ-glomérulo permanece intacto y las grabaciones son entonces retirados en un sistema todavía operativa. Por último, la formación de imágenes en sí se realiza mediante microscopía de línea de iluminación que permite la adquisición de volúmenes 3D. Microscopía Line-iluminación es una de las técnicas confocales proporcionan las velocidades de adquisición de posibles más altos 6 </ Sup>, que son necesarios para cubrir una gran parte del bulbo olfatorio. sistemas de adquisición más lentos pueden ser usados pero tienen la desventaja de que el tamaño del volumen registrado debe ser reducida. En los últimos años, otros métodos para la adquisición rápida de imágenes se han desarrollado y se pueden utilizar como alternativas 14,15. Sin embargo, la microscopía de línea de iluminación sigue siendo uno de los métodos más fáciles para ganar velocidad y resolución suficiente. Aquí sigue una cierta información como guía para seleccionar las configuraciones de imagen adecuados. Desde imágenes de calcio se realiza dentro de las preparaciones de cerebro de espesor, la configuración debe proporcionar confocalidad decente y los objetivos debe tener aperturas numéricas de 1.0 o superior. Para un punto de referencia, las grabaciones tomadas con el microscopio línea de iluminación corresponden a las imágenes tomadas con un microscopio de barrido láser estándar con un tamaño del agujero de alfiler de 0,5-1 unidades ventiladas. la velocidad de adquisición rápida es deseable. Un volumen con un espesor de 20 micras cubierto por al menos 5 lAyers, un campo lateral de vista de 100 micras x 100 micras y un tamaño de píxel de 0,5 micras o menor debe ser escaneado a una velocidad mínima de 1 Hz por pila. La reducción de la confocalidad puede aumentar la cantidad de fotones contados y por lo tanto permite adquisiciones más rápidas si es necesario, pero tiene el inconveniente de grabación más luz fuera de foco. Sin embargo, ya que este enfoque aumenta el grosor de las rodajas ópticos, sino que puede facilitar la localización de dendritas a través de diferentes planos z después de la aplicación de ACI 6.
Las herramientas necesarias para estudiar ampliamente en las redes de procesamiento de temperatura del bulbo olfatorio se presentan en este documento. la actividad inducida por la temperatura se registra en el primer y segundo orden neuronas a través de los tintes y las señales de llegada o de salida de la γ-glomérulo sensibles al calcio. Además, el grado en que procesar las células mitrales individuales tanto información química y la temperatura se puede evaluar. Dado que la lea preparaciónves el bulbo olfatorio intacto, el papel de la inervación bilateral en el procesamiento olfativo puede ser estudiado más. El procedimiento también es útil para revelar si y cómo termopar y chemoinformation está codificado en la superposición de las redes olfativas 5. Por último, las técnicas mencionadas anteriormente no se limitan al estudio de las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio, pero se pueden aplicar para una evaluación más general del sistema olfativo, especialmente las redes de procesamiento celulares en grandes volúmenes tres dimensiones. Bolo de carga y de imagen actividad de correlación son herramientas poderosas para observar y comparar la actividad de las neuronas de decenas, por lo que es aplicable a diferentes redes cerebrales 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
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