Protocol
Alle eksperimenter med Xenopus laevis haletudser blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er godkendt af Göttingen Universitet Komité Etik i dyreforsøg.
1. Elektroporation
- Vælg dyr af trin 49-54 ifølge Nieuwkoop og Faber 7.
- Kontroller, at opsætningen optagelse består af et stereomikroskop med en stor arbejdsafstand og en elektroporation indretning, som kan anvende spændingsimpulser på 20 V i 20 msek ved en frekvens på mindst 2 Hz. Påfør spændingsimpulserne via to platinelektroder med en ru diameter på 200 um, således at de kan indsættes i de haletudser 'næsebor uden at forårsage skade.
- Forbered krystaller af en dextran konjugeret farvestof (f.eks Calcium Green 10 kDa Dextran eller Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) ved at opløse den typisk leveres mængde på 5 mg i ca. 100 pi destilleret vand og lade små dråber af2 pi tørt på et ark Parafilm.
Bemærk: Krystallerne tørre i mindre end en dag og kan opbevares bagefter ved -18 ° C i fryseren i en periode på over et år. - Bedøve dyrene ved at placere dem i ledningsvand indeholdende 3% tricaine methansulfonat i 1-2 min, indtil den når den kirurgiske anæstesi tilstand karakteriseret ved nedsat hjertefrekvens, tab af alle bevægelser og manglende responser på mekaniske stimuli.
- Fordyb den bedøvede dyr i 10 sek i rent vand fra hanen.
- Placer dyret på en gel pude og ordne det ved at placere nåle omkring det uden at skade det.
Bemærk: Du må ikke lave dyret ved at stikke nåle gennem sin hud. - Forsigtigt tørre området omkring næseborene med et væv.
- Sende dyret under stereomikroskop og fokus på næseborene.
- Brug pincet til at plukke et farvestof krystal størrelse matcher næsebor hul, placere den i en af de næsehulen og vent til den opløses fuldstændigt, which tager mindre end 1 min. Hvis krystallerne er mindre, tilsættes 2 eller 3 ind i hvert hulrum, indtil de producerer en ikke-gennemskinnelig høj koncentreret opløsning.
- Placer katoden på huden af haletudse og anoden i en af næseborene.
Bemærk: Denne særlige indstilling gælder for de ovenfor i trin 1.3 farvestoffer. For farvestoffer med en anden polaritet, kan farvningsresultaterne forbedres ved at placere katoden i næseborene. Hvis usikker polariteten af farvestoffet, kan begge elektroder placeres samtidig i næseborene (én pr næsebor), og polariteten vekslede mellem enkelt spændingspulser. - Påfør seks pulser af 20 V og 20 ms med ca. 0,5 sek af stimulus interval.
Bemærk: Små bobler skal vises omkring elektroden i næseboret under elektroporering forudsat at elektroderne er i kontakt med huden, og opløsningen i næseboret. Hvis ingen bobler er synlige kontrollere tilslutningskabler og sørg for elektroporering device leverer den ønskede spændingsimpuls. - Gentag proceduren (1,9-1,11) for det andet næsebor.
- Overfør den elektroporerede haletudse i et bægerglas fyldt med ledningsvand ved stuetemperatur. Vent 5 til 10 min, indtil dyret kommer til bevidsthed og genoptager sin svømning. Foder det og lad det komme sig i mindst 1 dag i løbet af hvilken farvestoffet bliver transporteret langs lugtenerven til lugtekolben.
- Brug elektroporerede dyr inden 1-7 dage efter elektroporation efter de bedste imaging resultater. Giv mindst 24 timers tid til transport farvestof og inddrivelse før billeddannelse.
2. Hele Mount Forberedelse
- Bedøver dyret i ledningsvand indeholder 3% tricaine metan sulfonat, indtil alle bevægelser er standset, og det ikke længere reagerer på mekaniske stimulationer.
- Overfør haletudse til en gel pude under et stereomikroskop og ordne det stramt ved at stikke nåle gennem huden på hver side af forebrain.
- Ofre haletudse ved overskæring sin rygmarv.
- Brug en skalpel til at dissekere en blok af væv, der indeholder både næsehulen, de olfaktoriske nerver og olfaktoriske pærer (figur 1A). Gøre det første snit tæt på venstre næsebor-uden at røre det-og flytte klingen fremad skæring ved siden af den venstre olfaktoriske nerve og pære, indtil telencephalic-diencephalic grænse. Gøre det samme på højre side. Isoler præparatet fra resten af nervesystemet ved at lave en endelig snit posterior til telencephalon.
- Bortskaffe kroppen af haletudse og omhyggeligt flip vævsblokken hovedet, så at den ventrale side af præparatet hjerne vender opad.
- Pin vævsblokken igen ved at indsætte to nåle mellem de olfaktoriske nerver.
- Sæt en dråbe Frog Ringer-opløsning (98 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, indstillet til pH 7,8, osmolakerhed 230 mOsmol / l) på vævet.
- Fjern meninges dækker Axon sortering zone og de olfaktoriske pærer ved at gøre tre indsnit ved hjælp af fine sakse. Startende fra den bageste kant af vævet blok, skåret caudorostrally tæt langs venstre lugtekolben indtil indgangspunktet af de olfaktoriske nerver i pærerne (Axon sortering zone).
- Gentag trin 2.8 for højre hjernehalvdel.
- Hæv meninges med pincet og gøre den tredje snit vinkelret på de tidligere på Axon sortering zone.
Bemærk: Den ventrale side af olfaktoriske pære er nu tilgængelig for billedbehandling og bolus lastning. - For at forbedre billedkvaliteten i det lys billede, gentag proceduren for den dorsale side. Disse ekstra trin kan lette navigationen af mikropipetten for bolus lastning, men er ikke strengt nødvendigt.
- Overfør prøven til en optagelse kammer fyldt med Frog Ringer til yderligere behandling og billeddannelse. Foretag sure, at den ventrale side vender opad og fastgør prøven med et net af nylonfibre spændte over en lille platin ramme.
- For en lettere anvendelse af stimuli placere næsehulen på toppen af en af nylonfibre.
3. Bolus Loading
- Opløs 50 ug af calcium AM farvestof (f.eks Fluo-8 AM) i 20 pi dimethylsulfoxid (DMSO) indeholdende 20% Pluronic F-127 (w / v) for at fremstille en stamopløsning på AM farvestof. Frys stamopløsninger i små portioner af 1-2 pi volumen. Stamopløsningen er stabil i mindst et halvt år, men undgå fryse-tø cykler.
- Brug en mikropipette aftrækker og træk pipetter med en modstand på 5-8 MQ og en spids diameter på 1-2 um.
- den fremstillede stamopløsning af farvestoffet i Frog Ringers opløsning opløses ved en koncentration på 250-500 uM.
- Tilføj MK571 at opnå en koncentration på 500 uM til at blokere multilægemiddelresistens transportører.
- Fyld mikropipette med 10 pi af løsningen ved hjælp af en langstrakt pipettespids og fjerne alle luftbobler ved at stille mikropipette.
- Monter mikropipette i holderen pipette og sørg for, at trykket kan påføres enten manuelt med en sprøjte eller en pneumatisk stof udslyngning enhed og overvåge påført tryk med en sporvidde.
- Brug om muligt et mikroskop setup med evnen til at ophidse den injicerede farvestof, så udstrømningen fra mikropipettespidsen kan visualiseres og justeres. Ideelt set bruge en konfokal billedbehandling setup. Brug en opretstående mikroskop med en fordybelse målsætning, så vævet kan nås med mikropipette.
- Placer hele mount forberedelse under mikroskopet, følg olfaktoriske nerve indtil pæren og fokus på det område af interesse i det olfaktoriske pære.
- Perfundere frisk Ringer løsning gennem optagelsen kammer for at øge rentabiliteten af præparat og udvaske farvestoffet utætfra mikropipettespidsen.
- Sænk pipette på overfladen af lugtekolben, med spidsen pegende ind rostralt retning af præparatet.
- Anvende en lille og konstant positivt tryk (~ 25 hPa) til mikropipetten at forhindre tilstopning af pipetten og forsigtigt indsætte det i vævet.
- Når pipetten har overtrådt de ydre væv lag, flytte den i en Rostro-dorsal retning i mitral cellelag. (Bemærk, at en tæller farvning af olfaktoriske receptor neuroner ved elektroporering er nyttigt at justere mikropipette position.) Ideelt placere pipettespidsen i en afstand af 50-100 um fra den ønskede optagelse site.
- Til farvning af temperaturfølsomme γ-glomerulus, målrette mod et område omkring 50 um rostrally fra positionen for den præsynaptiske neuropil af γ-glomerulus.
- Påfør et positivt tryk i området fra 100-200 hPa. Justere trykket styrke afhængig af størrelsen afmikropipettespidsen. Bekræft udstrømningen fra pipetten ved at se for mindre væv bevægelser synlige under brightlight belysning når trykket er anvendt for første gang.
- Opretholde et konstant tryk i ca. 10 minutter, idet mikropipette forbliver i vævet. Hvis det er muligt, skal du kontrollere neuropil i mellemtiden for celle lastning under fluorescerende belysning så vellykket belastning vil resultere i synlige celle somata farvning med stigende intensitet over tid.
Bemærk: Ofte årsagen til mislykket læsning er pipette tilstopning på grund af væv ind i spidsen eller aggregerede farvestof klynger. Det er nogle gange muligt at redde pipetten ved forsigtigt at bryde dens spids mod den nedre overflade af optagelsen kammeret. Imidlertid bør pipettespidsen ikke mere end nogle få mikrometer. Kompensere større pipette åbninger ved at anvende lavere tryk under bolus lastning. - Efter de 10 minutter som indlæsning, reducere det påførte tryk til nul og tjekke farvning.
Note: Størrelsen af det farvede område varierer betydeligt og afhænger af flere parametre som mængden af indsprøjtet farvestof og placering for udslyngning site. En god farvning dækker et område på omkring 100 um x 100 um. - Hvis de farvede område er for lille eller ikke dækker den ønskede optagelse webstedet Gentag trin 3,10-3,13. Brug den samme mikropipette til den næste injektion, hvis den endnu ikke er tilstoppet.
- Vent mindst 30 minutter efter den sidste injektion, før du starter nogen eksperimenter for at tillade farvestof optagelse og deesterificering. Fortsæt med at perfundere optagelsen kammeret med frisk Ringer-opløsning på alle tidspunkter.
4. Måling Indstillinger
- Sørg for, at målingen setup består af en konfokal mikroskop med tilstrækkelig hastighed til at optage tredimensionelle mængder. Vælg et opkøb på mindst 1 Hz pr stak.
Bemærk: Egnede opsætninger omfatter for eksempel line-belysning mikroskoper scanning prøven line-wise i stedet for punkt ved pFælles. En enkel realisering af en sådan opsætning er tidligere blevet beskrevet 6. Andre muligheder er spinning disk mikroskoper. Hvis en sådan opsætning er tilgængelig, er det stadig muligt at måle mindre områder med en normal point-scanning setup. - Indstil måleparametre således at et volumen stor nok til at passe til størrelsen af en glomerulus kan dækkes.
Bemærk: Den typiske tykkelse en optagelse volumen i området fra 20 um, som bør være omfattet af mindst 5 lag. - Kontroller alle præsynaptiske målinger for blegning. Juster lasereffekten indtil den gennemsnitlige fluorescensintensitet af de optagede billeder ikke falder over tidsforløbet for optagelse.
- Begræns måletid og område til optagelser på den postsynaptiske side for at undgå blegning så meget som muligt, selv om målinger, der overstiger 20-30 sek blegning er sandsynlig.
5. Lugt Ansøgning og Temperatur Eksperimenter
- Hæld 25ml frisk Ringer-opløsning (tidligere lagret ved 4 ° C) i et 50 ml rør. Glasset anbringes i en ice bucket.
- Overvåge temperaturen af det afkølede Ringer ved at indsætte den rene probe af et termometer ind i røret. Vent, indtil temperaturen falder til under 1 ° C, før du starter eksperimentet.
- Forbered 50 ml L-histidin opløses i Ringer-opløsning ved en koncentration på 10 uM.
- Brug en tragt applikator 8 eller lignende applikationer, der muliggør stimulus levering samtidigt til perfusion Ringer så vandet flow i kammeret forbliver konstant og uafbrudt under frigivelse af stimulus løsning. Placer tragten på en sådan måde, at den distale udløb er mindre end 1 mm fra det olfaktoriske epitel.
- Placer en NiCr-Ni temperaturføler forbundet til en digital termometer tæt på epitel og udløbet af tragten applikator. Wire termometeret output port til en computer for at optage og visuelt disspille spændingsændringer afspejler temperatursvingninger små.
- Før du starter eksperimentet, tilslutte en anden termosensor til en standard termometer til at etablere den spænding-til-temperatur skala faktor.
- Kortlægning badtemperaturen i optagelsen kammer og sikre, at den ikke overstiger 22 ° C.
- Starte billedscanningen og sekventielt anvende 200-400 pi kold Ringer, L-histidin og stuetemperatur Ringer (20-22 ° C) via en elektronisk pipette med en interstimulus interval på 20-30 sek. For en bedre kontrol af stimulus ansøgningen, slipper stimulus med en trigger signal fra den valgte imaging setup til pipette, hvis muligt. Gentag ansøgningen protokol for reproducerbare resultater.
- Tag sæt af længere optagelser med flere runder af stimulation Da de er at foretrække for post-imaging-analyse med aktivitet korrelation billeddannelse.
Bemærk: Et kompromis mellem optagetid og den skive levedygtighed harskal findes. Målinger af ca. 2 min omfattede 6 stimulus applikationer giver tilstrækkelig aktivitet til en god rekonstruktion af nettet.
6. Image Processing Brug Aktivitet Korrelation Imaging (ACI)
- Image Processing af de præ-synaptiske Recordings
- I optagelser med stimulering af kold Ringer-opløsning og histidin, skelne temperaturfølsomme γ-neuropil fra nabolandet histidin-følsomme glomerulus af deres forskellige respons profiler (se Kludt et al. 5).
- Opret en maksimal intensitet projektion i aksial retning fra optagelser af præparatet hjernen, hvor ORNs er elektroporeret med to forskellige farvestoffer for at visualisere den bilaterale innervation af γ-glomerulus.
- Image Processing af den postsynaptiske Recordings Brug Aktivitet Korrelation Imaging (ACI)
- Vælg optagelser med tilstrækkelige tidspunkter (mere end 100 frames) og en anstændig mængde aktivitet (mindst to begivenheder).
Bemærk: Aktiviteten kan enten være spontan at afsløre de processer af enkelte mitral celler eller fremkaldt af flere programmer af stimuli i samme optagelse til at afsløre de trådløse netværk, der aktiveres af de olfaktoriske stimuli. - Vælg optagelser hvor de målte strukturer bevæger ikke mere end 2-3 pixels over tidsforløbet for optagelse.
Bemærk: Optagelser med for meget bevægelse kan reddes ved at anvende et skift korrektion beskrevet i Kludt et al 5. - Kontroller, om optagelserne lider blegning. Hvis det gennemsnitlige intensitet af hele billedet falder over tidsforløbet for optagelse, blegemiddel korrektion er nødvendig, ellers springe de næste to trin.
- Beregn den lineære trend for tidskurven for hver pixel ved at udføre en lineær regression.
- Trække resultatet fra hver pixel individuelt for at fjerne den lineære component af blegning.
Bemærk: Som det kan bruges en alternativ Legendre fitting som beskrevet af Bao og Schild 9. - Download klar-til-brug MATLAB script sammen med en trin-for-trin guide for aktivitet korrelation imaging (ACI) som beskrevet af Junek et al. 6
Bemærk: Følg trinene beskrevet i Junek et al 6 som et alternativ til at bruge den medfølgende Matlab script.. - Flyt filerne 'aci.m', 'matVis.m "og" aci_roiSelector.m' fra den downloadede beholderen til Matlab stien til den, der anvendes til evaluering af data.
- Indlæse rådata erhvervet i trin 5.8 som en variabel til Matlabs bruger arbejdsområde organiseret som en [x, y, z, t] -matrix med x og y refererer til de laterale dimensioner, Z, den aksiale retning og t, tidsforløbet .
- Call 'aci' fra MATLAB kommandolinjen.
- I brugergrænsefladen (UI)der vises, skal du vælge 'Forbered data ", og vælg derefter den variabel, der indeholder de data og en mappe, hvor resultaterne vil blive gemt.
Bemærk: For en fuldstændig beskrivelse af UI se medfølgende manual ACI script. - Rul gennem de målte z-lag ved at flytte den tilsvarende skyderen i brugergrænsefladen til at få et overblik over variansen kortet vises.
- Indtast størrelsen af området af interesse (ROI) i UI. For en mitral celle soma justere ROI til at spænde omkring 10 um i den laterale og 5 um i den aksiale retning. For en glomerulus, de lidt højere værdier af 20 um på tværs og 10 um aksialt er hensigtsmæssige.
Bemærk: størrelse Den ROI skal indtastes som en række pixels, som afhænger af pixel skalering er valgt til optagelse. - Vælg en ROI der indeholder γ-glomerulus og yderligere områder for hver synlig soma af de omkringliggende mitral celler ved at klikke med den midterste museknap på center af cellen / glomerulus.
- Luk vigtigste UI, der udløser beregningen af korrelationen kort til alle reference- spor. Resultatet gemmes automatisk og vises.
- Vælg optagelser med tilstrækkelige tidspunkter (mere end 100 frames) og en anstændig mængde aktivitet (mindst to begivenheder).
Representative Results
Elektroporation af olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) blev opnået med Alexa Fluor farvestoffer eller calcium indikatorer konjugeret med dextranmolekyler for anterograd mærkning via aktiv axonal transport. Mens de tidligere farvestoffer giver lyse farvning af de sensoriske neuroner og deres axonterminaler forgrening i den glomerulære lag af løget, sidstnævnte tillader måling af neuronal aktivitet i disse celler (figur 1 og 2). Først blev positionen af den varmefølsomme γ-glomerulus og dens innervation mønster visualiseret ved elektroporering Alexa Fluor 647 Dextran og Alexa Fluor 546 Dextran i den venstre og højre olfaktoriske epitel, henholdsvis (figur 1A). Fireogtyve timer efter indgrebet, de ORNs i næseborene, de to olfaktoriske nerver og glomeruli i begge halvkugler var synlige under fluorescerende mikroskopi. De forskellige glomerulære klynger var identifiable af deres respektive positioner, især den lille klynge omfatter γ-glomerulus (figur 1B). Et lille antal kontralaterale olfaktoriske fibre løb gennem den kontralaterale lugtekolben, krydsede den forreste commissure og afsluttet i den ipsilaterale γ-glomerulus (figur 2A).
For at optage calcium svarene fra de præsynaptiske fibrene i γ-glomerulus, blev Calcium Green Dextran elektroporeret i ORNs, efter samme procedure. Negative temperatur hopper blev induceret ved næseboret via kontrolleret frigivelse af iskold Ringer-opløsning (0-1 ° C). En 3D volumendatamængde omfatter γ-glomerulus blev afbildet under hurtig line-illumination konfokalt mikroskop. ΔTs af -1 ° C var tilstrækkelige til at udløse kolde reaktioner i γ-glomerulus og dets afferenter, genkendelig som vendbare toppe i bf / F Ca 2 + spor (figur 2B </ strong>, C).
Yderligere eksperimentelle trin blev udført for at måle kuldeinduceret aktivitet i mitral celler forbundet til γ-glomerulus via deres ramifying dendritiske endelser. Disse postsynaptiske fibre og den omgivende neuropil blev effektivt farvet ved bolus belastning af calcium-sensitive farvestof Fluo-8 AM, udført få dage efter Alexa 647 Dextran var blevet elektroporeret i ORNs (figur 3A, B). Mitral celler blev fyldt med Fluo-8 AM, og lugteepitelet blev stimuleret to gange efter følgende paradigme: kold Ringer, histidin (10 uM) og stuetemperatur Ringer, anvendes senere. To referencepunkter spor blev taget fra områder af interesse i den optagede mængde, man reagerer udelukkende temperaturen falder, den anden, kun til histidin. Aktivitet korrelation imaging (ACI) 6 er beregnet på baggrund af den valgte henvisningenspor at visualisere med høj kontrast den dendritiske morfologi af postsynaptiske net svarer til den temperatur eller histidin-responsive Ca2 + signal (figur 3C, D). Endelig varmefølsom og chemosensitive kort var farvekodet og overlejret oven på hinanden, viser, hvordan temperatur og kemisk information føres fra individuelle glomeruli til de olfaktoriske anden ordens neuroner (figur 3e). For en beskrivelse af integration og behandling af begge typer af oplysninger i delte olfaktoriske netværk, se Kludt et al. 5
Figur 1: Oversigt over ORN elektroporering og bolus loading (A) Olfactory receptor neuroner i begge næsehulen af X.. laevis larver blev elektroporeret med Alexa farvestoffer eller calcium-sensitive farvestoffer koblet til dextranmolekyler. De fluorescerende indikatorer blev transporteret anterogradely indtil terminalen axonal arborization. 24 timer efter elektroporering, den glomerulære lag i begge halvkugler viste fluorescerende farvning. (B) Skematisk af den cellulære organisering af olfaktoriske pære i en halvkugle. Den glomerulære lag spænder pæren i klynger: de mediale, små, mellem- og laterale klynger. Olfaktoriske oplysninger overføres fra receptor neuroner til at mitral celler via excitatoriske synapser i glomeruli. Periglomerular celler og granulerede celler er hæmmende neuroner modulerende olfaktoriske behandling og kodning. Den γ-glomerulus (cyan) blev let identificeret som den lille neuropil hvor ipsilaterale (rød) og kontralaterale (orange) olfaktoriske fibre fusioneret. (C) Bolus belastning blev opnået i nærheden af γ-glomerulus at plette den postsynaptiske neuropil består primært af mitral celler og deres dendritic træer forgrenede betydeligt i den glomerulære lag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Elektroporation af ORNs afslører strukturel og funktionel tilslutning (A) Bilateral innervation af γ-glomerulus af ipsilaterale (grøn) og kontralaterale (rød) olfaktoriske receptor neuroner (ORNs).. Scale bar = 50 um. (B) lugtekolben efter elektroporation med calcium-sensitive farvestof Calcium Green Dextran. Den tværmediale (IMC), mediale (MC) og den lille klynge (SC) er synlige. Billedet er et maksimum projektion af 100 um tykke målevolumen. Scale bar = 50 um. (C) Nærbillede af den lille klynge. Den registrerede mængde (12 um) errepræsenteret i en maksimal projektion. Billedet viser den basale fluorescerende niveau i grå og farvekodede bf / F kortet som et overlay. Den maksimale respons på stimulering med kold Ringer opløsning er plottet. Den γ-glomerulus reagerede kraftigt, mens de to tilstødende glomeruli tie. Det indsatte viser bf / F trace for γ-glomerulus svarende til den indikerede region af interesse. Den blå søjle repræsenterer stimulus ansøgningen. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Bolus lastning og ACI dissociere varmefølsomt og chemosensitive net (A) axoner ORNs ender i den lille klynge blev farvet ved elektroporering med den ikke-Calcium farvestof Alexa 647 Dextran. Den stiplede linje skitserer γ-glomerulus. (B) Billede af den samme region som i (A) i den anden målekanal efter bolus lastning med calcium-sensitive farvestof Fluo-8 AM. Nogle mitral celle somata var synlige, men kontrasten var begrænset. Efter pilene blev to respons spor plottet, som blev anvendt til aktivitet korrelation billeddannelse (ACI). Blå, røde og sorte bjælker under sporene skildrer den begyndende anvendelse af kold Ringer, histidin (10 uM) og rum-temperatur Ringer som negativ kontrol, hhv. De to Ca 2+ spor blev taget fra forskellige regioner af interesse af den målte mængde. (C) ACI resultat af sporet i (B) fremhæve områder reagerer overvejende til kold Ringer. (D) ACI Resultatet af spor i (B) fremhæve områder reagerer overvejende til histidin. (E) overlejring af to ACI kort. Mitral celler reagerer på histidine og innerverede glomerulus (rød) var lette at skelne fra varmefølsomme mitral celler og γ-glomerulus (cyan). Alle billeder af denne figur er maksimal intensitet fremskrivninger af en 28 um tyk volumen. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Metoderne præsenteret heri sigter mod optagelse temperatur forarbejdning i lugtekolben af Xenopus laevis haletudser. Protokollen pletter første og anden ordens neuroner i olfaktoriske pære og giver en prøveforberedelse, hvor olfaktoriske system, forbliver hovedsageligt intakt. Således kan aktiveringen af temperaturfølsomme γ-glomerulus overvåges og sammenlignes med dens kemo-sensitive tilstødende glomeruli. Den unikke bilaterale innervation af denne glomerulus visualiseres ved celle elektroporering med spektralt forskellige farvestoffer. Endvidere bolus loading muliggør farvning af mitral celler spænder over en stor volumen inden lugtekolben. De neuronale netværk forarbejdning temperatur-induceret signaler er afsløret ved at tage calcium målinger med gentagne stimulus applikationer og efterfølgende analysere data med aktivitet korrelation billeddannelse.
Protokollen fremhæver to sofistikerede farvning proce durer, der begge kræver forsigtig manipulation og praksis for at opnå tilfredsstillende og reproducerbare resultater. Under elektroporering har skal undgås enhver skade af dyrene, især ved placering af elektroderne i næseborene. Optimalt set bør ingen kontakt med lugteepitelet forekomme. Bemærk, at dyr, der stadig lever efter elektroporation procedure og skal tages deres restitutionstid i betragtning. Hvis farvningen stadig for svag efter en runde af elektroporering, hvilket kan ske afhængigt af typerne af anvendte farvestoffer, kan dens intensitet forøges ved stigende koncentration farvestof i næseborene. Da dextran-koblet molekyler transporteres via flere mekanismer, herunder langsom axonal transport (ved hastighed på 1-2 mm / dag 10) og passiv diffusion, andet alternativ er at vente 48 timer efter elektroporering før at ofre dyrene. Alternativt kan elektroporering gentages efter én dags nyttiggørelse.
jove_content "> Bolus loading er et kritisk trin eftersom mængden af farvestof ind mitral celler er vanskelig at regulere og afhænger af forskellige parametre som pipettespidsen størrelse og placering af ansøgningen. Overvågning proceduren i et konfokalt fluorescensmikroskop viser sig at være nyttige til tilpasning af varigheden af farvestof anvendelse og således frembringe lignende farvningsresultater tværs præparater. Endvidere tidligere elektroporerede haletudser bør anvendes til at bestemme den bedste position for farvestoffet ansøgning ved at identificere positionen af lille klynge (omfattende γ-glomerulus). den mest afgørende skridt under målingerne er at undgå både skift og blegning af prøven. skiftet kan undgås ved omhyggeligt at placere Ringer flow under mikroskop. som at begrænse blegning af området med interesse, bør målingen tid reduceres til det væsentlige .Bolus loading farvning med calcium-sensitive farvestoffer giver kun megetbegrænset kontrast da sunde celler generelt har lave niveauer af calcium og dermed vise svag basal fluorescens. Anvendelse aktivitet korrelation imaging omgår denne begrænsning ved at generere kontrast baseret på aktivitet og fremhæver strukturer med lignende calcium signaler. Denne post-erhvervelse analysemetode beregner korrelationskoefficient mellem calcium signal om et udvalgt område af interesse (henvisningen spor), og at hver enkelt pixel i 3D volumen. Derfor er de opnåede kraftigt resultaterne afhænge af aktiviteten mønster valgt som reference spor. Hvis det primære fokus er at visualisere mitral celle innervationsområderne mønstre, er en reference signal stammer fra spontane neuronal aktivitet foretrækkes, og vælge de mest aktive mitral celler vil give de bedste resultater. For at afsløre kemo- eller termo-følsomme netværk af mitral celler, bør udvælges reference- spor, der kun indeholder svar på enten histidin eller kold Ringer. Udvælgelsen af en hel glomerulus or mitral celle soma som område af interesse, kan ikke altid give en klar henvisning spor, især hvis de strukturer reagerer på de to forskellige stimuli ligger oven på hinanden. I et sådant tilfælde er det ofte nyttigt at vælge et mindre område af glomerulus eller cellelegemet som område af interesse.
I de sidste årtier er elektroporering blevet beskrevet som en effektiv metode til at farve enkelte eller flere celler 11,12. Her er det bruges til specifikt mærke olfaktoriske receptor neuroner. Dextran-konjugerede molekyler giver den højeste effektivitet, og for ikke-calciumsensitiv farvestoffer, rækken af markering er bredt og dækker hele spektret typisk anvendes i fluorescensmikroskopi 13. Imidlertid calcium-sensitive farvestoffer, som på vellykket elektroporeret ind olfaktoriske receptor neuroner er i øjeblikket begrænset til calcium-grøn dextran og Fluo-4 dextran hvis det stadig kommercielt tilgængelige. Desuden optagelserne målrette primært superficial lag på den ventrale overflade af kun lugtekolben, eftersom indtrængningsdybde hurtige målemetoder er begrænset. To-foton billedbehandling kan til dels overvinde denne begrænsning, men mangler ofte hastigheden og begrænser mængden af valgbare calcium-sensitive farvestoffer yderligere.
Vi beskrives her en protokol til måling af temperatur-induceret aktivitet i lugtekolben. Hjernen neuropil scannes som en tredimensionel volumen til at visualisere komplekse mobilnetværk involveret i det olfaktoriske behandling af temperaturen. Måling temperatur-induceret aktivitet i olfaktoriske pære er for ganske nylig rapporteret 5 og kræver et specielt tilpasset procedure kombinerer forskellige teknikker. En stort aktiv for de teknikker præsenteret ovenfor, er, at hundredvis af celler afbildet i tre dimensioner i et præparat, hvor de fleste af de olfaktoriske system, forbliver intakt. Disse fordele sætte store krav til farvningsteknikker samt hjernen perstatning og billeddannelse. For eksempel, celle elektroporation og bolus lastning ramte store mængder af celler i det olfaktoriske epitel og pære, og dermed gøre det muligt at visualisering af komplette mobilnetværk. Endvidere levering af kemiske indikatorer via bolus lastning stedet for genetisk indkodede fluoroforer muliggør målinger i en potentielt større sæt af arter. Andre alternativer som bad inkubation med AM farvestoffer arbejder primært i skiver, der skader lugtekolben alvorligt, så kun et par hundrede mikrometer af intakt væv. Til sammenligning hele mount præparat, der anvendes i vores protokol sikrer f.eks at den bilaterale innervation af γ-glomerulus forbliver intakt og optagelserne er således taget i en stadig operativ system. Endelig er det billeddannende selv gjort ved line-belysning mikroskopi tillader indsamling af 3D mængder. Line-belysning mikroskopi er en af de konfokale teknikker, der giver den højest mulige erhvervelse satser 6 </ Sup>, som er nødvendige for at dække en stor del af det olfaktoriske pære. Langsommere indkøbssystemer kan anvendes, men har den ulempe, at størrelsen af det optagne volumen skal reduceres. I de senere år har andre metoder til hurtig billedfangst blevet udviklet og kan anvendes som alternativer 14,15. Ikke desto mindre, line-belysning mikroskopi er stadig en af de nemmeste metoder til at få både tilstrækkelig hastighed og opløsning. Her følger nogle oplysninger som retningslinjerne for valg af egnede imaging opsætninger. Da calcium imaging er gjort inden fra tykke hjernen præparater, skal opsætningen give anstændige confocality, og målene skal have numeriske åbninger på 1,0 eller højere. For et referencepunkt, optagelserne er taget med belysning line mikroskop svarer til billeder taget med et standard laser scanning mikroskop med en pinhole størrelse på 0,5-1 luftige enheder. Hurtig erhvervelse hastighed er ønskelig. Et volumen med en tykkelse på 20 um dækket af mindst 5 lAyers, en lateral synsfelt på 100 um x 100 um og en pixelstørrelse på 0,5 um eller mindre, bør scannes med en hastighed på mindst 1 Hz per stabel. Reduktion af confocality kan øge mængden af fotoner tælles, og dermed giver mulighed for hurtigere opkøb hvis det er nødvendigt, men har den ulempe, at optage mere ud af fokus lys. Men da en sådan fremgangsmåde øger tykkelsen af de optiske skiver, det kan faktisk lette sporing af dendritter gennem forskellige z-planer efter anvendelse af ACI 6.
De nødvendige værktøjer til udstrakt studere temperatur forarbejdning i olfaktoriske pære netværk præsenteres heri. Temperatur-induceret aktivitet er registreret i den første og anden ordens neuroner via calcium-sensitive farvestoffer og signaler både ankommer og afsejler fra γ-glomerulus. Desuden, i hvilket omfang de enkelte mitral celler bearbejde, både kemisk og temperatur oplysninger kan vurderes. Siden udarbejdelsen leaves lugtekolben intakt, kan den rolle, den bilaterale innervation i olfaktoriske behandling undersøges yderligere. Proceduren er også nyttig til at afsløre, om og hvordan termo- og chemoinformation kodes i overlappende olfaktoriske net 5. Endelig er de ovennævnte teknikker ikke begrænset til studiet af temperaturen reaktioner i lugtekolben men kan anvendes til en mere generel vurdering af det olfaktoriske system især de cellulære behandling netværk i store tredimensionelle mængder. Bolus lastning og aktivitet korrelation imaging er effektive værktøjer til at observere og sammenlign aktiviteten af snesevis af neuroner, hvilket gør dem anvendelige til forskellige hjerne-netværk 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
