Protocol
Alle eksperimenter med Xenopus laevis rumpetroll ble utført i henhold til de retningslinjer godkjent av Göttingen universitet Committee of Ethics i forsøk med dyr.
1. Electroporation
- Velg dyr av stadier 49-54 ifølge Nieuwkoop og Faber 7.
- Sørge for at innspillingen oppsett består av et stereomikroskop med en stor arbeidsavstand og en elektroporering anordning som ved en frekvens på minst 2 Hz kan gjelde spenningspulser på 20 V til 20 ms. Anvende de spenningspulser via to platinaelektroder med en grov diameter på 200 mikrometer, slik at de kan settes inn i Tadpoles 'neseborene uten å forårsake skade.
- Fremstille krystaller av et dekstran konjugert fargestoff (f.eks, kalsium Grønn 10 kDa dekstran, eller Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) ved å oppløse det vanligvis levert mengde av 5 mg i omtrent 100 pl destillert vann og å la små dråper av2 pl tørre på et ark Parafilm.
Merk: Krystallene tørkes i mindre enn en dag og lagres deretter ved -18 ° C i fryseren i en periode på over et år. - Bedøve dyrene ved å plassere dem i springvann inneholdende 3% Tricaine metansulfonat i 1-2 min inntil den når kirurgisk anestesi tilstand karakterisert ved redusert hjertefrekvens, tap av alle bevegelser og mangel på respons på mekaniske stimuli.
- Dypp bedøvet dyret i 10 sek i rent vann fra springen.
- Plasser dyret på en gel pute og fikse det ved å plassere nåler rundt det uten å skade den.
Merk: Ikke fest dyret ved poking nåler gjennom huden. - tørk forsiktig området rundt neseborene med en vev.
- Plasser dyret under stereomikroskop og fokus på neseborene.
- Bruk pinsett til å plukke en farge krystall av størrelse matchende neseboret hull, legg den i en av nesehulene og vent til den er oppløst helt, wjør tar mindre enn 1 min. Dersom krystallene er mindre, legge til to eller tre inn i hvert hulrom inntil de frembringer en ikke-gjennomskinnelig høy-konsentrerte oppløsning.
- Plasser katoden på huden av rumpetroll og anoden i et av neseborene.
Merk: Dette bestemte innstillingen gjelder for fargestoffer sitert i trinn 1.3. For fargestoffer med en annen polaritet, kan fargingsresultater forbedres ved å plassere katoden inn i neseborene. Hvis du er usikker om polariteten av fargestoff, kan begge elektrodene plasseres samtidig i neseborene (ett per nesebor), og polariteten vekslet mellom enkelt spenningspulser. - Påfør seks pulser av 20 V og 20 ms med ca 0,5 sek på stimulus intervall.
Merk: Små bobler skal vises rundt elektroden i neseboret i løpet av electroporation forutsatt at elektrodene er i kontakt med huden og løsningen i neseboret. Hvis ingen bobler er synlige kontrollere tilkoblingskabler og sørg for at electroporating distribusjonse leverer den ønskede spenningspuls. - Gjenta prosedyren (01.09 til 01.11) for det andre neseboret.
- Overfør elektroporert rumpetroll inn i et begerglass fylt med vann fra springen ved romtemperatur. Vent 5 til 10 min før dyret gjenvinner bevissthet og gjenopptar sin svømming. Mate den og la den komme i minst en dag hvor fargestoffet transporteres langs luktenerven til luktelappen.
- Bruk electroporated dyr innenfor 1-7 dager etter electroporation for beste bilderesultatene. Gi minst 24 timers tid for fargestoff transport og gjenvinning før bildebehandling.
2. Hele Mount Forberedelse
- Bedøve dyret i vann fra springen inneholder 3% Tricaine metansulfonat til alle bevegelser har stoppet og det ikke lenger reagerer på mekanisk stimulering.
- Overfør rumpetroll til en gel pute under et stereomikroskop og fikse det tett ved poking nåler gjennom huden på hver side av forebrain.
- Ofre rumpetroll av severing sin ryggmargen.
- Bruk en skalpell til å dissekere ut en blokk av vev som inneholder både nesehulene, olfactory nerver og olfactory pærer (Figur 1a). Gjør det første snittet nær venstre nesebor, uten å berøre det-og flytte bladet fremover skjæring langs venstre luktenerven og pære til telencephalic-diencephalic grensen. Gjøre det samme på høyre side. Isoler forberedelse fra resten av nervesystemet ved å gjøre et siste kutt posterior til telencephalon.
- Kast kroppen av rumpetroll og snu forsiktig vevsblokk opp ned slik at ventral side av hjernen forberedelse vender oppover.
- Pin vevsblokk igjen ved å sette inn to nåler mellom olfactory nerver.
- Sette en dråpe av frosk Ringer-oppløsning (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glukose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, regulert til pH 7,8, osmolakerhet på 230 mOsmol / L) på vevet.
- Fjern hjernehinnene som dekker axon sortering sonen og olfactory pærer ved å gjøre tre snitt bruker gode saks. Starter fra bakre kant av vevsblokk, kuttet caudorostrally tett langs venstre luktelappen før inngangen punktet olfactory nerver til pærene (axon sortering sone).
- Gjenta trinn 2.8 for den høyre hjernehalvdelen.
- Hev hjernehinnene med pinsett og gjøre den tredje kutt, vinkelrett på de forrige på aksonet sortering sonen.
Merk: ventral side av luktelappen er nå tilgjengelig for bildebehandling og bolus lasting. - For å forbedre bildekvaliteten i det overførte lys bilde, gjenta prosedyren for ryggsiden. Disse ekstra trinn kan forenkle navigeringen av mikropipette for bolus lasting, men er strengt tatt ikke nødvendig.
- Overføre prøven til et registreringskammer som er fylt med frosk Ringers for videre behandling og avbildning. Gjør ature at ventral side vender oppover og fest prøven med et nett av nylon fiber strakte seg over en liten platina ramme.
- For en lettere anvendelse av stimuli sted nesehulene på toppen av en av nylonfibre.
3. Bolus Loading
- Oppløs 50 ug av kalsium AM fargestoff (f.eks Fluo-8 AM) i 20 ul dimetylsulfoksid (DMSO) inneholdende 20% av Pluronic F-127 (w / v) for å fremstille en stamoppløsning av AM fargestoff. Fryse stamløsninger i små porsjoner av 1-2 ul volum. Aksjen løsningen er stabil i minst et halvt år, men unngå å fryse-tine sykluser.
- Bruk en mikropipette avtrekker og trekke pipetter med en motstand på 5-8 Megohm og et tips diameter på 1-2 mikrometer.
- Oppløs den fremstilte stamløsning av fargestoffet i frosken Ringers løsning med en konsentrasjon på 250-500 pM.
- Legg MK571 for å nå en konsentrasjon på 500 pM for å blokkere multiresistens transportører.
- Fyll mikropipette med 10 mL av løsningen ved hjelp av en langstrakt pipette tips og fjerne alle luftbobler ved å flikke mikropipette.
- Monter mikropipette i pipetten holderen og sørge for at trykket kan påføres enten manuelt med en sprøyte eller en pneumatisk narkotika utstøting enheten og overvåke påførte trykk med en måler.
- Hvis det er mulig, bruker et mikroskop oppsett med evne til å opphisse den injiserte fargestoff slik at utstrømningen fra mikropipette spissen kan visualiseres og justeres. Bruk helst en confocal bildebehandling oppsett. Bruk en oppreist mikroskop med en nedsenking objektiv slik at vevet kan nås med mikropipette.
- Plasser hele mount forberedelse under mikroskop, følger luktenerven til pære og fokusere på det området av interesse i luktelappen.
- Perfuse frisk Ringer-oppløsningen gjennom opptakskammeret for å øke levedyktigheten av preparatet og vaske ut fargestoffet lekkerfra mikropipette spissen.
- Senk pipette til overflaten av luktelappen, med spissen pekende inn i den rostrale retning av preparatet.
- Påfør en liten og konstant positivt trykk (~ 25 hPa) til mikropipette å forhindre tilstopping av pipette og sett det forsiktig inn i vevet.
- Når pipetten har brutt de ytre vev lag, flytte den i en rostro-dorsal retning inn i mitral celle laget. (Merk at en teller farging av olfactory reseptor nerveceller ved elektroporering er nyttig å justere mikropipette posisjon.) Ideelt plassere pipettespissen i en avstand på 50-100 mikrometer fra ønsket opptaks nettstedet.
- For farging av temperaturfølsomme γ-glomerulus, rettet mot et område omkring 50 um rostrally fra posisjonen av den presynaptiske neuropil av γ-glomerulus.
- Påføre et positivt trykk i området fra 100 til 200 hPa. Juster trykkfasthet, avhengig av størrelsenmikropipette spissen. Bekreft utstrømningen fra pipetten ved å se for små vev bevegelser synlig under Brightlight belysning når trykket er brukt for første gang.
- Opprettholde et konstant trykk i omtrent 10 min, mens mikropipette forblir i vevet. Hvis mulig, sjekk neuropil i mellomtiden for celle lasting under fluorescerende belysning som vellykket lasting vil resultere i synlig celle somata farging med økende intensitet over tid.
Merk: Ofte er årsaken til mislykket lasting er pipette tilstopping på grunn av vev inn i tuppen eller aggregerte fargestoff klynger. Det er noen ganger mulig å redde pipette ved forsiktig å bryte sin spiss mot den nedre flate av opptakskammeret. Imidlertid bør pipettespissen ikke overstige noen få mikrometer. Kompensere større pipettes åpninger ved å bruke lavere trykk under bolus lasting. - Etter 10 minutter før lasting, redusere det påførte trykket til null og kontrollere farging.
Notat: Størrelsen på det fargede området varierer betydelig og avhenger av flere parametere som mengden av injisert fargestoff og plasseringen av utskytings området. En god farge dekker et område på omkring 100 pm x 100 pm. - Hvis de fargede området er for lite eller ikke dekker den ønskede opptaks nettstedet, gjenta trinn 03.10 til 03.13. Bruk samme mikropipette for neste injeksjon hvis det ennå ikke har tettet.
- Vent minst 30 minutter etter siste injeksjon før du starter noen eksperimenter for å tillate fargestoff opptak og deforestrings. Fortsett å perfuse opptakskammeret med frisk Ringer-løsning til enhver tid.
4. Innstillinger Måle
- Kontroller at måleoppsettet består av en konfokalmikroskop med tilstrekkelig hastighet til å registrere tredimensjonale volumer. Velg et oppkjøp hastighet på minst 1 Hz per stack.
Merk: Passende oppsett inkluderer for eksempel line-belysning mikroskoper skanning prøven line-messig i stedet for punkt ved point. En enkel realisering av et slikt oppsett er tidligere beskrevet seks. Andre alternativer er spinning disk mikroskoper. Dersom slik oppsettet er tilgjengelig, er det fortsatt mulig å måle mindre områder med en normal punkt-scanning oppsett. - Setter måleparametrene slik at et volum stort nok til å passe størrelsen av en glomerulus kan dekkes.
Merk: Den typiske tykkelsen av et opptaksvolumet er i området 20 mikrometer, som skal dekkes av minst 5 lag. - Sjekk alle presynaptiske målinger for bleking. Juster laser makt til gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av innspilte bilder ikke synker over tid løpet av opptaket.
- Begrens måling tid og område for opptak på den postsynaptiske siden for å unngå bleking så mye som mulig, selv for målinger overstiger 20-30 sek bleking er sannsynlig.
5. Lukt Søknad og Temperatur Experiments
- hell 25ml frisk Ringer-løsning (tidligere lagret ved 4 ° C) i et 50 ml rør. Plasser røret i en isen bøtte.
- Overvåke temperaturen av den kjølte Ringer ved å sette den rene sonden av et termometer inn i røret. Vent til temperaturen synker under 1 ° C før start av eksperimentet.
- Fremstille 50 ml L-histidin oppløses i Ringer-oppløsning ved en konsentrasjon på 10 uM.
- Bruk en trakt applikator 8 eller lignende applikasjoner slik stimulans levering samtidig til perfusert Ringer slik at vannstrømmen i kammeret forblir konstant og uavbrutt under utgivelsen av stimulus løsning. Plasser trakten på en slik måte at den distale utløp er mindre enn 1 mm fra det olfaktoriske epitel.
- Plasser en NiCr-Ni temperaturføler som er koblet til et digitalt termometer nær epitelet og utløpet av trakten applikator. Wire termometeret utgang til en datamaskin for å spille inn og visuelt disspille spenningsendringer som gjenspeiler små temperatursvingninger.
- Før eksperimentet startes, koble en annen termosensor til en standard termometer for å etablere den spenning-til-temperaturskalafaktor.
- Kartlegge badetemperatur i opptaksrommet og sikre at den ikke overstiger 22 ° C.
- Start image oppkjøpet og sekvensielt gjelder 200-400 ul kald Ringer, L-histidin og romtemperatur Ringer (20-22 ° C) via en elektronisk pipette med en interstimulus intervall på 20-30 sek. For en bedre kontroll av stimulus søknaden, slipper stimulus med et triggersignal sendes av den valgte bildeoppsettet til pipetten hvis mulig. Gjenta påfør protokollen for reproduserbare resultater.
- Ta sett med lengre opptak med flere runder med stimulering siden de er å foretrekke for post-bildeanalyse med aktivitet korrelasjon bildebehandling.
Merk: Et kompromiss mellom opptakstiden og sektoren levedyktighet harå bli funnet. Målinger av ca. 2 min dekker 6 stimulerings applikasjoner gir tilstrekkelig aktivitet for en god rekonstruksjon av nettverket.
6. Bildebehandling Bruke aktivitet korrelasjon Imaging (ACI)
- Bildebehandling av den presynaptiske Recordings
- I innspillinger med stimulering av kulde Ringer løsning og histidin, skille temperaturfølsom γ-neuropil fra nabo histidin sensitive glomerulus av sine ulike svarprofiler (se Kludt et al. 5).
- Skape en maksimal intensitet fremspring i aksial retning fra opptak i hjernen preparat hvor Orns har blitt elektroporert med to forskjellige fargestoffer for å visualisere den bilaterale innervasjon av γ-glomerulus.
- Bildebehandling av den postsynaptiske Recordings Bruke aktivitet korrelasjon Imaging (ACI)
- Velg innspillinger med tilstrekkelig tidspunkter (mer enn 100 rammer) og en anstendig mengde aktivitet (minst to hendelser).
Merk: Aktiviteten kan enten være spontan å avdekke prosessene i enkelt mitral celler eller indusert av flere anvendelser av stimuli i samme opptak for å avsløre mobilnettverk aktiveres av olfactory stimuli. - Velge registreringer hvor de målte strukturene beveger seg ikke mer enn 2-3 piksler i løpet av tidsforløpet av opptaket.
Merk: Opptak med for mye bevegelse kan bli reddet ved å påføre et skifte korreksjon prosedyren beskrevet i Kludt et al fem. - Sjekk om opptakene lider av bleking. Dersom den gjennomsnittlige intensitet av hele bildet synker i løpet av tidsforløpet av opptaket, er blekemiddel korreksjon er nødvendig, ellers hoppe over de neste to trinn.
- Beregn lineære trenden for tiden trase for hver piksel ved å utføre en lineær regresjon.
- Subtrahere resultatet fra hver piksel individuelt for å eliminere den lineære komponenter;t av bleke.
Merk: Som et alternativ Legendre passende kan anvendes som beskrevet av Bao og Schild 9. - Last ned klar til bruk MATLAB script sammen med en steg-for-steg guide for aktivitet korrelasjon imaging (ACI) som beskrevet av Junek et al. 6
Merk: Følg trinnene som er beskrevet i Junek et al 6 som et alternativ til å bruke den medfølgende MATLAB script.. - Flytt filene 'aci.m', 'matVis.m' og 'aci_roiSelector.m' fra den nedlastede beholderen til MATLAB banen av systemet som brukes for dataanalyse.
- Laster rådata overtatte i trinn 5.8 som en variabel i MATLAB bruker arbeidsområde organisert som en [x, y, z, t] -matrix med x og y med henvisning til de laterale dimensjoner, z, aksial retning og t, tidsforløpet .
- Call "ACI" fra MATLAB kommandolinjen.
- I brukergrensesnittet (UI)som vises, velg "Forbered Data ', velg deretter variabel som inneholder data og en katalog der resultatene vil bli lagret.
Merk: For en fullstendig beskrivelse av UI se manualen som følger med ACI script. - Bla gjennom de målte z-lag ved å flytte den tilsvarende glidebryteren i brukergrensesnittet for å få en oversikt over variansen kartet vises.
- Angi størrelsen på regionen av interesse (ROI) i brukergrensesnittet. For en mitral celle soma justere ROI for å strekke seg over omtrent 10 mikrometer i den laterale og 5 um i den aksiale retning. For en glomerulus, er litt høyere verdier av 20 um i sideretningen og 10 mm aksialt er passende.
Merk: ROI størrelse må legges inn som et antall piksler, som avhenger av pikselskalerings valgt for opptak. - Velg en ROI som inneholder γ-glomerulus og flere regioner for hvert synlig soma av de omkringliggende mitral celler ved å klikke med midtre museknapp på center av cellen / glomerulus.
- Lukk hoved UI som utløser beregning av korrelasjon kart for alle referanse spor. Resultatet lagres automatisk og vises.
- Velg innspillinger med tilstrekkelig tidspunkter (mer enn 100 rammer) og en anstendig mengde aktivitet (minst to hendelser).
Representative Results
Elektroporeringsmetoden av olfactory reseptor nevroner (Orns) ble oppnådd med Alexa Fluor fargestoffer eller kalsium indikatorer konjugert med Dextran molekyler for antero merking via aktiv aksonal transport. Mens det tidligere fargestoffer som gir lys farging av de sensoriske nevroner og deres axon terminaler forgrening i glomerulær laget av pæren, idet sistnevnte tillater måling av neuronal aktivitet i disse cellene (figur 1 og 2). Først ble posisjonen av termo γ-glomerulus og dens innervasjon mønster visualisert ved electroporating Alexa Fluor 647 Dextran og Alexa Fluor 546 Dekstran i venstre og høyre olfaktorisk epitel, henholdsvis (figur 1A). Tjuefire timer etter inngrepet, de Orns i neseborene, de to olfactory nerver og glomeruli i begge halvkuler var synlige under fluorescerende mikroskopi. De ulike glomerulær klynger var identifiaold ved sine respektive posisjoner, i særdeleshet liten klynge omfatter γ-glomerulus (figur 1B). Et lite antall kontralaterale olfactory fibre kjørte gjennom den kontralaterale luktelappen, krysset anterior commissure og ble avsluttet i ipsilaterale γ-glomerulus (Figur 2A).
For å kunne ta opp kalsium reaksjoner fra presynaptiske fibrene i γ-glomerulus, ble kalsium Grønn Dextran elektroporert i Orns, i henhold til den samme prosedyre. Negativ temperatur-hopp ble indusert ved neseboret via den kontrollerte frigivelse av iskald Ringer-oppløsning (0-1 ° C). En 3D-volum som består av den γ-glomerulus ble avbildet i henhold til en fastline-lys konfokalt mikroskop. ßTs på -1 ° C var tilstrekkelig til å utløse kalde responser i γ-glomerulus og sine afferente, gjenkjennelig som reversible topper i AF / F Ca 2 + spor (figur 2B </ strong>, C).
Ytterligere eksperimentelle trinn ble utført for å måle kald-indusert aktivitet i mitral celler forbundet til den γ-glomerulus via sine forgrenede dendrittiske avslutninger. Disse postsynaptiske fibre og den omkringliggende neuropil ble effektivt farget av bolus lasting av kalsium-sensitive fargestoff Fluo-8 AM, utførte et par dager etter Alexa 647 dekstran hadde blitt electroporated inn Orns (figur 3A, B). Mitral-celler ble fylt med Fluo-8 AM, og det olfaktoriske epitel ble stimulert to ganger i henhold til den følgende paradigmet: kald Ringers, histidin (10 uM) og rom-temperatur Ringers, deretter påføres. To referanse spor ble tatt fra områder av interesse i den registrerte volum, en reagerer utelukkende til temperaturen synker, den andre, til histidin bare. Aktivitet korrelasjon imaging (ACI) 6 ble beregnet basert på den valgte referansenspor for å visualisere med høy kontrast dendrittiske morfologien til de postsynaptiske nettverkene svarende enten til den temperatur eller den histidin-responsive Ca 2 + signal (figur 3C, D). Til slutt, termo og kjemosensitiv kartene var fargekodet og kledde på toppen av hverandre, og viser hvordan temperatur og kjemisk informasjon formidles fra enkelte glomeruli til olfactory andre-ordens nevroner (Figur 3E). For en beskrivelse av integrering og behandling av begge typer informasjon i delte olfactory nettverk, se Kludt et al. 5
Figur 1: Oversikt over ORN electroporation og bolus lasting (A) Olfactory reseptor nevroner i begge nesehulene av X.. laevis larver ble electroporated med Alexa fargestoffer eller calcium-sensitive fargestoffer koblet til Dextran molekyler. De fluoriserende indikatorene ble fraktet anterogradely inntil terminalen aksonal arborization. 24 timer etter elektroporering, glomerulær laget i begge halvkuler viste fluorescerende farging. (B) Skjematisk av den cellulære organisering av luktelappen i en halvkule. Glomerulær laget spenner pære i klynger: medial, små, middels og side klynger. Lukte informasjon overføres fra reseptoren nevroner til mitral celler via eksitatoriske synapser i glomeruli. Periglomerular celler og granule celler er hemmende nerveceller modulerlukte bearbeiding og koding. Den γ-glomerulus (cyan) ble lett identifisert som den lille neuropil hvor ipsilaterale (rød) og kontralaterale (oransje) olfactory fibre slått sammen. (C) Bolus lasting ble oppnådd i nærheten av γ-glomerulus å farge den postsynaptiske neuropil består hovedsakelig av mitral celler og deres dendritic trær forgreninger betydelig i glomerulær laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Electroporation av Orns avslører strukturell og funksjonell tilkobling (A) Bilateral innervasjon av γ-glomerulus ved ipsilaterale (grønn) og kontralaterale (røde) olfactory reseptor nevroner (Orns).. Scale bar = 50 mikrometer. (B) Den luktelappen etter elektroporering med kalsiumfølsomme fargestoffer Kalsium Grønn dekstran. Den intermediale (IMC), medial (MC) og den lille klyngen (SC) er synlige. Bildet er maksimalt projeksjon av 100 mikrometer tykk målevolumet. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Nærbilde av den lille klyngen. Den registrerte volum (12 mm) errepresentert i en maksimal projeksjon. Bildet viser basal fluorescerende nivå i grått og fargekodede AF / F kartet som et overlegg. Den maksimale respons til stimulering med kald Ringers løsning er plottet. Den γ-glomerulus reagerte sterkt, mens de to nabo glomeruli tie. Det innfelte viser AF / F spor for γ-glomerulus tilsvarer den angitte regionen av interesse. Den blå linjen representerer den stimulans programmet. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Bolus lasting og ACI dissosiere termo og kjemosensitiv nettverk (A) Axoner av Orns som ender i liten klynge ble farget ved elektroporering med det ikke-Calcium sensitive fargestoff Alexa 647 dekstran. Den stiplede linjen skisserer γ-glomerulus. (B) Bilde av den samme region som i (A) i den andre målekanal etter bolus lasting med kalsium-sensitive farvestoff Fluo-8 AM. Noen mitral celle somata var synlige, men kontrasten var begrenset. Som vist med pilene, ble to respons spor plottet, som ble anvendt for aktivitet korrelasjon imaging (ACI). Blå, røde og svarte striper under sporene viser utbruddet av anvendelsen av kald Ringer, histidin (10 mm) og romtemperert Ringer som negativ kontroll, henholdsvis. De to Ca 2+ spor ble tatt fra forskjellige regioner av interesse for den målte volumet. (C) ACI resultat av spor i (B) fremhever områder svarer hovedsakelig til kaldt Ringer. (D) ACI Resultatet av spor i (B) å fremheve områder svarer hovedsakelig til histidin. (E) Overlegg av de to ACI kart. Mitral celler reagerer på histidine og innerverte glomerulus (rød) var lett å skille fra termo mitral celler og γ-glomerulus (cyan). Alle bilder av dette tallet er maksimal intensitet projeksjoner av en 28 mikrometer tykk volum. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Metodene som presenteres her tar sikte på opptak temperatur behandling i luktelappen av Xenopus laevis rumpetroll. Protokoll flekker første og andre ordens nevroner i luktelappen og gir en prøveopparbeidelse der luktsystemet forblir hovedsakelig intakt. Dermed kan aktiveringen av den temperaturfølsomme γ-glomerulus bli overvåket og sammenlignet med sin chemo-sensitive nabo glomeruli. Den unike bilateral innervasjon av dette glomerulus er visualisert ved celle elektroporering med spektralt ulike fargestoffer. Videre gir bolus lasting for farging av mitral-celler som strekker seg over et stort volum innenfor luktelappen. De nevrale nettverk behandling temperaturinduserte signalene er avslørt ved å ta kalsiummålinger med gjentatte stimulans programmer og deretter analysere dataene med aktivitet korrelasjon bildebehandling.
Protokollen fremhever to sofistikerte farging proce sedyrer, som begge krever forsiktig håndtering og praksis for å oppnå tilfredsstillende og reproduserbare resultater. Under electroporation noen skade av dyrene har til å unngås, særlig ved plassering av elektrodene inn i neseborene. Optimalt bør ingen kontakt med det olfaktoriske epitel forekomme. Legg merke til at dyrene fortsatt lever etter electroporation prosedyre og deres utvinning tid må tas i betraktning. Hvis fargingen fremdeles for svak etter en runde med elektroporering, noe som kan skje avhengig av hvilke typer av fargestoffer som brukes, kan dens intensitet økes ved å øke fargestoff-konsentrasjonen i neseborene. Siden dekstran-koblede molekyler transporteres gjennom flere mekanismer inkludert langsom aksonal transport (ved en hastighet av 1-2 mm / dag 10) og passiv diffusjon, er et annet alternativ for å vente 48 timer etter elektroporering før det går på bekostning dyrene. Alternativt kan electroporation bli gjentatt etter en dag for utvinning.
jove_content "> Bolus lasting er et kritisk trinn siden mengden av fargestoff kommer inn i mitral cellene er vanskelig å regulere og er avhengig av flere parametere som pipettespissen størrelse og plassering av søknaden. Overvåking av fremgangsmåten under en konfokal fluorescens mikroskop viser seg å være nyttig for justering av varigheten av fargestoff søknad og dermed generere liknende fargingsresultater på tvers preparater. Videre er tidligere elektroporerte rumpetroll bør benyttes for å bestemme den beste posisjonen for fargestoffet anvendelse ved å identifisere posisjonen til små klynger (omfattende den γ-glomerulus). den mest kritisk trinn under målingene er å unngå både forskyvning og bleking av prøven. Vridningen kan unngås ved forsiktig å posisjonere Ringer strømningen under mikroskopet. Som å begrense bleking av området av interesse, bør måletiden reduseres til den essensielle .Bolus lasting farging med kalsiumfølsomme fargestoffer kun girbegrenset kontrast siden friske celler generelt har lavt kalsiumnivå og dermed vise svak basal fluorescens. Bruk av aktivitet korrelasjon bildebehandling omgår denne begrensningen ved å generere kontrast basert på aktivitet og høydepunkter strukturer med tilsvarende kalsium signaler. Dette innlegget kjøp analysemetode beregner korrelasjonsfaktor mellom kalsium signal av en valgt region av interesse (referanse spor), og at i hver enkelt piksel i 3D volumet. Derfor er resultatene som oppnås sterkt avhengig av aktiviteten mønster valgt som referanse spor. Hvis hovedfokus er å visualisere mitral celle innerverte mønstre, er et referansesignal utledet fra spontane neuronal aktivitet foretrukket, og velge de mest aktive mitral celler vil gi de beste resultatene. For å avsløre lekkasje fra kjemiske eller termosensitive nettverk av mitral celler, bør referanse spor bare inneholder svar på enten histidin eller kald Ringer velges. Utvelgelsen av en hel glomerulus or mitral celle soma som region av interesse kan ikke alltid gi en klar referanse spor, spesielt hvis de strukturene som svarer på de to forskjellige stimuli blir liggende oppå hverandre. I et slikt tilfelle, er det ofte nyttig å velge et mindre område av glomerulus eller celle-legeme som region av interesse.
I de siste tiårene har electroporation blitt beskrevet som en effektiv metode for å flekke én eller flere celler 11,12. Her er det brukt for å spesifikt merke olfactory reseptor nerveceller. Dekstran-konjugerte molekyler gi den høyeste effektivitet, og for ikke-kalsiumfølsomme fargestoffer, er utvalget av utvalget bredt og dekker hele spekteret vanligvis brukes i fluorescens mikroskopi 13. Men kalsiumfølsomme fargestoffer som er vellykket electroporated inn olfactory reseptor nerveceller er i øyeblikket begrenset til kalsium-grønn dekstran, og Fluo-4 dekstran om fortsatt kommersielt tilgjengelig. Dessuten opptakene primært mot superficial lag på den ventrale overflaten av luktelappen eneste, siden inntrengningsdybden av raske måleteknikker er begrenset. To-foton avbildning kan delvis overvinne denne begrensningen, men ofte mangler hastighet og begrenser mengden av valgbare kalsiumfølsomme fargestoffer ytterligere.
Vi er beskrevet her er en protokoll for å måle temperatur-indusert aktivitet i luktelappen. Hjernen neuropil blir skannet som et tredimensjonalt volum for å visualisere de komplekse mobilnettverk som er involvert i det olfaktoriske behandling av temperatur. Måling av temperatur-indusert aktivitet i luktelappen har nylig blitt rapportert 5 og krever en spesielt tilpasset prosedyre å kombinere forskjellige teknikker. En stor ressurs av teknikkene presentert ovenfor er at hundrevis av cellene er avbildes i tre dimensjoner i et preparat der de fleste av luktsystemet forblir intakt. Disse fordelene setter høye krav til fargeteknikker, så vel som hjernen poppreisning og bildebehandling. For eksempel, celle elektroporering og bolus lasting treffer store mengder celler i det olfaktoriske epitel og pære, og således muliggjøre visualisering av komplette mobilnettverk. Videre levering av kjemiske indikatorer via bolus lasting i stedet for genetisk kodede fluoroforer muliggjør målinger i en potensielt større sett av arter. Andre alternativer som bad inkubasjon med AM fargestoffer primært arbeide i skiver som skader luktelappen alvorlig, slik at bare noen få hundre mikrometer intakt vev. Til sammenligning er hele mount forberedelse brukes i vår protokoll sikrer for eksempel at den bilaterale innervasjon av γ-glomerulus forblir intakt og opptakene blir dermed tatt i en fortsatt operativ system. Endelig er bildebehandling selv gjort av line-belysning mikroskopi tillater kjøp av 3D-volumer. Linje-belysning mikroskopi er en av de confocal teknikker som gir høyest mulige oppkjøpsprisene 6 </ Sup>, som er nødvendig for å dekke en stor del av luktelappen. Langsommere innhentingssystemer kan anvendes, men har den ulempe at størrelsen av den innspilte volum må reduseres. I de senere år, har andre metoder for rask bildeoverføring er utviklet og kan anvendes som alternativer 14,15. Likevel er line-belysning mikros en av de enkleste metodene for å få både tilstrekkelig hastighet og oppløsning. Her følger litt informasjon som retningslinjer for valg av egnede bilde oppsett. Siden kalsium bildebehandling gjøres innen fra tykke hjerne preparater, bør oppsettet gi anstendig confocality og målene bør ha numeriske åpninger på 1,0 eller høyere. For et referansepunkt, opptakene tatt med linjen belysning mikroskop tilsvarer bilder som er tatt med en standard laser scanning mikroskop med et pinhole størrelse på 0,5-1 luftige enheter. Rask oppkjøpet hastighet er ønskelig. Et volum med en tykkelse på 20 um dekket av minst 5 lAyers, en lateral synsfelt på 100 pm x 100 pm og en pikselstørrelse på 0,5 pm eller mindre, bør skannes ved en hastighet på minst 1 Hz per stabel. Redusere confocality kan øke mengden av fotoner telles og dermed gir mulighet for raskere oppkjøp dersom det er nødvendig, men har den ulempen med å samle inn mer ut av fokus lys. Imidlertid, siden en slik tilnærming øker tykkelsen av de optiske skiver, det kan faktisk lette sporing av dendritter gjennom forskjellige z-plan etter påføring av ACI 6.
De nødvendige verktøy for å grundig studere temperatur behandling i luktelappen nettverk presenteres her. Temperatur-indusert aktivitet er registrert i første og andre ordens nevroner via kalsiumfølsomme fargestoffer og signaler både ankomst og avreise fra γ-glomerulus. Videre i hvilken grad enkelt mitral celler behandle både kjemiske og temperatur kan vurderes. Da fremstillingen leaves luktelappen intakt, kan rollen til den bilaterale innervasjon i det olfaktoriske behandlingen bli ytterligere undersøkt. Fremgangsmåten er også nyttig for å avdekke hvorvidt og hvordan termo og chemoinformation er kodet i overlappende lukt nettverk 5. Endelig er de teknikker som er nevnt ovenfor ikke er begrenset til studiet av temperatur responser i luktelappen, men kan anvendes for en mer generell vurdering av den olfaktoriske system, spesielt cellulære prosesseringsnettverk i store tredimensjonale volum. Bolus lasting og aktivitet korrelasjon bildebehandling er kraftige verktøy for å observere og sammenligne aktiviteten av dusinvis av nerveceller, noe som gjør dem gjeldende for forskjellige hjernenettverk 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
