Introduction
エージングは、心血管石灰化1の漸進的増加と関連しています。血行動態的に重要な大動脈弁狭窄症は、65 2歳以上の人口の3％に影響を及ぼし、さらには中程度の大動脈弁狭窄（3-4メートル/秒のピーク速度）を有する患者は、40％未満の5年無イベント生存率を持っています3。現在、そこに大動脈弁の石灰化の進行を遅らせるために有効な治療法はなく、外科的大動脈弁置換術は、高度な大動脈弁狭窄4のための唯一の可能な治療です。
大動脈弁石灰化の開始および進行に寄与するメカニズムのより深い理解を得ることを目的とした研究は、大動脈弁狭窄5、6を管理するための薬理学的および非外科的方法に向かって移動中の重要な最初のステップです。遺伝学的なLY-変更されたマウスは、種々の疾患に貢献し、今大動脈弁狭窄6、7、8の生物学を理解することを目的とした機構研究の最前線に来ているメカニズムの理解を開発する上で大きな役割を果たしてきました。アテローム性動脈硬化症や心不全、血管および心室機能を評価するための標準プロトコルは大部分がされているような他の心血管疾患とは異なり、マウスにおける心臓弁の機能のin vivoでの表現型に関連付けられている固有の課題は、十分に確立された-があります。最近のレビューは、多数のイメージングおよびげっ歯類9、10、11における弁の機能を評価するために使用侵襲的モダリティの長所と短所についての徹底的な議論を提供してきたが、今日まで、私たちはCOMPREを提供する出版物を認識していませんhensive、マウスでは心臓弁の機能を表現型のためのステップバイステップのプロトコル。
本稿の目的は、マウスにおける心臓弁の機能を表現型にする方法およびプロトコルを記述することです。すべての方法及び手順は、メイヨークリニック制度動物実験委員会によって承認されています。このプロトコルの主な構成要素は、麻酔の深さ、心機能の評価、および心臓弁の機能の評価を含みます。我々は、この報告書は、心臓弁疾患の分野の研究を追求に興味を持って研究者を案内するのに役立つだけでなく、この急速に成長している分野で、データの再現性と妥当性を確保するためのプロトコル標準化に関連する国内および国際的な対話を開始することを願っています。重要なことには、高解像度の超音波システムを使用して成功したイメージングは、基本Principでの理解を加工超音波検査の原理の知識（及び一般的に超音波検査で使用される用語）を必要とレ心臓生理学、およびげっ歯類における心機能の正確かつ時間効率の評価を可能にするために超音波検査での豊富な経験の。
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Protocol
1.材料および装置（表1、図1）を準備
- 超音波装置の電源をオンにします。動物のID、日付、および時刻（シリアルイメージング実験用）、およびその他の関連情報を入力します。
- 高周波超音波トランスデューサー、〜20グラムまたは20グラム〜より大きいマウスについての30 MHzのより小さいイメージングマウス用の40MHzを使用してください。
- 特定のモダリティのためのイメージングのECGゲーティングを監視心電図（ECG）にプラットフォームを接続します。
注：批判的に、これはまた、麻酔の適切な深さのいくつかの指標の一つとして用いることができる心拍数（HR）の瞬間的な計算を可能にします。 - 37°Cのプラットフォームを事前に加熱します。
注：すべての市販の超音波機器は、Bモード、Mモード、ドップラー心エコー検査のための画像取得を制御し、試験管理制御を提供する制御パネルを有しています。心臓測定ツールは、自動測定用のマシンに埋め込まれています心臓や弁膜機能の一般的な心エコーパラメータの計算。
2.イメージングと麻酔の誘導のためにマウスを準備
- そっと尻尾によるマウスをピックアップし、しっかりと首のうなじに動物を保持します。
- ノーズコーンに動物の鼻を導きます。 1％のイソフルランで麻酔の流れを開始します。動物がガスへの曝露の3〜5秒以内に鎮静剤を投与されていることを確認してください。
- 迅速かつ正確に前足と後足がプラットフォームのECGセンサ上に存在することを確認し、仰臥位でプラットフォームに動物を置きます。
- 穏やかにノーズコーン装置ヘッドを安定化し、尾を安定化させるために接着テープを適用するために接着テープを適用軽く、すべての四肢の粘着テープで動物を固定します。後足と前足の両方が生理的イメージングシステムにより、安定したクリアなECG信号の取得を確実にするために平らになるように置いてください。
- HRを確認してください。 IMAを使用してこれを行ってくださいECG機能を持つ、または外部ECGデバイスとプラットフォームを銀杏。ベースラインのHRは600〜700 bpmの間にあることを確認してください。 HRはどのような状況の下で450 BPMを下回らないことを確認してください。
注：手順の間、HRが原因麻酔に若干低下することがありますが、それはほとんどの場合で500拍以上である必要があります。 - （麻酔の安定状態に達するまで〜0.1％ずつ15秒毎）に応じて少しずつ麻酔の流れを調整します。
注：麻酔の安定状態は、上述した心臓パラメータが維持されている（ステップ2.5を参照）、動物が公然と様々な撮像ウインドウ上のプローブの配置からの刺激に応答しない状態です。重要なことは、これは、マウスでマークされたcardiodepressionになり、麻酔の外科的平面ではありません。長時間のイメージングセッションでは、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏の適用が推奨されます。 - 直腸体温計を使用して体温をチェックしてください。 36.5°Cと38°Cの間の温度にしてください。
注：適切に環境制御室では、加熱プラットフォーム上で、体温（直腸に測定されたが）結果的に、時間をかけて心血管血行動態に影響を与える交絡因子ではない、全体の手順の間に一定のままと。 - 細かい毛で使用するために設計された電気バリカンを使用して、胸から毛を剃り落とします。湿らせたペーパータオルできれいな胸を拭いてください。動物は、イメージングのための準備ができています。
注：これらは、長期実験で経時的に有意な皮膚刺激を引き起こすことができるように毛の化学的除去はまた、そのような化合物の使用を回避するため、実行することができるが。さらに、そのような化学ベースの脱毛製品の適切な適用および除去は、2~3分（〜10〜20％）により麻酔曝露の持続時間を延長することができます。麻酔導入から皮膚の準備が完了するまでの合計時間は3分未満を取る必要があります。
注：Bモード/ 2-D、Mモード、ドプラ（スペクトルパルス波ドップラーおよびカラーフロードップラー画像）の3つの画像を取得する際に使用される超音波モダリティがあります。胸骨傍と頂端の窓（ 図2）心臓及び心臓弁の画像を取得するために使用される二つの基本的なトランスデューサの位置があります。
- 各トランスデューサの位置からは、手動で変換器を回転させるとangulatingによってその長軸と短軸に、心臓の相対的な複数の断層画像を得ます。
注：アンギュレーションが胸壁上の固定点からトランスデューサの端から端まで移動することをいうながら回転は、ピボットまたは胸壁上の固定位置からトランスデューサをねじることをいいます。全ての超音波トランスデューサは、溝（ノッチ）、外部リブ、またはボタンの形で画像インデックスマーカーを持っています。 - ことを確認した超音波SIGNALは、それに応じてトランスデューサの位置を調整することによって、標的構造に対して垂直です。
- フローに送信された超音波ビームを平行に整列させることによってカラーフローおよびピーク速度信号を最適化します。超音波ビームと流れとの間の角度は60°未満であるべきです。
- コントロールパネルのコントロールを使用して、画質を最適化します。取り調べの領域のみが画像表示を埋める必要があります。
注：トランスデューサとプラットフォームの位置の微調整はほとんど常に鮮明な画像を得るために必要です。でも内部の解剖学で最適な条件、呼吸運動、胸壁の解剖学（ 例えば、小リブの間隔）、および変形中に（固有および疾患誘発性の両方）は、音響窓を制限し、画像取得が非常に困難にすることができます。 - Mモードと2-D / Bモードでの左心室の寸法を測定する場合、ほとんどの連続エコーラインで測定キャリパーを配置します。
- カラードップラーセクターANを調整パネル上で検出されたセクタの制御を調整することによって質問の面積Dサンプル体積。
注：ドップラー研究で色符号化方式は、血流の速度及び方向性を示しています。赤ドップラー信号は、変換器に向かって層状の血流を示しています。青色であるドップラー信号は、トランスデューサから離れる層流を示しています。 「モザイク」カラーパターンは、（一般的に弁膜狭窄症または弁膜逆流で発生する）乱流または非層の血流の領域を示しています。 - オフライン分析のための各撮像窓からのリアルタイムのBモード/ 2Dエコーの2つの5秒のストリップ（または100フレーム）の最小値を記録します。
注：市販のエコーマシンがフレームまたはシネループサイズの予め設定された番号をキャプチャ画像取得の設定を持っています。長いシネループを取得することができるように、画像収集の設定を変更することができます。高品質な画像の取得は、豊富な経験と実験が必要です。 Investigatorsは、多くのビューや音響窓から画像を取得するために、トランスデューサの配置とプラットフォームの角度の適切な組み合わせを見つける必要があります。
4.大動脈弁の評価（AV）機能
注：大動脈弁機能のアセスメントは、バルブの定性評価（ 例えば、知覚されるカスプ厚増加による弁石灰化にエコー輝度、およびプレゼンスやカラードプラを用いて、逆流ジェットの不在）とバルブ機能の定量的尺度を含む（ 例えば、ピークtransvalvular速度およびカスプ分離距離）。
- Bモード画像の取得を選択して画像に大動脈弁を始めます。
- しっかりプラットフォームと離れた研究者から直面して頭の上に固定した動物では、左側のテーブル15-20°を傾けます。これは、胸壁に近い、前方心と左方向をもたらすでしょう。 Aの上に直接変換器に超音波ゲルの寛大な量を適用しますか、ニマルの胸。
- 後方に向いてトランスデューサ（ 図2）の画像インデックスマーカーを有する心臓の長軸と約90°垂直parasternallyトランスデューサを、置きます。 AVが見えてくるまで、2D / Bモードにある間、トランスデューサ頭をスライドさせます。これは、大動脈弁の「短軸」の図です。
注：通常の大動脈弁は、収縮期に広く開いて、血液のない逆流が戻って左心室に存在しないように、拡張期に十分に閉じて3薄い尖を持っています。カスプは非常に急速に移動し、非常に薄く、そして多くの場合、視覚化するために挑戦することができます。 - 画像インデックスマーカーポイントの尾側までトランスデューサを時計回りに回転させます。大動脈基部、大動脈弁、左心室流出路、僧帽弁、左心房、および画像表示上の右心室流出路の一部を観察します。
注：これはAVの「傍胸骨長軸」の図です。音波検査すべきその後のMモード画像および分析（下記参照）を可能にするBモード画像で心臓サイクル全体を通して見える2大動脈弁尖があることを確かめます。 - このビューで大動脈根を評価します。大動脈基部の画像は大動脈基部の最大寸法が含まれるように慎重に前後に掃引。マシンに埋め込まれた測定ツールに関連する電子キャリパーを使用して、大動脈の最大の前後寸法を測定します。
- 長軸で大動脈弁の位置を確認します。唯一の大動脈弁は、コントロールパネルの画像の幅ボタンを調整することにより、画像表示になるように画像の幅を減らします。それは正確に大動脈弁尖の分離を評価するために大動脈弁の先端と交差尋問のMモードラインを配置します。
- 大動脈弁のMモード表示では、measurに関連する電子キャリパーを使用して、カスプ分離距離（収縮期中の箱のような外観）を測定マシンに埋め込まementツール。
注：Mモード画像の最大の利点は、大動脈弁の機能を評価するために必須である非常に高い時間分解能です。 AVのMモード画像は、短期および長期軸ビューの両方で取得することができるが、撮像面は検査技師が容易に先端の向きと位置を識別することができるので、胸骨傍長軸図が一般的に好ましいです収縮期に尖。 - まだ大動脈弁の傍胸骨長軸ビューで、コントロールパネルのカラードプラコントロールキーを押しながら。大動脈弁の領域にカラードップラーを適用します。
注：収縮期に大動脈弁を通して左心室からの通常の流れは、トランスデューサに向かっているので、赤の符号化されています。 - 大動脈弁逆流の有無を文書化します。
注：大動脈弁逆流は、拡張期に発生した異常な流れであるとtransducから離れて向けられていますえー。したがって、青色符号化されます。 - パルス波ドップラーコントロールキーを押してください。コントロールパネルにあるトラックボールを使用して、超音波ビームと血流との間の角度が傾斜させることにより60°未満であることを確認して、ちょうど大動脈弁上に、近位上行大動脈にパルス状波サンプルボリュームを配置プラットフォームおよび/またはトランスデューサ。可能な場合は、胸骨上切痕ウィンドウから大動脈弁全体のピーク速度を得ます。
- マシン（ 図3Cおよび3F）に埋め込まれた測定ツールに関連する電子カリパスを用いてスペクトル表示のピーク速度を測定します。
注：モザイクカラーは、非層流パターンを含む可能性がある高流速を示しています。
僧帽弁（MV）関数の5評価
注：僧帽弁機能の評価は、バルブの定性的な評価を（ 例えば、当たりceivedカスプ厚起因弁石灰化、カラードップラーを用いて、逆流ジェットの存在または非存在）とバルブ機能の定量的な対策にエコー源性を増加させました。
- Bモードでの頂端の位置に変換器を配置します。それはマウス（ 図2C）の頭部に向かって傾斜しているように、変換器を配置します。右心室（RV）を観察し、左心室（LV）、右心房（RA）、および画像ディスプレイ上心房（LA）を残しました。動物は、それはLVに開くと僧帽弁を視覚化する「ヘッド・ダウン」の位置にあるように、手動で少しプラットフォームを傾けます。
注：頂端4室ビューが僧帽弁と三尖弁のほか、僧帽弁輪の組織速度を横切って血流速度を調べるための最適な図です。これはまた、RVおよび心室中隔の動きや大きさを評価するための良い図です。 - 心尖部4腔像からは、画像の幅を減少させることによって、焦点の僧帽弁をもたらします。僧帽弁尖が2つの薄い、モバイルフィラメントが開き、各心周期中に閉鎖として表示されていることを確認します。
注：「ノーマル」マウスの僧帽弁リーフレットは、イメージングは、生理学的HR（ すなわち、> 450 BPM）で行われた場合に可視化することは困難です。 - リーフレットの厚さを評価するために、僧帽弁全体でMモードカーソルを置きます。
注：それは超音波ビーム（ 図4）に垂直であるとき、前尖が最高の収縮期に可視化されます。 - 心尖部4腔像を使用して、拡張期僧帽弁を介して画像を左心房からの流れをカラードップラーを適用します。僧帽弁逆流のために確認します。
注：フローは、トランスデューサに向けられているため、赤色の符号化されています。逆流の流れは青エンコードされ、収縮期（ 図5）の間に発生します。 - 頂端長軸ビューを使用して、パルス波モードに切り替えます。の先端にドプラサンプルボリュームを移動僧帽弁尖。僧帽弁流入スペクトル表示の2つのピークを注意してください。リーフレットはよく可視化されていない場合は、明るい赤またはモザイク色のパターンで領域を識別し、その時点でサンプルボリュームを配置するカラードップラーを使用しています。
注：僧帽弁の流れのスペクトル表示が遅いのHR（<450 BPM）で2つのピークを有しています。通常の時間で（> 450 BPM）、早期（E）および後期充填は、（A）フローが融合しています。僧帽弁を横切る流れのスペクトルドップラ表示は、左心室拡張期機能（ステップ7.5参照）の評価に使用されます。
右側心臓弁の機能の6評価
注：三尖弁及び肺動脈弁は、右側心臓弁を備えます。肺動脈弁は胸骨傍の長短軸の両方のビューにおいて可視化することができるが三尖弁を容易に、頂端の長軸像で可視化することができます。
- 頂端長軸から見ると、トランスデューサの先端のuを傾けたりポイント右心室は、画像表示の中心になるように揺動運動を歌います。唯一の右心室を画像表示に表示されるように画像の幅を減らします。
- 同じ画像面では、右心房と右心室の間に、各心周期にわたって開閉と薄く、モバイルフィラメントを表示さ三尖弁リーフレットを、可視化します。
- 三尖弁の領域でカラードプラを適用します。三尖弁逆流のために注意してください。
注記：通常のフローが拡張期中に発生し、変換器に向けられ、したがって赤色符号化されます。異常な逆流フローは収縮期の間に起こる、離れトランスデューサから導かれ、従って青色符号化されます。逆流ジェットのピーク速度は、右心室収縮期圧を推定するために使用されます。 - 大動脈弁のレベルで傍胸骨短軸の位置にトランスデューサを移動します。大動脈弁の上に右心室OUTFです低管、肺動脈弁、近位主肺動脈、左右の肺動脈（ 図6）。
- 修正された胸骨傍長軸位置にトランスデューサを時計回りに回転させます。その後、肺動脈弁の短軸像を得るために、やや上向き変換器を傾けます。
- このビューでは、肺動脈弁尖（ 図7）の分離距離を評価するために、Mモード画像を適用します。
- 弁閉鎖不全（拡張期にモザイクパターン化、高速のジェット）及び狭窄症（収縮期のモザイク柄、高速のジェット）のために評価するために、肺動脈弁の領域においてカラードップラーを適用します。
- パルス波制御キーを押して、ちょうど肺動脈弁の後にサンプルボリュームを配置します。
注記：流れのスペクトルドップラ表示の分析は、肺動脈圧（ 図8）を推定するために使用されます。
心機能の7評価
例えば、駆出率、局所壁運動異常、および壁の知覚される厚さの目測）と左心室の定量的尺度機能（ 例えば、駆出率、左心室重量、左心室の拡張機能、および心筋性能の指標）。
- 乳頭筋のレベルで傍胸骨短軸位置トランスデューサと、2D / BモードでLVの短軸ビューを取得します。トランスデューサを上下に移動し、頂点にベースからLVをスキャンします。壁運動異常を観察します。
- 左心室の胸骨傍短軸から見ると、コントロールパネルにあるMモードボタンを押してください。トラックボールを使用して、乳頭筋とobtaiのレベルで左心室腔の中心にMモードカーソルを合わせnはMモード画像。
- 拡張末期における左心室腔の寸法を測定し、ここで前壁と後壁との間の距離が最も大きい、との両方の前部と後部の壁の内側への動きが最大であるにおける収縮末期、（ 図9）です。
- 拡張末期と収縮末期に前部と後部壁の厚さを測定します。
注：乳頭筋が正しい撮像面を確保するために不可欠なランドマークであるが、いずれの測定に含めないように注意してください。 - 頂端ウィンドウにトランスデューサを移動します。ステップ5.1を参照してください。頂端長軸ビューで僧帽弁全体の血流のパルス波ドップラーを使用して、左心室拡張期機能を評価します。
- 僧帽弁尖の先端にサンプルボリュームを配置します。僧帽弁全体のパルス波ドップラー速度のスペクトル表示からのピーク僧帽弁流入速度を測定します。
- LV INFL間のサンプル容量を置きOWと流出。僧帽弁と大動脈弁の開閉信号に注意してください。等容性弛緩時間、等容性収縮時間、および左心室駆出時間（ 図10）を測定します 。
- 頂端長軸ビューで僧帽弁輪の組織ドプライメージング（TDI）を実行します。 TDIコントロールキーを押して、僧帽弁輪の内側面にサンプルボリュームを配置します。サンプル容量が僧帽弁尖を侵害していないことを確認してください。 0.21ミリメートルと0.27ミリメートルの間のドップラーサンプルボリュームのサイズを保ちます。僧帽弁輪（ 図11）の早期拡張期速度（E '）を測定します。
8.最終手順
- 取得した画像を確認します。すべての必要な画像が得られたことを確認。
- マウスの胸から余分な超音波ゲルを外し、静かに所定の位置に動物を固定テープを外します。麻酔をオフにします。
- 吸収紙タオルで動物を置きます（吸引することができますまたは復元中に気道をブロックすることができない寝具、）。胸骨の横臥位になるまで動物を観察します。麻酔が適切に投与された場合、回復は30〜60秒以内に発生する必要があります。
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Representative Results
日常的に動物の心臓の超音波画像から得られる画像の例は、この原稿に含まれています。動物の胸にトランスデューサ配置の図が読者に変換器が記載されているように画像を取得するように配置されるの明確な理解を与えるために設けられています。超音波実験室セットアップの写真はまた、適切な装置、特に、使用される超音波トランスデューサと麻酔の方法の重要性を強調するために含まれています。 2D / Bモード、Mモード、カラードップラー、正常および異常な弁のディスプレイ、右心室および左心室と大動脈根が適切に標識されています。ひずみ速度イメージングが日常的に行われていないが、例も含まれています。
僧帽弁逆流は、S中に弁を横切って高い、通常、非層状血流速度（モザイク着色）することを特徴としますystole（ 図5）。 ECGトレース中のQRS群の後に発生するMV全体の左心房、左心室から、このようなモザイクカラードップラーフローパターンの存在は、MRの明確な診断を可能にします。これは、大動脈弁逆流および/または左心室機能障害の不存在下で発生した場合、これは、単離された僧帽弁逸脱として特徴付けることができます。左心室（これは実験的に誘導する心不全または麻酔の過剰な深さ）の著しい拡張がある場合、これは、虚血性僧帽弁逆流（または心機能不全に続発逆流）として特徴付けることができます。パルス波スペクトルドップラ表示は、血流の逆流ジェットの存在およびタイミングを確認するために使用することができます。
通常の大動脈弁が開き、各心周期の間に十分に閉じて3薄く、柔軟な尖を持っています。大動脈弁尖の分離は、2D-案内さで測定されます長軸ビューで大動脈弁のMモード。電子キャリパーは、左大動脈尖の先端に右大動脈尖（ 図3）の先端から測定するのに使用されています。正常マウスにおける大動脈弁尖分離距離は、0.9〜1.3 mmです。カラードップラーでは収縮期バルブ前後と大動脈根への層流を示しています。乱流は、大動脈弁逆流と同様に、増加した流量の条件で認識、または大動脈弁狭窄症のように、圧力を増加させることができます。これは、流出路内のモザイク着色として示されています。大動脈弁逆流の少量でも起因亢進、心機能にピークtransvalvular速度の大幅な増加をもたらし、左心室前負荷を増加することができます。正常マウスにおけるピーク大動脈速度1.50メートル/秒0.90メートル/秒の範囲です。 > 5メートル/秒のピーク大動脈弁の速度は、重度の大動脈弁狭窄症を有するマウスで記録されています。
12（ 図8）の指標を提供するために使用することができます。肺動脈加速時間は、ピーク流速の収縮期肺動脈流の開始からの時間間隔です。右心室駆出時間は、収縮期肺動脈収縮期流の停止がある点まで右心室駆出の開始との間の間隔です。右心室駆出時間に肺動脈加速時間の割合の減少に短縮肺動脈加速時間の組み合わせは、（肺動脈または右心室圧の侵襲的または直接的尺度を用いて確認することができる）、肺動脈高血圧症の存在を示唆しています。
図1：動物C超音波研究所ardiac。実験室は、高周波（30 MHzおよび40 MHz）のトランスデューサ（MS 400およびMS 550D）、イソフルランディフューザー、動物プラットフォーム、温度および心拍数モニター、1％〜1.5％イソフルランと小動物専用の超音波装置が装備されていますイソフルランディフューザ100％O 2、毛かみそり、超音波ゲル、電極ゲル、粘着テープ、紙タオルに接続された1 L /分、100％O 2、ノーズコーンとチューブと混合しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：基本的なトランスデューサ体位。 （A）胸骨傍ウィンドウ。トランスデューサヘッドは、尾側指向トランスデューサの画像インデックスマーカーと、左胸骨傍の境界に位置しています。金曜日OMこの位置、左心室、大動脈弁、及び大動脈根の長軸図及び肺動脈弁の短軸像を得ることができます。胸骨傍ウィンドウ（B）は 、トランスデューサヘッドは、後方に向けられたノッチと、反時計方向に回転させます。この位置から、左心室と大動脈弁及び肺動脈弁の長軸ビューの短軸像を得ることができます。 （C）アピカルウィンドウ。トランスデューサヘッドは、心臓の頂点に位置しています。この位置から、右心室および左心室と僧帽弁と三尖弁の長軸像を得ることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：規範で大動脈弁機能の評価石灰大動脈弁疾患を持つマウスにおける大動脈弁の機能対アルマウス。 （A）長軸ビューで正常な大動脈弁の2D画像。大動脈弁が収縮期にも開くことに注意してください。 （B）Mモード画像は、通常の大動脈弁機能（箱状の外観）を示します。カスプ分離距離は1.12ミリメートルで測定されることに注意してください。通常の大動脈弁全体のピーク速度の（C）スペクトルドップラー表示は、1.3メートル/ sでmeauredました。 （D）欠乏、低密度リポタンパク質受容体（LDLR - / - ）から長軸ビューにおける石灰化大動脈弁の2D画像と西洋食を与えたアポリポタンパク質B100のみ（アポB 100/100）マウス。尖は肥厚しており、収縮期に制限された開口部に生じるエコー輝度を、増加しています。 （E）は、同じ狭窄大動脈弁を示すMモード画像は、0.7mmでカスプ分離距離の測定を示します。 （F <狭窄大動脈弁全体のピーク速度の/ strong>の）スペクトルドップラ表示は4.6メートル/秒でmeauredました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：通常の僧帽弁のMモード。頂端ウィンドウから、僧帽弁の長軸像が得られます。質問のMモード線は、僧帽弁尖に印加されます。僧帽弁のリーフレットの厚さは、理論的に電子ノギスを用いて測定することができるが、これは薄く、不十分なエコー発生与えられた非常に挑戦すること、及び急速に正常な僧帽弁のリーフレットを移動することができます。矢印は、収縮期における僧帽弁尖のMモードを指します。 CLIくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらのCK。
図5：カラードップラーイメージングを使用して、僧帽弁逆流ジェットの証拠。胸骨傍ウィンドウから、僧帽弁の変形長軸像が得られます。カラードップラー問い合わせは（矢印で強調）収縮期の僧帽弁でモザイク色のジェットを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：主肺動脈とその主要な枝の長軸ビュー。主肺動脈の長軸ビュー（MPA）および右（RPA）及び左（LPA）ブランチがparasteから得ることができ rnalウィンドウ。右心室流出路（RVOT）、肺動脈弁（PV）、および大動脈（AO）が部分的に見られます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：通常の肺動脈弁を描いたMモード画像。胸骨ウィンドウから、肺動脈弁の両方の短期および長期軸像を得ることができます。質問のMモード線は肺動脈弁に印加されます。肺動脈弁尖分離（矢印）の距離は、この図から測定することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図8：肺動脈弁を横切る流れのパルス波ドップラー尋問。肺動脈の加速時間（PAAT）は、ピーク流速の収縮期肺動脈流の開始からの時間間隔です。右心室駆出時間（RVET）は流れの停止がある点まで右心室駆出の開始との間の間隔です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：左心室の短軸ビューを描いたMモード画像。胸骨傍ウィンドウから、左心室の短軸像をするよう後方にまたは背反時計画像インデックスマーカ点をトランスデューサヘッドを回転させることによって得られます。 M-MOD質問のe線は、乳頭筋のレベルで左心室に印加されます。左心室拡張終期寸法（LVEDD）、左心室収縮終期寸法（LVESD）、及び前壁（AW）および後壁（PW）の厚さを容易に測定することができます。いずれの測定で乳頭筋（*）を含めるしないように注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10：カラードップラー評価と僧帽弁流入のパルス波ドップラースペクトル表示。 （A）頂端長軸図で僧帽弁流入のカラードップラー評価を示す画像。 2Dカラードプラ画像はグラムのための重要なツールであることに注意してください（パネルBに示されている）、パルス波ドップラー追跡の取得のための適切なサンプルボリューム位置をuiding。 （B）、パルス波ドップラーを使用して、僧帽弁流入のスペクトル表示。 （頂端長軸ビュー）僧帽弁を横切って血流のパルス波ドップラー評価は、左心室拡張期機能を評価するために行われます。サンプル体積は、僧帽弁尖の先端に配置されています。等容性弛緩時間（IVRT）、等容性収縮時間（IVCT）、左心室駆出時間（LVET）、ピーク僧帽弁流入速度（E）は、すべての僧帽弁の両端のパルス波ドップラー速度のスペクトル表示から導出することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Fiのグレ11：中隔僧帽弁輪の組織ドップラーイメージング。頂端ウィンドウから、僧帽弁の長軸像が得られます。組織ドプラサンプルボリュームは、僧帽弁輪の中隔領域に配置されています。ピーク僧帽弁流入速度（図10（b）中の変数E）及び（eピーク僧帽弁輪の組織速度の比」（白い矢印で示されるが、）、左心室拡張期機能を評価するために使用される一般的E / Eと呼びます」）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図12：左心室心筋のひずみとひずみ速度の評価。そこに特殊な解析ソフトウェアパッケージが市販されており、歪み及び歪み速度変数とすることができます内因性の心筋の収縮特性の初期またはサブ臨床変化の尺度として得られます。上に示した例は、マウスにおいて、一般的に取得された撮像面における半径方向の歪み及び歪み速度を示します。これらの撮像面（や歪みトレーシングのその後の形状）が頻繁に頂端長軸または4室ビューで取得されたヒトでの画像とは異なることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
麻酔導入
適切な麻酔の導入および保守は、マウスの心臓弁の変化の正確な評価や心機能のために重要です。イソフルランによって誘発される麻酔の迅速な誘導と深い麻酔後にこの麻酔薬の比較的長いウォッシュアウト時間を考えると、我々は誘導のために、スタンドアロンの麻酔室を使用しないでください。上記で詳細に述べたように代わりに、動物を麻酔の比較的低濃度の麻酔の迅速かつ制御された誘導を可能にする麻酔コーンに直接導かれます。
マウスのほとんどの株は十分に1.5％未満のイソフルランで鎮静状態に残ります。心機能に対するイソフルランの累積的影響は密接しかし、監視する必要があり、および麻酔薬の濃度の小さな減少は、時間の経過とともに必要になることがあります。相互に、麻酔薬の濃度の小さな増分もねかもしれeded。 （麻酔の不十分な深さを示唆する）任意の移動のためにとHRの増加または減少のために動物を慎重に監視します。これは、麻酔の深さを迅速かつプロアクティブな管理を可能にします。
ヒトとは対照的に、イソフルラン、マウスにおけるHRの減少を誘発します。左心室機能が最初に過度の麻酔の投与期間中に保存することができる一方で、HRの減少は、ほぼ普遍的に心臓の収縮の抑制に続発する左心室拡張が続いています。したがって、駆出率は、transvalvular（大動脈弁および僧帽弁）ピーク流速が低下低下、大動脈弁の閉鎖は、初期発生、および組織ドップラー速度は減少します。連続的にHRが良く450 BPM上に残ることを保証するために、動物の生理的状態を監視することが肝要です。イメージングマウスで経験されていない個人、専用の超音波検査技師を含みアプローチとのため麻酔深度を監視する専用の第二の研究者が推奨されます。
AV機能の解析
心エコー検査ガイドラインの臨床的には、アメリカの社会13左室流出路の直径とパルス波ドップラーを使用して、左心室流出路速度の取得をお勧めします。 AVA =（CSA LVOT X VTI LVOT）/ VTIのAV：ピークトランス大動脈弁の速度は連続方程式を用いて、大動脈弁の領域を計算するために、専用の連続波ドップラーを用いて測定することがshuld。これらのドップラーデータが存在しない場合には、2Dまたは3Dによって測定されるように大動脈弁のオリフィスの解剖学的（幾何学）断面積が推奨されます。トランスデューサは、高い空間分解能と時間分解能を有するが、大動脈弁尖は、一貫して短軸ビューで線引きすることはできません。これにより、AVオリフィス面積を正確に追跡することができません。 Furthermore、そしておそらくもっと重要なのは、現在利用可能な高周波小動物専用の超音波は、専用の連続波ドップラー機能が装備されていません。したがって、連続の式で使用するための「真」のピークtransvalvular速度の同定は非常に困難である（と臨床的に受け入れられないであろう）。同様に、他の市販の超音波プローブは、非常に高い速度を記録する機能を持っていない可能性があり、したがって、より低い速度に制限されています。これらの主な制限を考えると、小動物に高解像度イメージングに向けたシステムを使用して、臨床画像化プロトコルが十分に捕捉できません。
MV機能の解析
一般的に、マウスは、僧帽弁逸脱の発展に非常に耐性があります。急速なHRの設定で、僧帽弁を横切る逆流ジェットの可視化は、非常に挑戦することができます。また、人間の心エコー検査で、anteriまたはおよび後部僧帽弁尖が明らかと脱出したり、容易に認識されているリーフレットを動揺しています。しかし、マウスでは、僧帽弁のリーフレットは、前部と後部によく線引きすることはできません、と動揺や脱出リーフレットを見つけることは、非石灰化、薄い組織のエコー輝度の低レベルを考えると、非常に困難です。したがって、逆流ジェットを表示するカラードプラの使用は、マウスにおける僧帽弁の機能を評価するための最も有用な手段です。孤立した僧帽弁逆流の診断は慎重に左心室機能、大動脈弁の機能、および僧帽弁の機能を評価した後にのみ行われるべきです。
現在までに、僧帽弁狭窄のない堅牢なマウスモデルはありません。石灰化を提案することができ、僧帽弁のエコー密度を増加したが、前方または後尖のいずれかへの局在化は困難です。臨床的には、僧帽弁狭窄症の診断は、制限付き厚く、石灰化したリーフレットの設定で作られていますエド運動。リーフレットの厚さの測定は、Mモード（ 図4）によって行うことができます。ドップラーを使用して、ピークE速度は通常増加し、圧力の延長部の半時間に関連しています。したがって、これらの機能を奪還すると、僧帽弁狭窄症の新規モデルの評価に重要です。心エコーのアメリカの社会は、僧帽弁領域の推定は圧力ハーフタイム（MV面積= 220 /圧力ハーフタイム）を使用して行われることをお勧めしますが、このような計算は、マウス13で検証されていません。
三尖弁及び肺弁機能の解析
三尖弁は、リーフレットモビリティ、弁膜狭窄、及び弁閉鎖不全のために評価されます。典型的に、これらのデータは、定性的及びバイナリ様式（ すなわち、存在または機能不全の非存在下）で発現されます。三尖弁逆流ジェットのピーク速度はestimatするために使用され電子右心室収縮期圧。さらに、三尖弁逆流は、通常、ストレスのないマウスでは珍しいことではありません。
肺動脈弁機能は、2D / Bモード、Mモード、カラーフローイメージング（ 図6及び7）によって評価することができます。これらの様式は、肺動脈弁の厚さ（2Dで例えば、可視性またはエコー源性）を評価する肺動脈弁のオリフィス開口（カスプ分離距離）を測定し、肺動脈弁の移動及び接合（2Dおよびカラードプラ）を評価するために使用されます。上記のように肺動脈弁逆流は、容易に、カラードプラと理解することができます。肺動脈弁逆流の重症度は、拡張期肺動脈弁を介して（パルス波ドップラーを用いて測定）ピーク逆行性血流を使用して評価することができます。
心機能の解析
短期および長期軸ビューで左心室の2D / Bモードイメージングは、VIS提供します心機能のUAL評価。このイメージングモダリティは、左心室機能の粗い評価を可能にする一方で、Mモードイメージングは、2D / Bモードイメージングと比較した場合、それより優れた技術なって、有意に高い時空間分解能を提供しています。これは、通常のマウスが450から700 BPMに至るまでのHRを持つことができるという事実を考慮すると、非常に重要です。データは非麻酔し、心臓生理学および血行動態の近い代表であるように、我々は450 BPM上記のHRを維持します。 HRは、過度の麻酔が原因で落下させる場合、および/または、左心室拡張、transvalvular血液速度および弁機能の他の定性的な特徴付け（中心収縮の推定値の減少、および劇的な変化、鎮静オーバー例えば、僧帽弁逆流の変化左心室の拡張、ピーク大動脈弁の流速の減少、および僧帽弁の血液流入速度の低下）に二次がしばしば観察されます。
セグメント壁運動異常、駆出率（EF）及び短縮率（FS）の非存在下でテント "> Mモード画像を使用して、左心室収縮機能の高度に再現可能な尺度。であり、最大の拡張期と収縮期の寸法が得られ、使用されていますEF、FS、及びLV質量14,15を算出します。これらの測定はすべて、自動的に超音波装置に関連したソフトウェアパッケージで計算することができます。心臓および弁機能の評価は、「標準」の臨床超音波システムを使用して行うことができるが、解像度の比較的低いレベル（ 例えば、12〜15 MHzのプローブ）が挑戦マウスにおける心臓および弁機能の正確な評価を行うことができます。
拡張機能は、左心室の機能を評価するの不可欠な部分です。臨床試験では、拡張期心不全は、高度にCであることが見出されています罹患率と死亡率とのorrelated。拡張機能は、パルス波ドップラー心エコー検査および組織ドップラーイメージングによって評価されます。 E / A比（初期の急速充填波、E、およびによる心房収縮、A後半充填波との比）とEの減速時間が原因の融合にマウスでの拡張機能の有効なパラメータではありませんEと適切に麻酔したマウスに存在する非常に高いのHRへの二次A波。
左心室拡張機能、ピーク僧帽弁流入速度、等容性弛緩時間（IVRT）、等容性収縮時間（IVCT）、左心室駆出時間、僧帽弁輪の組織を評価するために、速度（E '）が利用されます。これらのドップラーパラメータは容易に、入手、測定、および再現性があります。組織ドプライメージングで測定した僧帽弁輪の拡張早期速度（E '）は、ピークマイルとの間の比左心室の心筋弛緩の信頼できる指標でありますクトル流入速度と初期の僧帽弁輪の組織速度は、肺毛細血管楔入圧16とよく相関することが臨床試験で示されています。
グローバルな左心室機能もテイ指標として知られている心筋の性能指数を用いて評価することができます。これは、両方の収縮期および拡張期左室機能の統合指標を可能にするために、収縮期および拡張期の時間間隔の両方を内蔵しています。収縮機能障害は、前駆出時間（IVCT）を延長し、左心室駆出時間（ET）を短縮します。拡張機能または心筋弛緩の異常がIVRTの有意な延長をもたらすことができます。左心室の心筋の性能指数（MPI）はMPI = IVCT + IVRT / LVET 17として計算することができます。高いMPI値は、心機能障害を示唆するであるのに対し、この文脈では、MPIの減少は、心機能の改善と関連しています。
組織ドプラ
組織ドプラは、E、Eを使用して拡張機能を評価するために使用される '、およびE / E'の変数が、この方法は、現在広く使用されていないことができます。このように、齧歯類株の種々の変動および測定の再現性は、厳密に複数の研究グループによってテストされていません。それにもかかわらず、E / E 'および臨床環境で、左心房圧との相関関係を使用することは、初期のマウスにおける心機能障害の検出、疾患メカニズムの適用の可能性は、この心臓の結果を評価するの不可欠な成分せる可能性がありますトランスレーショナルリサーチにおける心臓弁膜症。
歪み率イメージング
小動物モデルは、非常に貴重なTであることが証明されています心機能の病態生理学的変化の根底にあるメカニズムを理解するためにOOL。 2Dとドップラー心エコー検査は、心臓の形態、機能、およびin vivoでの血行動態の包括的かつ非侵襲的な評価を提供するが、彼らは慢性圧力または容量過負荷に応答して心筋機能における早期の変化を検出する感度（誘導された最も一般的なストレス要因のうちの2つを欠いています）心臓弁膜症によって。
これらの制限の結果として、より正確に固有心筋の収縮特性の初期またはサブ臨床変化を検出する可能性を秘めているレート心筋歪みやひずみなどの心臓機能などの臨床的に使用されるインデックスのアプリケーションでの関心が高まっています。歪み及び歪み速度画像は、心不全18及び高血圧性心疾患19、心臓dysynchronyの反転の進行のげっ歯類研究に首尾よく使用されていますそして、心機能障害20、および若年マウス21で心の長手方向の機能。歪率イメージングは、心臓機能の徹底的な2Dおよび組織ドップラー由来の措置を補足するイメージング技術と見なされることが推奨されます。研究者らは、心筋のひずみとひずみ速度の測定の基礎となる原則の基本的な理解を持っていることを確認するために、後続のセクションでは、歪み計算および歪み速度イメージングの基礎となる基本原則や限界を提供することを目指します。
歪み及び歪み速度が元の長さに対する心筋の繊維の長さの変化に由来する（心臓病学において、端部拡張期長さと収縮末期の長さの差は、この計算のために使用されます）。心筋の繊維長の変化の正確な測定は、多方向に生じる、心筋繊維束の螺旋アーキテクチャによって複雑になります収縮期を通じてアル歪み変形（ラジアル、縦、周軸で例えば、歪み）。マウスにおける最近の研究は、組織ドプラderived-スペックル追跡由来歪み及び歪み速度変形パラメータは、固有の心筋機能22に密接に関連することを示唆しています。両方の技術は、23（ 図12の例を参照）、目的の変数の相対的に自動生成を可能にする研究用イメージングシステムに特化した解析ソフトウエアの追加を必要とします。
ストレインイメージングは約束を保持しているが、スペックル追跡分析のための高品質な2D画像の取得が困難な場合があります。また、手動でひずみ測定のための心内膜および心外膜の境界線をトレースすることは困難であり、面倒です。練習や画像を含むイントラ調査官測定（の再現性と一貫性の堅牢な評価にかなりの量品質、一貫性のあるイメージングプレーン、およびオフライン解析）心機能を評価するためのひずみ測定の使用を実装する際に重要です。したがって、ひずみとひずみ速度の分析は完全に盲目にすることによって行われるべきで、高品質で再現性のあるデータを確実にするために研究者を訓練しました。
ECGゲーティング高解像度超音波イメージング
組織ドプライメージングと歪率イメージングは、完全な心周期にわたる心筋変形の測定を可能にするが、それらの時間分解能（せいぜい5ミリ秒）に、彼らは、心臓24のグローバルな動きに制限されたまま。高フレームレート超音波画像化を達成するために、心電図同期データ収集の使用に基づく他のアプローチは、最近、心臓血管用途のために提案されています。心臓血管組織の心電図同期機械的および電気機械波イメージングは、高フレームで超音波を用いて組織を画像化に基づいています料金、秒あたり最大8000フレーム数（fps）、ECG信号24上の2次元画像取得を同期させることもできます。これは明らかに、および心室機能の評価のため、この撮像方法のインビボの実現可能性に （心拍数が〜マウスで500〜650拍である生理的条件下でより高い解像度を提供する）〜千FPSの2D / Bモードのフレームレートを上回る有します（小動物モデル25の心臓壁運動異常の優れた検出を提供する）麻酔した動物において実証されて。
ストレス誘発性心機能
運動負荷試験が頻繁に臨床的状況において生物ストレスを増加するために心臓の応答を評価するために使用されているが、げっ歯類では意識下鎮静および/または麻酔の必要性は、心臓機能の即時運動後の評価は非常に挑戦的になります。したがって、薬理学的ストレス試験は、臨床的である可能性が高いです心臓弁膜症（重症大動脈弁狭窄症、中等度から重度の僧帽弁狭窄症、および重度の主要な僧帽弁逆流）の心臓の影響を評価するための-relevant並列。これは、症状の状態を明確に心臓弁膜異常の動的コンポーネントを評価し、残り26で見逃される可能性がある無症候性心筋機能障害のマスクを解除するためにストレステストの役割を強調する最近の臨床ガイドライン与えられ、研究の特に重要な新興地域になります。
前の節で述べたように、マウスは後負荷誘発性心機能不全に極めて耐性があります。このように、ドブタミン負荷心エコーは、心臓弁膜症の様々なレベルとマウスでは明らかではないかもしれない左心室の初期の減少を検出するための非常に便利なツールかもしれません。重度の石灰化大動脈弁狭窄でさえマウスは比較的よく保存収縮機能を持っており、APPLための有用なプラットフォームを提供する可能性が高いことができますドブタミン負荷心エコーのicationは、これらの動物におけるタイミング（多くの場合、非常に迅速な）心不全の発症を予測します。これまでに、我々は、心臓弁膜症の任意の程度を有するマウスにおけるドブタミン負荷心エコーの使用を調査する任意の研究を認識していません。
3D心エコー検査
臨床的には、3D心臓イメージングは、拡張期および収縮期容積、ストローク量、心拍出量の正確な測定を可能にし、特に強力なツールです。 3D心エコー検査は、正確なバルブ面積測定による弁膜狭窄症の重症度の評価における新たな臨床標準となっている、そしてそれは、僧帽弁疾患における個々のセグメントの脱出の正確な同定および定量を可能にします。
高周波数トランスデューサとの研究超音波システムは、心臓ゲート制御画像の取得のために、その後のオフラインreconstrucを可能にカスタムソフトウェアパッケージを使用して、3D画像の化。それは、このハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使用して、左心室の3次元画像を取得することは可能であるが、これは、多くの場合、変化の生理学的重要性の外挿を行うこと、（HRを下げ、呼吸アーチファクトを最小化する）麻酔の比較的深いレベルで行われます心機能の難しいです。
マウスにおける心臓弁の機能を評価するための3Dイメージングの使用に関しては、これは、正常な生理学的条件下で心臓弁の小型、比較的低いエコー輝度、および高い速度を与えられた非常に困難な命題です。画像取得と処理における技術の進歩は、このような条件下での心臓弁の明確な識別を可能にするまでは、私たちの経験では、3Dイメージングは、マウスにおける心臓弁の機能の正確かつ徹底的な特性評価に限られて有用であることをされています。
まとめると、ハイテク小動物イメージングにおけるnologicalの進歩は、この心臓弁膜症とその心臓の影響の根底にある病態生理学的メカニズムへの洞察を得るために非常にエキサイティングな時間行います。私たちはしっかりと心臓弁の機能と心機能の両方の徹底的な評価は、マウスにおける心臓弁の機能の、遺伝薬理学的、または機械的操作の影響を理解するために不可欠であることを主張します。我々は、この原稿は、心臓弁疾患の病因の研究を追求する研究者のための有用なリソースとして機能するだけでなく、我々の研究コミュニティの中で、このような研究では心臓弁膜や心機能を評価するための最良の方法に関する議論に拍車をかけることを願っています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound machine | VisualSonics, Fujifilm | Vevo 2100 | |
| Isoflurane diffuser (capable of delivering 1 % to 1.5 % isoflurane mixed with 1 L/min 100% O2 | VisualSonics, Fujifilm | N/A | |
| Transducers for small mice (550D) or larger mice (400) | MicroScan, VisualSonics, Fujifilm | MS 550D, MS 400 | |
| Animal platform | VisualSonics, Fujifilm | 11503 | |
| Advanced physiological monitoring unit | VisualSonics, Fujifilm | N/A | |
| Isoflurane | Terrell | NDC 66794-019-10 | |
| Nose cone and tubing connected to isoflurane diffuser and 100% O2 | Custom Engineered in-house | -- | |
| Hair razor | Andis Super AGR+ vet pack clipper | AD65340 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | REF 01-08 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | REF 15-25 | |
| Adhesive tapes | Fisher Laboratories | 1590120B | |
| Paper towels |
References
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