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Biology

Histone बाद translational संशोधनों के विश्लेषण के लिए पूरा कार्यप्रवाह नीचे अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग: Histone निकासी से डेटा विश्लेषण करने के लिए

Published: May 17, 2016 doi: 10.3791/54112
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Epigenetics Program, Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

इस प्रोटोकॉल हिस्टोन बाद translational मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग संशोधनों निस्र्पक के लिए एक पूरी तरह से एकीकृत कार्यप्रवाह रूपरेखा। कार्यप्रवाह सेल संस्कृतियों या ऊतकों, हिस्टोन derivatization और पाचन, एमएस विश्लेषण नैनो-प्रवाह तरल क्रोमैटोग्राफी और डेटा विश्लेषण के लिए दिए गए निर्देशों का उपयोग करने से हिस्टोन शुद्धि भी शामिल है। 3 दिन - 2 प्रोटोकॉल के भीतर पूरा करने के लिए बनाया गया है।

Abstract

Nucleosomes क्रोमेटिन की सबसे छोटी संरचनात्मक इकाई, डीएनए के 147 आधार जोड़े हिस्टोन प्रोटीन का एक octamer के चारों ओर लिपटा से बना रहे हैं। हिस्टोन समारोह व्यापक बाद translational संशोधन द्वारा परमाणु प्रोटीन की एक बहुत बड़ी संख्या द्वारा मध्यस्थता है। इन संशोधनों के परमाणु अखंडता के लिए महत्वपूर्ण के रूप में वे जीन विनियमन, डीएनए की मरम्मत और गुणसूत्र संक्षेपण में शामिल क्रोमेटिन संरचना और भर्ती एंजाइमों को विनियमित कर रहे हैं। हालांकि वैज्ञानिक समुदाय का एक बड़ा हिस्सा हिस्टोन PTM बहुतायत को चिह्नित करने के लिए एंटीबॉडी आधारित तकनीक को गोद ले, इन तरीकों, कम throughput और hypermodified प्रोटीन के खिलाफ पक्षपाती हैं के रूप में मिलान पास संशोधनों से बाधित हो सकता है। इस प्रोटोकॉल हिस्टोन संशोधनों की सही मात्रा का ठहराव के लिए नैनो तरल क्रोमैटोग्राफी (एनएलसी) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के उपयोग का वर्णन करता है। इस विधि हिस्टोन PTMs की एक बड़ी विविधता है और कई हिस्टोन के रिश्तेदार बहुतायत को चिह्नित करने के लिए बनाया गया है भीतर वेरिएंटचिमनी का विश्लेषण करती है। लंबाई में 20 हूँ - इस प्रोटोकॉल में, histones propionic 5 की पेप्टाइड्स उत्पन्न करने के लिए trypsin के साथ पाचन द्वारा पीछा किया एनहाइड्राइड साथ derivatized रहे हैं। पाचन के बाद, हिस्टोन पेप्टाइड्स के नव उजागर एन Termini एनएलसी एमएस दौरान chromatographic बनाए रखने में सुधार करने के लिए derivatized रहे हैं। इस विधि के परिमाण के चार आदेशों फैले हिस्टोन PTMs के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है।

Introduction

एपिजेनेटिक्स जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन पैतृक कि अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम 1 फेरबदल के अलावा अन्य तंत्र द्वारा ही पैदा की अध्ययन के रूप में परिभाषित किया गया है। Epigenetic विनियमन के विकास के दौरान महत्वपूर्ण के रूप में जीव से होकर गुजरती है नाटकीय प्ररूपी परिवर्तन भले ही अपने डीएनए सामग्री को बदल नहीं करता है। वहाँ कई महत्वपूर्ण हिस्टोन बाद translational संशोधनों (PTMs), हिस्टोन वेरिएंट, गैर-कोडिंग RNAs, डीएनए मेथिलिकरण और डीएनए बाध्यकारी कारकों, जिनमें से प्रत्येक अलग तंत्र के माध्यम से 2 जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित सहित उचित epigenetic रखरखाव के लिए आवश्यक घटक हैं। उदाहरण के लिए, जबकि डीएनए मेथिलिकरण एक अत्यधिक स्थिर संशोधन है कि जीन अनुवाद 3, हिस्टोन वेरिएंट और हिस्टोन PTMs और अधिक गतिशील हैं और तरीके 4 की एक किस्म में क्रोमेटिन प्रभावित कर सकते हैं represses है।

हिस्टोन PTMs ज्यादातर एन टर्मिनल पूंछ पर स्थानीय कर रहे हैं के रूप में वे सबसे अधिक संपर्क में है और लचीला क्षेत्र हैंप्रोटीन की। हालांकि, nucleosome कोर भी भारी औसत प्रोटीन 5 की तुलना में संशोधित किया गया है। हालांकि हिस्टोन के निशान बड़े पैमाने पर पिछले एक दशक में विशेषता किया गया है, ज्ञात हिस्टोन के निशान और उनके कार्य के बीच कई लिंक अभी भी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं। यह काफी हद तक सच है कि अधिकांश हिस्टोन PTMs अकेला अन्य PTMs ( "पार बात") के साथ मिलकर में समारोह काम नहीं करते, बल्कि एक विशिष्ट प्रक्रिया प्रतिलेखन 6.7 के रूप में इस तरह के परिवर्तन करने के लिए की वजह से है। उदाहरण के लिए, जीन P21 पर मिश्रित मार्क H3S10K14ac अपने प्रतिलेखन, जो दो PTMs 8 का केवल एक ही साथ घटित नहीं होगा सक्रिय। प्रोटीन HP1 काम्पैक्ट H3K9me2 / ME3 पहचानने और आसपास के nucleosomes करने के लिए संशोधन के प्रसार के द्वारा chromatin। हालांकि, HP1 H3K9me2 / 3 के लिए बाध्य नहीं किया जा सकता जब आसन्न S10 फॉस्फोरिलेटेड 9 है। H3K4 के एसिटिलीकरण Schizosaccharomyces pombe 10 में H3K9me2 / ME3 के लिए प्रोटीन spChp1 के बंधन को रोकता है। इसके अलावा, हिस्टोन लाइसिन घemethylase PHF8 उच्चतम nucleosome बाध्यकारी दक्षता जब तीन PTMs H3K4me3, K9ac, और K14ac वर्तमान 11 हो गया है। इन उदाहरणों हिस्टोन PTM परिवर्तन का एक वैश्विक सिंहावलोकन प्राप्त करने के बजाय एकल संशोधनों पर ध्यान केंद्रित करने के महत्व पर प्रकाश डाला।

अनुक्रम की उपस्थिति भी वेरिएंट हिस्टोन विश्लेषण की जटिलता बढ़ जाती है, के रूप में हिस्टोन isotypes आम तौर पर अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों है, लेकिन अक्सर क्रोमेटिन में अलग-अलग भूमिका है। उदाहरण के लिए, H2A.x एक सी टर्मिनल अनुक्रम जो और अधिक आसानी से विहित H2A 12 की तुलना में डीएनए की क्षति पर phosphorylated किया जाता है, और यह पुरुष माउस अर्धसूत्रीविभाजन 13 में सेक्स क्रोमोसोम की निष्क्रियता के लिए आवश्यक है; इसी तरह, CENP-ए centromeres 14 में विहित हिस्टोन H3 विकल्प। उनके विभिन्न कार्यों के बावजूद, इन वेरिएंट संबंधित विहित हिस्टोन के साथ उनके अमीनो एसिड अनुक्रम के एक बड़े हिस्से का हिस्सा है, यह पहचान करने और उन्हें अलग से अंदाजा लगाना मुश्किल बना रही है। इस तरह के पश्चिमी सोख्ता के रूप में एंटीबॉडी आधारित तकनीक बड़े पैमाने पर histones को चिह्नित करने के लिए अपनाया गया है। हालांकि, एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण निम्नलिखित कारणों के लिए सीमित कर रहे हैं: (i) वे केवल एक संशोधन की उपस्थिति की पुष्टि कर सकते हैं और अज्ञात PTMs की पहचान नहीं कर सकते हैं; (Ii) वे सह मौजूदा निशान की उपस्थिति है, जो बंधन संबंध प्रभावित कर सकते हैं की वजह से पक्षपाती रहे हैं; (iii) वे मिश्रित निशान की पहचान नहीं कर सकते हैं, के रूप में केवल बहुत कुछ एंटीबॉडी इस तरह के प्रयोजन और (iv) वे अत्यधिक समान हिस्टोन वेरिएंट या इसी तरह के PTMs (जैसे, di- और लाइसिन अवशेषों की trimethylation) के बीच पार प्रतिक्रिया के लिए उपलब्ध हैं। Egelhofer एट अल। वर्णित है कि वाणिज्यिक एंटीबॉडी के 25% से अधिक डॉट धब्बा या पश्चिमी धब्बा द्वारा विशिष्टता परीक्षण असफल हो, और विशिष्ट एंटीबॉडी के बीच में 20% से अधिक क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रयोगों 15 में असफल। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) वर्तमान में उपन्यास और / या मिश्रित PTMs अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त विश्लेषणात्मक उपकरण है,और यह बड़े पैमाने पर हिस्टोन प्रोटीन (16 में समीक्षा) के लिए लागू किया गया है। यह ज्यादातर उच्च संवेदनशीलता और एमएस की बड़े पैमाने पर सटीकता, और संभावना बड़े पैमाने पर विश्लेषण प्रदर्शन करने के कारण है।

(- 20 हूँ 5) बॉटम-अप रणनीति हिस्टोन लक्षण वर्णन और उनके PTMs, जिसमें बरकरार प्रोटीन enzymatically छोटे पेप्टाइड में पच जाता है के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स रणनीति है। यह पाचन दोनों नियंत्रण रेखा जुदाई और एमएस का पता लगाने की सुविधा। 600 की रेंज में जनता - 2,000 दा आमतौर पर अधिक आसानी से आयनित और उच्च जन सटीकता और बड़ा आम जनता से संकल्प के साथ की पहचान कर रहे हैं। एमएस / एमएस विखंडन भी सुधार हुआ है, के रूप में कम पेप्टाइड्स आम तौर पर टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। हालांकि, histones बॉटम-अप एमएस के लिए एक चुनौती पेश के रूप में वे अत्यधिक बुनियादी अमीनो एसिड के अवशेष, अर्थात् लाइसिन और arginine में समृद्ध कर रहे हैं। इसलिए, trypsin पाचन पेप्टाइड्स की पीढ़ी है कि बहुत एसएम हैं की ओर जाता हैसभी नियंत्रण रेखा बनाए रखने और PTMs की स्पष्ट स्थानीयकरण के लिए। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल लाइसिन और पेप्टाइड एन टर्मिनल रासायनिक derivatization 17 भी शामिल है। Propionic एनहाइड्राइड का उपयोग अन्य अभिकर्मकों 18 की तुलना में कुशल रासायनिक derivatization के लिए सिफारिश की है। इस तरह के derivatization ब्लॉकों असंशोधित और monomethyl लाइसिन अवशेषों की ɛ अमीनो समूहों, trypsin केवल arginine अवशेषों के सी टर्मिनल पर प्रोटियोलिसिस प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। Derivatized amines समाधान के साथ प्रोटॉन का आदान-प्रदान नहीं कर सकता है और इस तरह पेप्टाइड्स आम तौर पर केवल दोगुना या triply, चार्ज किया जाता है एमएस और एमएस / एमएस का पता लगाने की सुविधा। इसके अलावा, एन टर्मिनल derivatization पेप्टाइड hydrophobicity और इस तरह उलट चरण chromatographic प्रतिधारण बढ़ जाती है। यहाँ, हम कार्यप्रवाह histones शुद्ध और नीचे अप प्रोटिओमिक्स (चित्रा 1) के माध्यम से PTM विश्लेषण के लिए उन्हें तैयार करने का वर्णन है। इस रणनीति को प्राप्त एकल हिस्टोन के निशान और मिश्रित निशान च की मात्रा का ठहरावया हिस्टोन PTMs कि अमीनो एसिड अनुक्रम में अपेक्षाकृत करीब हैं।

Protocol

1. संस्कृति से कोशिकाओं के संग्रह

  1. कोशिकाओं निलंबन में बड़े हो रहे थे, तो 5 मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। अगर पक्षपाती, महाप्राण और त्यागने सेल के माध्यम। सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ जुड़ी कोशिकाओं कुल्ला (पीबीएस आगे जा रहा है के रूप में)। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की सतह को कवर करने के लिए जब तक कोशिकाओं को अलग (समय अलग सेल लाइनों के लिए भिन्न होता है) पर्याप्त मात्रा के साथ - (0.5% सेल लाइन के आधार पर 0.025%) या तो trypsin या trypsin-EDTA में कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. 5 मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धोएं और centrifugation द्वारा इकट्ठा।
  3. graduations 1.8 मिलीलीटर ट्यूब या 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर चिह्नित से लगभग पैक सेल मात्रा का अनुमान है।
    नोट: संस्कृति से कोशिकाओं जा तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए हैं और इस स्तर पर कम से -80 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।

बरकरार कोशिकाओं से नाभिक के 2. अलगाव

  • बर्फ पर पिघलना कोशिकाओं।
  • पिघलना परमाणु अलगाव बफर (एनआईबी, 1 टेबल)।
  • हर 100 μl पैक सेल मात्रा के लिए लगभग 5 मिलीलीटर निब बफर (तालिका 1) तैयार करें। 1 एम डीटीटी का 1 μl, 200 मिमी AEBSF के 2.5 μl, 2.5 माइक्रोन के microcystin और 5 एम सोडियम butyrate के 2 μl के 2 μl: हर 1 मिलीलीटर निब बफर के लिए, प्रोटीज अवरोधकों और स्थिर एजेंट के रूप में निम्नानुसार जोड़ें। अवरोधकों के साथ निब इस बिंदु से आगे निब के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा।
    नोट: हिस्टोन फोस्फोराइलेशन का अध्ययन किया जाता है, EDTA मुक्त प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोध कॉकटेल शामिल हैं।
  • निब बफर का पांचवां मात्रा इस प्रकार तैयार निकालें और 0.2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एनपी 40 वैकल्पिक (तालिका 1) जोड़ें। शेष चार पांचवें मात्रा washes के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  • एनपी 40 वैकल्पिक अनुपात बिना निब 1:10 सेल गोली में धो सेल गोली (वी / वी)। 5 मिनट के लिए 700 आरसीएफ में centrifugation द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  • lyse सेलबर्फ पर रखकर और 0.2% एनपी 40 वैकल्पिक साथ निब 1:10 सेल गोली जोड़कर एल गोली (वी / वी)।
  • अगर ऊतक के नमूने से निकालने, मोर्टार और मूसल या Dounce homogenizers का उपयोग कर homogenize। संवर्धित कोशिकाओं कोमल pipetting द्वारा homogenized जा सकता है।
  • 10 मिनट - 5 के लिए बर्फ पर homogenized कोशिकाओं को सेते हैं। कोशिकाओं lyse और नाभिक जारी करेंगे।
  • 10 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस - 5 के लिए 1,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। गोली ज्यादातर नाभिक सेल, जबकि सतह पर तैरनेवाला ज्यादातर cytoplasmic घटक शामिल होता है। cytoplasmic अंश बचाने के लिए अगर वांछित।
  • धीरे 01:10 (वी / वी) निब में यह resuspending बिना एनपी 40 वैकल्पिक द्वारा नाभिक गोली धो लें।
    नोट: यह धोने कदम से पहले नाभिक से histones निकालने के लिए डिटर्जेंट के निशान को दूर करने के लिए पूरी तरह है।
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  • दोहराएँ 2.10 कदम - 2.11 कम से कम दो बार पूरी तरह से एनपी 40 वैकल्पिक हटा दें। एनपी 40 वैकल्पिक हटाने स्पष्ट एक हैकोमल pipetting दौरान धोने कदम नहीं रह बुलबुले रूपों है।
  • ऊतकों से हिस्टोन निकासी के लिए:
    1. ठंडा नोक में ताजा या thawed जमे हुए ऊतक कुल्ला।
    2. ऊतक गीला रखने के लिए एनआईबी के साथ बर्फ पर रखा एक पेट्री डिश के लिए ऊतक स्थानांतरण, बस काफी है।
    3. धार के साथ सबसे छोटे टुकड़े (<1 मिमी) में पासा नाभिक अलगाव के लिए सतह से संपर्क बढ़ाने के लिए।
    4. एक पूर्व ठंडा homogenizer के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा निब में धो लें।
    5. 5 मिनट के लिए 300 आरसीएफ में centrifuging द्वारा बफर निकालें।
    6. कोशिकाओं के लिए निब युक्त एनपी 40 वैकल्पिक जोड़ें कोशिकाओं में: 1:10 के अनुपात बफर (वी / वी) और 5 से homogenize - 10 स्ट्रोक।
    7. सेल के लिए जाँच करें और जरूरत के रूप homogenization दोहराएँ। एक अच्छा संकेत है कि कोशिकाओं lysed दिया है गोली की मात्रा की कमी है। गोली केवल नाभिक को शामिल करना चाहिए।
    8. 5 मिनट के लिए 700 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र और गोली बचाने के लिए। 2 अधिक समय - यह गोली 1 निकाला जा सकता है1:10 एस (वी / वी) निब युक्त एनपी 40 वैकल्पिक; इस स्तर पर, histones क्रोमेटिन से बाहर निकाले जाते हैं और गोली काफी सिकुड़ा गया है।
    9. डिटर्जेंट के निशान को दूर करने के लिए NP40 वैकल्पिक बिना निब के 3 मिलीलीटर - 2 के साथ दो बार धोएं।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: नमूना निब + 5% ग्लिसरॉल की न्यूनतम मात्रा में resuspended जा सकता है, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।

    • 3. नाभिक से निकालना और histones की शुद्धि

    नोट: histones उन्हें कसकर डीएनए के फॉस्फोरिक एसिड रीढ़ की हड्डी के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देता है, बुनियादी अमीनो एसिड के अवशेष में बहुत अमीर हैं। Histones नाभिक में सबसे बुनियादी प्रोटीन शामिल हैं, इस प्रकार की अनुमति उन्हें गैर हिस्टोन प्रोटीन है, जो मजबूत एसिड में वेग से कम से कम प्रदूषण के साथ ठंडा सल्फ्यूरिक एसिड (0.2 महाराष्ट्र 2 अतः 4) में निकाला जाता था। अत्यधिक ध्यान केंद्रित टीसीए (33% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) तो सल्फ्यूरिक से histones वेग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएसिड। टीसीए 4 डिग्री सेल्सियस पर भूरे रंग की बोतल में 100% के रूप में जमा है।

    1. Resuspend सेल नाभिक में 1: 5 (वी / वी) कोमल pipetting द्वारा ठंडा 0.2 महाराष्ट्र 2 अतः 4 (1 टेबल)।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटा - निरंतर रोटेशन या कोमल 2 के लिए झटकों के साथ नमूना सेते हैं। आमतौर पर, 500 से अधिक μl सेल गोली के साथ नमूने के लिए, एक 2 घंटा निकासी histones निकालने के लिए पर्याप्त है; अब ऊष्मायन अन्य बुनियादी प्रोटीन की निकासी में हो सकता है। छोटे परमाणु छर्रों के लिए (<200 μl), 4 घंटा निकासी के लिए एक बेहतर उपज प्रदान करता है।
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,400 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र।
    4. एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
    5. दोहराएँ कदम 3.3 - 3.4 के किसी भी अघुलनशील सामग्री हटा दें।
    6. Histones वेग, 1 के अनुपात में एकत्र सतह पर तैरनेवाला (अब histones युक्त) के लिए ठंडा 100% टीसीए (तालिका 1) जोड़ें: 3 (वी / वी), क्रम में 33% की एक अंतिम टीसीए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। ट्यूब कुछ टी inverting द्वारा मिक्सIME में।
      नोट: नमूने, टीसीए के अलावा पर बादल छाए रहेंगे बंद हो जाएगा histones की उपस्थिति का संकेत है।
    7. कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं। छोटे शुरुआती गोली आकार के लिए, रात भर वर्षा की सिफारिश की है।
    8. 5 मिनट के लिए 3,400 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र। histones कोट ट्यूबों के पक्ष और भी तल पर जमा। एक सफेद अघुलनशील गोली भी ट्यूब, जो ज्यादातर गैर हिस्टोन प्रोटीन और अन्य जैविक अणुओं में शामिल है के बहुत नीचे रूपों। आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें, ध्यान पक्षों या गोली स्क्रैप के बिना।
    9. एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करके, साथ ठंडा एसीटोन + 0.1% एचसीएल (तालिका 1) ट्यूब कुल्ला के रूप में तो कोटिंग पक्ष और नीचे उपजी प्रोटीन कवर करने के लिए।
    10. 2 मिनट और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए 3,400 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र, ध्यान पक्षों या गोली स्क्रैप के बिना।
    11. दोहराएँ 3.9 कदम - 3.10 100% ठंडा एसीटोन का उपयोग कर।
    12. हवा का प्रवाह के साथ या एक VACU के साथ सूखी गोलीउम अपकेंद्रित्र, या बस ट्यूब खुला छोड़ कर। एसीटोन जल्दी evaporates।
    13. सफेद परत पूरी तरह से भंग करने के लिए कम से कम मात्रा में DDH 2 हे (डबल आसुत जल) के साथ histones संभव भंग। Histones पानी में आसानी से घुलनशील हैं। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में छर्रों के लिए, 100 μl DDH 2 हे आमतौर पर पर्याप्त histones जमा है।
    14. 2 मिनट के लिए 3,400 आरसीएफ में अपकेंद्रित्र और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।

    4. प्रोटीन एकाग्रता और पवित्रता का आकलन

    1. प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए, बीसीए, ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख या एमिनो एसिड विश्लेषण (एएए) का उपयोग करें। तकनीक है कि 280 एनएम पर absorbance को अपनाने, के रूप में histones खुशबूदार अमीनो एसिड के अवशेष में गरीब हैं का प्रयोग न करें।
    2. एक 15% एक्रिलामाइड जेल और Coomassie धुंधला (वैकल्पिक) के साथ एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण द्वारा निकाले histones की शुद्धता की जाँच करें।
    3. उच्च शुद्धता एकल हिस्टोन वेरिएंट वांछित हैं, का एचपीएलसी यूवी विभाजन करने के लिए जारीहिस्टोन वेरिएंट (धारा 5)। यदि नहीं, तो सीधे छोड़ें बॉटम-अप हिस्टोन PTM विश्लेषण (धारा 6) के लिए तैयारी करने के लिए नमूना।

    उलट चरण HPLC द्वारा Histone वेरिएंट की 5. पृथक्करण (वैकल्पिक)

    नोट: उच्च शुद्धता हिस्टोन वेरिएंट उलट चरण एचपीएलसी एक यूवी डिटेक्टर के लिए युग्मित का उपयोग करते हुए कच्चे तेल हिस्टोन मिश्रण fractionating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। ये शुद्ध histones अध्ययन है कि उच्च संवेदनशीलता और पवित्रता की आवश्यकता के लिए उपयोगी होते हैं। हालांकि, मानक हिस्टोन PTM लक्षण वर्णन के लिए, इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है क्योंकि विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील और व्यापक है। बरकरार हिस्टोन के विभाजन आदर्श वेरिएंट कम से कम 100 की आवश्यकता है - 300 माइक्रोग्राम सामग्री शुरू की।

    1. शुरू हिस्टोन एकाग्रता के आधार पर एक एचपीएलसी के लिए एक उपयुक्त सी 18 5 माइक्रोन स्तंभ कनेक्ट: के बारे में 100 माइक्रोग्राम histones के साथ, 0.2 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह की दर के साथ 2.1 मिमी x 250 मिमी स्तंभ का उपयोग करें; के बारे में 300 माइक्रोग्राम histones के साथ, के साथ 4.6 x 250 मिमी स्तंभ का उपयोग करें0.8 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह की दर। बफर ए और बी समर्पित कांच के बने पदार्थ का उपयोग कर के रूप में निम्नानुसार तैयार:
      1. एचपीएलसी ग्रेड पानी में 5% एचपीएलसी ग्रेड acetonitrile, 0.1% TFA: बफर तैयार करें।
      2. एचपीएलसी ग्रेड पानी में 95% HPLC ग्रेड acetonitrile, 0.1% TFA: बफर बी तैयार करें।
    2. एक यूवी डिटेक्टर करने के लिए स्तंभ कनेक्ट करें, और 210 absorbance सेट - 220 एनएम।
    3. हिस्टोन नमूना 100% टीएफए के साथ पानी में भंग खट्टा 0.1-1% टीएफए के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
    4. सिफारिश प्रवाह दर है, जो लगभग करने के लिए तीन स्तंभ मात्रा में मेल खाती है पर कम से कम 15 मिनट के लिए 100% बफर के साथ स्तंभ संतुलित करना। यूवी डिटेक्टर के शून्य absorbance के स्तर निर्धारित करने के लिए इस संकेत का प्रयोग करें।
    5. या तो स्वयं या एक स्वचालित नमूना कलेक्टर में अंशों को इकट्ठा करने की नलियों उचित आकार तैयार करें।
    6. लगभग 1 माइक्रोग्राम / μl या अधिक की एकाग्रता में नमूना इंजेक्षन। बड़ी मात्रा में भंग नमूने स्तंभ डीयू के संतुलन को बदल सकता हैअंगूठी लोड हो रहा है और कम बनाए रखने के लिए नेतृत्व।
    7. 1 मिनट में 0 से 30% बी करने के लिए, 90 मिनट में 30 से 60% करने के लिए बी, और 1 मिनट में 60 से 90% करने के लिए बी: ढाल भागो, प्रोग्राम इस प्रकार है।
    8. एक स्वचालित अंश कलेक्टर का उपयोग कर 1 मिनट के अंतराल में भिन्न (उदाहरण के वर्णलेख चित्रा 2 में दिखाया गया है) ले लीजिए। उचित आकार ट्यूबों में अंशों लीजिए पूरी मात्रा को नियंत्रित करने के।
    9. एक शून्य concentrator में fractionated नमूने नीचे सूखी।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: सूखे हिस्टोन अंशों संक्षिप्त अवधि के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है (1 - 2 दिन) या लंबी अवधि की अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में।

    6. histones का रासायनिक derivatization नीचे अप विश्लेषण के लिए Propionic एनहाइड्राइड का प्रयोग

    1. 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 के 40 μl में हिस्टोन नमूने भंग, 8.0 पीएच (अनुशंसित राशि: 50 - 100 माइक्रोग्राम)। अगर नमूने शुद्ध DDH 2 हे में थे, 50 मिमी, 8 पीएच को बनाने के लिए ध्यान केंद्रित किया एनएच 4 HCO 3 जोड़ें।0।
    2. नमूना नुकसान के बिना पीएच सूचक स्ट्रिप्स का उपयोग पीएच की जांच के लिए नमूना में एक P10 विंदुक टिप गीले। एनएच 4 ओह, और फार्मिक एसिड 8.0 पीएच को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: प्रोटोकॉल के निम्न भाग (कदम 6.3 - 6.7) अधिकतम तीन से चार नमूने के बैच में किया जाना चाहिए, ताकि propionic एनहाइड्राइड प्रतिक्रियाशील रखने के लिए।
    3. बाद के चरणों जहां propionic एनहाइड्राइड के लिए प्रयोग किया जाता है धूआं हुड का प्रयोग करें। अनुपात 1 में acetonitrile साथ propionic एनहाइड्राइड के मिश्रण से ताजा propionylation अभिकर्मक तैयार: 3 (वी / वी)। 1 में नमूने के लिए propionylation अभिकर्मक जोड़ें: 4 (वी / वी)। 40 μl histones के लिए, 10 μl propionylation अभिकर्मक जोड़ें।
      नोट: यह इस कदम पर सफेद मलबे निरीक्षण करने के लिए संभव है। हालांकि, यह ज्यादातर लवण और propionic एसिड होता है, और इस तरह कोई विशेष कार्रवाई किए जाने की जरूरत है।
    4. जल्दी से फिर से स्थापित पीएच 8.0 समाधान करने के लिए एनएच 4 OH जोड़ें। नोट: Propionic एनहाइड्राइड पेप्टाइड्स के मुक्त amines के साथ प्रतिक्रिया पैदा करता है सहाराआयनिक एसिड है कि पीएच कम हो जाती है। आमतौर पर, 1 के अनुपात के साथ नमूना करने के लिए एनएच 4 OH जोड़कर: 5 (वी / वी) को फिर से स्थापित पीएच 8.0 के लिए उपयुक्त है, जैसे, नमूना के 40 μl के लिए एनएच 4 ओह के 8 μl।
    5. vortexing द्वारा तुरंत मिक्स।
    6. 6.2 कदम के रूप में एक ही प्रक्रिया के साथ पीएच की जाँच करें।
      सावधानी: जब पीएच 10.0 की तुलना में अधिक है, उच्च pKa के साथ अन्य अमीनो एसिड के अवशेष की लेबलिंग संभव है।
    7. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं।
    8. दोहराएँ 6.3 कदम - 6.7, सख्ती propionylation अभिकर्मक के प्रति बैच कोई 3 से अधिक या 4 नमूने के लिए प्रतिक्रिया प्रदर्शन।
    9. एक शून्य concentrator में 20 μl - 10 के लिए नीचे सूखी नमूने हैं। इस unreacted propionic एनहाइड्राइड, acetonitrile, एसिटिक एसिड और अमोनिया गैस एनएच 4 OH से रिहा evaporates। अगर नमूने पूरी तरह से सूखे, कोई महत्वपूर्ण नमूना घाटा होते हैं।
      नोट: Isopropanol acetonitrile के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। हालांकि, acetonitrile निचली सतह तनाव और इस प्रकार अधिक हैतेजी से वाष्पीकरण।
    10. DDH 2 हे के साथ Resuspend या पतला नमूने जब ​​तक अंतिम मात्रा के 40 μl हासिल की है।
    11. दोहराएँ कदम 6.2 - 6.9। हिस्टोन propionylation की एक डबल राउंड प्रतिक्रिया पूरा होने के> 95% है।
    12. आर्गन गैस के साथ propionic एनहाइड्राइड बोतल भरें इतनी के रूप में बोतल में नमी के साथ संपर्क में एसिटिक एसिड के गठन को रोकने के लिए।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: नमूना -80 डिग्री सेल्सियस DDH 2 हे या सूखे में पुनर्गठन पर संग्रहित किया जा सकता है।

    7. trypsin के साथ Proteolytic पाचन

    1. 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में Resuspend histones 1 माइक्रोग्राम / μl या अधिक की एक इष्टतम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए। अधिक पतला नमूने trypsin क्षमता कम करने के लिए नेतृत्व।
      नोट: इस कदम पर histones पीएच 8.0 पर होने के लिए यह अभी भी अम्लीय है, तो एनएच 4 HCO 3 pipet टिप का उपयोग करके नमूने के लिए नमक जोड़ने के लिए की जरूरत है।
    2. 1:10 अनुपात (WT / गुम्मट) पर हिस्टोन नमूने के trypsin जोड़ें।
    3. Incuba8 घंटा - 6 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ते।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस में ठंड से पाचन बंद करो।
    5. एक शून्य concentrator में 20 μl - 10 के लिए नमूना नीचे सूखी।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

    एन-रोम में Histone पेप्टाइड्स की 8. Propionylation

    नोट: इस खंड में trypsin डाइजेस्ट से उत्पन्न पेप्टाइड एन Termini की derivatization का वर्णन है। , Propionyl समूह के रूप में पेप्टाइड hydrophobicity बढ़ जाती है - इस तरह की प्रक्रिया कम से कम पेप्टाइड्स (8 हिस्टोन H3 के जैसे, अमीनो एसिड 3) का एचपीएलसी प्रतिधारण में सुधार।

    1. 100 मिमी एनएच 4 HCO 3 के 30 μl में Resuspend नमूने हैं।
    2. दोहराएँ कदम 6.1 - 6.9।
      नोट: यह है कि शून्य में नमूने के सूखने के इस कदम पर एक लंबे समय लेता सामान्य है।
    3. Resuspend या 50 के साथ नमूने पतला - 100 μl DDH 2 ओ + या तो 0.1% TFA या 0.5% एसिटिक एसिड। नोट: एसिटिक एसिड लंबे भंडार के लिए सिफारिश की है टीएफए facilitat के रूप में,लंबी अवधि में methionine ऑक्सीकरण तों। दूसरी ओर, यदि TFA चरण-ढोने (धारा 9) एक ही दिन, के रूप में टीएफए एक बेहतर chromatographic प्रतिधारण की सहायता करता किया जाता है की सिफारिश की है।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

    9. स्टेज-सुझावों के साथ नमूना Desalting

    नोट: इस स्तर पर, वहाँ नमूने में नमक मौजूद है। साल्ट एचपीएलसी-एमएस विश्लेषण में बाधा क्योंकि वे electrospray दौरान योण बनाना, पेप्टाइड्स से संकेत दबा। लवण भी पेप्टाइड्स पर आयनिक adducts फार्म कर सकते हैं, गैर adducted पेप्टाइड के लिए संकेत तीव्रता को कम करने। जैसा कि adducted पेप्टाइड एक अलग बड़े पैमाने पर होगा, पेप्टाइड को ठीक से पहचान नहीं की जाएगी या मात्रा।

    1. एक P1000 विंदुक टिप का उपयोग करके, एक ठोस चरण निष्कर्षण डिस्क से 18 सी सामग्री का एक डिस्क पंच। एक जुड़े सिलिका केशिका का उपयोग करके P1000 टिप से बाहर minidisk धक्का और एक P100 / 200 विंदुक टिप की तह तक minidisk जमा। सुनिश्चित करें कि घISK सुरक्षित रूप से टिप (चित्रा 3) के तल पर अंकित है।
      नोट: P1000 टिप नहीं बल्कि एक छोटा सा छेद सी 18 डिस्क पंच के लिए है। यह आदेश बड़ा व्यास के साथ एक छेद है करने के लिए टिप के अंतिम सेंटीमीटर कटौती करने के लिए उचित है।
    2. एक ही P100 / P200 टिप में दो सी 18 घूंसे का उपयोग नमूने के desalting 25 से अधिक माइक्रोग्राम है।
    3. 1.5 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह में मंच सुझावों धारण करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूज एडाप्टर का प्रयोग करें। ; - (400 आरसीएफ 300) रोटेशन धीमी गति का प्रयोग करें सॉल्वैंट्स सामान्य रूप से एक मिनट से भी कम समय में राल के माध्यम से गुजरती हैं।
    4. 100% acetonitrile के 50 μl के साथ घूम 18 सी सामग्री को सक्रिय करने और संभावित संदूषण को दूर करने के द्वारा राल फ्लश।
    5. धीमी गति से centrifugation द्वारा 0.1% TFA के 80 μl निस्तब्धता द्वारा डिस्क संतुलित करना।
    6. पीएच 4.0 या एसिटिक एसिड के साथ कम करने के लिए नमूना खट्टा। नमूना नुकसान को कम करने के लिए पीएच स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जाँच करें। धीमी गति से centrifugation द्वारा डिस्क पर लोड नमूना।
    7. धुलाईधीमी गति से centrifugation द्वारा 0.1% TFA के 80 μl - 70 निस्तब्धता द्वारा नमूना।
    8. धीमी गति से centrifugation द्वारा 70 μl 75% acetonitrile और 0.5% एसिटिक एसिड निस्तब्धता द्वारा नमूना Elute। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना ले लीजिए।
    9. एक शून्य concentrator में सूखी नमूना।
      नोट: अंतरिम रोक बिंदु: नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

    10 Histone पेप्टाइड्स का विश्लेषण

    नोट: एनएलसी एमएस मंच स्थापित किया जाना चाहिए के रूप में पारंपरिक पेप्टाइड विश्लेषण में किया। 200 का उपयोग - 300 nl प्रवाह स्तंभ (75 माइक्रोन आईडी विश्लेषणात्मक स्तंभ, सी 18 कण) की सिफारिश की है, क्योंकि वे संवेदनशीलता और स्थिरता के बीच एक उत्कृष्ट समझौता कर रहे हैं। एमएस अधिग्रहण विधि लक्षित स्कैन 19 या एक डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआइए) 20,21, दोनों प्रतिनिधि परिणाम और चित्रा 4 में वर्णित के साथ डेटा पर निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) के दोनों एक संयोजन हो सकता है।

    1. एचपीएलसी बफ़र्स तैयार - एक: में 0.1% फार्मिक एसिडएचपीएलसी ग्रेड पानी; बी: एचपीएलसी ग्रेड acetonitrile में 0.1% फार्मिक एसिड।
    2. एचपीएलसी विधि कार्यक्रम इस प्रकार है: 0 से 30% बफर बी करने के लिए 30 से अगले 5 मिनट के लिए 100% बी के लिए और 8 मिनट के लिए isocratic 100% बी पर 30 मिनट में। 100 0% तक बी से 1 मिनट में 0% बी पर 10 मिनट के लिए ढाल और isocratic प्रवाह: एचपीएलसी नमूना लोड करने से पहले स्वचालित स्तंभ संतुलन के लिए प्रोग्राम नहीं है, तो निम्न शामिल हैं। 300 nl / मिनट - 250 के लिए विश्लेषण के प्रवाह की दर निर्धारित करें।
    3. एमएस अधिग्रहण विधि कार्यक्रम प्रदर्शन करने के लिए या तो डीडीए लक्षित स्कैन 19 या डीआइए 20,21 (चित्रा 4) के साथ संयुक्त। कि एमएस कर्तव्य चक्र एक पूर्ण एमएस हर ~ 2 सेकंड स्कैन की अनुमति देता है सुनिश्चित करें, आदेश chromatographic चोटी है, जो अधिक सटीक मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता पार करने के लिए पर्याप्त डेटा अंक पाने के लिए। नोट: सी 18 क्रोमैटोग्राफी साथ, औसत आधारभूत शिखर चौड़ाई ढाल ऊपर वर्णित के बारे में 30 सेकंड है।
    4. एचपीएलसी ग पर लगभग 1 ग्राम के नमूना का भारolumn।
    5. के रूप में क्रमादेशित एचपीएलसी-एमएस / एमएस विधि चलाएँ।
      नोट: प्रोटोकॉल में हम कॉलम, एमएस उपकरणों या एमएस पैरामीटर विवरण की बारीकियों की सिफारिश नहीं है, किसी भी इष्टतम सेटअप है कि विकसित एक व्यक्ति प्रोटिओमिक्स प्रयोगशाला विधि के लिए उपयुक्त हो जाएगा। प्रोटिओमिक्स प्रयोगशालाओं, उनके अनुकूलित सेटअप का उपयोग के बाद से हिस्टोन पेप्टाइड्स परंपरागत पेप्टाइड्स के रूप में अलग होना चाहिए।

    11. डेटा विश्लेषण

    1. सॉफ्टवेयर में एमएस कच्चे फ़ाइलें आयात शिखर क्षेत्र एकीकरण करने के लिए। नोट: EpiProfile 22 की सिफारिश की है, के रूप में यह हिस्टोन पेप्टाइड्स के लिए अनुकूलित है; chromatographic क्षालन की अवधारण समय ज्ञान का उपयोग करके यह ज्ञात हिस्टोन पेप्टाइड्स के विश्वसनीय शिखर क्षेत्र निकासी करता है। वैकल्पिक रूप से, क्षितिज 23 प्रयोजन के लिए एक और आदर्श सॉफ्टवेयर है।
      1. इसकी संशोधित सभी रूपों में है कि पेप्टाइड के कुल क्षेत्रफल से अपने क्षेत्र को विभाजित करके एक दिया पेप्टाइड के रिश्तेदार बहुतायत गणना। नोट: खोज analy के मामले मेंबहन शुभंकर संशोधित हिस्टोन पेप्टाइड्स के स्पेक्ट्रा की पहचान करने की सिफारिश की है। इस उपकरण का प्रदर्शन हाल ही में 24 में वर्णित किया गया है। प्रोटिओमिक्स के लिए अन्य सभी डेटाबेस खोज इंजन भी प्रयोग करने योग्य हैं, लेकिन हमारे परीक्षण पर वे कम प्रदर्शन प्रदान की है।

    Representative Results

    एक उदाहरण के रूप में, हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के साथ और बिना retinoic एसिड (आरए) उत्तेजना, 200 μl सेल छर्रों के साथ शुरू से निकाले histones का विश्लेषण किया। सेल संस्कृति में आरए की उपस्थिति ईएससी भेदभाव होता है। 100 माइक्रोग्राम histones के निकाले गए थे, जो हिस्टोन पेप्टाइड्स के कई नियंत्रण रेखा एमएस इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त से अधिक है - सेल गोली, के बारे में 50 से। Derivatization, पाचन, और desalting के बाद, नमूने एक 75 माइक्रोन x 15 सेमी सी 18 कॉलम (कण व्यास 3 माइक्रोन, ताकना आकार 300 ए) के सीरियल मोड में करने के लिए मिलकर microfluidic चिप्स के साथ एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी नैनो प्रणाली के साथ पर लोड कर रहे थे एक संकर रैखिक जाल quadrupole - Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर। एमएस अधिग्रहण डीआइए उपयोग किया गया था। समानांतर में, नमूने भी एक नैनो प्रवाह UHPLC एक संकर आयन जाल-Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित का उपयोग कर एक डीडीए विधि के साथ विश्लेषण किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। मेंप्रत्येक चक्र, एक पूर्ण एमएस Orbitrap का पता लगाने 1,400 मी / z, 60,000 (200 मी / z) और एजीसी के एक संकल्प के 10 में से 6। फिर, डेटा निर्भर अधिग्रहण मोड एक गतिशील के साथ लागू किया गया था करने के लिए 290 की सीमा स्कैन के साथ प्रदर्शन किया गया था 30 सेकंड के बहिष्कार। एमएस / एमएस स्कैन सबसे तीव्र लोगों से माता-पिता आयनों पर पीछा किया गया था। एक के एक आरोप राज्य के साथ आयनों एमएस / एमएस से बाहर रखा गया। 2 मी / z की एक अलग खिड़की इस्तेमाल किया गया था। आयनों 35% की टक्कर ऊर्जा के साथ टकराव से प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) का उपयोग कर खंडित कर रहे थे। आयन जाल का पता लगाने के सामान्य स्कैन रेंज मोड और 10 4 की एजीसी के साथ सामान्य दर स्कैन के साथ इस्तेमाल किया गया था।

    कच्चे एमएस डेटा अग्रदूत और टुकड़ा आयन chromatograms की निकासी के लिए सॉफ्टवेयर को गोद लेने, अर्थात् 23 और 22 EpiProfile क्षितिज विश्लेषण किया गया। EpiProfile, हिस्टोन पेप्टाइड्स के लिए अनुकूलित किया गया है के रूप में यह पेप के पिछले ज्ञान के कारण बुद्धिमान शिखर क्षेत्र निकासी एकीकृतज्वार अवधारण समय। दूसरी ओर, क्षितिज डीआइए विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, और इस तरह डीआइए आंकड़ों से प्रदर्शित (आंकड़े 4 और 5 ए) इस सॉफ्टवेयर से स्क्रीनशॉट रहे हैं। निकाले आयन chromatogram से, वक्र के तहत क्षेत्र को लिया गया है, और यह प्रत्येक पेप्टाइड की बहुतायत अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। Chromatographic चोटी के क्षेत्र [एम एच] के लिए गणना की गई +, [एम + 2H] 2 + और ​​[एम + 3H] उसी पेप्टाइड 3 + आयनों, यहां तक कि ज्यादातर मामलों में [एम + 2H] हालांकि 2 + प्रचलित रूप था। यह एक पेप्टाइड का एक दिया संशोधित रूप कच्चा बहुतायत प्रदान करता है। आदेश PTMs के रिश्तेदार बहुतायत को प्राप्त करने के लिए, एक हिस्टोन पेप्टाइड के सभी विभिन्न संशोधित रूपों का योग 100% के रूप में माना जाता था, और विशेष रूप से पेप्टाइड के क्षेत्र में अपनी संशोधित सभी रूपों में है कि हिस्टोन पेप्टाइड के लिए कुल क्षेत्र द्वारा विभाजित किया गया था ।

    हिस्टोन पेप्टाइड्स एक वीए में मौजूद हैंसमदाब रेखीय रूपों की riety (चित्रा 5)। समदाब रेखीय पेप्टाइड्स, जैसे, K18ac और K23ac, केवल एमएस / एमएस स्तर है, जहां उनके अद्वितीय टुकड़ा आयनों समदाब रेखीय प्रजातियों (चित्रा 5 ए और 5 ब) के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यह अनुपात दो प्रजातियों के बीच chromatographic चोटी के क्षेत्र को विभाजित करने के लिए किया जाता है। डीडीए का उपयोग करते हैं, इन समदाब रेखीय रूपों, लक्षित जनता की एक सूची में शामिल किया गया है क्योंकि इन पेप्टाइड्स, उनके पूरे क्षालन के माध्यम से विखंडन के लिए चुने जाने की जरूरत है जो एक मानक डीडीए प्रयोग में घटित नहीं होता। समदाब रेखीय प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत के भेदभाव तो टुकड़ा आयनों की क्षालन प्रोफ़ाइल निगरानी के द्वारा किया जाता है। दूसरी ओर, अधिग्रहण के डीआइए प्रकार कोई भी शामिल सूची की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, अधिग्रहण विधि इस प्रकार अज्ञात संशोधित पेप्टाइड्स की खोज को रोकने सकता पारंपरिक डेटाबेस खोज के साथ संगत नहीं है, और इस तरह।

    hESCs जब भेदभाव (चित्रा 6A और 6B) के लिए प्रेरित acetylated पेप्टाइड्स का एक स्पष्ट कमी देखी गई। इस के रूप में पिछले परिणामों फर्क लोगों को 25 के मुकाबले ESCs में उच्च एसिटिलीकरण सूचना दी, आश्चर्य की बात नहीं थी,pluripotent क्रोमेटिन के आम तौर पर स्वतंत्र स्वभाव को दर्शाती है। हिस्टोन H3 पर ध्यान केंद्रित करके, 35 अलग अलग रूपों संशोधित मात्रा निर्धारित किया गया (चित्रा 6C)। हालांकि, सभी हिस्टोन proteoforms कि इस दृष्टिकोण के साथ जांच की जा सकती है, 200 से अधिक सभी हिस्टोन वेरिएंट और कम बहुतायत संशोधनों (डेटा नहीं दिखाया गया है) भी शामिल हैं। इसके अलावा, हमारे विश्लेषण से पता चला है कि उच्च reproducibility, के रूप में त्रुटि सलाखों (± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व) के छोटे आकार इसका सबूत तकनीकी प्रतिकृति के बीच प्राप्त किया जा सकता है। साथ में ले ली, इस खंड का वर्णन कैसे एनएलसी एमएस डेटा का उपयोग कर पेप्टाइड्स हिस्टोन संशोधित के रिश्तेदार बहुतायत निकालने के लिए।

    आकृति 1
    चित्रा 1:। बॉटम-अप एमएस / एमएस Histone विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह हिस्टोन विश्लेषण के लिए दस कदम समय प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक के एक अनुमान सहित दिखाया गया है। खंड संख्या पांडुलिपि में उपहार के रूप में कोष्ठक में दी गई है। धारा 5, नमूना विभाजन का वर्णन विभिन्न हिस्टोन वेरिएंट को अलग-थलग करने के लिए, जब तक कि एक दिया संस्करण के अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषण के लिए एक की जरूरत है छोड़ा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: Histone संस्करण Fractionation और Coomassie जेल उलट चरण उच्च प्रवाह नियंत्रण रेखा (ए) नियंत्रण रेखा यूवी वर्णलेख बरकरार हिस्टोन जुदाई का प्रतिनिधित्व।। हिस्टोन H3 वेरिएंट उनकी क्षालन समय के अनुसार एक दूसरे से भेदभाव किया जा सकता है। भिन्न या तो स्वयं या एकत्र किया जा सकता है एक स्वचालित अंश कलेक्टर का उपयोग कर। (बी) हिस्टोन शुद्धि के तीन प्रतिकृति की Coomassie जेल।= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। स्टेज- ढोने प्लग एक P1000 विंदुक टिप के साथ द मेकिंग, एक ठोस चरण निष्कर्षण डिस्क (दूसरा पैनल) से 18 सी सामग्री से बना एक डिस्क पंच। minidisk, टिप (मध्यम पैनल) में रहना इतना है कि यह एक छोटे P100 / 200 पिपेट छोटे केशिका के किसी भी तरह का उपयोग टिप में बाहर धकेल दिया जा सकता है। इस उदाहरण में, हम एक 700 माइक्रोन बाहरी व्यास जुड़े सिलिका ट्यूबिंग इस्तेमाल किया। minidisk P100 / 200 विंदुक टिप जब तक यह किसी भी आगे (पिछले पैनल) नहीं जा सकते हैं की तह तक धकेल दिया जाना चाहिए। मंच टिप, हिस्टोन desalting के लिए तैयार है, क्योंकि यह कई प्रतिकृति के लिए पर्याप्त नमूना सामग्री बनाए रखने के लिए पर्याप्त क्षमता है। 20 माइक्रोग्राम एसए के - विशेष रूप से, एक minidisk के लिए 15 के लिए पर्याप्त हैmple। अधिक नमूना आवश्यक है, कई डिस्क एक दूसरे पर पैक किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4:। डीडीए और डीआइए के तरीके की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व डीडीए का उपयोग करते हैं, एमएस स्कैन चक्र एमएस / एमएस विखंडन के लिए अग्रदूत आयनों की अनुक्रमिक सेलेक्शन उनकी तीव्रता और आरोप के अनुसार राज्य की विशेषता है। एक बार एक अग्रदूत आयन खंडित कर दिया गया है यह एक ही पेप्टाइड के दोहराव से बचने के चयन के लिए, ताकि एमएस कम प्रचुर मात्रा में संकेतों में "खुदाई" कर सकते हैं एक अपवर्जन सूची में रखा गया है। इस अधिग्रहण विधि खोज मोड के लिए प्रोटिओमिक्स में पसंद की तकनीक है। मात्रा का ठहराव एक दिया आयन से भरा संकेत स्कैन पहचान एमएस करने के लिए अगले एकीकृत करके हासिल की है /एमएस स्पेक्ट्रम। डीआइए में, पूरे मी / z रेंज हर चक्र स्कैन में खंडित है। यह दृष्टिकोण खोज मोड के लिए कम उपयुक्त है, लेकिन यह सब आयनों, व्यापारियों और उत्पादों की एक chromatographic प्रोफ़ाइल पैदा करता है। यह और अधिक आत्मविश्वास और मात्रा का ठहराव समदाब रेखीय रूपों में भेदभाव होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: समदाब रेखीय पेप्टाइड्स की मात्रा (ए) के दो समदाब रेखीय पेप्टाइड्स सामान्यतः हिस्टोन विश्लेषण में प्रचुर मात्रा का उदाहरण है।। निकाले आयन chromatogram उनकी अग्रदूत द्रव्यमान और (ऊपर) रिश्तेदार आइसोटोप की (XIC) समान है। हालांकि, उत्पाद आयनों की XIC (नीचे) के दो रूपों की समदाब रेखीय भेदभाव के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, केवल अद्वितीय टुकड़ा आयनों हमें होना चाहिएएड दो प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत का अनुमान है। (ख) दो वर्णित पेप्टाइड्स के लिए अद्वितीय टुकड़ा आयनों का प्रतिनिधित्व (लाल रंग में हाइलाइट)। (सी) में कम से कम एक समदाब रेखीय बराबर होने होमो सेपियन्स में आमतौर पर विश्लेषण किया पेप्टाइड्स की सूची। अनुक्रम वेरिएंट के बीच सूचीबद्ध हिस्टोन पेप्टाइड्स संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6: के साथ और retinoic एसिड उपचार के बिना मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम (ए) हिस्टोन H3 पेप्टाइड KQLATKAAR के सापेक्ष मात्रा का ठहराव - अपने संशोधित proteoforms के सभी में (एए 18 26)।। रिश्तेदार बहुतायत 100% (रिलायंस एनर्जी के रूप में सभी proteoforms का उपयोग कर अनुमान लगाया गया थाअसंशोधित पेप्टाइड का ative प्रतिशत नहीं दिखाया गया है) (बी) हिस्टोन H3 पेप्टाइड KSTGGKAPR (एए 9 के सापेक्ष मात्रा का ठहराव -।। 17) (सी) के साथ और retinoic एसिड के साथ सेल उपचार के बिना विहित हिस्टोन H3 के लिए पता लगाया पेप्टाइड्स के रिश्तेदार बहुतायत। आंकड़ा इंगित करता है दो उपचार की जिसमें दिए गए संशोधनों अधिक प्रचुर मात्रा में (> 50%) कर रहे हैं। कुल मिलाकर, हम उस हिस्टोन H3 एसिटिलीकरण सेल भेदभाव की प्रेरण पर लाइसिन अवशेषों के अधिकांश में कम हो जाती है प्रदर्शित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    उपाय # रचना
    1 परमाणु अलगाव बफर (एनआईबी) स्टॉक प्रकार के रूप में बनाया गया है और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिलीलीटर aliquots के रूप में जमे हुए संग्रहित किया जाता है; पिघलाया हुआ15 मिमी Tris, 60 मिमी KCl, 15 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी 2 CaCl, और 250 मिमी सुक्रोज: निब कुछ हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। बफर का पीएच एचसीएल के साथ 7.5 के लिए निकाला जाता है।
    2 Protease inhibitors (बफ़र्स के लिए नए सिरे से जोड़ने का उपयोग करने से पहले): DDH 2 में 1 एम dithiothreitol (डीटीटी) ओ (1,000x); DDH 2 हे (400x) में 200 मिमी AEBSF
    3 फॉस्फेट अवरोध करनेवाला (बफ़र्स के लिए नए सिरे से जोड़ने का उपयोग करने से पहले): 2.5 माइक्रोन के Microcystin 100% इथेनॉल में (500x)
    4 HDAC अवरोध (उपयोग करने से पहले बफ़र्स के लिए नए सिरे से जोड़ने के लिए): 5 एम सोडियम butyrate, पीएच 7.0 (500x) के लिए NaOH का उपयोग 5 एम butyric एसिड का अनुमापन द्वारा किए गए
    5 एनपी 40 वैकल्पिक: 10% v / DDH 2 हे में v
    6 0.2 महाराष्ट्र 2 अतः 4 DDH 2 हे में
    7 Trichloroacetic एसिड (टीसीए): 100% w / DDH 2 हे में v
    8 एसीटोन + 0.1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल): 0.1% वी / वी एचसीएल एसीटोन में

    तालिका 1. समाधान।

    Discussion

    यहां वर्णित प्रोटोकॉल लागत, समय, और प्रदर्शन पर विचार अनुकूलित है। अन्य तैयारियों संभव हो रहे हैं, लेकिन वे सीमाएं हैं, विशेष रूप से एमएस विश्लेषण के साथ युग्मन के मामले में। उदाहरण के लिए, उच्च नमक निकासी प्रोटोकॉल histones 26 के बजाय टीसीए वर्षा (धारा 3) को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में यह मजबूत एसिड का उपयोग नहीं करता उच्च नमक प्रोटोकॉल, आंतरिक रूप से मामूली है। यह एसिड अस्थिर PTMs को बरकरार रखता है और निकाले histones की पैदावार बढ़ जाती है, के रूप में टीसीए वर्षा सह precipitates कई अन्य क्रोमेटिन बंधनकारी प्रोटीन। हालांकि, उच्च नमक निकासी एचपीएलसी-एमएस / एमएस के लिए भी ध्यान केंद्रित नमक युक्त नमूनों की ओर जाता है। उदाहरण के लिए trypsin ऊष्मायन समय और एंजाइम / सब्सट्रेट अनुपात 27 को कम करने या पाचन एंजाइम 28-30 के रूप में argc का उपयोग करके - एक विकल्प तैयार करने में, हिस्टोन पाचन propionylation (8 धारा 6) के बिना किया जा सकता है। हालांकि, propionic एनहाइड्राइड साथ derivatization मैं के रूप में की सिफारिश की हैटी अधिक हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स, जो बेहतर तरल क्रोमैटोग्राफी के दौरान रखा जाता है की पीढ़ी के लिए होता है।

    रासायनिक derivatization के लिए, कार्बनिक अम्ल एनहाइड्रों की एक किस्म का मूल्यांकन किया गया है और उनके गुण व्यापक 18 चर्चा की। बहरहाल, propionic एनहाइड्राइड दक्षता, कम से कम पक्ष उत्पादों और बेहतर पेप्टाइड hydrophobicity के बीच सबसे अच्छा समझौता करने के लिए साबित कर दिया। संभावित, propionic एनहाइड्राइड isotopically लेबल के रूप में खरीदा जा सकता है; यह कई नमूने मिश्रण है और उन्हें भारी लेबल से अलग से दिया जनता पर आधारित एमएस स्तर पर भेदभाव की संभावना के कारण बहुसंकेतन विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इस विश्लेषण नियंत्रण रेखा एमएस वर्णलेख की एक वृद्धि की जटिलता की ओर जाता है और नमूना की राशि है कि प्रत्येक एकल हालत के लिए इंजेक्शन जा सकता है कम कर देता है।

    इस संबंध में प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। निम्नलिखित चर्चा के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिएप्रक्रिया के मामले में नकारात्मक परिणाम प्राप्त कर रहे प्रदर्शन में त्रुटियों को खोजने के ecklist। सबसे पहले, नाभिक वर्षा के बाद गोली ध्यान से निब साथ एनपी 40 वैकल्पिक (खंड 2.10) (मिश्रण के दौरान बुलबुले की कमी से ध्यान देने योग्य) डिटर्जेंट का पूरी तरह हटाने तक बिना धोया जाना चाहिए। ऐसा न होने एसिड के साथ हिस्टोन निकासी समझौता होगा। दूसरा, टीसीए के साथ हिस्टोन वर्षा (धारा 3.9) एसीटोन के साथ गोली की washes के बाद महत्वपूर्ण है। केंद्रित एसिड की उपस्थिति निम्नलिखित कदम को नुकसान पहुँचा है, तो propionylation और पाचन (धारा 6.1) सीधे प्रदर्शन कर रहे हैं। यह मामला हिस्टोन विभाजन में समस्याग्रस्त नहीं (धारा 5) किया जाता है हो सकता है। (- 6.7 अनुभाग 6.3) तीसरा, यह कि propionylation प्रतिक्रिया जल्दी से किया जाता है आवश्यक है। 4 लगातार नमूने - ऐसा करने के लिए, अधिक से अधिक 3 के लिए एक ही propionylation मिश्रण (propionic एनहाइड्राइड + acetonitrile) का उपयोग करने से बचें। इसके अतिरिक्त, पीएच trypsin पाचन (धारा 7) का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है। अगर नहींचारों ओर 8.0 (7.5 - 8.5) पाचन अप्रभावी हो जाएगा। यह भी हो सकता है के रूप में नमूना इस कदम पर propionic एसिड में अमीर हो जाएगा। एनएच 4 OH आवश्यक जब तक जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटिओमिक्स workflows के साथ परिचित शोधकर्ताओं के लिए यह नमूना खट्टा करने के लिए trypsin पाचन को समाप्त करने के लिए सामान्य महसूस होगा। यह नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह निम्नलिखित प्रतिक्रिया, यानी, पेप्टाइड एन Termini (धारा 8.1) के propionylation ख़तरे में डालना होगा। अंत में, एक ही अंक में, यह महत्वपूर्ण है कि डेटा विश्लेषण असंशोधित पेप्टाइड्स वास्तव में असंशोधित नहीं हैं के लिए याद करने के लिए है; सभी मुक्त लाइसिन अवशेषों और एन Termini propionylation (56.026 दा) का कब्जा हो जाएगा। इस प्रकार, बड़े पैमाने पर पेप्टाइड अनुक्रम करने के लिए विशिष्ट रूप से इसी के निकालने आयन क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन कोई परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे।

    विधि की सीमाओं छोटे पेप्टाइड दृश्यों के कारण ज्यादातर मिश्रित PTMs का पता लगाने, की अक्षमता से संबंधित हैं, और सच Abun को प्राप्त करने में पूर्वाग्रहोंएक संशोधन के नृत्य, तथ्य यह है कि अलग-अलग रूपों में संशोधित पेप्टाइड्स अलग क्षमता के साथ योण हो सकता है की वजह से। पहला मुद्दा एक मध्यम नीचे या ऊपर से नीचे दृष्टिकोण (16 में समीक्षा) के साथ इस तकनीक के संयोजन के द्वारा हल किया जा सकता है। विश्लेषण के इस प्रकार, तकनीकी रूप से भले ही अधिक चुनौतीपूर्ण, संशोधन के सह-अस्तित्व आवृत्तियों के अध्ययन के लिए आदर्श है। इसके अलावा, यह हिस्टोन वेरिएंट है, जो हमेशा बॉटम-अप के साथ हासिल नहीं किया जा सकता, क्योंकि कुछ पेप्टाइड्स अलग हिस्टोन वेरिएंट में उसी क्रम राशि के बेहतर भेदभाव की अनुमति देता है। दूसरा मुद्दा, आयनीकरण दक्षता से संबंधित है, सिंथेटिक पेप्टाइड्स 31 के एक पुस्तकालय का उपयोग कर हल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण हिस्टोन PTMs के रिश्तेदार बहुतायत का एक और अधिक सटीक आकलन करता है। हालांकि, सबसे प्रयोगों में, वांछित परिणाम का विश्लेषण किया स्थितियों के बीच दिए गए संशोधनों के रिश्तेदार परिवर्तन है। इस मामले में, इस तरह के सुधार के लिए आवश्यक नहीं, तथ्य यह है कि सभी नमूनों ही Bia है की वजह से हैएस।

    अंत में, इस प्रोटोकॉल हिस्टोन PTMs का विश्लेषण है कि एनएलसी मिलकर एमएस करने के लिए मिलकर का उपयोग कर 3 दिन में पूरा किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है। एमएस के अलावा अन्य तकनीकों के साथ तुलना यानी, के रूप में परिचय में चर्चा एंटीबॉडी आधारित रणनीतियों का उपयोग, के रूप में वे भी लगभग throughput के इस स्तर को प्राप्त नहीं कर सकते, उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, एंटीबॉडी आधारित तकनीक उपन्यास संशोधनों की खोज के लिए अनुमति नहीं है, लेकिन वे विशेष रूप से इस बात की पुष्टि की भविष्यवाणी की और निशान बढ़ाता पर आधारित हैं। हम इस प्रकार हिस्टोन पेप्टाइड्स पर कि नीचे अप प्रोटिओमिक्स अटकलें हिस्टोन के निशान है, जो ट्यूनिंग जीन अभिव्यक्ति में मुख्य पात्र हैं के विनियमन जानने में सहज ज्ञान युक्त फायदे के कारण प्रोटिओमिक्स प्रयोगशालाओं में लोकप्रियता हासिल है और इस तरह proteome के विनियमन को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, प्रोटोकॉल वर्णित नमूना तैयार करने और डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर में हाल ही में सुधार है, जो हिस्टोन विश्लेषण अधिक प्रयोगशाला के लिए भी तुच्छ बनाने में शामिलटोरी कि hypermodified पेप्टाइड्स के इस प्रकार के लक्षण वर्णन अनुभवी कभी नहीं।

    Disclosures

    लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

    Acknowledgments

    यह काम एनआईएच अनुदान (DP2OD007447, R01GM110174 और R01AI118891) से धन के द्वारा समर्थित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Trypsin 0.25% EDTA Invitrogen 25200056 For harvesting cells
    PBS Invitrogen 14200075
    Tris Roche 77-86-1
    Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
    Sodium Chloride Sigma S9888
    Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272
    Calcium Chloride, anhydrous Sigma C1016
    Sucrose Fisher Scientific BP220-1
    DTT Invitrogen 15508-013
    AEBSF EMD Millipore Corp 101500
    Microcystin Sigma M4194
    Sodium Butyrate Sigma B5887
    Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)  Fisher Scientific 78445
    NP- 40 Alternative CALBIOCHEM 492016
    Sulfuric Acid, ACS grade Fisher Chemical 7664-93-9
    Trichloroacetic acid Sigma T6399
    Acetone Sigma 179124
    HCl Fisher Chemical A144-500
    Bradford reagent Biorad 500-0006
    30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml Biorad 1610156
    Coomassie Fisher Scientific 20278
    C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm Grace 218TP52
    C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm Grace 218TP54
    HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
    HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
    TFA Fisher Scientific A11650
    Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
    ammonium hydroxide Sigma 338818
    propionic anhydride Sigma 240311
    Sequencing grade modified trypsin Promega PRV5113 For digesting histones for MS
    Acetic Acid Sigma 49199
    C18 extraction disk Empore 2215
    Formic Acid Sigma F0507

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    References

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    Histone बाद translational संशोधनों के विश्लेषण के लिए पूरा कार्यप्रवाह नीचे अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग: Histone निकासी से डेटा विश्लेषण करने के लिए
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    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K.… More

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).

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