Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

doi: 10.3791/54112 Published: May 17, 2016

Summary

ويعرض هذا البروتوكول على سير العمل متكامل للتميز هيستون التعديلات بعد متعدية باستخدام مطياف الكتلة (MS). يتضمن سير العمل تنقية هيستون من مزارع الخلايا أو الأنسجة، اشتقاق هيستون والهضم، وتحليل MS باستخدام النانو تدفق اللوني السائل وتعليمات لتحليل البيانات. تم تصميم بروتوكول لاستكمال غضون 2 - 3 أيام.

Abstract

جسيم نووي هي أصغر وحدة الهيكلية للونين، ويتألف من 147 زوج قاعدي من الحمض النووي ملفوفة حول وجود octamer من البروتينات هيستون. وتتوسط وظيفة هيستون من تعديلات واسعة النطاق بعد متعدية من قبل عدد لا يحصى من البروتينات النووية. هذه التعديلات هي الحاسمة للسلامة النووية كما أنها تنظم لونين هيكل وتجنيد الأنزيمات المشاركة في تنظيم الجينات، وإصلاح الحمض النووي والتكثيف كروموسوم. على الرغم من أن جزءا كبيرا من المجتمع العلمي تتبنى التقنيات المعتمدة الأجسام المضادة لتوصيف هيستون PTM وفرة، وهذه الطرق هي منخفضة الإنتاجية ومنحازة ضد بروتينات hypermodified، كما يمكن أن يعرقل حاتمة من التعديلات المجاورة. يصف هذا البروتوكول استخدام اللوني نانو السائل (مؤتمر العمل النيجيري) ومطياف الكتلة (MS) لتقدير دقيق للتعديلات هيستون. تم تصميم هذا الأسلوب لوصف مجموعة كبيرة ومتنوعة من PTMs هيستون والوفرة النسبية لعدد من المتغيرات هيستون في الصورةيحلل إنجل. في هذا البروتوكول، وderivatized الهستونات مع أنهيدريد البروبيونيك تليها الهضم مع التربسين لتوليد الببتيدات من 5-20 أأ في الطول. بعد الهضم، وderivatized المكشوفة حديثا N-ترميني من الببتيدات هيستون لتحسين معدلات الاحتفاظ الكروماتوغرافي خلال مؤتمر العمل النيجيري-MS. وتسمح هذه الطريقة لتقدير النسبي للPTMs هيستون تمتد أربع درجات.

Introduction

ويعرف علم التخلق مثل دراسة التغيرات الموروثة في التعبير الجيني التي تنشأ عن طريق آليات أخرى من تغيير الأساسي تسلسل الحمض النووي 1. تنظيم جينية أمر بالغ الأهمية خلال التنمية باعتبارها كائن يخضع المظهرية مثيرة يتغير على الرغم من أن لا يتم تغيير محتوى الحمض النووي. وهناك العديد من العناصر الأساسية اللازمة لصيانة جينية المناسبة، بما في ذلك هيستون التعديلات بعد متعدية (PTMs)، المتغيرات هيستون، الرنا غير الترميز، الحامض النووي والعوامل الحمض النووي ملزم، كل منها يؤثر على التعبير الجيني من خلال آليات مختلفة 2. على سبيل المثال، في حين الحامض النووي هو تعديل درجة عالية من الاستقرار الذي يقمع ترجمة الجينات المتغيرات هيستون وPTMs هيستون أكثر ديناميكية بكثير، ويمكن أن تؤثر على لونين في مجموعة متنوعة من الطرق (4).

يتم ترجمة PTMs هيستون في الغالب على ذيول-N محطة، لأنها المنطقة الأكثر تعرضا ومرنةمن البروتين. ومع ذلك، يتم تعديل جوهر جسيم نووي أيضا بشكل كبير مقارنة بمتوسط ​​البروتينات 5. على الرغم من علامات هيستون اتسمت على نطاق واسع في العقد الماضي، العديد من الروابط بين علامات هيستون المعروفة وظيفتها لا تزال غير واضحة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم PTMs هيستون لا تعمل وحدها، وإنما وظيفة جنبا إلى جنب مع PTMs الأخرى ( "عبر الحديث") لتغيير عملية معينة مثل النسخ 6،7 هذا. على سبيل المثال، علامة H3S10K14ac اندماجي على P21 الجين ينشط النسخ، والذي لن يحدث مع واحد فقط من اثنين من PTMs 8. التعاقدات البروتين HP1 لونين من خلال الاعتراف H3K9me2 / ME3 ونشر تعديل جسيم نووي قريب. ومع ذلك، HP1 لا يمكن ربط H3K9me2 / 3 عندما S10 المجاور هو فسفرته 9. أستلة H3K4 يمنع الارتباط من spChp1 البروتين لH3K9me2 / ME3 في pombe السكيراء 10. وعلاوة على ذلك، فإن هيستون يسين دemethylase PHF8 لديها أعلى جسيم نووي كفاءة ملزمة عندما تكون موجودة 11 ثلاثة PTMs H3K4me3، K9ac، وK14ac. هذه الأمثلة تبرز أهمية تحقيق نظرة شاملة للتغيرات PTM هيستون بدلا من التركيز على التعديلات واحدة.

وجود تسلسل المتغيرات أيضا يزيد من تعقيد تحليل هيستون، كما فعل isotypes هيستون عموما تسلسل مشابهة إلى حد كبير، ولكن في كثير من الأحيان أدوارا مختلفة في لونين. على سبيل المثال، H2A.x لديه تسلسل C-المحطة التي فسفرته أكثر سهولة على الحمض النووي من التلف مقارنة H2A الكنسي 12، وكان مطلوبا لتثبيط الكروموسومات الجنسية في الذكور الماوس الانقسام الاختزالي 13؛ وبالمثل، CENP-A بدائل H3 هيستون الكنسي في القسيم 14. وعلى الرغم من وظائفهم مختلفة، وهذه المتغيرات تشترك في جزء كبير من تسلسل الأحماض الأمينية مع هيستون الكنسي منها، مما يجعل من الصعب تحديد وقياس كل منها على حدة. وقد تم اعتماد التقنيات المعتمدة الأجسام المضادة مثل النشاف الغربي على نطاق واسع لوصف الهستونات. ومع ذلك، والنهج القائم على الأجسام المضادة محدودة للأسباب التالية: (أ) يمكن أن تؤكد فقط وجود تعديل ولا يمكن تحديد PTMs غير المعروفة؛ (ب) ومنحازة بسبب وجود علامات موجودة المشترك، والتي يمكن أن تؤثر على تقارب ملزم. (ج) لا يمكن تحديد علامات اندماجي، كما ليست سوى عدد قليل جدا من الأجسام المضادة المتاحة لهذا الغرض و (د) عبورهم في رد الفعل بين المتغيرات هيستون مماثلة إلى حد كبير أو PTMs مماثلة (على سبيل المثال، دي وtrimethylation من بقايا يسين). Egelhofer وآخرون. وصف أن أكثر من 25٪ من الأجسام المضادة التجارية تفشل الإختبارات خصوصية لطخة نقطة أو لطخة غربية، وبين الاجسام المضادة المحددة تفشل أكثر من 20٪ في التجارب مناعي لونين 15. مطياف الكتلة (MS) هو حاليا أداة تحليلية أكثر ملائمة لدراسة الرواية و / أو اندماجي PTMs،وكان قد تم تنفيذها على نطاق واسع للبروتينات هيستون (إعادة النظر في 16). هذا يرجع في معظمه إلى حساسية عالية ودقة الجماعية لمرض التصلب العصبي المتعدد، وإمكانية لإجراء تحليلات واسعة النطاق هذا.

استراتيجية من أسفل إلى أعلى هي الأكثر استخداما استراتيجية البروتينات يستند إلى MS-لتوصيف هيستون وPTMs بهم، حيث يتم هضم البروتين سليمة إنزيمي في الببتيدات قصيرة (5-20 أأ). هذا الهضم يسهل على حد سواء فصل LC والكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. الجماهير في حدود 600 - 2000 دا يشيع المتأين أكثر سهولة وحددت بدقة أعلى الجماعية وقرار من الجماهير الكبيرة. تم تحسين MS / MS تجزئة أيضا، كما هي عادة مناسبة تماما الببتيدات القصيرة للتصادم الناجم عن تفكك (CID). ومع ذلك، الهستونات تحديا لمن أسفل إلى أعلى MS كما هي التخصيب في مخلفات الأحماض الأمينية الأساسية، وهي يسين وأرجينين. لذلك، والهضم التربسين يؤدي إلى توليد الببتيدات التي هي أيضا SMجميع من أجل الاحتفاظ LC والتعريب لا لبس فيه من PTMs. للتحايل على هذه المسألة، ويتضمن بروتوكول لدينا ليسين والببتيد-N محطة الكيميائية اشتقاق 17. من المستحسن استخدام الخل البروبيونيك لكفاءة اشتقاق الكيميائية بالمقارنة مع الكواشف الأخرى 18. هذه القطع اشتقاق الفئات-ɛ الأمينية من بقايا يسين معدلة وmonomethyl، مما يسمح للالتربسين لأداء التحلل البروتيني فقط في C-محطة من بقايا أرجينين. الأمينات Derivatized لا يمكن تبادل البروتونات مع الحل، وبالتالي يتم عادة إلا مضاعفة أو ثلاثة أسباب اتهم الببتيدات، وتسهيل التصلب العصبي المتعدد والكشف MS / MS. وعلاوة على ذلك، اشتقاق N-محطة يزيد للا مائية الببتيد ومرحلة عكس بالتالي الاحتفاظ الكروماتوغرافي. هنا، نحن تصف سير العمل لتنقية الهستونات وإعدادهم للتحليل PTM عبر البروتينات من أسفل إلى أعلى (الشكل 1). هذه الاستراتيجية تحقق القياس الكمي للعلامات هيستون واحدة وعلامات اندماجي وأو PTMs هيستون التي هي قريبة نسبيا في تسلسل الأحماض الأمينية.

Protocol

1. مجموعة من الخلايا من الثقافة

  1. إذا كانت تزرع الخلايا في التعليق، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 300 لمدة 5 دقائق. إذا تمسكا، نضح وتجاهل الخلايا المتوسطة. شطف الخلايا المرفقة مع برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (المشار إليها باسم الذهاب PBS إلى الأمام). احتضان الخلايا في أي التربسين أو التربسين- EDTA (0.025٪ - 0.5٪ اعتمادا على خط الخلية) مع حجم ما يكفي لتغطية سطح لوحات عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا (الوقت يختلف عن خطوط مختلفة من الخلايا).
  2. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 300 لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا مرتين أخريين في برنامج تلفزيوني وجمع بواسطة الطرد المركزي.
  3. تقدير حجم الخلية معبأة تقريبا من التخرج ملحوظ على 1.8 مل أنابيب أو أنابيب مخروطية 15 مل.
    ملاحظة: خلايا من ثقافة يمكن المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة.

2. عزل نواة من خلايا سليمة

  • خلايا ذوبان الجليد على الجليد.
  • ذوبان عازلة العزلة النووي (بنك الاستثمار القومي، الجدول 1).
  • إعداد حوالي 5 مل العازلة طرف مستدق (الجدول 1) مقابل كل 100 ميكرولتر حجم الخلية معبأة. لكل عازلة طرف مستدق 1 مل، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وكلاء الاستقرار على النحو التالي: 1 ميكرولتر من 1 M DTT، 2.5 ميكرولتر من 200 ملي AEBSF، 2 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر microcystin و 2 ميكرولتر من 5 M الزبدات الصوديوم. طرف مستدق مع مثبطات سيتم يشار إلى طرف مستدق من هذه النقطة إلى الأمام.
    ملاحظة: إذا تم درس الفسفرة هيستون، وتشمل EDTA البروتيني مجاني وكوكتيل الفوسفاتيز المانع.
  • إزالة المجلد الخامس من العازلة بنك الاستثمار القومي وبالتالي إعداد وإضافة NP-40 البديل (الجدول 1) إلى التركيز النهائي من 0.2٪. سيتم استخدام حجم أربعة أخماس المتبقية لغسيل.
  • غسل الخلية بيليه في 01:10 خلية بيليه لبنك الاستثمار القومي دون NP-40 نسبة البديلة (ت / ت). إزالة طاف بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 700 لمدة 5 دقائق.
  • ليز وسلل بيليه عن طريق وضعه على الجليد واضاف بيليه 01:10 الخلية إلى طرف مستدق مع 0.2٪ NP-40 البديل (ت / ت).
  • إذا استخراج عينات من الأنسجة، والتجانس باستخدام المجانسة هاون ومدقة أو dounce. الخلايا المستزرعة يمكن المتجانس من قبل pipetting لطيف.
  • احتضان خلايا متجانسة على الجليد لمدة 5-10 دقائق. فإن الخلايا ليز والافراج عن نوى.
  • أجهزة الطرد المركزي في 1000 إطار التعاون الإقليمي ل5-10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بيليه تحتوي الخلية معظمهم نوى، في حين طاف يحتوي على مكونات معظمهم هيولية. حفظ جزء حشوية إذا رغبت في ذلك.
  • يغسل بيليه أنويتها عن طريق إعادة التعليق برفق في 01:10 (ت / ت) بنك الاستثمار القومي دون NP-40 البديل.
    ملاحظة: هذه الخطوة غسل هي فقط لإزالة آثار المنظفات قبل استخراج الهستونات من النوى.
  • أجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 1000 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
  • كرر الخطوة 2،10-2،11 مرتين على الأقل لإزالة تماما NP-40 البديل. إزالة NP-40 البديل هو واضحق pipetting لطيف خلال الخطوة غسل لم يعد يشكل فقاعات.
  • لاستخراج هيستون من الأنسجة:
    1. شطف الأنسجة المجمدة الطازجة أو إذابة في الجليد الباردة بنك الاستثمار القومي.
    2. نقل الأنسجة إلى طبق بتري وضعت على الجليد مع بنك الاستثمار القومي، ما يكفي للحفاظ على النسيج الرطب.
    3. النرد إلى أصغر قطعة (<1 مم) مع شفرة حلاقة لزيادة الاتصال السطح لعزل النوى.
    4. نقل الأنسجة المفروم إلى الخالط قبل المبردة ويغسل في بنك الاستثمار القومي من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    5. إزالة العازلة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 300 لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة طرف مستدق تحتوي على NP-40 بديل الخلايا في الخلايا: العازلة نسبة 01:10 (ت / ت) والتجانس من 5-10 السكتات الدماغية.
    7. تحقق من وجود تحلل الخلايا وتكرار التجانس حسب الحاجة. وهناك مؤشر جيد أن الخلايا هي lysed تم هو الحد من حجم بيليه. يجب أن تحتوي على كريات النوى الوحيدة.
    8. أجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 700 لمدة 5 دقائق وحفظ بيليه. هذا بيليه يمكن استخراج 1-2 المزيد من الوقتالصورة في 01:10 (ت / ت) من طرف مستدق تحتوي على NP-40 البديل. في هذه المرحلة، يتم استخراج الهستونات من لونين وبيليه قد تقلصت إلى حد كبير.
    9. غسل مرتين مع 2-3 مل من طرف مستدق دون NP40 البديل لإزالة آثار المنظفات.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: نموذج يمكن معلق في الحد الأدنى للحجم طرف مستدق + 5٪ الجلسرين، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  • 3. استخراج وتنقية الهستونات من النوى

    ملاحظة: الهستونات غنية جدا في مخلفات الأحماض الأمينية الأساسية، والسماح لهم للتفاعل وثيق مع العمود الفقري حمض الفوسفوريك من الحمض النووي. الهستونات هي من بين البروتينات الأساسية في النواة، وبالتالي السماح لهم ليكون استخراجه في حامض الكبريتيك المثلج (0.2 MH 2 SO 4) مع التلوث الحد الأدنى من البروتينات غير بسيطة، مما يعجل في حمض قوي. ويمكن بعد ذلك TCA مركزة للغاية (لتركيز النهائي من 33٪) يمكن أن تستخدم لترسيب الهستونات من الكبريتحامض. يتم تخزين TCA إلى 100٪ في زجاجة بنية اللون في 4 درجات مئوية.

    1. نواة الخلية resuspend في 1: 5 (ت / ت) فتور 0.2 MH 2 SO 4 (الجدول 1) من قبل pipetting لطيف.
    2. احتضان العينة مع دوران مستمر أو لطيف تهتز ل2-4 ساعة عند 4 درجات مئوية. عادة، للعينات مع أكثر من 500 خلية بيليه ميكرولتر، استخراج 2 ساعة كافية لاستخراج الهستونات. قد يؤدي أطول حضانة في استخراج البروتينات الأساسية الأخرى. الكريات النووية الصغيرة (<200 ميكرولتر)، ويوفر 4 استخراج ساعة عائد أفضل.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 3400 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. طاف لنقل أنبوب جديد.
    5. كرر الخطوات من 3،3-3،4 لإزالة أي مواد غير قابلة للذوبان.
    6. لترسيب الهستونات، إضافة المبردة 100٪ TCA (الجدول 1) لطاف جمعها (الآن تحتوي على الهستونات) في نسبة 1: 3 (ت / ت)، وذلك للحصول على تركيز TCA النهائي من 33٪. مزيج من قبل قلب الأنبوب عدد قليل ربرامج تحرير أسلوب الإدخال.
      ملاحظة: إن عينات تتحول غائم على إضافة TCA، تشير إلى وجود الهستونات.
    7. احتضان الخليط على الجليد لمدة لا تقل عن 1 ساعة. لأحجام بيليه انطلاق أصغر، فمن المستحسن هطول الأمطار بين عشية وضحاها.
    8. أجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 3400 لمدة 5 دقائق. معطف الهستونات جانبي الأنابيب وأيضا إيداع في القاع. يشكل بيليه غير قابلة للذوبان الأبيض أيضا في أسفل الأنبوب، والتي في معظمها يحتوي على البروتينات غير هيستون والجزيئات الحيوية الأخرى. إزالة طاف بواسطة الشفط، بعناية دون كشط الجانبين أو بيليه.
    9. باستخدام ماصة باستير الزجاج، شطف أنبوب مع الثلج الباردة الأسيتون + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (الجدول 1) وذلك لتغطية البروتينات عجلت طلاء الجانبين وأسفل.
    10. أجهزة الطرد المركزي في 3400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 2 دقيقة وطاف نضح، بعناية دون كشط الجانبين أو بيليه.
    11. كرر الخطوات 3،9-3،10 استخدام 100٪ الأسيتون الجليد الباردة.
    12. بيليه الجافة مع تدفق الهواء أو مع vacuأم أجهزة الطرد المركزي، أو فقط من خلال ترك أنبوب مفتوحة. الأسيتون يتبخر بسرعة.
    13. حل الهستونات مع ده 2 O (الماء المقطر المزدوج) في حجم الحد الأدنى الممكن حل طبقة بيضاء تماما. الهستونات قابلة للذوبان في الماء بسهولة. الكريات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، و 100 ميكرولتر ده 2 O هو عادة ما يكفي لجمع الهستونات.
    14. أجهزة الطرد المركزي في 3400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 2 دقيقة وطاف لنقل أنبوب جديد.

    4. تقدير تركيز البروتين والطهارة

    1. لقياس تركيز البروتين، استخدم BCA، برادفورد البروتين فحص أو تحليل الحمض الأميني (AAA). لا تستخدم التقنيات التي تعتمد الامتصاصية في 280 نانومتر، كما الهستونات ضعيفة في مخلفات الأحماض الأمينية العطرية.
    2. التحقق من نقاء الهستونات المستخرجة من تحليل SDS-PAGE مع هلام الأكريلاميد 15٪ وCoomassie تلطيخ (اختياري).
    3. وإذا رغبت عالية النقاء المتغيرات هيستون واحد، ومواصلة تجزئة HPLC للأشعة فوق البنفسجية منالمتغيرات هيستون (القسم 5). إن لم يكن، انتقل مباشرة إلى تحضير العينة للتحليل هيستون PTM من أسفل إلى أعلى (المادة 6).

    5. فصل هيستون متغيرات كل مرحلة عكس HPLC (اختياري)

    ملاحظة: يمكن الحصول على المتغيرات هيستون عالية النقاء من قبل بكسر الخليط هيستون الخام باستخدام المرحلة عكس HPLC بالإضافة إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية. هذه الهستونات تنقية مفيدة للدراسات التي تتطلب حساسية أعلى والنقاء. ومع ذلك، لمعيار توصيف هيستون PTM، هذه الخطوة يمكن تخطي لأن تحليل حساسة وشاملة بما فيه الكفاية. تجزئة من هيستون سليمة المتغيرات مثالي يتطلب لا يقل عن 100 - 300 ميكروغرام من بدء المادية.

    1. توصيل C 18 5 ميكرون العمود المناسب لHPLC اعتمادا على تركيز هيستون البدء: مع حوالي 100 ميكروغرام من الهستونات، استخدم 2.1 ملم × 250 ملم عمود مع معدل تدفق 0.2 مل / دقيقة. مع حوالي 300 ميكروغرام الهستونات، استخدم عمود 4.6 × 250 ملم معمعدل تدفق 0.8 مل / دقيقة. إعداد العازلة A و B باستخدام الأواني الزجاجية مخصصة على النحو التالي:
      1. إعداد العازلة ج: 5٪ HPLC الصف الأسيتونتريل، TFA 0.1٪ في الماء HPLC الصف.
      2. إعداد B الاحتياطي: 95٪ HPLC الصف الأسيتونتريل، TFA 0.1٪ في الماء HPLC الصف.
    2. ربط العمود إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية، وتعيين الامتصاصية إلى 210-220 نانومتر.
    3. يحمض عينة هيستون المذاب في الماء مع 100٪ TFA لتحقيق تركيز النهائي من 0،1-1٪ TFA.
    4. تتوازن العمود مع 100٪ عازلة لمدة 15 دقيقة على الأقل في معدل تدفق أوصى، وهو ما يعادل تقريبا ثلاثة مجلدات العمود. استخدام هذا إشارة إلى تعيين مستوى الصفر الامتصاصية للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.
    5. إعداد أنابيب بحجم مناسب لجمع الكسور إما يدويا أو في عينة جامع التلقائي.
    6. حقن عينة بتركيز حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. عينات الذائبة في كميات أكبر قد يغير موازنة العمود دوتحميل حلقة وتؤدي إلى انخفاض الأداء.
    7. تشغيل التدرج، مبرمجة على النحو التالي: 0-30٪ B في 1 دقيقة، 30 إلى 60٪ B في 90 دقيقة، و 60 إلى 90٪ B في 1 دقيقة.
    8. جمع الكسور (على سبيل المثال اللوني هو مبين في الشكل 2) في 1 فترات دقيقة باستخدام جزء جامع التلقائي. جمع الكسور في أنابيب حجم المناسبة لاحتواء وحدة التخزين بالكامل.
    9. تجف أسفل العينات مجزأة في مكثف فراغ.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: يمكن تخزين كسور هيستون المجفف في درجة حرارة الغرفة لفترات قصيرة (1-2 أيام) أو في الفريزر -80 درجة مئوية لفترات طويلة الأجل.

    6. اشتقاق الكيميائية من الهستونات عن طريق البروبيونيك الاندريد للتحليل من أسفل إلى أعلى

    1. (الكمية الموصى بها: 50 - 100 ميكروغرام) حل عينات هيستون في 40 ميكرولتر من 50 ملي NH 4 HCO ودرجة الحموضة 8.0. إذا كانت العينات في ده النقي 2 O، إضافة تركيزا NH 4 HCO 3 لتعويض 50 ملم، ودرجة الحموضة (8).0.
    2. الرطب طرف P10 ماصة في عينة للتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني دون خسائر العينة. NH 4 OH وحمض الفورميك يمكن استخدامها لضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
      ملاحظة: الجزء التالي من البروتوكول (الخطوات 6،3-6،7) ينبغي أن يتم على دفعات من أقصى 3-4 عينات، من اجل الحفاظ على أنهيدريد البروبيونيك رد الفعل.
    3. استخدام غطاء الدخان للخطوات اللاحقة حيث يتم استخدام الخل البروبيونيك. إعداد propionylation كاشف جديدة عن طريق خلط الخل البروبيونيك مع الأسيتونتريل في نسبة 1: 3 (ت / ت). إضافة كاشف propionylation لعينة في 1: 4 (ت / ت). 40 الهستونات ميكرولتر، إضافة 10 ميكرولتر كاشف propionylation.
      ملاحظة: من الممكن أن نلاحظ الحطام الأبيض في هذه الخطوة. ومع ذلك، هذا في معظمها يحتوي على الأملاح وحمض البروبيونيك، وبالتالي لا يحتاج الإجراءات المحددة التي يتعين اتخاذها.
    4. بسرعة إضافة NH 4 OH لإعادة تأسيس ودرجة الحموضة 8.0 إلى الحل. ملاحظة: أنهيدريد البروبيونيك التفاعل مع الأمينات خالية من الببتيدات تنتج دعامةحمض الأيونية أن يقلل الحموضة. عادة، مضيفا NH 4 OH على عينة مع نسبة 1: 5 (ت / ت) غير مناسبة لإعادة تأسيس ودرجة الحموضة 8.0، على سبيل المثال، 8 ميكرولتر من NH 4 OH 40 ميكرولتر من العينة.
    5. مزيج فورا من قبل vortexing.
    6. تحقق درجة الحموضة مع نفس الإجراء الخطوة 6.2.
      الحذر: عند الرقم الهيدروجيني أكبر من 10.0، ووضع العلامات من بقايا الأحماض الأمينية الأخرى مع ارتفاع الباكاف الحمضية غير ممكن.
    7. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    8. كرر الخطوات من 6،3-6،7، وأداء بدقة رد فعل لمدة لا تتجاوز 3 أو 4 عينات لكل دفعة من كاشف propionylation.
    9. عينات الجافة وصولا الى 10-20 ميكرولتر في مكثف فراغ. هذا يتبخر الخل المتفاعل البروبيونيك، الأسيتونتريل، وحامض الخليك وغاز الامونيا صدر من NH 4 OH. إذا عينات تجف تماما، لم تحدث خسائر كبيرة العينة.
      ملاحظة: كحولالأيسوبروبيل يمكن استخدامها بدلا من الأسيتونتريل. ومع ذلك، الأسيتونتريل ديه أقل التوتر السطحي، وبالتالي أكثرالتبخر السريع.
    10. و resuspend أو تمييع العينات مع ده 2 O حتى يتم تحقيق 40 ميكرولتر من الحجم النهائي.
    11. كرر الخطوات من 6،2-6،9. جولة مزدوجة من propionylation هيستون يضمن> 95٪ من اكتمال التفاعل.
    12. ملء زجاجة الخل البروبيونيك بغاز الأرجون وذلك لمنع تشكيل حمض الخليك في اتصال مع رطوبة في زجاجة.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: يمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية تشكيلها في ده 2 O أو المجففة.

    7. متعلق ب التحلل البروتيني الهضم مع التربسين

    1. الهستونات resuspend في 50 ملي NH 4 HCO 3 لتحقيق تركيز الأمثل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. عينات أكثر المخفف تؤدي إلى خفض كفاءة التربسين.
      ملاحظة: في حاجة إلى الهستونات في هذه الخطوة لتكون على درجة الحموضة 8.0 إذا كان لا يزال الحمضية، ثم إضافة NH 4 HCO 3 الملح لعينة باستخدام طرف الماصة.
    2. إضافة التربسين لعينات هيستون بنسبة 01:10 (وزن / وزن).
    3. Incubaالشركة المصرية للاتصالات عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة.
    4. وقف عملية الهضم من خلال تجميد في -80 درجة مئوية.
    5. تجف أسفل العينة إلى 10-20 ميكرولتر في مكثف فراغ.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: يمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية.

    8. Propionylation من هيستون الببتيدات في N-ترميني

    ملاحظة: يصف هذا القسم اشتقاق الببتيد N-ترميني المتولدة من التربسين هضم. هذا الإجراء يحسن الاحتفاظ HPLC من أقصر الببتيدات (على سبيل المثال، الأحماض الأمينية 3-8 من H3 هيستون)، ومجموعة بروبيونيل يزيد الببتيد للا مائية.

    1. عينات resuspend في 30 ميكرولتر من 100 ملي NH 4 HCO 3.
    2. كرر الخطوات من 6،1-6،9.
      ملاحظة: فمن الطبيعي أن تجفيف العينات في فراغ يأخذ وقتا أطول في هذه الخطوة.
    3. و resuspend أو تمييع العينات مع 50-100 ميكرولتر ده 2 O + إما TFA 0.1٪ أو 0.5٪ حامض الخليك. ملاحظة: ينصح حمض الخليك لتخزين طويلة، كما TFA facilitatوفاق الأكسدة ميثيونين على المدى الطويل. من ناحية أخرى، ينصح TFA إذا يتم تنفيذ-ترجيح مرحلة (المادة 9) في نفس اليوم، كما يساعد TFA لاستبقاء أفضل الكروماتوغرافي.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: يمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية.

    9. تحلية عينة مع مسارح، نصائح

    ملاحظة: في هذه المرحلة، هناك الملح الحاضر في العينة. أملاح تعرقل تحليل HPLC-MS لأنهم تأيين خلال electrospray، قمع إشارة من الببتيدات. يمكن الأملاح أيضا تشكيل adducts الأيونية على الببتيدات، والحد من كثافة إشارة لالببتيد غير المقرب. كما الببتيد المقرب سيكون له الإعلام المختلفة، لن يتم التعرف على الببتيد بشكل صحيح أو كميا.

    1. باستخدام P1000 ماصة، لكمة قرص من C 18 مادة من قرص استخراج المرحلة الصلبة. دفع MiniDisk لمن طرف P1000 باستخدام الشعرية السيليكا تنصهر وإيداع MiniDisk لفي الجزء السفلي من ماصة P100 / 200. تأكد من أن دوتنحصر ISK آمن في الجزء السفلي من طرف (الشكل 3).
      ملاحظة: غيض P1000 لديه ثقب صغير بدلا لكمة القرص C 18. ومن المناسب أن يقطع آخر سنتيمتر من طرف من أجل الحصول على حفرة بقطر أكبر.
    2. استخدام اثنين من C 18 اللكمات في نفس طرف P100 / P200 إذا تحلية أكثر من 25 ميكروغرام من العينة.
    3. استخدام محول أجهزة الطرد المركزي لعقد مراحل نصائح في مكان في 1.5 مل أو 2 مل أنابيب microcentrifuge ل. استخدام بطيء (300-400 إطار التعاون الإقليمي) التناوب. المذيبات تمر عادة من خلال الراتنج في أقل من دقيقة.
    4. تدفق الراتنج من خلال الدوران مع 50 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل لتفعيل المادة 18 C وإزالة التلوث المحتملة.
    5. تتوازن القرص عن طريق تنظيف 80 ميكرولتر من 0.1٪ TFA بواسطة الطرد المركزي بطيئة.
    6. تحمض العينة لدرجة الحموضة 4.0 أو أقل مع حمض الخليك. تحقق من درجة الحموضة مع شرائح الأس الهيدروجيني للحد من فقدان العينة. عينة تحميل على القرص عن طريق الطرد المركزي بطيئة.
    7. غسلعينة عن طريق تنظيف 70-80 ميكرولتر من 0.1٪ TFA بواسطة الطرد المركزي بطيئة.
    8. أزل العينة عن طريق تنظيف 70 ميكرولتر 75٪ الأسيتونتريل وحمض الخليك 0.5٪ عن طريق الطرد المركزي بطيئة. جمع العينة في أنبوب 1.5 مل.
    9. عينة الجافة في المكثف فراغ.
      ملاحظة: نقطة توقف المؤقتة: يمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية.

    10. تحليل هيستون الببتيدات

    ملاحظة: يجب تعيين منصة مؤتمر العمل النيجيري-MS يصل كما هو الحال في تحليل الببتيد التقليدي. ينصح 300 عمود تدفق نيكولا لانغ (75 ميكرون معرف العمود التحليلي، C 18 الجسيمات)، كما هي حلا وسطا ممتازا بين الحساسية والاستقرار - استخدام 200. يمكن أن يكون طريقة الشراء MS إما مزيج من الاستحواذ التي تعتمد على البيانات (DDA) مع مسح المستهدفة 19 أو المستقل الحصول على البيانات (DIA) 20،21، على حد سواء وصفت في ممثل النتائج والشكل (4).

    1. إعداد مخازن HPLC - A: حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ فيHPLC الصف المياه؛ باء: حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الأسيتونتريل HPLC الصف.
    2. برمجة طريقة HPLC على النحو التالي: 0-30٪ B العازلة في 30 دقيقة، من 30 إلى 100٪ B لمدة 5 دقائق المقبل وفي isocratic 100٪ B لمدة 8 دقائق. إذا لم يتم برمجة HPLC الآلي لموازنة عمود قبل تحميل عينة، ثم ما يلي: التدرج 100-0٪ B في 1 دقيقة وتدفق isocratic في 0٪ B لمدة 10 دقيقة. ضبط معدل تدفق التحليل إلى 250-300 NL / دقيقة.
    3. البرنامج طريقة الشراء MS إلى القيام بأي السلاح جنبا إلى جنب مع مسح المستهدفة 19 أو DIA 20،21 (الشكل 4). تأكد من أن دورة العمل MS يسمح لأحد الكامل MS مسح كل ~ 2 ثانية، من أجل الحصول على نقاط بيانات كافية لفي ذروة الكروماتوغرافي، والتي تمكن الكمي أكثر دقة. ملاحظة: مع C 18 اللوني، متوسط ​​ذروة الأساس العرض هو حوالي 30 ثانية لالتدرج هو موضح أعلاه.
    4. تحميل ما يقرب من 1 ميكروغرام من العينة على HPLC جolumn.
    5. تشغيل الأسلوب HPLC-MS / MS كما كان مخططا.
      ملاحظة: في البروتوكول لا نوصي تفاصيل الأعمدة، وأدوات MS أو MS تفاصيل المعلمة، لأن أي الإعداد الأمثل الذي مختبر البروتينات الفردية المتقدمة سوف تكون مناسبة للأسلوب. يجب مختبرات البروتينات استخدام الإعداد الخاصة بهم الأمثل، منذ الببتيدات هيستون منفصلة كما الببتيدات التقليدية.

    تحليل 11. البيانات

    1. استيراد ملفات الخام MS إلى البرنامج لأداء التكامل منطقة ذروة. ملاحظة: يوصى EpiProfile 22، كما هو الأمثل لالببتيدات هيستون. باستخدام الوقت الاحتفاظ معرفة شطف الكروماتوغرافي ينفذ موثوق استخراج ذروة مجال الببتيدات هيستون المعروفة. بدلا من ذلك، الأفق 23 هو برنامج مثالي آخر لهذا الغرض.
      1. حساب الوفرة النسبية من الببتيد التي قدمها تقسيم المنطقة من قبل مساحة إجمالية قدرها أن الببتيد في جميع أشكاله المعدلة. ملاحظة: في حالة اكتشاف analyينصح جهاز الأمن والمخابرات التميمة لتحديد أطياف الببتيدات هيستون تعديلها. وقد وصفت أداء هذه الأداة مؤخرا 24. جميع محركات البحث قاعدة بيانات أخرى عن البروتينات هي أيضا قابلة للاستخدام، ولكن على تجاربنا قدموا أداء أقل.

    Representative Results

    وكمثال على ذلك، قمنا بتحليل الهستونات المستخرجة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مع أو بدون حمض الريتينويك (RA) التحفيز، بدءا من 200 الكريات خلية ميكرولتر. وجود التهاب المفاصل الروماتويدي في زراعة الخلايا يؤدي إلى ESC التمايز. من بيليه الخلية، حول 50-100 ميكروغرام من الهستونات انتزعت، التي هي أكثر من كافية لأداء عدة حقن LC-MS من الببتيدات هيستون. بعد اشتقاق، والهضم، وتحلية، تم تحميل العينات على 75 ميكرومتر × 15 سم C 18 عمود (الجسيمات قطرها 3 ميكرون، حجم المسام 300 Å) في وضع تسلسلي مع ارتفاع أداء نظام السائل نانو اللوني مع رقائق ميكروفلويديك بالإضافة إلى هجين خطي فخ رباعي - مطياف الكتلة orbitrap. تم تنفيذ الاستحواذ MS باستخدام مطار دبي الدولي. في موازاة ذلك، تم تحليل عينات أيضا مع طريقة إدارة شؤون نزع السلاح باستخدام UHPLC النانو تدفق بالإضافة إلى هجين أيون مطياف الكتلة فخ orbitrap (لا تظهر البيانات). فيكل دورة، تم تنفيذ واحد كشف MS orbitrap الكامل مع مسح مجموعة من 290 إلى 1400 م / ض، وهو قرار من 60،000 (في 200 م / ض) و AGC من 10 6. وبعد ذلك، تم تطبيق البيانات وضع اكتساب تعتمد مع ديناميكية استبعاد 30 ثانية. وتلت بمسح MS / MS على أيونات الأم من أكثرها كثافة. تم استبعاد أيونات مع ولاية تهمة واحدة من MS / MS. تم استخدام نافذة عزل 2 م / ض. كانت مجزأة أيونات باستخدام الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) مع الطاقة اصطدام 35٪. كان يستخدم أيون كشف مصيدة مع وضع مجموعة المسح العادي ومعدل المسح العادي مع AGC من 10 4.

    وقد تم تحليل البيانات الخام MS اعتماد برنامج لاستخراج السلائف والأيونات جزء الاستشرابية، وهي أفق 23 و 22 EpiProfile. وقد تم تحسين EpiProfile لالببتيدات هيستون، كما أنه يدمج ذكي استخراج الذروة المنطقة بسبب معرفة سابقة من الحماسيالمد الوقت الاحتفاظ. من ناحية أخرى، هو الأمثل الأفق لتحليل DIA، وبالتالي فإن الأرقام DIA عرض (الأرقام 4 و 5A) ولقطات من هذا البرنامج. من اللوني ايون المستخرج، يتم استرداد المنطقة تحت المنحنى، وهذا يستخدم لتقدير وفرة من كل الببتيد. تم حساب منطقة ذروة الكروماتوغرافي لل[M + H] + [M + 2H] 2+، و[M + 3H] 3+ أيونات الببتيد نفسه، حتى وإن كان في معظم الحالات [M + 2H] 2+ كان الشكل السائد. وهذا يوفر وفرة الخام من شكل معدل معين من الببتيد. من أجل تحقيق الوفرة النسبية للPTMs، اعتبر مجموع كل أشكال معدلة مختلفة من الببتيد هيستون إلى 100٪، وقسمت المنطقة من الببتيد معين من المساحة الإجمالية لهذا الببتيد هيستون في جميع أشكاله المعدلة .

    الببتيدات هيستون موجودة في فا riety من أشكال إسوي الضغط (الشكل 5). الببتيدات إسوي الضغط، على سبيل المثال، K18ac وK23ac، لا يمكن إلا أن يكون كميا على مستوى MS / MS، حيث يتم استخدام أيونات جزء فريدة من نوعها لتحديد نسبة الأنواع إسوي الضغط (الشكل 5A و5B). وتستخدم هذه النسبة إلى تقسيم منطقة ذروة الكروماتوغرافي بين النوعين. عند استخدام السلاح، وقد أدرجت هذه الأشكال إسوي الضغط في قائمة الجماهير المستهدفة، لأن هذه الببتيدات يجب اختيارها للتجزئة من خلال شطف لهم بأكمله، وهو ما لا يحدث في تجربة السلاح القياسية. التمييز من الوفرة النسبية للأنواع إسوي الضغط ثم يتم تنفيذ من خلال مراقبة البيانات الشخصية شطف من الأيونات شظية. من ناحية أخرى، نوع DIA الاستحواذ لا يتطلب أي قائمة إدراج. ومع ذلك، فإن هذا النوع من طريقة الشراء غير متوافق مع البحث في قاعدة البيانات التقليدية، وبالتالي قد تحول دون اكتشاف الببتيدات غير معروفة تعديلها.

    الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> والتمييز يسين أستلة (+ 42،011 دا) من trimethylation إسوي الضغط تقريبا (+ 42،047 دا) باستخدام عالية الدقة MS الاستحواذ (> 30000). وعلاوة على ذلك، أستلة أكثر مسعور من trimethylation، مما يؤدي إلى شطف من الببتيد الأسيتيل في وقت لاحق من تلك trimethylated منها. شكل معدلة من نفس الببتيد elutes حتى وقت لاحق، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ليسين وpropionylated. وباختصار، فإن ترتيب للا مائية لالببتيد مع موقع واحد قابل للتعديل هو عرق وtrimethylated <الأسيتيل <معدلة (propionylated) <monomethylated (propionylated).

    وأظهرت hESCs انخفاض واضح من الببتيدات الأسيتيل عندما حفز للتمايز (الشكل 6A و 6B). وهذا لم يكن مفاجئا، كما أفادت النتائج السابقة أعلى أستلة في المجالس الاقتصادية والاجتماعية بالمقارنة مع التفريق منها 25،يعكس الطبيعة المتساهلة عموما من لونين المحفزة. من خلال التركيز على H3 هيستون، وتم قياس كمية 35 أشكال معدلة مختلفة (الشكل 6C). ومع ذلك، كل proteoforms هيستون التي يمكن أن يتم التحقيق مع هذا النهج أكثر من 200، بما في ذلك جميع المتغيرات هيستون والتعديلات وفرة منخفضة (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، أظهر تحليلنا أن استنساخ عالية يمكن الحصول عليها بين مكررات التقنية، كما يدل على ذلك حجم صغير من أشرطة الخطأ (تمثل ± الانحراف المعياري). معا، ويصف هذا القسم كيفية استخراج الوفرة النسبية من الببتيدات هيستون تعديلها باستخدام بيانات NLC-MS.

    الشكل 1
    الشكل 1: سير العمل من أسفل إلى أعلى MS / MS تحليل هيستون ويبين الخطوات العشر لتحليل هيستون، بما في ذلك تقدير الوقت اللازم لكل خطوة. ونظرا للعدد القسم بين قوسين أنها موجودة في المخطوطة. القسم 5، واصفا عينة تجزئة لعزل مختلف المتغيرات هيستون، يمكن إغفال ما لم يكن هناك حاجة لتحليل حساسة للغاية من البديل معين. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: عكس المرحلة العليا تدفق LC للهيستون البديل تجزئة وCoomassie جل (A) اللوني LC-الأشعة فوق البنفسجية تمثل الفصل هيستون سليمة. المتغيرات هيستون H3 يمكن تمييز بعضها عن بعض وفقا لآخر شطف لهم. الكسور يمكن جمعها إما يدويا أو باستخدام جامع جزء الآلي. (ب) Coomassie هلام من ثلاثة مكررات لتنقية هيستون.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الرقم 3: جعل من مسارح البقشيش التوصيل مع P1000 ماصة، لكمة قرص مصنوع من C 18 مادة من قرص استخراج المرحلة الصلبة (الفريق الثاني). سوف MiniDisk لعصا في طرف (لوحة المتوسطة)، بحيث يمكن دفع بها إلى ماصة P100 أصغر / 200 باستخدام أي نوع من الشعرية الصغيرة. في هذا المثال، استخدمنا 700 ميكرون قطرها الخارجي السيليكا تنصهر أنابيب. يجب دفع MiniDisk للأسفل ماصة P100 / 200 حتى أنه لا يمكن أن تذهب إلى أي مزيد من (لوحة الماضية). غيض المرحلة هو على استعداد لتحلية هيستون، كما أن لديها القدرة الكافية للاحتفاظ ما يكفي من المواد عينة للعديد من مكررات. على وجه التحديد، MiniDisk لواحدة تكفي ل15-20 ميكروغرام من ساmple. إذا كنت بحاجة إلى المزيد من العينة، والأقراص متعددة يمكن أن تكون معبأة على بعضها البعض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الرقم 4: التمثيل التخطيطي من السلاح وDIA طرق عند استخدام السلاح، وتتميز دورة المسح MS عن طريق الانتقاء متتابعة من أيونات تمهيدا لتجزئة MS / MS وفقا لكثافتها وولاية تهمة. مرة واحدة وقد تم تجزئة أيون السلائف يتم وضعها في قائمة استثناء لتجنب اختيار المتكررة من نفس الببتيد، بحيث MS يمكن "حفر" إلى إشارات أقل وفرة. هذه طريقة الشراء هو الأسلوب المفضل في البروتينات لوضع الاكتشاف. ويتحقق الكمي من خلال دمج إشارة مسح كامل لايون نظرا القادمة إلى MS تحديد /MS الطيف. في مطار دبي الدولي، تم تجزئة كامل نطاق م / ض في كل دورة المسح الضوئي. هذا النهج هو أقل ملاءمة لوضع الاكتشاف، ولكنها تنتج لمحة الكروماتوغرافي من كل الأيونات، السلائف والمنتجات. وهذا يؤدي إلى تقدير أكثر ثقة والتمييز من أشكال إسوي الضغط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 5
    الرقم 5: الكمي لإسوي الضغط الببتيدات (أ) مثال اثنين من الببتيدات إسوي الضغط عادة وفيرة في تحليل هيستون. اللوني ايون المستخرج (XIC) من كتلة السلائف والنظائر النسبية (أعلاه) مطابق. ومع ذلك، فإن XIC من الأيونات المنتج (أدناه) يسمح للتمييز من هذين الشكلين إسوي الضغط. والجدير بالذكر، يجب أن يكون لنا الأيونات شظية الفريدة فقطإد لتقدير الوفرة النسبية للنوعين. (ب) تمثيل أيونات جزء فريدة من نوعها لاثنين من الببتيدات وصفت (باللون الأحمر). قائمة (ج) من الببتيدات تحليلها عادة في الإنسان العاقل وجود ما يعادل إسوي الضغط واحد على الأقل. تسلسل المتغيرات بين وأشار الببتيدات هيستون المدرجة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (6)
    الشكل 6: ممثل النتائج من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع وبدون الريتينويك علاج حمض (A) الكمي النسبي من الببتيد هيستون H3 KQLATKAAR (أأ 18 - 26) في كل من proteoforms معدلة. وقدرت الوفرة النسبية باستخدام جميع proteoforms الى 100٪ (ويختلطلا يظهر نسبة ative من الببتيد معدلة) (B) الكمي النسبي للهيستون H3 الببتيد KSTGGKAPR (أأ 9 - 17) (C) وفرة نسبية من الببتيدات الكشف عن H3 هيستون الكنسي مع وبدون العلاج بالخلايا مع حمض الريتينويك. يشير هذا الرقم في أي من المعاملتين التعديلات المعطاة هي أكثر وفرة (> 50٪). وعموما، علينا أن نبرهن على هيستون H3 أستلة انخفاض في معظم بقايا يسين على تحريض تمايز الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    حل # تركيب
    1 يتم عزل النووي الواق الأوراق المالية (بنك الاستثمار القومي) على النحو التالي وتخزينها المجمدة الى 100 مل aliquots في -20 درجة مئوية. إذابةويمكن تخزين طرف مستدق عند 4 درجة مئوية لمدة أسابيع قليلة: 15 ملي تريس، 60 مم بوكل، 15 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 1 ملم CaCl و 250 ملي السكروز. يتم ضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك.
    2 مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة إلى مخازن قبل الاستخدام): 1 M Dithiothreitol (DTT) في [ده 2 O (1،000x)؛ 200 ملي AEBSF في ده 2 O (400X)
    3 الفوسفاتيز المانع (إضافة جديدة إلى مخازن قبل الاستخدام): 2.5 ميكرومتر Microcystin في الإيثانول بنسبة 100٪ (500X)
    4 مثبط HDAC (إضافة جديدة إلى مخازن قبل استخدامها): 5 الزبدات M الصوديوم، الذي أدلى به معايرة حمض 5 M زبدي باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.0 (500X)
    5 NP-40 البديل: 10٪ ت / ت في [ده 2 O
    6 0.2 MH 2 SO 4 في ده 2 O
    7 حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA): 100٪ ث / ت في [ده 2 O
    8 الأسيتون + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك): 0.1٪ حجم / حجم حمض الهيدروكلوريك في الأسيتون

    الجدول 1. حلول.

    Discussion

    هو الأمثل بروتوكول صفها هنا النظر في التكاليف والوقت والأداء. استعدادات أخرى ممكنة، ولكن لديهم قيود، وخاصة في حالة اقتران مع تحليل MS. على سبيل المثال، بروتوكول استخراج عالية من الملح يمكن أن تستخدم لتنقية الهستونات 26 بدلا من هطول TCA (القسم 3). بروتوكول عالية من الملح أكثر اعتدالا في جوهرها، كما أنه لا يستخدم حمض قوي. هذا يحفظ PTMs حمض عطوب ويزيد من العائد من الهستونات المستخرج، كما TCA هطول المشارك يترسب العديد من البروتينات الأخرى لونين ملزمة. ومع ذلك، واستخراج عالية من الملح يؤدي إلى عينات تحتوي على الملح مركزة للغاية بالنسبة HPLC-MS / MS. في إعداد بديل، والهضم هيستون يمكن القيام بها دون propionylation (القسم 6-8)، على سبيل المثال من خلال تقليل الوقت التربسين الحضانة ونسبة انزيم / الركيزة 27 أو باستخدام ARGC كما انزيم الهضم 28-30. ومع ذلك، فمن المستحسن اشتقاق مع أنهيدريد البروبيونيك، وأنار يؤدي إلى توليد المزيد من الببتيدات مسعور، والتي يتم الاحتفاظ بشكل أفضل خلال اللوني السائل.

    لاشتقاق الكيميائية، تم تقييم مجموعة متنوعة من المركبات الحمضية اثنين من الأحماض العضوية ومزاياها مناقشة شاملة 18. ومع ذلك، أثبتت أنهيدريد البروبيونيك إلى أفضل حل وسط بين الكفاءة والمنتجات الجانبية الحد الأدنى وتحسين للا مائية الببتيد. يحتمل، أنهيدريد البروبيونيك يمكن شراؤها في شكل المسمى isotopically. وهذا يسمح للتحليل الإرسال المتعدد نظرا لإمكانية خلط عينات متعددة وتميز على الصعيد MS على أساس كتل مختلفة المنقولة من التسمية الثقيلة. ومع ذلك، هذا التحليل يؤدي إلى زيادة تعقيد اللوني LC-MS ويقلل من كمية العينة التي يمكن حقنها في كل حالة واحدة.

    وفي هذا الصدد، ينبغي إبراز بعض الجوانب الهامة من البروتوكول. وينبغي أن تستخدم ما يلي كما الفصلecklist إلى العثور على أخطاء في تنفيذ الإجراء في حال الحصول على نتائج سلبية. أولا، بعد هطول الأمطار أنويتها يجب غسلها بيليه بعناية مع بنك الاستثمار القومي دون (القسم 2.10) حتى الاستئصال الكامل للمنظفات (ملحوظ بسبب عدم وجود فقاعات خلال خلط) NP-40 البديل. ان الفشل في القيام بذلك تنازلات استخراج هيستون مع الأحماض. ثانيا، بعد هطول الأمطار هيستون مع TCA (القسم 3.9) يغسل بيليه مع الأسيتون أمر بالغ الأهمية. ان وجود حمض المركزة تضر الخطوة التالية إذا يتم تنفيذ propionylation والهضم (القسم 6.1) مباشرة. وسيكون من لا مشكلة في تجزئة القضية هيستون يتم تنفيذ (القسم 5). ثالثا، من الضروري أن رد الفعل propionylation تتم بسرعة (قسم 6،3-6،7). للقيام بذلك، تجنب استخدام مزيج propionylation نفسه (أنهيدريد البروبيونيك + الأسيتونتريل) لأكثر من 3-4 عينات متتالية. بالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة هو الجانب الأكثر أهمية في عملية الهضم التربسين (المادة 7). ان لمحول 8.0 (7،5-8،5) ستكون عملية الهضم غير فعالة. هذا يمكن أن يحدث، كما العينة سوف تكون غنية في حمض البروبيونيك في هذه الخطوة. NH 4 OH يمكن إضافة حتى لزم الأمر. أيضا، للباحثين على دراية سير العمل البروتينات وسوف تشعر الطبيعي أن يحمض عينة لإنهاء التربسين الهضم. لا ينبغي أن يتم هذا، لأنها سوف يعرض للخطر التفاعل التالي، أي propionylation الببتيد N-ترميني (القسم 8.1). وأخيرا، في نفس القضية، من المهم أن نتذكر لتحليل البيانات أن الببتيدات معدلة ليست معدلة في الواقع. جميع سيتم المحتلة بقايا يسين مجاني وN-ترميني من propionylation (56،026 دا). وهكذا، وأداء استخراج اللوني ايون من كتلة المقابلة فريد لتسلسل الببتيد من شأنه أن يؤدي إلى أية نتائج.

    القيود المفروضة على طريقة هي في معظمها ذات الصلة إلى عدم القدرة على اكتشاف PTMs اندماجي، ويرجع ذلك إلى تسلسل الببتيد قصيرة، والتحيز في تحقيق أبون صحيحرقصة التعديل، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الببتيدات في أشكال معدلة مختلفة قد تأيين مع كفاءات مختلفة. العدد الأول يمكن حلها عن طريق الجمع بين هذه التقنية مع لأسفل المتوسط ​​أو نهج من أعلى إلى أسفل (التي استعرضت في 16). هذا النوع من التحليل، حتى لو كان من الناحية الفنية أكثر تحديا، مثالية لدراسة الترددات التعايش بين التعديلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح بالتمييز أفضل من المتغيرات هيستون، الذي لا يمكن أن يتحقق دائما مع القاعدة إلى القمة منذ بعض الببتيدات لديها نفس تسلسل في المتغيرات هيستون مختلفة. المسألة الثانية، تتعلق كفاءة التأين، يمكن حلها باستخدام مكتبة من الببتيدات الاصطناعية 31. هذا النهج يضمن تقدير أكثر دقة من الوفرة النسبية للPTMs هيستون. ومع ذلك، في معظم التجارب، والنتيجة المرجوة هي التغيرات النسبية من تعديلات معينة بين الظروف تحليلها. في هذه الحالة، هذا التصحيح ليس من الضروري، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن جميع العينات لها نفس بياالصورة.

    في الختام، يسمح هذا البروتوكول لتحليل PTMs هيستون الذي يمكن أن تكتمل في 3 أيام باستخدام NLC بالإضافة إلى بالترادف MS. مقارنات مع غيرها من التقنيات من مرض التصلب العصبي المتعدد، أي باستخدام استراتيجيات الأجسام المضادة تستند كما جاء في المقدمة، ليست مناسبة، لأنها لا يمكن أن تحقق حتى ما يقرب من هذا المستوى من الإنتاجية. وبالإضافة إلى ذلك، وتقنيات الأجسام المضادة على أساس لا تسمح لاكتشاف تعديلات جديدة، لكنها تستند حصرا على تأكيد وقياس العلامات المتوقعة. وبالتالي فإننا نفترض أن البروتينات أسفل إلى أعلى على الببتيدات هيستون سوف تكسب شعبية في المختبرات البروتينات نظرا لمزايا بديهية في معرفة تنظيم علامات هيستون، والتي هي أبطال في التعبير ضبط الجينات، وبالتالي تؤثر على تنظيم بروتيوم. وعلاوة على ذلك، وصفت البروتوكول يشمل التحسينات الأخيرة في إعداد العينات والبرمجيات لتحليل البيانات، مما يجعل تحليل هيستون أكثر تافهة أيضا للمختبرالمحافظين الذي لم يشهد توصيف هذا النوع من الببتيدات hypermodified.

    Disclosures

    الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من خلال تمويل من منح المعاهد الوطنية للصحة (DP2OD007447، R01GM110174 وR01AI118891).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Trypsin 0.25% EDTA Invitrogen 25200056 For harvesting cells
    PBS Invitrogen 14200075
    Tris Roche 77-86-1
    Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
    Sodium Chloride Sigma S9888
    Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272
    Calcium Chloride, anhydrous Sigma C1016
    Sucrose Fisher Scientific BP220-1
    DTT Invitrogen 15508-013
    AEBSF EMD Millipore Corp 101500
    Microcystin Sigma M4194
    Sodium Butyrate Sigma B5887
    Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)  Fisher Scientific 78445
    NP- 40 Alternative CALBIOCHEM 492016
    Sulfuric Acid, ACS grade Fisher Chemical 7664-93-9
    Trichloroacetic acid Sigma T6399
    Acetone Sigma 179124
    HCl Fisher Chemical A144-500
    Bradford reagent Biorad 500-0006
    30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml Biorad 1610156
    Coomassie Fisher Scientific 20278
    C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm Grace 218TP52
    C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm Grace 218TP54
    HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
    HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
    TFA Fisher Scientific A11650
    Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
    ammonium hydroxide Sigma 338818
    propionic anhydride Sigma 240311
    Sequencing grade modified trypsin Promega PRV5113 For digesting histones for MS
    Acetic Acid Sigma 49199
    C18 extraction disk Empore 2215
    Formic Acid Sigma F0507

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Waddington, C. H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters. Nature. 150, 563-565 (1942).
    2. Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 31, (1), 27-36 (2010).
    3. Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, (5532), 1089-1093 (2001).
    4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
    5. Tessarz, P., Kouzarides, T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Bio. 15, (11), 703-708 (2014).
    6. Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol. 15, (2), 172-183 (2003).
    7. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142, (5), 682-685 (2010).
    8. Simboeck, E., et al. A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors. J Biol Chem. 285, (52), 41062-41073 (2010).
    9. Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature. 438, (7071), 1176-1180 (2005).
    10. Xhemalce, B., Kouzarides, T. A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly. Genes Dev. 24, (7), 647-652 (2010).
    11. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, (6), 967-980 (2010).
    12. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19, (5), 207-217 (2009).
    13. Fernandez-Capetillo, O., et al. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev Cell. 4, (4), 497-508 (2003).
    14. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. Embo J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
    15. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
    16. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, (12), 3419-3433 (2012).
    17. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. J Proteome Res. 8, (11), 5367-5374 (2009).
    18. Sidoli, S., et al. Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis. Proteomics. 15, (9), 1459-1469 (2015).
    19. Lin, S., Garcia, B. A. Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry. Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).
    20. Sidoli, S., et al. SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. Mol Cell Proteomics. (2015).
    21. Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. J Proteome Res. (2015).
    22. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra. Mol Cell Proteomics. 14, (6), 1696-1707 (2015).
    23. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, (7), 966-968 (2010).
    24. Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications. J Proteome Res. 13, (10), 4470-4478 (2014).
    25. Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11493-11498 (2013).
    26. Vonholt, C., et al. Isolation and Characterization of Histones. Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).
    27. Zhang, K. L., et al. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 306, (2), 259-269 (2002).
    28. Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells. Plos One. 6, (1), e15960 (2011).
    29. Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics. 4, (5), 1382-1396 (2004).
    30. Zhao, X. L., et al. Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury. J Proteome Res. 13, (4), 2175-2186 (2014).
    31. Lin, S., et al. Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13, (9), 2450-2466 (2014).
    سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).More

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter