Summary
Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.
Introduction
La comprensione delle basi genetiche dell'evoluzione tratto è un obiettivo di ricerca critica di biologi evoluzionisti. Notevoli progressi sono stati fatti per identificare loci sottostanti l'evoluzione dei tratti e individuare geni candidati all'interno di questi loci (ad esempio 1-3). Tuttavia, funzionalmente testare il ruolo di questi geni è rimasta sfidando come molti organismi utilizzati per studiare l'evoluzione dei tratti non sono attualmente geneticamente trattabili. L'avvento delle tecnologie di editing genoma è notevolmente aumentato manipolabilità genetica di una vasta gamma di organismi. Trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens) e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPRs) sono stati utilizzati per generare mutazioni nei geni mirati in una serie di organismi (ad esempio 4-11). Questi strumenti, applicati ad un sistema evolutivamente rilevanti, hanno il potenziale per rivoluzionare il modo in cui i biologi evoluzionisti studiare le basi genetiche dell'evoluzione.
Astianatte mexicanus è una specie di pesci che esiste in due forme:. Un fiume-dimora forma di superficie (pesce di superficie) e molteplici forme cavernicoli (cavefish) A. mexicanus cavefish si è evoluta da antenati dei pesci di superficie (recensito in 12). Le popolazioni di cavefish hanno sviluppato un certo numero di caratteristiche tra cui la perdita degli occhi, diminuzione o perdita della pigmentazione, aumento del numero di papille gustative e neuromasti cranici, e cambiamenti nel comportamento come la perdita di comportamento scolastico, maggiore aggressività, cambiamenti di alimentazione postura e iperfagia 13 -19. Cavefish e pesce di superficie sono interfertili, e gli esperimenti di mappatura genetica sono stati effettuati per identificare loci e geni candidati per i tratti rupestri 1,20-26. Alcuni geni candidati sono stati testati per un ruolo funzionale nel contribuire a tratti rupestri in coltura cellulare 1,19, in organismi modello di altre specie di 21 o da 27 o sovraespressione atterramento transitoria ucantare morpholinos 28 in A. mexicanus. Tuttavia, ciascuno di questi metodi ha limitazioni. La capacità di generare alleli mutanti di questi geni in A. mexicanus è fondamentale per comprendere la loro funzione nell'evoluzione del cavefish. Così, A. mexicanus è un organismo candidato ideale per l'applicazione di tecnologie di modifica del genoma.
Qui descriviamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus utilizzando Talens. Questo metodo può essere utilizzato per valutare mosaico iniettato pesce fondatore per fenotipi e per isolare le linee di pesce con mutazioni nei geni stabili di interesse 29.
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Protocol
Tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali alla Iowa State University e l'Università del Maryland.
1. TALEN design
- Ingresso desiderato sequenza bersaglio di un sito web di progettazione TALEN. (Per esempio: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Ingresso scelto lunghezze degli array distanziale / ripetizione.
- Copiare la sequenza genomica nella casella "Sequenza".
- All'interno della scheda "Fornire personalizzato Spacer / RVD Lunghezze" selezionare la lunghezza dello spaziatore e la lunghezza dell'array.
Nota: lunghezze Spacer di 15 paia di basi e ripetere le lunghezze degli array di 15-17 lavoro bene e fare il montaggio meno complessa.
- Selezionare una coppia TALEN. coppie Talen progettati intorno a un sito di enzima di restrizione unico permettono di genotipizzazione da enzima di restrizione digerireun prodotto di PCR.
- Primer design per amplificare la regione genomica che circonda il sito di destinazione TALEN utilizzando un sito come Primer3 30-32. Quando la genotipizzazione con un enzima di restrizione, primer design per amplificare una regione che contiene il sito enzima di restrizione sola volta. Si raccomanda che questa regione è amplificato e sequenziato prima TALEN costruzione per identificare eventuali polimorfismi presenti in A. mexicanus popolazione laboratorio da utilizzare per microiniezione.
2. Montaggio TALEN (Modificata dal protocollo TALEN Kit) 33,34
Per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi, consultare il protocollo 34.
- Preparare e la sequenza plasmidi necessari dal kit TALEN secondo le istruzioni del produttore.
- Impostare il # 1 Reazioni per reazioni A e B. Includere ripetere variabile diresidues (RVDS) 1-10 e la destinazione di pFUS_A vettore in reazione A. Includere RVDS 11- (N-1) e THe destinazione vettoriale pFUS_B (N-1) Reaction B dove N è il numero totale di RVDS in TALEN.
- Aggiungere a ciascuna reazione: 1 pl di ciascun plasmide contenente ciascuna RVD (100 ng / ml), il vettore di destinazione (100 ng / ml), 1 ml Bsa I restriction enzyme, 1 ml Bovine Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ml ligasi, 2 microlitri di tampone 10x ligasi e x microlitri di acqua, per un volume totale di 20 microlitri. Ad esempio, vedi Tabella 1.
Nota: reazioni metà può anche essere usato. - Posizionare reazioni in un termociclatore ed eseguire il ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Aggiungere a ciascuna reazione: 1 pl di ciascun plasmide contenente ciascuna RVD (100 ng / ml), il vettore di destinazione (100 ng / ml), 1 ml Bsa I restriction enzyme, 1 ml Bovine Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ml ligasi, 2 microlitri di tampone 10x ligasi e x microlitri di acqua, per un volume totale di 20 microlitri. Ad esempio, vedi Tabella 1.
- Incubare le reazioni con nucleasi. Per ogni reazione aggiungere 1 ml di 25 mM ATP e 1 ml nucleasi. Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 ora.
- Trasforma reazioni.
- Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti.
Nota: Homemade c competenteells possono essere utilizzati. Tuttavia, le cellule con bassa competenza può risultare in mancanza di colonie.- Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per cinque minuti. Incubare le cellule per 30 secondi a 42 ° C.
- Posizionare i tubi in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 125 ml di brodo di Super ottimale con la repressione Cataboliti (SOC). Agitare le provette a 37 ° C per 1 ora.
- Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con spectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N a 37 ° C.
- Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti.
- Scegliere 2-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabella 2).
- Fare un master mix dei reagenti. Ad esempio, vedere la tabella 3.
- Scegli una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con spectinomicina(50 mg / ml). Posizionare 15 microlitri della master mix nella provetta con la colonia.
- Eseguire il seguente programma PCR (Tabella 4)
- Controllare la PCR (eseguire l'intero volume) su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una banda alla dimensione prevista, nonché uno striscio e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33.
- Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione.
- Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore.
- Sequenza per verificare la sequenza TALEN con pCR8_F1 e pCR8_R1. Seguire i metodi descritti in precedenza 35.
- Usando i cloni giusti verificati mediante sequenziamento, impostare la reazione # 2 (kit TALEN), che porrà le RVDS dei vettori A e B e la RVD finale nel vettore di destinazione.
- Preparare miscela per la reazione 2 (Tabella 5).
Nota: Hareazioni lf possono essere utilizzati. - Mettere le reazioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Preparare miscela per la reazione 2 (Tabella 5).
- Trasforma reazioni.
- Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti.
- Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per 5 min. Heat Shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C.
- Mettere i tubi in ghiaccio. Aggiungere 125 ml di SOC. Porre i tubi in un incubatore agitazione a 37 ° C per 1 ora.
- Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con ampicillina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Grow O / N a 37 ° C.
- Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti.
- Scegliere 1-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer TAL_F1 e TAL_R2 (Tabella 2).
- Fare una soluzione della polimerasi Mastermix, acqua e primer comedescritti nella Tabella 3. Scegliere una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con ampicillina (100 ug / ml). Posizionare 15 microlitri della soluzione nella provetta con la colonia.
- Eseguire il programma di PCR (Tabella 6).
- Controllare la PCR su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una sbavature e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33.
- Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione.
- Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore.
- Sequenza per verificare la sequenza TALEN con TAL_F1 e TAL_R2 seguendo i metodi descritti in precedenza 35.
3. mRNA Trascrizione di Talens
- Digest 4 mg di modello di sequenza-verificata con 2 ml Sac I per 2 ore a 37 ° C. Eseguire 2 microlitri del plasmide Sac I digerito su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I plasmidi che sono correttamente digeriti mostreranno una singola banda.
- Purificare il residuo plasmide Sac I digeriti seguendo il protocollo del kit di purificazione PCR. Lavare due volte con la soluzione di lavaggio prima di eluizione. Eluire in 30 ml di acqua priva di nucleasi.
- Seguire il protocollo standard per la produzione di T3 mRNA.
- Impostare reazioni metà con 0,5 mg di modello linearizzato (preparato in precedenza). Incubare a 37 ° C per 2 ore.
- Aggiungere 0,5 ml di DNasi (incluso nel kit) e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Purificare l'mRNA, seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 30 acqua priva di nucleasi microlitri.
- Eseguire un gel 1,5% mediante elettroforesi per controllare l'mRNA.
- Pulire l'apparato gel con un prodotto per eliminare la contaminazione RNasi e preparare un gel 1,2%.
- Mix 1 ml di mRNA + 4 &# 181; l priva di nucleasi acqua + 5 ml colorante glyoxyl carico. Incubare i campioni a 50 ° C per 30 min. Centrifugare le provette brevemente e posto sul ghiaccio prima di eseguire il gel.
- Controllare la concentrazione utilizzando un metodo di quantificazione concentrazioni di acidi nucleici e conservare l'RNA in aliquote a -80 ° C. Scegli una dimensione un'aliquota tale che l'RNA non sia congelato / scongelato più di una volta.
Nota: Le concentrazioni di 500-1000 ng / nl sono in genere ottenuti. RNA con una concentrazione inferiore può essere utilizzato fintanto che l'integrità dell'RNA è mantenuto (come valutato da una banda piuttosto che una macchia sul gel).
4. Iniettare Astianatte mexicanus embrioni con TALEN mRNA
- Preparare strumenti per l'iniezione.
- Versare in piastre di iniezione versando 1,2% agarosio in acqua i pesci (acqua condizionata con bicarbonato di sodio e sale marino a pH 7,4 e conducibilità 700 mS) in una capsula di Petri. Mettere uno stampo (pezzo di plastica con le proiezioni per fare pozzi per i pesciuova) all'interno del piatto. Rimuovere lo stampo quando l'agarosio si è indurito e conservare a 4 ° C. Per ulteriori informazioni sullo stampo vedere 36.
- Tirare aghi per l'iniezione con un estrattore ago secondo le istruzioni del produttore.
Nota: adeguata lunghezza dell'ago è importante per preparazioni iniettabili. Aghi che sono troppo lunghi saranno troppo flessibile per iniezioni. Il protocollo per gli aghi che tirano varierà con le attrezzature utilizzate per tirare gli aghi. Un esempio di un ago appropriato è mostrato in Figura 1. Per la nostra attrezzatura, abbiamo tirare aghi che sono 5-6 cm di lunghezza, ed hanno un diametro esterno sulla punta di circa 0,011 millimetri quando rotto. Tuttavia, gli aghi devono essere calibrati (fase 4.3.4) per determinare la larghezza di apertura. Un esempio di programma per tirare gli aghi possono essere trovate nella Tabella 7. - Preparare pipette di vetro per il trasferimento di embrioni rompendo la pipetta in modo che l'apertura è grande abbastanza per un uovo di passare attraverso. Fiamma fine rotto finonon è più tagliente.
Nota: E 'importante utilizzare pipette di vetro e ciotole di vetro quando si lavora con A. uova mexicanus ed embrioni in quanto sono appiccicosi e aderirà alla plastica.
- Raccogliere 1-cell fase Uova.
- Razza A. mexicanus seguendo protocolli standard 37.
Nota: Per esempio, se i pesci sono mantenuti su un 14 luce: buio ciclo 10 ed usando tempo Zeitgerber (ZT) con ZT0 come luci accese e ZT14 come luci spente, il nostro uova di pesce di superficie tra ZT15 e ZT19. momento della riproduzione esatta deve essere determinata per ogni singolo laboratorio. - Indurre la deposizione delle uova da sovralimentazione pesce per 3-4 giorni prima dell'accoppiamento e l'immissione di pesci in acqua dolce. Sollevare il ° C di temperatura 2. Nota: La nostra temperatura dell'acqua iniziale è di circa 74 ° C.
- Raccogliere uova di pesce di superficie al buio, controllando ogni 15 minuti per ottenere le uova nella fase 1 delle cellule. Centinaia di uova possono essere ottenuti da una singola coppia di pesci di superficie.
- Collezionareuova in ciotole di vetro per evitare che si attacchi alle superfici di plastica e sorta per isolare gli embrioni allo stadio di 1 cella di prima dell'iniezione osservando le uova sotto il microscopio e raccogliere le uova che sono una singola cella. Conservare le uova in acqua dolce sistema (serbatoio di acqua in cui sono alloggiati i pesci adulti, che è stato trattato per pH e conducibilità).
- Razza A. mexicanus seguendo protocolli standard 37.
- Iniettare TALEN mRNA.
- Iniettare diverse quantità di mRNA totale (quantità uguali di ciascun TALEN in coppia) per determinare la concentrazione ottimale per l'iniezione la tossicità e l'efficacia variano dagli accoppiamenti TALEN. Inizia iniettando concentrazioni di mRNA totale che sono 400-800 pg. Diluire e combinare mRNA a concentrazioni desiderate per l'iniezione di 1,5 nl.
- Carico diluito mRNA nella parte posteriore dell'ago e collegare l'ago a un micro-iniettore.
- Rompere l'ago con pinze.
- Calibrare l'ago. Ad esempio, espellere 10 volte e raccogliere il calo conseguente micro capillare. Per 10 x 100 usa e getta 1.081; l, 32 millimetri micro capillare, il calo dovrebbe riempire il micro capillare a 0,5 mm per 1,5 NL / 1 iniezione. Regolare il tempo di iniezione e la pressione necessaria.
- Inserire l'ago nella singola cella e iniettare l'mRNA. Iniettare il mRNA direttamente nella cella, non nel tuorlo.
- Raccogliere embrioni iniettati in ciotole di vetro. Mantenere gli embrioni a 23-25 ° C. Rimuovere gli embrioni morti (gli embrioni che diventano nuvoloso e di forma irregolare) regolarmente per i primi giorni dopo l'iniezione. Un numero record di embrioni morti e deformi da controllo (uninjected) e le piastre iniettato.
Nota: La maggiore concentrazione di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità / la morte degli embrioni. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere bilanciato per determinare la migliore concentrazione di mRNA per iniettare.
5. fenotipo Fondatore Pesce e valutare l'efficienza TALEN
- Sacrificare embrioni in base al protocollo animali istituzionale.
Nota: eutanasiaembrioni rapidamente raffreddato su ghiaccio. - Raccogliere gli embrioni in 0,8 microlitri tubi striscia PCR utilizzando una pipetta di trasferimento.
Nota: La genotipizzazione può essere eseguita su singoli embrioni o gli aggregati di embrioni. - Estrarre il DNA.
- Inserire embrioni in 100 ml di idrossido di 50 mM di sodio (NaOH) e incubare a 95 ° C per 30 minuti, poi raffreddare a 4 ° C.
- Aggiungere 1/10 del volume (10 ml) di 1 M Tris-HCl pH 8.
- Eseguire una PCR sulla regione utilizzando i primer disegnati in fase 1.3 (vedi tabelle 8 e 9 per i protocolli di esempio). Per i singoli embrioni 1 ml di DNA è sufficiente per la reazione PCR.
- Digerire il prodotto di PCR risultante con l'enzima di restrizione appropriato ed eseguire un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi.
- Ad esempio, per la genotipizzazione del locus oculocutaneous albinism 2 (OCA2) in embrioni iniettati digerire il prodotto di PCR utilizzando l'enzima di restrizione Bsr I aggiungendo 0.5 Ml di Bsr io direttamente a 12,5 ml di reazione PCR completato, incubazione a 65 ° C per 2 ore. Eseguire il digerito e il prodotto digerito su un gel. Bande resistenti enzima di restrizione (cioè, gruppi che non digeriscono) indicano che le mutazioni TALEN-indotte sono presenti (Figura 2).
- (Opzionale) Calcolare tasso di mutazione percentuale determinando la percentuale del prodotto non tagliato analizzando le immagini di gel in Fiji 38 utilizzando lo strumento di analisi di gel per calcolare il valore di intensità di ogni banda come descritto in precedenza 29.
- Determinare la sequenza di alleli mutanti da TA clonazione della banda mutante resistente gel purificato l'enzima di restrizione e sequenziamento cloni.
- Gel purificare l'enzima di restrizione banda mutante resistente seguendo le istruzioni del produttore. TA clonare la band seguendo le istruzioni del produttore. Scegli colonie e crescere in 1,5 ml LB O / N a 37 ° C in agitazioneincubatrice.
- culture Miniprep seguito le istruzioni del produttore. Invia il DNA per il sequenziamento.
- Utilizzando un programma come scimmia, allineare le sequenze mutanti alla sequenza di tipo selvatico.
- Copia e incolla entrambe le sequenze in file APE. Scegliere lo strumento "allineare due sequenze" dal menu "Strumenti".
- Specificare le due sequenze di DNA utilizzando i menu a discesa.
Nota: Il complemento inverso della sequenza clonata può essere necessario utilizzare a seconda della direzione della PCR è andato nel vettore di clonazione. Se le sequenze non si allineano, ripetere i passaggi selezionando la casella "Rev-Com" nella casella "Allinea DNA".
- Valutare pesce fondatore di fenotipi in fase appropriata e con metodi adeguati per il fenotipo atteso 29 (Ad esempio, la Figura 3). Metodi di fenotipizzazione saranno basate sul fenotipo atteso per il gene bersaglio dal ricercatore utilizzando il ProtoColo.
6. schermo per la trasmissione germinale
Nota: A. mexicanus raggiungere la maturità sessuale a 4-8 mesi.
- Attraversate pesce fondatore sessualmente maturi per i pesci wild type.
- Embrioni schermo o pesci adulti con metodi a passi 5.1-5.7 (figura 4). Per i pesci adulti, un pezzo della coda può essere agganciato dopo anestesia.
- Anestetizzare pesce sommergendo pesci in una soluzione di tricaine (acido 3-aminobenzoico etil estere) per ridurre lo stress durante amputazione delle pinne. In seguito fin ritaglio, permettono di recuperare il pesce in acqua dolce. Pesce recuperare rapidamente; osservare fino a che non hanno recuperato (sono il nuoto normalmente).
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Representative Results
Talen coppia iniezioni provocano vincolante delle RVDS a specifici nucleotidi del DNA e quindi dimerizzazione di domini FokI, con conseguente rotture a doppia elica 39, che possono essere riparati attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ). NHEJ spesso introduce errori che si traducono in inserzioni o delezioni (indels). Indels possono essere identificati amplificando la regione circostante il sito di destinazione TALEN e digerire l'amplicone risultante con un enzima di restrizione che taglia all'interno della regione distanziale TALEN. Gli alleli senza un indel saranno digerire mentre alleli contenente indels che cambiano la sequenza target enzima di restrizione non digerire, producendo una banda resistente enzima di restrizione (Figura 2).
Iniezioni Talen possono probabilmente porterà a mutazioni del gene bialleliche in A. mexicanus 29. Così, alcuni fenotipi possono essere valutati nel pesce fondatore. Per esempio, abbiamo valutato la pigmentazione nel pesce superficie iniettato con Talens OCA2 mira, il gene ipotizzato di essere responsabile di albinismo in molteplici popolazioni albini di cavefish 1,28. Abbiamo trovato macchie albini in OCA2 pesce TALEN-iniettato non presente nel pesce uninjected 29 (Figura 3).
Per molti esperimenti, è desiderabile avere linee mutanti di pesce per valutare fenotipi. Fondatore pesce con alleli mutanti trasmessi può essere identificato dal genotipizzazione discendenza da incroci di pesce fondatore di pesce wild type (Figura 4).
Figura 1. L'ago per l'iniezione di mRNA. Fotografia di una micropipetta prima di essere rotto usato per l'iniezione TALEN mRNA in singoli embrioni unicellulari._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. efficienza TALEN per OCA2. 306 bp prodotti di PCR di esone 9 di OCA2 in mexicanus Astyanax sono stati esaminati per la perdita del sito di enzima di restrizione quando diverse quantità di TALEN mRNA sono stati iniettati 29. L'amplicone da un embrione di controllo è stato digerito mentre una parte dell'amplicone era resistente alla restrizione digest nelle piscine di 10 TALEN iniettato embrioni. Enzima di restrizione digerire bande resistenti da embrioni iniettati con mRNA TALEN mirata OCA2 hanno dimostrato di contenere indels 29. Si noti che concentrazioni crescenti di mRNA iniettato si traduce in una maggiore efficienza TALEN (più DNA non digerito). Corsie con "-" sono non digerito, corsie con "+" sono DigesTed con enzima di restrizione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. pesce Fenotipizzazione fondatore per i cambiamenti nella pigmentazione. (A) Superficie di controllo uninjected A. mexicanus. (B) Patch manca melanofore in un pesce di superficie fondatore iniettato con 400 pg TALEN mRNA di targeting OCA2 (freccia). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. trasmissione germinale di mutatio TALEN indottans. 306 bp prodotti di PCR di esone 9 di OCA2 in A. mexicanus sono stati esaminati per la perdita del sito enzima di restrizione in pozze di 10 F 1 pesce da un pesce fondatore iniettato. L'amplicone da un embrione di controllo è stato digerito mentre una parte dell'amplicone era resistente alla restrizione digest nelle piscine di 10 F 1 embrioni. Enzima di restrizione digerire bande resistenti da F OCA2 sono stati visualizzati 1 s per contenere indels 29. Corsie con "-" sono non digerito, corsie con "+" sono digerito con enzima di restrizione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| reazione A | riattisu B | |||
| quantità | reagente | quantità | reagente | |
| 4 pl | acqua | 10 microlitri | acqua | |
| 1 ml | pFUS_A | 1 ml | pFUS_B4 | |
| 1 ml | BsaI | 1 ml | BsaI | |
| 1 ml | BSA | 1 ml | BSA | |
| 1 ml | ligasi | 1 ml | ligasi | |
| 2 ml | Buffer 10x Ligase | 1 ml | Buffer 10x Ligase | |
| 1 ml | pNH1 | 1 ml | pNG1 | |
| 1 ml | pNH2 | 1 ml | PhD2 | |
| 1 ml | pNG3 | 1 ml | pNH3 | |
| 1 ml | pHD4 | 1 ml | pNI4 | |
| 1 ml | pHD5 | |||
| 1 ml | PHD6 | |||
| 1 ml | pNG7 | |||
| 1 ml | pHD8 | |||
| 1 ml | pNG9 | |||
| 1 ml | pHD10 | |||
Tabella 1. Esempio assemblaggio reazione A e B per unTALEN contenente RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| nome Primer | Sequenza (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabella 2. primer PCR per colonia PCR, da 34.
| reagente | quantità |
| Taq Mastermix, 2x | 50 microlitri |
| pCR8_F1 fondo,10 uM | 4 pl |
| pCR8_R1 fondo, 10 uM | 4 pl |
| acqua priva di nucleasi | 42 ml |
| * Regolare master mix se si utilizza un diverso Taq | |
Tabella 3. mix master per 100 ml (15 ml / reazione) per colonia PCR 1.
| passo | Temperatura (° C) | tempo (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Passare al punto 2 per 30 cicli | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabella 4. programma PCR per colonia PCR 1.
| quantità | reagente | concentrazione |
| 12 ml | acqua | |
| 1 ml | vettore A | 100 ng / ml |
| 1 ml | vettore B | 100 ng / ml |
| 1 ml | destinazione vettore pT3Ts-GT | 50 ng / ml |
| 1 ml | RVD finale (PLR-RVD) | 100 ng / ml |
| 1 ml | Esp3I | |
| 1 ml | ligasi | |
| 2 ml | Buffer 10x Ligase | |
Tabella 5. Protocollo per le reazioni seconda assemblea.
| passo | Temperatura (° C) | tempo (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Passare al punto 2 per 30 cicli | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabella 6. programma PCRper colonia PCR 2.
| calore | 290 |
| Tirare | 150 |
| velocità | 100 |
| tempo | 150 |
| Questi parametri sono per un Flaming / Brown Micropipetta Puller Modello P-97 utilizzando un filamento di depressione | |
Tabella 7. ago Esempio programma di trazione.
| reagente | quantità |
| Taq Mastermix, 2x | 12,5 ml |
| gene specifico primer forward, 10 micron | 1 μl |
| gene specifico primer reverse, 10 micron | 1 ml |
| acqua priva di nucleasi | 9,5 ml |
| DNA | 1 ml |
| * Regolare master mix se si utilizza un diverso Taq | |
Tabella 8. protocollo di esempio per gene specifico PCR.
| passo | Temperatura (° C) | tempo (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Andare a Step 2 per 35 cicli | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Regolare la temperatura di ricottura e il tempo di estensione per primer specifici e PCR dimensioni del prodotto | ||
Tabella programma PCR 9. Esempio per gene specifico PCR.
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Discussion
Grandi passi avanti sono stati compiuti negli ultimi anni verso la comprensione delle basi genetiche dell'evoluzione dei tratti. Mentre sono stati identificati geni candidati sottostanti l'evoluzione di un certo numero di tratti, è rimasta impegnativo per testare questi geni in vivo a causa della mancanza di trattabilità genetica di specie più interessanti evolutivamente. Qui riportiamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus, una specie utilizzate per studiare l'evoluzione degli animali grotta. Mappatura genetica studia 1,21,23 e gene candidato si avvicina a 19,40 hanno identificato una serie di geni candidati per l'evoluzione dei tratti sotto forma di grotta A. mexicanus. La recente pubblicazione del genoma cavefish 41 fornisce un potente strumento aggiuntivo per l'identificazione di geni candidati per l'evoluzione dei tratti grotta. Testare la funzione di molti di questi geni candidati richiede tecniche per ridurre l'espressione genica. L'unica opzione corrente per motivi di studioing ridotta espressione genica in A. mexicanus è con l'uso di Morpholinos. Tuttavia, gene morfolino atterramento è transitorio, limitato a un post qualche giorno la fecondazione, e non è utile per studiare i tratti in animali adulti, come le differenze comportamentali tra grotta adulti e pesci di superficie, come la scolarizzazione 17, iperfagia 19 e l'attrazione delle vibrazioni comportamento 42. Generazione di perdita di alleli funzione dei geni, come quelli che possono essere realizzati con Talens, sarà fondamentale per testare il ruolo di geni candidati per questi tratti.
I metodi sono stati sviluppati per un facile montaggio di Talen coppie 33 e il protocollo dettagliato per questo metodo è disponibile 34. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso zebrafish da Bedell et al. 7, utilizzando un diverso vettore destinazione finale, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Questo vettore consente la trascrizione di mRNA TALEN per l'iniezione in singoli embrioni di zebrafish unicellulari.Abbiamo usato questo metodo di assemblaggio modificato, spiegato in dettaglio qui, da montare e trascrivere Talens per iniezione in A. mexicanus. Abbiamo scoperto che quando iniettato in superficie unicellulare A. embrioni mexicanus, come descritto all'interno di questo protocollo, abbiamo potuto mutare A. geni mexicanus 29. Per la ricerca futura sui geni candidati non descritti in questo protocollo, le sequenze possono essere trovati nel genoma cavefish 41 e utilizzati per identificare i siti di destinazione Talen.
Critical per le iniezioni di successo è di alta qualità TALEN mRNA. Pertanto, controllando la qualità dell'RNA eseguendo una piccola quantità di RNA su gel prima iniezione è importante (Passo 3.6). Altre precauzioni per mantenere l'integrità dell'RNA, come ad esempio il congelamento aliquote per evitare disgelo congelamento (passo 3,7), e il mantenimento di condizioni di sterilità utilizzando tubi di acqua pulita e RNase-free e suggerimenti durante le iniezioni (fase 4), dovrebbero essere prese. Un passaggio fondamentale aggiuntivo per sollevare il pesce iniettato èpulizia di embrioni morti dopo l'iniezione, come embrioni morti possono rapidamente compromettere la qualità dell'acqua. Così, togliamo embrioni morti la mattina seguente iniezioni, e periodicamente per i prossimi giorni dopo le iniezioni per mantenere sani embrioni vivi (passo 4.3.6).
TALEN mutagenesi in Astianatte mexicanus può essere altamente efficiente; Tuttavia, l'efficienza varia a seconda della coppia TALEN iniettato 29. L'aumento delle concentrazioni di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità e la morte degli embrioni iniettati. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere provato e bilanciato per determinare la concentrazione ottimale di mRNA per iniettare. Per le coppie Talen altamente efficienti, fenotipi possono essere valutate nel pesce fondatore iniettato. Ad esempio, l'iniezione di Talens mira OCA2 comportato patch albini in pesci superficie 29 (Figura 3). Per gli altri tratti o geni, tuttavia, la valutazione dei fenotipi nei pesci fondatore può essere difficile a causaalla sottilmente del fenotipo o bassa efficienza della coppia TALEN iniettato. Così, per molte applicazioni sarà desiderabile generare germline mutazioni in un gene di interesse per l'analisi del ruolo di un gene candidato in un animale non-mosaico. Ottenere la trasmissione germinale di mutazioni TALEN-indotte in A. mexicanus è possibile 29 (Figura 4). Così, questa tecnica può essere applicata per valutare altri geni candidati.
Esistono alcune limitazioni per l'esecuzione di manipolazioni genetiche in Astianatte mexicanus in questo momento. Superficie e razza cavefish al buio, a tarda notte. In un laboratorio in cui non è possibile invertire il ciclo scuro chiaro, i ricercatori devono venire in tarda notte per eseguire iniezioni, in quanto è fondamentale per iniettare immediatamente dopo la deposizione delle uova. Inoltre, è importante raccogliere embrioni dei pesci superficiali al buio, come luce interesserà riproduttiva.
Altre tecniche, in particolar il CRISPR sistema / Cas (rivisto nel 43), esiste per la modifica del genoma e sarà probabilmente applicabile ad A. mexicanus. In effetti, i protocolli per la guida di montaggio RNA esistono, che sono rapidi e facili 44 e il protocollo qui riportati possono essere modificati per CRISPR / Cas iniezione. Inoltre, nuove applicazioni per l'editing del genoma stanno rapidamente in fase di sviluppo, e molti di questi possono rivelarsi utili per la A. ricercatori mexicanus. Ad esempio, in zebrafish mutazioni precise sono state fatte in un gene di interesse per la co-iniezione Talens con un unico oligo filamento contenente una mutazione 7. Questa tecnica potrebbe essere utile per valutare il ruolo di alleli grotta nel generare fenotipi grotta, come ad esempio il ruolo di una mutazione missense in alcuni alleli rupestri di MC4R a differenze nel metabolismo osservate tra cavefish e la superficie del pesce 19. Talens sono stati utilizzati anche per generare alleli dei geni tramite ricombinazione omologa che esprimono i marcatori fluorescentin modelli simili al loci endogena 45. Questi metodi possono essere usati nella A. mexicanus per valutare sottoinsiemi di cellule o espressione di geni candidati. Il sistema / Cas CRISPR è stato utilizzato in zebrafish per ottenere tessuto-specifica del gene knockout 46. Queste tecniche, applicate ad A. mexicanus, potrebbe essere utile per valutare la base genetica di processi come la perdita degli occhi in cavefish. La lente svolge un ruolo fondamentale nel processo di perdita dell'occhio in cavefish 47 e il sistema / Cas CRISPR tessuto-specifica potrebbe essere utilizzato per valutare il ruolo dei geni candidati per la perdita di occhio particolare nella lente rispetto ad altri tessuti dell'occhio. Queste ed altre tecniche genoma modifica possono essere utilizzati in A. mexicanus in studi futuri per rispondere a domande critiche circa l'evoluzione dei tratti grotta.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Genetica, Sviluppo e Biologia Cellulare e Iowa State University e dal NIH concedere EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornito commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105 (2012).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
