Abstract
Les intestins - qui contiennent le plus grand nombre de cellules immunitaires de tout organe dans le corps - sont constamment exposés à des antigènes étrangers, à la fois microbienne et alimentaire. Compte tenu de la compréhension croissante que ces antigènes luminal contribuent à façonner la réponse immunitaire et que l'éducation des cellules immunitaires dans l'intestin est critique pour un certain nombre de maladies systémiques, on a accru l'intérêt pour la caractérisation du système immunitaire intestinal. Cependant, de nombreux protocoles publiés sont laborieux et prend du temps. Nous présentons ici un protocole simplifié pour l'isolement de lymphocytes à partir propria de l'intestin grêle lamina couche intraépithéliales et les plaques de Peyer qui est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux. Bien que le protocole met l'accent sur l'intestin grêle, il est également adapté à l'analyse du côlon. De plus, nous mettons en évidence certains aspects qui peuvent avoir besoin d'optimisation supplémentaires en fonction de la ques scientifique spécifiquetion. Cette approche se traduit par l'isolement d'un grand nombre de lymphocytes viables qui peuvent ensuite être utilisés pour l'analyse par cytométrie de flux ou d'autres moyens de caractérisation.
Introduction
La tâche principale de l'intestin grêle est souvent considérée comme la digestion et l' absorption des nutriments 1. Bien que cette fonction métabolique est évidemment essentiel, de l'intestin grêle a un rôle tout aussi important dans la protection de l'hôte à partir du barrage continu des antigènes environnementaux trouvés dans la lumière 2. Le tractus intestinal sépare le monde extérieur (par exemple., Antigènes luminal) à partir de l'environnement interne de l'hôte avec une couche épithéliale qui est seulement une couche cellulaire unique épaisse. En tant que tel, le système immunitaire de l'intestin grêle a la formidable tâche d'équilibrer son seuil pour la réactivité, ce qui permet des antigènes étrangers provenant de l'alimentation et commensaux microbes d'entrer dans la muqueuse avec un minimum, le cas échéant, la réponse immunitaire lors du montage d'une réponse robuste contre les agents pathogènes envahisseurs et d'autres antigènes "nuisibles". Réponses immunitaires excessives ou inappropriées à ces antigènes peuvent conduire à une maladie pathologique (par exemple., Inflammamaladie tory de l' intestin, diabète de type I, la sclérose en plaques) et doit être évitée 3-6.
Dans l' ensemble, le tractus gastro - intestinal est considéré comme représentant le plus grand organe immunitaire dans le corps, contenant plus de 70% de toutes les cellules sécrétrices d'anticorps 7. Le système immunitaire de l' intestin grêle est composé de 3 compartiments principaux - la lamina propria (LP), la couche intraépithéliale, et les plaques de Peyer (PP) - que chacun contient un groupe distinctif de lymphocytes 2. Les lymphocytes LP (LPLs) sont principalement des cellules avec des cellules ~ 20% B TCRap + T; lymphocytes intraépithéliaux (LIE) contiennent très peu de cellules B avec plus de cellules TCRγδ + T que les cellules TCRap + T; et PPs, qui sont les organes lymphoïdes secondaires embarqués dans le petit-intestinal mur, contiennent ~ 80% de cellules B. Bien que chacune de ces régions anatomiques a des fonctions légèrement distinctes et les bases ontologiques, ils fonctionner dans ahla mode armonized pour protéger l'hôte contre les insultes pathogènes.
En outre, il est de plus en plus l' appréciation que le microbiote est un facteur déterminant pour le développement du système immunitaire intestinal, avec l' augmentation de la reconnaissance de la relation entre les microbes spécifiques apparenté et l'ontogenèse des particuliers lignées cellulaires 8,9. En outre, étant donné que l' éducation du système immunitaire intestinal affecte les réponses immunitaires dans des sites anatomiquement éloignés (par exemple., L' arthrite, la sclérose en plaques, la pneumonie), il est devenu clair que le développement du système immunitaire intestinal est pertinent pour plus de processus de la maladie que précédemment reconnu 10 -12. En tant que tel, l'intérêt pour l'évaluation quantitative du système immunitaire intestinal a étendu au-delà des interactions hôte-pathogène pour inclure désormais les interactions hôte-commensal et la pathogenèse de nombreuses maladies systémiques ainsi.
Compte tenu de la variabilité des méthodes actuelles dans leisolement des lymphocytes intestinaux, un procédé qui est optimisé pour le rendement, de la viabilité et l'uniformité tout en équilibrant le temps nécessaire est de plus en plus critique. Les protocoles qui impliquent des gradients de Percoll sont le temps et de main - d'œuvre et potentiellement plus sujettes à l' erreur humaine, conduisant à un rendement variable et la viabilité 13. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l'isolement et la caractérisation des lymphocytes de tous les compartiments 3 immunitaire de l'intestin grêle. De plus, l'intérêt croissant porté par des altérations induites par les microbes dans le système immunitaire des muqueuses, on comprend les étapes qui peuvent être utilisés pour permettre la transmission horizontale des micro-organismes entre la souris pour évaluer la façon dont ces modifications affectent quantitativement le système immunitaire intestinal.
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Protocol
Toutes les études ont été menées en cours d'examen et les lignes directrices strictes selon le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à la Harvard Medical School, qui répond aux normes vétérinaires établies par l'American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).
1. Transmission horizontale des bactéries via Co-logement (en option)
- Pour minimiser la contamination exogène (en particulier en cas d'utilisation des souris gnotobiotique), pratiquer une technique aseptique lors de l'assemblage des cages stériles jetables, en utilisant la nourriture et de l'eau qui ont tous deux été autoclavé.
- Utilisez des poinçons de l'oreille ou des étiquettes pour marquer individuellement âgées de 6 semaines C57BL / 6 qui abritent différents microbiotes et loger eux dans la même cage. Étant donné que les souris sont coprophages et mangent pelotes fécales du sol de la cage, les microbes seront naturellement transmises horizontalement entre les souris.
- souris Co-maison pour ≥1 semaine pour laisser le temps pour le transfert microbien et le changement immunologique avant l'analyse. 2. Préparation d'une suspension cellulaire unique de la couche intraépithéliale Petit-intestinal et la lamina propria
- Préparation des solutions
- Préparer des milieux d'extraction (par l'intestin grêle): 30 ml de RPMI + 93 ul de 5% (p / v), dithiothréitol (DTT) + 60 ul d'EDTA 0,5 M + 500 ul de sérum foetal bovin (FBS). Ajouter le TNT immédiatement avant utilisation.
- Préparer les médias de digestion (par l'intestin grêle): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de collagénase II + 300 pi de FBS. Ajouter la dispase et de la collagénase immédiatement avant utilisation.
- Pour toutes les incubations effectuées à 37 ° C, des solutions Préchauffer à 37 ° C.
- Euthanize la souris par asphyxie au CO2 suivie d' une dislocation cervicale.
- Placez la face dorsale de la souris vers le bas et pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol. Utilisez des ciseaux pour effectuer une laparotomie en coupant successivement la peau et le fascia puis péritonéale le long de la ligne médiane ventrale from la symphyse pubienne du processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale.
- Utilisez des ciseaux pour séparer de l'intestin grêle de l'estomac par sectionnant le sphincter pylorique. Retirez délicatement le petit intestin du péritoine, taquinant le gras mésentérique.
- Pour supprimer complètement le petit intestin, faire une deuxième coupe à la jonction iléo-caecale. Placer le petit intestin isolé à froid ( par exemple., 4 ° C) , RPMI contenant 10% de FBS pour maximiser la viabilité cellulaire.
- Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l'aide des pinces incurvées. Faites preuve de prudence pour éviter de déchirer le tissu intestinal lui-même tout en essayant d'enlever la graisse.
- Pour supprimer le contenu intestinal, rincer délicatement les intestins avec 15 - 20 ml de PBS froid à l'aide d'une aiguille d'alimentation 18 G fixée à une seringue.
- Utilisez des ciseaux pour exciser PPs, et les placer dans RPMI froid contenant 5% de FBS. PPs sont situés sur le côté antimésentérique du petit intestin et apparaissent comme un blanc multi-lobuléeMasse. En fonction de la souche spécifique, une souris a typiquement 8 - 12 PPs.
- Couper l'intestin grêle dans 3 - 4 segments de pouce.
- Retirer le gras résiduel en roulant chaque segment de l'intestin grêle sur une serviette en papier humidifié avec RPMI, en utilisant un scalpel terne pour taquiner la graisse loin du tissu.
- Tourner le tissu à l'intérieur par canulation les segments intestinaux avec des forceps incurvés et de saisir l'extrémité distale du tissu. Ensuite, utilisez une paire de pinces droites pour enlever délicatement le segment de tissu de la pince incurvées (commençant à l'extrémité proximale), ce qui entraîne dans le tissu étant inversé.
- Placez les segments de tissu dans une tasse contenant 30 ml de milieu d'extraction et une barre d'agitation. Fixer le couvercle sur la coupe, et on agite à 500 tours par minute pendant 15 minutes à 37 ° C; agitation devrait être vigoureuse mais non turbulent.
- Après incubation, utilisez une passoire en acier pour séparer les morceaux de tissu à partir du surnageant contenant l'épithélium, qui devrait apparaître nuageux. Ce surnageant contient iLes lymphocytes ntraepithelial qui peuvent être analysées plus en profondeur, le cas échéant, en procédant à un filtrage de l'échantillon dans les étapes 2,18 - 2,23.
- agiter manuellement les morceaux de tissu dans RPMI pour laver milieux d'extraction résiduels.
- Placez le tissu sur une serviette en papier et le retourner bout sur bout à plusieurs reprises pour faciliter l'élimination du mucus résiduel qui n'a pas été libéré par le milieu d'extraction.
- Placer les fragments de tissu dans un tube de 1,5 ml avec 600 ul de milieu de digestion.
- Utilisez des ciseaux pour hacher le tissu jusqu'à ce que les pièces ne collent aux ciseaux et la solution semble homogène. Cette étape est essentielle pour assurer la digestion enzymatique complète du tissu.
- Ajouter de l'intestin grêle haché dans une tasse contenant 25 ml de milieu de digestion. Agiter à 500 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C. A mi - chemin à travers la digestion (ie., À 15 min), pipeter de haut en bas avec une pipette sérologique pour aider à briser les gros morceaux de tissu.
- Filtre tissu digéré (ou epithElial couche de l'étape 2.12 si IELs de traitement) à travers une cellule de tamis 100 pm dans un tube de 50 ml. Rincer le filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
- Centrifuger la solution filtrée à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
- Filtrer les cellules remises en suspension à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Rinçage filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
- solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS.
- Transfert excisé PPs à une tasse avec 25 ml de milieu de digestion et une barre d'agitation. couvercle sécurisé, et un essorage à 500 tours par minute pendant 10 minutes à 37 ° C.
- Filtre digéré PPs à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Si un amas remadans, les presser à travers le tamis en utilisant l'extrémité plate du piston d'une seringue de 1 ml.
- Rinçage filtre avec 10 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
- solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS.
- Aliquoter volume approprié de cellules (par exemple., 200 pi de LPLs) dans une plaque à fond rond de 96 puits.
- Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 90 ul de RPMI contenant 2% de FBS et une dilution 1: 100 d'anticorps anti-CD16 / 32 (bloc Fc). Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter 10 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant parinversant la plaque.
- (Facultatif) cellules tache avec la viabilité de colorant, si désiré, en suivant le protocole du fabricant.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1% de formaline pour fixer les cellules. Incuber pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
- Ajouter 200 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 200 ul de PBS. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux.
3. Préparation d'une suspension cellulaire unique à partir des plaques de Peyer
4. Coloration de surface pour la cytométrie de flux
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Representative Results
L' analyse par cytométrie de suspensions de cellules isolées de l' intestin grêle lymphocytes devrait donner une population discrète de cellules qui ont des caractéristiques similaires avant et dispersion latérale comme splénocytes (Figures 1A et 1B). Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu ne soit pas maintenu à 4 ° C au cours des premières étapes de l'isolement, ce qui entraîne dans la population de lymphocytes ayant une dispersion inférieure vers l' avant et d' être plus difficiles à séparer des autres cellules épithéliales et mortes (figure 1C) . Par ailleurs, si le tissu de l' intestin grêle ne sont pas complètement débarrassé de sa graisse mésentérique, il n'y a pratiquement une perte totale de lymphocytes (figure 1D). Ces caractéristiques illustrent comment travailler rapidement (ie., Ne permet pas le tissu pour se réchauffer) et en accordant une attention aux détails (ie., La suppression même de petites quantités de graisse mésentérique) est nécessaire pour assurer la qualité de l' échantillon. Typically, on obtient ~ 80% de viabilité pour l' intestin grêle LPLs (figure 1E).
La figure 2A montre comment la composition de la flore microbienne peut affecter considérablement le nombre de populations cellulaires spécifiques. Comme nous l'avons déjà démontré (GF) souris exemptes de germes, qui sont totalement dépourvues de tout micro-organisme, ont un système immunitaire de l'intestin grêle qui est nettement plus immatures par rapport à des souris spécifiques exemptes de germes pathogènes (SPF), et la colonisation des souris GF avec une microflore normale de la souris (MMB) se traduit par la restauration du système immunitaire de l' intestin grêle 14. En revanche, les souris gnotobiotiques hébergeant un microbiote humain normal (HMB) - et qui ont un certain nombre et la diversité des bactéries fécales que les souris MMB similaires - ont un système immunitaire de l' intestin grêle qui est indiscernable de celle de GF souris 14.
Profiter dela nature coprophages des souris, les souris co-logement représente ensemble une méthode simple, mais puissant pour permettre la transmission horizontale des organismes entre les souris. Cette approche permet de tester si le changement résultant dans le microbiote affecte le système immunitaire de l'intestin grêle. A titre d'exemple, nous avons démontré que les souris co-logement HMB avec des souris MMB pendant 4 semaines abouti à la normalisation du nombre de cellules CD3 + CD8 + T dans le SI LP (figure 2B) 14. Ce résultat confirme que les différences entre les souris et MMB HMB observées sur la figure 2A est due à des variations de la flore microbienne entre ces souris - les variations qui sont surmontées par la co-habitation les souris ensemble.
Figure 1. Intestinal Lymphocytes ont FSC et SSC Caractéristiques similaires à splénocytes A -. D. Dparcelles ot représentant SSC et FSC pour splénocytes optimale préparés (A) et l'intestin grêle lamina propria (SI LP) des cellules (B - D). l'échantillon B. L'IS LP a été préparé selon le protocole décrit. C. Le tissu intestinal a été volontairement laissé se réchauffer à démontrer que les cellules SI LP commencent à avoir une FSC inférieure. D. La graisse mésentérique n'a pas été nettoyée de l'intestin grêle avant la préparation de cellules individuelles, ce qui entraîne la perte d'un SI LP population de lymphocytes discernable. E. L'échantillon représenté dans le panneau B a été coloré à l' étape 4.7 avec fixable colorant de viabilité (par ex., EFluor 780) selon les instructions du fabricant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. microbiote Impacts Maturation du Petit-IntestSystème immunitaire inal. A. Cellules CD3 + CD8 + T ont été dénombrées dans le SI LP du SPF, MMB, HMB et souris GF. Souris B. HMB ont été co-logés avec des souris MMB pendant 4 semaines avant l' énumération des cellules CD3 + CD8 + T dans le SI LP. souris MMB et HMB qui ne sont pas co-logés ont été analysés aux fins de comparaison. Chaque point de données représente une souris individuelle, et les barres horizontales reflètent la moyenne. NS, non significatif; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Les chiffres sont reproduits-avec la permission de la référence-14, avec une légère modification de B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous présentons un protocole pour l'isolement et le flux de caractérisation cytométrie de petits lymphocytes-intestinaux, y compris le LPLs, IELs, et les lymphocytes dans le PPs. Pour ceux intéressés à évaluer comment les changements dans le microbiote affectent le système immunitaire de l'intestin grêle, nous détaillons les étapes simples impliqués dans la transmission horizontale des organismes entre les souris hébergeant différentes microbiotes. Bien que ce protocole se concentre sur l'intestin grêle, la procédure est la même pour l'analyse du gros intestin, à la seule différence étant qu'il n'y a pas d'enlever PPs (bien que les patchs coliques sont présents, ceux-ci ne sont généralement pas nettement visibles).
Il y a plusieurs étapes clés dans la réalisation de l'isolement optimal des lymphocytes à partir de tissus de l'intestin grêle. élimination Méticuleux du tissu adipeux est absolument essentielle pour assurer la viabilité des lymphocytes et le rendement optimal. En outre, la TNT est un mucolytique essentiel utilisé dans l'extractiondes cellules épithéliales. Compte tenu de sa nature instable, nous vous suggérons de stockage à usage unique aliquotes d'une solution de 5% à ≤-20 ° C et non re-congélation tout volume utilisé. Bien que l' EDTA est utilisé dans le milieu d'extraction afin d' aider à l'élimination des cellules epitheliales 15, sa présence - ainsi que l' excès de mucus ou de FBS - au cours du processus de digestion peuvent inhiber la collagénase. La concentration de la collagénase utilisée a été démontré qu'elles affectent différentiellement l' expression des marqueurs de surface et la viabilité des cellules 13,16,17. Par ailleurs, selon le marqueur de surface d'intérêt, il est possible qu'une formulation différente de la collagénase (par ex., La collagénase de type I, II, VI ou VIII) est optimale 13,17. Certains optimisation empirique peut être nécessaire en fonction de la question expérimentale spécifique et, en raison de la variation de lot à lot, le lot spécifique et le niveau d'activité relative de la collagénase. En outre, l'optimisation supplémentaire peut être nécessaire en fonction de la spécifsouche ic et l'âge de la souris utilisées. Par exemple, les heures indiquées ici ont été optimisés pour une semaine ~ 6 vieux C57BL / 6 de la souris; une ancienne ~ 8 semaines souris Swiss Webster, le temps de digestion peut être augmentée jusqu'à 40 minutes.
En résumé, nous avons fourni un protocole détaillé pour l'isolement des lymphocytes petits intestinaux de la lamina propria, couche intraépithéliale et PPs. Une fois maîtrisé, on peut raisonnablement traiter 4 souris et ont des suspensions cellulaires simples prêts pour la coloration dans ~ 4 h. Bien que nous décrivons la coloration immédiate de ces cellules pour la cytométrie de flux de caractérisation, on peut en variante , stimuler ces cellules pour évaluer la production de cytokines, trier les cellules pour la transcription et / ou d' analyses protéomiques, ou la culture des cellules pour étudier les interactions in vitro avec d' autres types de cellules. De plus, alors que nous nous sommes concentrés sur la population des lymphocytes, ce protocole peut également être utilisé pour examiner les cellules myéloïdes. Pris ensemble, cette approche rationalisée pour isoler seule CEpopulations ll de divers compartiments intestinaux permet d'interroger à la fois comment divers facteurs (par exemple., microbiote, antigènes alimentaires) influencent l'ontogenèse du système immunitaire intestinal et aussi comment ces cellules peuvent être pertinentes dans les maladies extra-intestinales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
