Abstract
Der Darm -, die die größte Anzahl von Immunzellen von jedem Organ im Körper enthalten - sind auf fremde Antigene ständig ausgesetzt sind, sowohl mikrobielle und Nahrungs. Gegeben helfen ein zunehmendes Verständnis, dass diese luminale Antigene, die Immunantwort zu gestalten und dass Bildung von Immunzellen im Darm für eine Reihe von systemischen Erkrankungen kritisch ist, hat es bei der Charakterisierung des intestinalen Immunsystems erhöht Interesse. viele veröffentlichte Protokolle sind jedoch mühsam und zeitraubend. Wir präsentieren hier ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus dem kleinen intestinalen Lamina propria, intraepitheliale Schicht und Patches Peyer, die eine schnelle, reproduzierbar ist, und erfordert keine mühsamen Percoll Gradienten. Obwohl das Protokoll auf den Dünndarm konzentriert ist es auch für die Analyse des Kolons geeignet. Darüber hinaus stellen wir einige Aspekte, die auf die spezifische wissenschaftliche ques je eine zusätzliche Optimierung benötigention. Dieser Ansatz führt zu der Isolierung einer großen Anzahl von lebenden Lymphozyten, die anschließend für die durchflusszytometrische Analyse oder alternative Mittel zur Charakterisierung verwendet werden können.
Introduction
Die Hauptaufgabe des Dünndarms wird oft als 1 , um die Verdauung und Resorption von Nährstoffen ist. Während diese Stoffwechsel - Funktion deutlich von wesentlicher Bedeutung ist, hat der Dünndarm eine ebenso bedeutende Rolle in den Host aus dem ständigen Flut von Umweltantigene innerhalb des Lumens 2 gefunden zu schützen. Der Darmtrakt trennt die Außenwelt (z. B. luminale Antigene) aus der inneren Umgebung des Wirts mit einer Epithelschicht , die nur eine einzige Zellschicht dick ist. Als solche hat die kleine-Darm Immunsystem die gewaltige Aufgabe seine Schwelle auf Reaktivität auszugleichen, so dass fremde Antigene aus der Ernährung und commensal Mikroben die Schleimhaut mit minimal, wenn überhaupt, Immunantwort zu aktivieren, während eine robuste Antwort gegen eindringende Pathogene Montage und andere "schädlich" Antigene. Übermäßige oder unangemessene Immunantworten gegen diese Antigene zu pathologischen Krankheit führen können (z. B. inflammatory Darmerkrankung, Typ - I - Diabetes, Multiple Sklerose) , und 3-6 vermieden werden muss.
Insgesamt ist der Gastrointestinaltrakt das größte Immunorgan im Körper darzustellen gedacht, mit über 70% der Antikörper-sezernierenden Zellen 7. Die Klein intestinale Immunsystem besteht aus 3 Hauptfächer - die lamina propria (LP), der intraepithelialen Schicht und Peyer-Plaques (PPs) - dass jede 2 eine besondere Gruppe von Lymphozyten enthält. Die LP - Lymphozyten (LPLs) sind in erster Linie TCRαβ + T - Zellen mit ~ 20% B - Zellen; intraepitheliale Lymphozyten (IELs) enthalten nur sehr wenige B - Zellen mit mehr TCRγδ + T - Zellen als TCRαβ + T - Zellen; und PPs, die in der kleinen Darmwand eingebettet sekundären lymphatischen Organe sind, die ~ 80% B-Zellen. Obwohl jede dieser anatomischen Regionen leicht unterschiedliche Funktionen und ontologischen Basen hat, funktionieren sie in aharmonized Art und Weise den Wirt vor pathogenen Beleidigungen zu schützen.
Darüber hinaus gibt es wachsende Anerkennung , dass die Mikrobioten eine kritische Determinante für die Entwicklung des Darm Immunsystems, mit Anerkennung der kognaten Beziehung zwischen spezifischen Mikroben erhöht und die Ontogenese von bestimmten Zelllinien 8,9. Da darüber hinaus die Bildung des intestinalen Immunsystems in anatomisch entfernten Stellen Immunreaktionen beeinflusst (z. B. Arthritis, Multiple Sklerose, Lungenentzündung), ist es klar geworden , dass die Entwicklung des intestinalen Immunsystems zu mehr Krankheitsprozesse relevant ist , als bisher 10 erkannt -12. Als solches Interesse an quantitativ die intestinale Immunsystem Beurteilung hat sich über Wirt-Pathogen-Interaktionen erweitert jetzt Host-symbiotischer Interaktionen und die Pathogenese vieler systemischen Erkrankungen sowie umfassen.
die Variabilität der derzeitigen Methoden in der gegebenenIsolierung von Darm-Lymphozyten, eine Methode, die während Ausgleich erforderlich, um die Zeit für den Ertrag, Rentabilität und Konsistenz optimiert wird zunehmend kritisch. Protokolle, die Percoll Gradienten sind zeit- und arbeitsintensiv und möglicherweise anfällig für menschliche Fehler, was zu einer variablen Ausbeute und Lebensfähigkeit 13 beinhalten. Hierin stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, die aus allen drei kleinen intestinalen Immun Abteilen. Zusätzlich, da ein zunehmendes Interesse an mikroben induzierte Veränderungen in der mukosalen Immunsystems beziehen wir Schritte, die verwendet werden können, für die horizontale Übertragung von Mikroorganismen zwischen Mäusen zu ermöglichen zu beurteilen, wie diese Veränderungen quantitativ die intestinale Immunsystem beeinflussen.
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Protocol
Alle Untersuchungen wurden unter strengen Überprüfung und Richtlinien durchgeführt nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Harvard Medical School, die die Veterinär Standards, die von der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) erfüllt.
1. Horizontale Übertragung von Bakterien über Co-Gehäuse (optional)
- Zur Minimierung von exogenen Kontamination (insbesondere, wenn gnotobiotischer Mäusen), üben aseptischen Bedingungen während sterile Einweg-Käfige montieren, mit Nahrung und Wasser, die haben beide autoklaviert worden.
- Verwenden Ohr Schläge oder Tags einzeln markieren 6 Wochen alten C57BL / 6-Mäuse, die unterschiedliche microbiotas Hafen und beherbergen sie im selben Käfig. Da Mäuse sind Koprophagie und essen fäkalen Pellets aus dem Käfigboden, Mikroben wird natürlich horizontal zwischen den Mäusen übertragen werden.
- Co-Hausmäuse für ≥1 Woche Zeit für die mikrobielle Transfer und immunologischer Veränderungen vor der Analyse zu ermöglichen. 2. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Small-Darm-Intraepitheliale Schicht und Lamina Propria
- Herstellung von Lösungen
- Bereiten Extraktionsmedien (pro Dünndarm): 30 ml RPMI + 93 & mgr; l 5% (w / v) Dithiothreitol (DTT) + 60 & mgr; l 0,5 M EDTA + 500 ul fötales Rinderserum (FBS). Fügen Sie den DVB-T unmittelbar vor der Verwendung.
- Bereiten Sie die Verdauung Medien (pro Dünndarm): 25 ml RPMI + 12,5 mg Dispase + 37,5 mg Kollagenase II + 300 ul FBS. Fügen Sie die Dispase und Kollagenase unmittelbar vor dem Gebrauch.
- Für alle Inkubationen bei 37 ° C, vorwärmen Lösungen bis 37 ° C durchgeführt wird.
- Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte.
- Platzieren Sie die Maus dorsalen Seite nach unten und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Mit einer Schere eine Laparotomie durchzuführen, indem der Reihe nach in die Haut schneiden und dann Peritonealdialyse Faszie entlang der ventralen Mittellinie herm die Schambeinfuge zum Xiphoidbasis, wodurch die Bauchhöhle ausgesetzt wird.
- Mit einer Schere in den Dünndarm aus dem Magen zu trennen, indem Sie den Magenpförtner durchschneidet. Entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm aus dem Peritoneum, necken die mesenterialen Fett weg.
- Um voll und ganz in den Dünndarm zu entfernen, machen einen zweiten Schnitt am ileo-cecal Kreuzung. Platzieren Sie den isolierten Dünndarm in kaltes (dh., 4 ° C) RPMI 10% FBS enthält , die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren.
- Entfernen Sie vorsichtig große Stücke von Fett mit einer gebogenen Pinzette. Seien Sie vorsichtig, zu vermeiden, dass die Darmgewebe reißen sich während Fett zu entfernen versuchen.
- Zum Entfernen von Darminhalt, sanft spülen Darm mit 15 bis 20 ml kaltem PBS unter Verwendung einer 18 G Fütterung Nadel an einer Spritze befestigt.
- Mit einer Schere PPs auszuschneiden, und legen Sie sie in kaltem RPMI mit 5% FBS. PPs sind auf der antimesenteriale Seite des Dünndarms befindet und erscheinen als mehr gelappte whiteMasse. Je nach dem spezifischen Stamm hat eine Maus typischerweise 8 bis 12 PPs.
- Schneiden Sie den Dünndarm sich in 3 - 4-Zoll-Segmente.
- Entfernen Restfett durch jede kleine-Darm-Segment auf einem Papiertuch rollen mit RPMI befeuchtet, ein stumpfes Skalpell, das Fett zu necken aus dem Gewebe entfernt.
- Schalten Sie das Gewebe von innen nach außen durch die Darmsegmente mit einer gebogenen Pinzette Kanülierung und das distale Ende des Gewebes zu erfassen. Dann mit einem Paar von geraden Pinzette vorsichtig auf die Gewebesegment aus den gebogenen Pinzette entfernen (am proximalen Ende beginnend), die sich in das Gewebe invertiert wird.
- Legen Sie Gewebesegmente in einer Schale mit 30 ml Extraktionsmittel und einen Rührstab. Sichern Sie den Deckel auf den Becher, und rührt bei 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bei 37 ° C; Rühren sollte kräftig, aber nicht turbulent sein.
- Nach der Inkubation verwenden, um ein Wannensieb Gewebestücke aus dem Epithel enthaltenden Überstand zu trennen, die trübe erscheinen soll. Dieser Überstand enthält intraepithelial Lymphozyten, die weiter analysiert werden können, falls gewünscht, durch fortgefahren wird, die Probe in Schritten Filterung 2,18-2,23.
- die Gewebestücke in RPMI manuell agitieren Restextraktionsmittel abzuwaschen.
- Legen Sie Gewebe auf ein trockenes Papiertuch und drehen Sie sie über das Ende mehrmals am Ende Entfernung von Rest Schleim zu erleichtern, die nicht durch das Extraktionsmittel befreit wurde.
- Platzieren Gewebefragmente in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 600 ul Digestionsmedium.
- Mit einer Schere das Gewebe zu zerkleinern, bis Stücke nicht mehr auf die Schere halten, und die Lösung erscheint homogen. Dieser Schritt ist entscheidend vollständige enzymatische Verdauung des Gewebes zu gewährleisten.
- Fügen Sie den gehackten Dünndarm zu einer Tasse, die 25 ml Verdauung Medien. Rühre bei 500 rpm für 30 min bei 37 ° C. Auf halbem Weg durch die Verdauung (dh., 15 min), pipettieren nach oben und unten mit einer serologischen Pipette alle großen Brocken von Gewebe brechen zu helfen.
- Filter verdaute Gewebe (oder EpithElial Schicht aus Schritt 2.12, wenn die Verarbeitung IELs) durch ein 100 & mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sie das Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthält.
- Zentrifugieren der filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
- dekantieren sorgfältig den Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 10% FBS enthielt.
- Filter resuspendierten Zellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthielt.
- Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
- dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt.
- Transfer PPs zu einer Tasse mit 25 ml Verdauung Medien und einem Rührstab herausgeschnitten. Sichere Deckel und Schleudern bei 500 UpM für 10 min bei 37 ° C.
- Filter verdaut PPs durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb in einen 50-ml-Tube. Wenn jeder Klumpen REMAin, drücken sie durch das Sieb aus einer 1-ml-Spritze das flache Ende des Kolbens verwendet wird.
- Spülen Sieb mit 10 ml RPMI 10% FBS enthielt.
- Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
- dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt.
- Aliquotieren entsprechende Volumen von Zellen (z. B. 200 ul LPLs) in einer 96-Well - Rundbodenplatte.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
- Resuspendiere Zellen in 90 & mgr; l von RPMI, enthaltend 2% FBS und eine 1: 100-Verdünnung von anti-CD16 / 32 (Fc-Block). Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
- In 10 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
- Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Decant Stand durchUmdrehen der Platte.
- (Optional) Stain Zellen mit Lebensfähigkeit Farbstoff, falls gewünscht, durch das Protokoll des Herstellers folgen.
- Die Zellen in 100 ul 1% Formalin, die Zellen zu fixieren. Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
- In 200 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
- Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
- Die Zellen in 200 ul PBS. Analysieren Sie die Zellen unter Verwendung eines Durchflusszytometers.
3. Herstellung einer Einzelzellsuspension von Peyer-Plaques
4. Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie
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Representative Results
Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellsuspensionen von kleinen intestinalen Lymphozyten sollte eine diskrete Population von Zellen ergeben , die ähnliche haben Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften als Splenozyten (1A und 1B). Die Lymphozyten können beginnen zu sterben , wenn das Gewebe nicht bei 4 ° C während der ersten Phasen der Isolation gehalten, was in der Lymphozyten - Population eine niedrigere Vorwärtsstreuung aufweisen und schwierig zu trennen von anderen epithelialen und toten Zellen (1C) . Außerdem, wenn die kleine Darmgewebe nicht vollständig seiner mesenterialen Fett gereinigt, gibt es praktisch ein vollständiger Verlust der Lymphozyten (Figur 1D). Diese Funktionen zeigen , wie schnell arbeiten (dh., Nicht das Gewebe ermöglicht zum Aufwärmen) und Aufmerksamkeit zum Detail (dh., Das Entfernen bereits geringe Mengen an mesenterialen Fett) ist notwendig , Probenqualität zu gewährleisten. typically, so erhalten wir ~ 80% Lebensfähigkeit für kleine-Darm - LPLs (Abbildung 1E).
2A zeigt , wie die Zusammensetzung der Mikroflora stark die Anzahl von spezifischen Zellpopulationen beeinflussen können. Wie wir früher gezeigt haben, keimfrei (GF) Mäusen, die völlig frei von irgendwelchen Mikroorganismen sind, haben einen kleinen intestinalen Immunsystems, die deutlich unreifen im Vergleich zu spezifischen pathogenfreien (SPF) Mäusen und Kolonisierung von GF Mäusen mit einer normalen Maus microbiota (MMB) zu Wiederherstellung der kleinen intestinalen Immunsystems 14. Im Gegensatz dazu beherberge gnotobiotischen Mäusen eine normale menschliche microbiota (HMB) - und dass eine ähnliche Anzahl und Vielfalt von fäkalen Bakterien als MMb mice - haben einen kleinen intestinalen Immunsystems , die sich von der GF - Mäusen 14 ununterscheidbar ist.
Einen Vorteil ziehen ausdie Koprophagie Natur von Mäusen, Co-Gehäuse Mäuse stellt zusammen eine einfache, aber leistungsfähige Methode zur horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht es, ob die sich ergebende Änderung der Klein intestinalen Immunsystems in der Mikrobioten zu testen auswirkt. Als Beispiel haben wir gezeigt , dass die Co-Gehäuse HMB Mäuse mit MMb Mäuse für 4 Wochen in der Normalisierung der Zahl der CD3 + CD8 + T - Zellen in der SI LP (2B) 14 geführt. Dieses Ergebnis bestätigt , dass die Unterschiede zwischen MMb und HMB Mäusen beobachtet in 2A zu Variationen in der Mikrobioten zwischen diesen Mäusen zurückzuführen ist - Variationen , die durch Zusammenbringen der Mäuse zusammen überwunden werden.
Abbildung 1. Intestinale Lymphozyten haben FSC und SSC ähnliche Eigenschaften wie Splenozyten . A - D. Dot Plots Darstellung SSC und FSC für optimal vorbereitet Splenozyten (A) und des Dünndarms Lamina propria (SI LP) Zellen (B - D). B. Die SI LP Probe wurde nach dem beschriebenen Protokoll hergestellt. C. Das Darmgewebe wurde absichtlich erwärmen gelassen zu zeigen, dass SI LP Zellen beginnen, einen niedrigeren FSC zu haben. D. Die mesenterialen Fett wurde nicht in den Dünndarm vor der Herstellung einzelner Zellen gereinigt, was zu dem Verlust eines erkennbaren SI LP Lymphozytenpopulation. E. Die Probe in Feld B dargestellt wurde in Schritt 4.7 mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt (z. B. eFluor 780) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Mikrobiota Auswirkungen Ausreifung des Small-intestinal Immunsystem. A. CD3 + CD8 + T - Zellen wurden in SI LP von SPF, MMb, HMB und GF Mäuse gezählt. B. HMB Mäuse wurden gemeinsam untergebracht mit MMb Mäuse für 4 Wochen vor CD3 + CD8 + T - Zellen in der SI LP zu aufzählt. MMb und HMB-Mäuse, die waren nicht zusammengebracht wurden zum Vergleich untersucht. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Maus, und die horizontalen Balken entsprechen dem Mittelwert. NS, nicht signifikant; * P <0,05; **, P <0.01; *** P <0,001. Die Zahlen sind wiedergegebenen mit berechtigungs von Referenz 14, mit einer leichten Modifikation von B. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und durchflusszytometrische Charakterisierung von kleinen intestinalen Lymphozyten, einschließlich der LPLs, IELs und Lymphozyten in die PPs. Für Interessenten bei der Bewertung, wie sich Änderungen in der Mikrobiota die kleine-Darm-Immunsystem beeinflussen, wir ausführlich die einfachen Schritte in der horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen beteiligt verschiedenen microbiotas beherbergen. Obwohl dieses Protokoll auf den Dünndarm konzentriert, ist das Verfahren das gleiche für die Analyse des Dickdarms, mit dem einzigen Unterschied, dass es kein PPs zu entfernen sind (obwohl colonic Flecken vorhanden sind, sind diese typischerweise nicht grob sichtbar).
Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Erreichung optimaler Isolierung von Lymphozyten aus kleinen Darmgewebe. Sorgfältige Entfernung von Fettgewebe ist absolut entscheidend Lymphozyten Lebensfähigkeit und eine optimale Ausbeute zu gewährleisten. Zusätzlich ist ein entscheidender DTT schleimlösende in der Extraktion verwendetenvon Epithelzellen. Aufgrund seiner instabilen Natur, empfehlen wir Lagerung Einweg-Aliquots einer 5% igen Lösung bei ≤-20 ° C und nicht wieder einfrieren nicht verwendete Volumen. Obwohl EDTA in dem Extraktionsmedium verwendet wird , bei der Entfernung von Epithelzellen zu unterstützen 15, seine Anwesenheit - sowie überschüssiges FBS oder Schleim - während des Verdauungsprozesses kann die Kollagenase inhibieren. Die Konzentration von Kollagenase verwendet wurde , unterschiedlich Oberflächenmarker Ausdruck und die Lebensfähigkeit der Zellen 13,16,17 beeinflussen demonstriert. Darüber hinaus, abhängig von der Oberflächenmarker von Interesse, kann es sein , dass eine andere Formulierung von Kollagenase (z. B. Kollagenase Typ I, II, VI oder VIII) 13,17 optimal ist. Einige empirische Optimierung kann erforderlich sein, abhängig von der spezifischen experimentellen Frage und aufgrund von Los zu Los Variation, die spezifische Menge und die relative Aktivität der Kollagenase. Des Weiteren können zusätzliche Optimierung je nach spezif erforderlichic Stamm und Alter der Maus. Beispielsweise aufgelistet die Zeiten hier wurden für eine ~ 6 Wochen alten C57BL / 6-Maus optimiert; für eine ~ 8 Wochen alten Webster Maus Schweizer kann die Verdauung Zeit auf 40 Minuten erhöht werden.
Zusammenfassend haben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von kleinen intestinalen Lymphozyten aus der Lamina propria, intraepitheliale Schicht und PPs vorgesehen. Einmal gemeistert, kann man vernünftigerweise 4 Mäuse verarbeiten und haben Einzelzellsuspensionen bereit für die Färbung in ca. 4 Std. Obwohl wir die sofortige Färbung dieser Zellen für die durchflusszytometrische Charakterisierung beschreiben, kann man alternativ , diese Zellen zu stimulieren , um die Cytokin - Produktion bewerten, sortieren Zellen für die transkriptionale und / oder proteomische Analyse oder die Zellen Kultur bei in vitro - Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen zu suchen. Darüber hinaus, während man auf der Lymphozytenpopulation konzentriert, kann dieses Protokoll auch verwendet werden, myeloiden Zellen zu untersuchen. Zusammengenommen mit diesen optimierten Ansatz zu einzelnen ce isolierenll Populationen aus verschiedenen Darmfächer ermöglicht eine sowohl zu befragen , wie verschiedene Faktoren (z. B. Mikrobiota, Nahrungsantigene) beeinflussen die Ontogenese des intestinalen Immunsystems und auch , wie diese Zellen in Extra-Darm - Erkrankungen von Bedeutung sein können.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| Metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| Water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| Card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| Autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| Dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| Collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| Dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| Straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| Multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| Stir bar | VWR | 58949-062 | |
| Multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| Stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml Tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm Cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 ml Conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 96-well Plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| Anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (Optional) Fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% Formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
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