Summary
Sövda möss uppvisar icke-fysiologiskt systemiska blodtrycket, vilket utesluter meningsfull bedömning av autonoma tonar ges det intima förhållandet mellan blodtryck och det autonoma nervsystemet. Således beskrivs en roman metod att samtidigt spela in renal sympatisk nervaktivitet och blodtryck med intravenös infusion i medvetna möss.
Abstract
Nedsatt sympatiska nerver bidra betydligt till både fysiologiska och patofysiologiska fenomen. Utvärdera renala sympatisk nervaktivitet (RSNA) är av stort intresse inom många forskningsområden såsom kronisk njursjukdom, högt blodtryck, hjärtsvikt, diabetes och fetma. Entydig bedömning av det sympatiska nervsystemet roll är således tvingande för korrekt tolkning av experimentella resultat och förståelse av sjukdomsprocesser. RSNA har traditionellt mätts på sövda gnagare, inklusive möss. Men uppvisar möss vanligtvis mycket låga systemiska blodtrycket och hemodynamisk instabilitet i flera timmar under anestesi och kirurgi. Meningsfull tolkning av RSNA försvåras av detta icke-fysiologiskt tillstånd, ges det intima förhållandet mellan sympatiska nervsystemet tonen och kardiovaskulär status. För att lösa denna begränsning av traditionella metoder, utvecklat vi en ny metod för att mäta RSNA i medveten, fritt rörliga möss. Möss var kroniskt instrumenterad med radio-telemeters för kontinuerlig övervakning av blodtryck samt en jugular venös infusion kateter och specialdesignade bipolär elektrod för direktinspelning av RSNA. Efter en 48-72 timmars återhämtningsperiod, överlevnaden var 100% och alla möss uppförde sig normalt. Vid denna tid-punkt spelades RSNA framgångsrikt i 80% av möss, med livskraftiga signaler förvärvade upp till 4 och 5 dagar efter operationen i 70% och 50% av möss, respektive. Fysiologiska blodtryck noterades i alla möss (116±2 mmHg; n = 10). Inspelade RSNA ökade med ätande och grooming, så väletablerad i litteraturen. Dessutom validerades RSNA av ganglieblockerande blockaden och modulering av blodtryck med farmakologiska medel. Häri, beskrivs en effektiv och lätthanterlig metod för tydlig inspelning av RSNA i medveten, fritt rörliga möss.
Introduction
Intresset för att använda möss i flera områden av biomedicinsk forskning fortsätter att expandera med utvecklingen av otaliga genetiskt modifierade modeller. För det mesta, tekniska framsteg har hållit jämna steg med den ökade användningen av möss i fysiologi och det finns nu ett imponerande urval av miniaturized enheter utvecklats specifikt för att mäta viktiga fysiologiska parametrar hos möss. Även om telemetriska enheter för direkt mätning av autonoma nervösa tonen i den medvetna råttan har varit tillgängliga för över ett decennium, miniatyriserade enheter för bedömning av nervaktivitet i medvetna möss för närvarande inte tillgängliga. Utredarna vanligtvis kringgå denna begränsning genom att utvärdera bidraget från det autonoma nervsystemet med indirekta metoder (dvs plasma eller urin katekolaminer, farmakologiska autonoma blockad, spektralanalys av mönster av blod Tryck-och/eller puls)1.
Medan dessa synsätt ger värdefull information, är resultatet en global bild av övergripande autonoma ton, i stället för att avslöja det diskreta bidraget av isolerade populationer av nerver till fenomenet under utredning. Alternativt har direkt inspelning av aktiviteten från specifika nerver utförts hos sövda möss, som utgör en mängd funderingar. Det är ytterst svårt att upprätthålla stabil blodtryck inom fysiologiska spänna i en sövda mus för flera timmar efter kirurgi. I själva verket i dessa typer av experiment, blodtryck ofta orapporterat eller presenteras på extremt låga nivåer (dvs 60-80 mmHg vs > 100mmHg i en medveten mus)2. Bräckligheten i det kardiovaskulära systemet utställda i en sövda mus-förberedelse ofta utgör hinder för en meningsfull bedömning av autonoma nervaktivitet, ges codependent förhållandet mellan blodtryck och sympatisk ton3, 4.
För att åtgärda denna begränsning, en ny metod för direktinspelning av nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA) i medveten, utvecklades ohämmad möss, ostörd inom sina hem burar. Både den kirurgiska och experimentell metoden för framgångsrikt genomförande av denna teknik beskrivs i detalj. Detta preparat kan utredaren att samtidigt registrera artärtryck via radiotelemetry förutom RSNA, med extra kapacitet att intravenöst ingjuta ombud av intresse utan att störa musen.
Tjugofyra timmar efter operationen möss bete sig normalt och inte uppvisar tecken på smärta eller ångest. Experimentell inspelningar får sedan påbörjas 48 till 72 timmar efter operationen medan musen vilar bekvämt i sin hem bur med obegränsad tillgång till mat, vatten och miljö anrikning. Tydliga RSNA spår presenteras och de karakteristiska svar av denna nerv befolkning till normala fysiska förflyttningar av djur (t.ex. äta och grooming) demonstreras förutom farmakologisk modulering av det systemiska blodtrycket. Kvalitet och specificitet av RSNA signalen valideras ytterligare av ganglieblockerande blockad. Detta manuskript finns det audiovisuella komplementet till en början publicerade Beskrivning av denna teknik5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden är förenliga med de nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av University of Mississippi Medical Center.
1. djur och bostäder
- Hus möss (24-35 g) vid ankomsten i djuranläggningen institutionella laboratorium.
- Erbjuda möss standard gnagare chow och kranvatten ad libitum i alla skeden av det experimentella protokollet i en temperatur och luftfuktighet kontrollerad miljö.
2. anpassade tillverkning av den implanterbara RSNA elektroden
Obs: Konstruera implanterbara RSNA elektroden åtminstone några dagar i förväg planerade ingreppet att rymma härdning och sterilisering tid (beskrivs nedan).
- Skär tre lika längder isolerade rostfria multipel-stranded wire, 250 mm varje (tråddiameter 0,0254 mm kala, 0,14 mm belagda). Använd en skalpell blad (helst #11) att strippa cirka 15 mm av isolerande material att exponera den underliggande metallen från ena änden av varje av längderna av tråd.
- Löda en enda manliga stift (mässing med guld plätering) till bared slutet av bara två sladdar och med för att skapa bipolär elektrod leder (figur 1A). Lämna i slutet av tredje längd wire kala. Detta kommer att fungera som en jordledning.
- Glida en kort (~2.0 - 2,5 cm) bit av 1,6 mm diameter-Värmekrympande slang över stift och tråd att helt täcka nyligen lödde skarven mellan tråd och pin kontakten.
Obs: Spetsen av den stift som kommer att anslutas till en förstärkare headstage måste förbli utsatta. - Håll tråden ovan en värmepistol med ett par små tänger eller Peanger att krympa värmekänsliga slangen och elektriskt isolera anslutningen mellan stift och tråd. Upprepa för den andra wire/stift.
- Skär en 200 mm längd av polyeten slangen (PE 90; innerdiameter 0,86 mm, ytterdiameter 1,27 mm). Gruppera de tre kablarna (två leder + marken tråd) och införa orörd ändarna i PE 90 slangen, gängning dem tillsammans genom att den öppna änden av slangen (figur 1B).
Obs: PE 90 slangar funktioner som en slida att gruppera och skydda elektroden leder och marken tråd.- Identifiera en jordledning och dra det igenom PE 90 skidan lite längre för att skilja den från bipolär elektrod leads.
3. konstruktion av elektroden spets
- Visualisera orörd ändarna av elektroden trådarna med en dissekera Mikroskop. Gänga de tre lösa ändarna av elektroden genom en 5 mm - lång bit mindre polyeten slangen (PE 10, innerdiameter 0,28 mm, ytterdiameter 0,61 mm) att binda elektrod trådarna tillsammans.
- Trä en 1,5 mm bit av detta PE 10 slangar på tre elektrod trådarna. Förväg här slangar till vila 2,0 mm bort från den ursprungliga 5 mm bit av PE 10.
- Trä en andra 1,5 mm bit av PE 10 slangar på tips av de två bipolär elektrod leder till täcka och isolera tips och separera dem från en jordledning (figur 1 c).
- Trimma någon överflödig längd på kablarna med en sax.
- Limma de enskilda delarna av PE 10 slangar till elektroden ledningarna med en liten droppe flytande formula cyanoakrylat lim. Placera en avtrubbad 25 gauge nål på slutet av lim röret att förbättra kontroll och minska spill.
- Placera nålspetsen i korsningen mellan PE 10 och tråd, och sedan fördela en liten droppe lim och visualisera lim beläggning på insidan av PE slangen.
- Låt limmet helt bota över natten.
4. fina förberedelse av elektroden spetsen för inspelning
- Strip isolerande beläggning från bipolär elektrod tips och spetsen av en jordledning med #11 skalpell blad. Störa eller skada det underliggande flera strandsatta trådar som detta kommer att påverka kvaliteten på signalen RSNA inte.
- Grepp Byggyta elektroden mellan 5,0 mm och 1,5 mm PE 10 ankare med böjda pincetten och böja trådarna bildar 90° vinkel (figur 1 d).
Obs: Denna manöver bör placera bipolär elektrod leder över en jordledning, i en optimal position till vaggan nerv bunten.
5. byggandet av ankring piedestal
- Konstruera en piedestal att stabilisera elektroden leder till mitten av skulderbladsbrosket regionen av musen vid exteriorisering genom att skära en 3 cm bit av polyeten slangen (innerdiameter 2,70 mm, ytterdiameter 4.00 mm).
- Grepp slangen med pincett och smälta ena änden över en värmepistol. Tryck på uppvärmd slutet av slangar vinkelrätt mot en sval metallyta skapa en rundad ås eller ”flänsen”.
- Tråden här piedestal på Byggyta elektroden, sådan att flänsen pekar mot elektroden spetsen.
Obs: Kombinationen av PE 90 slida och piedestal kommer att skydda de elektrod leder en gång exteriorized från djuret.
6. sterilisering av slutförda implanterbara elektroden
- Paketet slutförda elektroden individuellt i sterilisering väskor och ozon sterilisera (TSO3) före implantation.
Obs: Samråda med lokala sjukhus sterilisering anläggning om viss typ av sterilisering väska och förfarande som skiljer sig mellan institutionerna.
7. anestesi och förberedelse för kirurgi
- Administrera analgesi 20 minuter före start av kirurgi (2 mg/kg meloxikam, S.C.). Placera musen i en induktion kammare infunderas med 100% medicinskt syre. Justera spridare inställningar för att öka andelen isofluran bedövningsmedel i steg om 0,5 till 4%. Utvärdera kirurgiska planet genom att bedöma den reflex Svaren till mild tryck tillämpas på tår eller fot kuddar av fore och hind extremiteterna samt långsammare andningsfrekvens.
- Överföra djuret till tabellen kirurgiska och underhålla anestesi med 1,5 till 2% isofluran via en noskon när det har nått kirurgiska plan och inte längre uppvisar de tå-nypa reflex. Upprepa det tå-nypa Svaren regelbundet och bedöma andningsfrekvens under hela operationstiden. Tillämpa oftalmologiska salva till ögonen att förhindra torrhet.
- Upprätthålla djurets normala kroppstemperatur vid alla tidpunkter med gel-fylld isotermiska värmedynor och motsvarande operationsbord. Lagra isotermiska kuddar i 37° C vattenbad och ersätta kuddar så ofta som behövs under operation för att upprätthålla fysiologiska kroppstemperatur.
- Administrera Glykopyrrolat (50-70 µg/kg subkutant (S.C.)) att förhindra överdriven produktion av luftvägarna sekret omedelbart vid induktion av anestesi. Administrera denna dos av Glykopyrrolat en andra gång vid mittpunkten av det kirurgiska ingreppet (steg 9,1).
- Genomföra alla kirurgiska ingrepp under aseptiska förhållanden. Säkerställa alla kirurgiska verktyg har Ånghärdad före planerad kirurgi. Rengöra operationsområdet som beskrivs nedan (7.2.1) och upprätthålla steriliteten genom hela förfarandet.
- Bära en ansiktsmask, lättbetong och autoklaverad isolering klänning och steril, engångsbruk handskar. Ren alla stora utrustning såsom svanhals lampa, dissekera omfattning och operationsbord med 70% etanol. Periodvis under förfarandet, att gälla de kirurgiska handskarna att säkerställa steriliteten 70% etanol.
- Ta bort hår från djurets vänstra flanken, ventrala hals regionen och dorsala midscapular regionen med små djur hårklippningsmaskiner följt av hårborttagningsprodukter grädde (känslig hud formel).
- Rengöra huden av dessa två kirurgiska fält med 3 omväxlande program av kirurgisk rengöring lösning (10% povidon jod) och 70% etanol. Förbereda operationsområdet med en slutlig ansökan av kirurgisk rengöring lösning.
8. kirurgisk Implantation av RSNA elektroden
- Placera musen på dess högra sida med rostralt slutet pekar kirurgens vänster, utsätta djurets vänstra flanken. Gör en 5 mm snitt i huden i midscapular regionen med en skalpell (nr 11).
Obs: Detta är platsen där RSNA elektrod leder kommer att vara exteriorized.- Gör en andra snitt (< 20 mm) i huden överliggande den vänstra flanken, vinkelrätt mot ryggraden och 2 mm kaudalt till bröstkorgen. Tunnel en 13G rostfri nål subkutant från detta snitt att snittet på webbplatsen dorsala exit.
Obs: Fil nålen att lämna en jämn, icke-framkant skarpa kanter. - Passera 13G nålen steriliserad implanterbara RSNA elektroden (steg 2 - 6). Dra 13G nålen tillbaka för att lämna elektrod spetsen liggande på buken muskler av den vänstra flanken. Lämnar ett segment av elektrod leder liggande under huden, och lämna resterande längderna framväxande från dorsala snittet.
- Gör en andra snitt (< 20 mm) i huden överliggande den vänstra flanken, vinkelrätt mot ryggraden och 2 mm kaudalt till bröstkorgen. Tunnel en 13G rostfri nål subkutant från detta snitt att snittet på webbplatsen dorsala exit.
- Placera elektroden spetsen åt sidan. Gör ett snitt i buken muskeln direkt bakom den huden snitt i 8.1.1. Separera fett och bindväv längs ryggmuskeln med små bomull spets applikatorer att exponera den vänstra njuren.
- Öppna operationsområdet med mikro-upprullningsdon och återkalla njuren. Gör inte sträcka den renala neurovaskulära bunt, vilket kommer att oåterkalleligt skada nedsatt nerverna och hinder för inspelning av en livskraftig RSNA signal.
Obs: Stål mikro-upprullningsdon kan vara hederliga från ett standard gem och en längd av 4-0 silke. Se till att dessa upprullningsdon också steriliseras med kirurgiska instrument för att bevara aseptisk teknik.
- Öppna operationsområdet med mikro-upprullningsdon och återkalla njuren. Gör inte sträcka den renala neurovaskulära bunt, vilket kommer att oåterkalleligt skada nedsatt nerverna och hinder för inspelning av en livskraftig RSNA signal.
- Visualisera den renala neurovaskulära bunten med hjälp av en hög effekt dissekera mikroskopet. Identifiera nedsatt nerv bunten, som vanligtvis (men inte alltid) löper parallellt med den nedsatt artär och ven. Dissekera nerv bunten från omgivande vävnader med fina, raka pincetten.
Obs: Nedsatt nerv bunten visas ogenomskinlig, med en ”rep” reflekterande utseende, unik jämfört med de lymphatic skyttlarna, vilket visas tydligt.- Manipulera nerv bunten så lite som möjligt. Vidrör inte, sträcka och plocka upp den nerv bunten när som helst. Inte stör fina blodkärl som försörjer nerven eller nedsatt lymfa kanalen eftersom detta kommer att äventyra livskraften hos nerven och producera kontinuerlig lymfan vätska pooling runt nerv/elektroden, som kommer att hindra eller helt utplåna den nerv signalen.
- Lämna den nedsatt nerv bunten intakt, vilket hjälper bevara långsiktiga lönsamhet av nerven samt upprätthålla stabil kontakten mellan nerv och elektroden (dvs. en sektionerad nerv kan glida bort av elektroder med tid och naturliga kroppsrörelser).
- Införa RSNA elektrod spetsen i buken. Justera sin position så att den bipolära Elektrodtråd spets och marken är vinkelrät mot den renala neurovaskulära bunten. Ytterligare justera positionen för elektroden så att jordledaren har bra kontakt med underliggande vävnader och elektroden inte komprimeras nedsatt fartyg, att kompromissa med nedsatt cirkulation (figur 1 d).
- Lyft den nedsatt nerv-bunten med vinklad pincett. Glida elektrod spetsen under den nerv, lämnar nerven i direkt kontakt med båda kablarna.
- Glida en liten bit av paraffin film mellan nerv/bipolär trådarna och den tredje (mark) kabeln (figur 1 d).
Obs: Blöt sterilisera paraffin filma i 70% etanol i 24 timmar och skölj i steril fysiologisk koksaltlösning före implantation. - Ta bort eventuella blod eller vätska från runt nerv/elektroden med små absorberande spjut som någon vätska kvar runt nerven eller elektrod ledningar kommer att hindras eller släcka den nerv signalen.
- Snabbt testa kvaliteten på signalen RSNA om så önskas (setup beskrivs nedan).
Obs: Detta måste göras snabbt som exponering för luft kommer att torka nerven och angripa dess livskraft. - Applicera en tvåkomponents silikonelastomer på nerv/elektrod apparaten, säkerställa att silikon poolerna under och runt nerven att tillhandahålla fullständig galvanisk isolering (dvs. inte bara en droppe ovanpå nerven).
Observera: Kontrollera elektrod tips är också belagda i silikon. Jordledaren bör förbli i kontakt med underliggande vävnad och elastomer behöver således inte poolen under denna tråd. Undvik att applicera en onödigt stor mängd av silikonelastomer, eftersom detta kan potentiellt hindra renalt blodflöde, eller bli rubbas med naturliga kroppsrörelser med tiden. - Låt 1-2 minuter för den silikonelastomerer att bota helt, sedan lyft försiktigt ytterkanterna på silikon ”glob” med pincett och applicera en liten mängd flytande formula kirurgisk tejp.
Obs: ta hand inte för att tillämpa en överdriven mängd detta lim, eftersom det kan försämra cirkulationen eller spridit sig till nerven och angripa dess livskraft.
- Glida en liten bit av paraffin film mellan nerv/bipolär trådarna och den tredje (mark) kabeln (figur 1 d).
- Nära buken snitt med diskontinuerlig, resorberbara suturer (5-0). Stäng den överliggande huden på ett liknande sätt med samma sutur material.
9. implantation av blodtryck Radiotelemeter
- Flytta musen på ryggen, med rostralt slutet riktad mot kirurgen. Justera anestesi noskon som behövs. Administrera den andra dosen av Glykopyrrolat på denna punkt (se 7.1.3).
- Gör en mittlinjen-snitt i huden i halsen regionen med en skalpell (nr 11), början från strax under djurets underkäken och sträcker sig strax ovanför bröstkorgen. Separata glandular vävnaden för att exponera underliggande nackmusklerna. Utsätta den vänstra gemensamma halspulsådern och separera från omgivande vävnader.
Obs: Ta stor omsorg för att inte skada vagusnerven eftersom detta kan leda till ökad postoperativ mortalitet.- Passera tre stycken 6-0 silk sutur material under artären. Placera en sutur så långt rostrally som möjligt och knyta den för att absorbera fartyget. Placera en andra sutur halvvägs längs längden av fartyget och knyt löst. Placera den senaste suturen som caudally som möjligt och knyt löst.
- Återkalla rostralt-mest suturen och säkra att noskon med en liten bit av navelsträngen tejp. Dra tillbaka caudal-mest suturen med mikro-mygga tången att begränsa blodflödet i kärlet.
- Gör ett litet snitt i kärlväggen med fina våren sax som rostrally som möjligt. Införa mus blodtryck radiotelemeter katetern in i fartyget och förskott till stjärtfenan suturen.
- Knyt den mellersta suturen för att tillfälligt stabilisera katetern, släppa den kaudala indragning och avancera 10 mm. slips suturen katetern runt katetern att säkra på plats.
- Tunnel telemeter kroppen till en subkutan ficka längs den högra flanken.
10. implantation och exteriorisering av den Jugular Venous Catheter
- Använda små bomull spets applikatorer för att exponera rätt halsvenen. Passera två stycken 6-0 silk sutur material runt fartyget.
- Placera en sutur så långt rostrally som möjligt och slips till Täpp fartyget. Placera andra suturen som caudally som möjligt och försiktigt dra in för att stoppa blodflödet i kärlet.
- Använd fina våren sax för att göra ett litet snitt i kärlväggen så nära rostralt suturen som möjligt. Catheterize i venen med värme-sträckt slang (OD 1,02 mm, sträckte sig till OD 0,64 mm), som är före fylld med steril fysiologisk koksaltlösning.
Observera: Kontrollera kateterspetsen skärs med en skalpell att producera en rundad avfasning för att förhindra att fartyget perforation. Bestäm volymen av vätska i katetern (dead space) för referens (se steg 14,4-14,6 nedan).- Fram katetern ~ 8 mm in i venen. Säkra katetern genom att knyta de silk suturerna runt de fartyg och katetern, samt tillämpningen av en liten droppe gel formel cyanoakrylat lim.
- Placera musen på vänster sida. Tunnel intravenösa katetern från halsen till avfarten vid regionen dorsala midscapular använder en 13G nål av rostfritt stål.
- Flytta musen på ryggen. Nära halsen snitt med diskontinuerlig suturer.
- Placera djuret i liggande position. Trä en liten subkutan knapp på venkateter. Säkra knappen under huden med suturer. Tråd motsvarande rostfria våren över venkateter och fäst den på huden för att skydda katetern.
11. att säkra Exteriorized elektrod leder
- Säkra den polyeten piedestal skydda elektroden leder till den underliggande muskeln vävnad klister. Sutur överliggande huden över flänsen för ytterligare support.
12. postoperativ återhämtning
- Gälla alla snitt antibiotisk salva.
- Administrera smärtstillande medicinering. Administrera ytterligare doser av smärtstillande medicin som behövs under återhämtningsperioden om djuret visar tecken på smärta eller ångest.
- Placera musen i en metabolisk bur som kantas av träflis sängkläder och pappershandduk för att återställa. Kontinuerligt övervaka djuret och inte lämna den utan uppsikt tills det återfår medvetandet och kan underhålla sternala koordinationsrubbning. Införa miljömässiga anrikning och mat och vatten (ad libitum) på denna punkt.
- Spolen elektrod leder utanför buren fram till tidpunkten för experimentet.
- Placera buren över en varm hetta madrassera för de första 24 timmarna av återhämtning. Anslut rostfritt stål våren och intravenös kateter till ett vridbart/infusion system för kontinuerlig infusion av fysiologisk koksaltlösning under återhämtningsperioden (0,5 mL/timme).
- Säkerställa djuret förblir ensamma inrymt i en dedikerad bur pågrund av exteriorized katetern och elektrod leder.
13. experimentella inställning för inspelning blodtryck och RSNA
- Utrusta en rostfritt stål vibrationsdämpande bord med en enkel Faraday-bur.
Obs: Denna Faraday bur kan konstrueras med en trä ram och aluminium skärm mesh. Elektriskt marken tabell/Faradays bur för att eliminera eventuella elektriska störningar. - Placera en blodtryck radiotelemetry mottagare inom Faraday bur.
- Anslut radiotelemetry mottagaren till den tillhörande adaptern för utgående. Anslut denna adapter till ett system för datainsamling till rekord blodtryck online.
- Löda två kvinnliga stiftskontakter som är avgiftsfritt till de elektrod manliga stiftskontakter (mässing med guld plätering) till ändarna av en Parade, avskärmad PVC isolerad kabel. Löda de motsatta ändarna av denna Parade kabel till banan pluggar. Anslut banan pluggarna till en preamplification headstage (10 X förstärkning).
- Anslut detta förförstärkare till en differential förstärkare. Justera inställningar för att förstärka till nerv signal x10, 000. Justera filterinställningarna som följer: Low cut, 100Hz; Hög klippa, 1000 Hz.
- Placera buren som innehåller musen på radiotelemetry mottagaren ligger inom Faraday bur 48 till 72 timmar efter operationen. Aktivera radiotelemetry sonden att registrera blodtryck signaler.
Obs: Acclimating musen genom att placera buren i setup under loppet av 1 vecka före operation är optimal. - Rulla upp de elektrod ledarna och Anslut stiftskontakter av bipolär elektrod till motsvarande kvinnliga stiftskontakter beskrivs ovan (13,4) att börja spela in RSNA.
- Visa och samtidigt spela in blodtryck signaler online med en dator, medan infusion av fysiologisk koksaltlösning eller lösning av intresse. Spela in data på en miniminivå av 2500 prover per sekund.
14. prova experimentellt protokoll och validering av RSNA Signal
- Att möss är bekväma i deras hem bur, ohämmat med fri tillgång till mat och vatten. Följ institutionella djurvård riktlinjer för kontroll av normalt utseende och beteende.
- Hus på möss i samma temperatur och luftfuktighet kontrollerad rum i vilka RSNA inspelningen kommer att äga rum. Säkerställa intravenös infusion fortsätter som beskrivs ovan.
- Låt minst 30 minuter av stabilisering när djuret är beläget i den inspelningen inställning som beskrivs ovan innan inspelningen en timme av baslinjen blodtryck och RSNA data. Se till att djuret Vila lugnt under inspelning eftersom naturliga rörelser associeras med ökning i sympatisk ton. Obs när djuret rör sig direkt på det digitala spåret under inspelning så detta kan lämnas under analysen.
- Testa den baroreflex Svaren genom att först långsamt injicera en bolusdos av natriumnitroprussid (2,5 µg/g kroppsvikt i en volym av 25 µL saltlösning) i Infusionsslangen. Långsamt spola infarten med ~ 50 µL fysiologisk koksaltlösning. Kontrollera att katetern dödvolymen är avmarkerad. Spela in blodtryck och RSNA för 2 till 5 minuter.
- Injicera långsamt en bolusdos av fenylefrin (20 µg/g kroppsvikt i 25 µL koksaltlösning). Spola med ~ 50 µL fysiologisk koksaltlösning. Kontrollera att katetern dödvolymen är avmarkerad. Spela in blodtryck och RSNA för ytterligare 10 till 15 minuter.
- Kontrollera postganglionära arten av den nerv signalen genom att långsamt injicera en bolusdos av ganglieblockerande blockeraren, hexamethonium (50 µg/g kroppsvikt i 25 µL saltlösning) i Infusionsslangen. Spola med ~ 50 µL saltlösning. Kontrollera att katetern dödvolymen är avmarkerad. Fortsätt inspelning i flera minuter.
- Använda den kvarvarande verksamhet som återstår efter hexamethonium administration som en uppskattning av bakgrundsljud för användning i analysen av RSNA (beskrivs nedan).
- Avliva musen med en överdos av isofluran (stegvis dosen i steg om 0,5 upp till 5%) och fortsätt inspelning RSNA för ytterligare 30 minuter. Obs: Återstående signalen kan också användas som en uppskattning av bakgrundsljud för analys av RSNA.
15. dataanalys
- Använda data förvärv programvara att analysera raw blodtryck och RSNA spår.
- Integrera digitalt och full-wave rätta raw RSNA spårningen använder denna programvara. Välj ”absolut Integral” för integrerad inställningar; Applicera en tid konstant förfalla av 0,1 sekunder6.
- Analysera integrerad RSNA signalen (visas i enheter av µV·s) för varje segment av det experimentellt protokollet. Bortse från delar av inspelningen när djuret råkade vara på väg. Ta minst 3 mätningar baslinjen och experimentella delar av experimentet, respektive.
- Analysera RSNA på högsta och lägsta blodtryck nivå uppnåtts för natriumnitroprussid eller fenylefrin, respektive för att bedöma baroreflex känslighet.
- Genomsnittliga enskilda mätningarna ovan för varje del av experimentella protokollet att ge ett enda värde.
- Kvantifiera RSNA svaret genom att beräkna den procentuella förändringen av RSNA från baslinjen, som betecknas på 100%7. Fullständig statistisk analys som är lämpligt.
Obs: I det här exemplet statistisk analys av svaret från RSNA natriumnitroprussid och fenylefrin slutfördes med en students t -test; betydelse accepterades med P värden < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet beskrivs var överlevnaden 100% - alla möss instrumenterad i denna studie överlevde och återhämtat sig väl efter det kirurgiska ingreppet. Inom 24 timmar efter kirurgisk beredning, alla möss uppförde sig normalt uppvisar typiska äta, grooming och utforskande beteenden. Inga djur visade några tecken på smärta eller ångest vid denna tid. 48 timmar efter kirurgi, spelades en kontrollerbar och tydlig RSNA signal i 10 av de 12 möss. Denna signal bibehölls i dessa möss 72 timmar efter operationen, men en sann RSNA signalen spelades i 7 (70%) av möss av dag 4 och i endast 5 (50%) möss av dag 5 efter operationen. Möss som inte uppvisar en hög kvalitet RSNA signal på grund av elektriska störningar eller kontaminering av elektrokardiogram signaler var fortfarande i god hälsa fram till tidpunkten för dödshjälp.
Menar arteriella trycket i medvetna möss 48 timmar efter operationen var 116±2 mmHg, med en motsvarande genomsnittliga puls på 596±22 bpm (n = 10). Samtidig inspelning av ett representativt urval av blodtryck och RSNA vid denna tid visat klart synliga och karakteristiskt rytmiska skurar av RSNA (figur 2). Den typiska ökningen av RSNA förväntade normala aktiviteter såsom ätande och grooming, som direkt observeras och noteras av personal, var också närvarande (figur 3). Hög kvalitet RSNA spelades även sekventiellt i 50% av mössen under utredning upp till 5 dagar efter kirurgisk beredning (figur 4). Blodtryck och puls förblev stabil för perioden 5 dag och värdena var inte skiljer sig från de vi har spelat in efter upp till 10 dagar av postoperativ återhämtning (tabell 1)8.
För att validera RSNA signalen och verifiera att det verkligen är fångas upp med den arteriell baroreflex, var blodtryck farmakologiskt manipuleras med en intravenös injektion av natriumnitroprussid och fenylefrin. RSNA ökar egenskapt som svar på natrium nitroprussid-inducerad minskning av arteriellt tryck; RSNA tystnade däremot praktiskt taget efter den fenylefrin-inducerad ökningen av arteriella trycket (figur 5). Kvantitativt sett natriumnitroprussid minskade blodtrycket till 62±3 mmHg, som motsvarade till en höjd av RSNA till 77±9% över baslinjenivåer (n = 5; P < 0,05, figur 6). Likaså efter fenylefrin administrering artärtryck nådde 137±6 mmHg, vilket minskade RSNA med 79±2% under basnivån (n = 5; P < 0,05, figur 6). Dessutom eliminerades RSNA helt efter ganglieblockerande blockad med hexamethonium (figur 7), att upprätta postganglionära beskaffenhet RSNA signalen.
Figur 1: konstruktion och placering av den implanterbara nedsatt sympatiska nerv elektroden. Schematiska skildring av design och Rekommenderad placering av den implanterbara nedsatt sympatiska nerv-elektroden. (A) bipolär leder försedda med stiftskontakter och en tredje marken tråd. (B) ledningar är gängade genom polyeten (PE) 90 slangen att skydda den exteriorized blytaket. (C) Design av elektroden spetsen för att skilja bipolär leads från en jordledning. (D) elektrod tip är böjd i en 90° vinkel att underlätta optimal position; nedsatt nerv bunten placeras vinkelrätt mot bipolära avledningarna och vax-baserade laboratorium film isolerar leads från en jordledning som är i kontakt med den underliggande vävnaden. Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant inspelning av artärtryck och nedsatt sympatiska nerv aktivitet (RSNA). Prov spår visar samtidig inspelning av systemiska arteriella blodtrycket, RSNA och integrerad RSNA i en medveten, lugnt vilande mus 48 timmar efter kirurgisk beredning. Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Svar av nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA) till normal fysisk aktivitet. Representativa spår med samtidig inspelning av systemiska arteriella blodtrycket, RSNA och integrerad RSNA i två medvetna möss 48 och 72 timmar efter operation vid baseline och (A) vid påbörjandet av aktiva grooming eller (B) lugnt äta. Den stora pilen betecknar påbörjandet av den fysiska aktiviteten från resten. Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Långsiktiga nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA) signalera lönsamhet. Sekventiell representativa inspelningar av blodtryck och RSNA i en medveten, lugnt vilande mus flera dagar efter kirurgisk beredning. (A) 2 dagar, b 3, c 4 dagar och (D) 5 dagar efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ångan av nedsatt sympatiska nerv aktivitet (RSNA) signalen med den arteriell baroreflex. Representativa inspelning av arteriellt blodtryck och RSNA i en medveten mus i vila under (A) baseline och efter efterföljande intravenös administrering av b natriumnitroprussid följt av (C) fenylefrin. Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kvantitering av nedsatt sympatiska responsivity till arteriella blodtrycket. Kvantitativa svar av arteriellt blodtryck och nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA) farmakologisk manipulation med natriumnitroprussid och fenylefrin. (A) menar artärtryck vid baseline (svart bar; 116±2 mmHg) och efterföljande intravenös administrering av natriumnitroprussid (grå stapel; 62±3 mmHg) och fenylefrin (öppen bar; 137±6 mmHg). (B) motsvarande RSNA svar under natriumnitroprussid (grå stapel; 77±9%) eller fenylefrin (öppen bar; -79±2%). RSNA uttrycks en procentuell förändring från baslinjen, medelvärde ± SEM. * signifikant skillnad från baslinjen (p < 0,05, n = 5). Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Postganglionära naturen av nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA). Representativa spår av arteriellt blodtryck och RSNA ursprungsnivån (A), (B) omedelbart efter ganglieblockerande blockad med hexamethonium och (C) efter slakt. Reproducerad med tillstånd5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Djur-ID | 2D | 3D | 4d | 5d | |
| A | mmHg | 112 | 110 | 108 | 109 |
| BPM | 657 | 551 | 626 | 616 | |
| B | mmHg | 115 | 107 | 111 | 110 |
| BPM | 582 | 652 | 662 | 668 | |
| C | mmHg | 115 | 118 | 113 | 111 |
| BPM | 591 | 599 | 689 | 664 | |
| D | mmHg | 114 | 115 | 116 | 110 |
| BPM | 457 | 513 | 599 | 531 | |
| E | mmHg | 109 | 109 | 103 | 105 |
| BPM | 632 | 687 | 699 | 689 |
Tabell 1: Baslinjen arteriella trycket och hjärtfrekvens medelvärden i instrumenterade möss över 5 dagar efter operation. Reproducerad med tillstånd5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har häri beskrivs, visade och validerat en ny metod för riktad utvärdering av RSNA i medvetna möss, gratis att flytta och vila bekvämt i sina hem burar. Efter kirurgisk implantation av ett arteriellt tryck radiotelemeter, en kvarkateter intravenös infusion och en specialdesignad bipolär RSNA elektrod, möss återhämtat sig från operationen och lämnades opåverkade för 48 till 72 timmar. Möss förblev bekvämt fast i deras hem bur vid alla tillfällen (inklusive experimentella) med obegränsad tillgång till mat, vatten och miljö anrikning. Alla efterföljande experimentella manipulation av prövaren var avlägsen och oro inte djuren. När det gäller kvalitet och tolkning av RSNA signalen bort detta synsätt helt de oönskade och oundvikliga fysiologiska komplikationerna av anestesi och kirurgiskt trauma samt återhållsamhet och andra källor till fysisk och psykisk stress till djur. Således avlägsnades effektivt dessa allvarliga störfaktorer som alltid påverkar tolkningen av sympatiska nerv Aktivitetsmätningar.
Alla möss var vid god hälsa och så tidigt som 24 timmar efter operationen, visas typiska beteenden såsom ljusstyrka, aktivitet, lyhördhet, äta, dricka, grooming samt lekfull och undersökande beteende. Alla djur uppvisade dessa egenskaper och engagerade aktivt med den medföljande miljömässiga anrikningen oavsett huruvida en livskraftig RSNA signal kunde registreras. Även om tiden för återhämtning krävs för att helt återställa normalt blodtryck följande implantation av radiotelemetric sonden är enligt uppgift så länge som 4-7 dagar9, arteriella trycket återgår till normal mycket förr, vilket framgår av värdena redovisas här för blodtryck och hjärtfrekvens. Ja, dessa kardiovaskulära parametrar är likvärdiga med dem som tidigare redovisats i likaså instrumenterade djur som fick upp till 10 dagar att återhämta sig från operation8,10.
Valet att använda radiotelemetric sonder för blodtryck mätning över en vätskefylld kateter var avsiktligt, eftersom detta minskar stress i möss och ger också mer tydliga och tillförlitliga blod och pulssignaler tryck och puls värden11. Med telemetriska teknik till rekord blodtryck innebär ytterligare en fördel eftersom behovet av att ofta spola och upprätthålla den vätskefyllda arteriell kateter med hepariniserad koksaltlösning, som oundvikligen stör djuret, elimineras helt. Också, att närma sig av kirurgiskt exteriorizing, förankra och skydda intravenös kateter och bipolär elektrod leder är perfekt jämfört med andra rapporter som beskriver tillfällig lagring av leads i en subkutan ficka12, sedan vårt tillvägagångssätt undviker även kort re-anestesi och kirurgiska manipulation av djuret omedelbart före experimentella inspelning, vilket skulle utan tvekan stör musen och äventyra kvaliteten och tolkningsbarhet av utsökt känslig autonoma nervsystemet data.
Denna metod ger sann RSNA signaler, vars kvalitet demonstreras av de karakteristiska skurar av elektriska aktiviteten klart urskiljbar från bakgrundsbruset i en avslappnad, lugnt vilande mus. Dessutom visade RSNA typiska lyhördhet för fysisk aktivitet i djuret som grooming och lugnt äta som rapporterats i litteratur13,14. Tanke den karakteristiska ökar i RSNA väntat med naturlig rörelse eller vakenhet av djur, är det således nödvändigt att notera och utesluta dessa tidsperioder för experimentell analys och att fokusera på segment av inspelningen under vilket den djur vilar tyst. Detta hjälper till att förebygga möjlig feltolkning av data. Andra faktorer som kan leda till data feltolkning är elektriskt brus eller störningar, samt signal kontaminering med ECG pulser15. Överdriven rörelse av exteriorized portionr av elektrod leder kan också påverka kvaliteten på signalen RSNA och kan visas som en instabil eller ”vacklande” baslinjen. Ibland dessa källor av signal störningar kan visas och spontant försvinner under en fullständigt klar inspelning och bör undantas från analys5,15,16. En ytterligare faktor är den tid då inspelningarna erhålls. Det är viktigt att notera att blodtryck och RSNA varierar med dygnsrytmen, så det är perfekt att göra experiment på samma tid på dagen för att undvika denna potentiellt störande faktor. I denna studie iakttog vi inte betydande variationer i blodtryck och RSNA på grund av dygnsrytm svängningar som vi spelade in alla parametrar mellan 10: 00 och 18.00 - väl inom dagsljus cykeln i anläggningen djurstallar. En annan viktig komponent i detta betänkande är validering av signalen RSNA, vilken som visat, är verkligen fångas upp med den arteriell baroreflex. Tanke på snabb minskning och behörighetshöjning RSNA parallellt med farmakologiskt inducerad minskning och ökning i systemiska blodtrycket, den arteriell baroreflex var säkerligen intakt - som i sig visar att ocklusiva implantation av den radiotelemetry kateter i en halspulsådern stör inte normala kardiovaskulär funktion. RSNA signalen vid ganglieblockerande blockad med hexamethonium ytterligare virtuella försvinnande bekräftar inspelning av postganglionära RSNA.
Det skulle vara perfekt för att ge en längre efter kirurgi återhämtningsperiod för möss, men vi och andra i det här fältet erkänna att upprätthålla långsiktiga lönsamhet av autonoma nerver i kroniskt instrumenterade djur, särskilt möss, förblir utmanande. Även om signalkvaliteten RSNA minskade under loppet av flera dagar efter operationen, var det fortfarande möjligt att tillförlitligt registrera sant RSNA för minst 3 dagar i följd i alla möss och för upp till 5 dagar i omkring hälften av djuren. Denna bedrift i sig innebär ett genombrott inom autonoma studier på möss. Dessutom maximerar denna metod användningen av dyrbara transgena djur, eftersom det är möjligt att registrera flera experimentella och styra prövningar på samma djur på olika dagar, naturligtvis, vilket möjliggör randomisering av rättegång ordning och ordentlig baslinjen inspelning innan varje experiment17. Det är uppmuntrande att se framgångsrika rapporter av långsiktiga sympatiska nerv inspelningar genomfördes i medvetna gnagare18,19,20 inklusive framsteg i telemetriska nerv inspelning teknik för råttor 15,21. Miniatyrisering av denna teknik för användning i medvetna musen är kommande och under tiden vi strävar efter att förbättra denna teknik för att öka livslängden på sympatiska nervtrådarna att utöka fönstret experimentella och kanske tillåta en längre efter operationen återhämtningstid. Men kvar denna metod en användbar och lätt tillgängliga och prisvärda alternativ/komplement till framtida utveckling i telemetriska nerv inspelningsteknik i möss, som kräver en investering i dedikerad utrustning och regelbundna enhet underhåll.
Behovet av tillförlitliga metoder för bedömning av kardiovaskulär och autonom funktion hos möss har aldrig varit så stor, med tanke på det växande intresset för transgena möss modeller inom biomedicinsk forskning. Stora framsteg har gjorts i många områden i fysiologi, men det är fortfarande långt kvar när det gäller standardisering och optimering av metoder för att utvärdera autonom funktion i musen. I dag finns det en rapport som beskriver mätning av sensorisk nervaktivitet i medvetna mus12. Denna metod beskriver mätning av urinblåsan sensorisk nervaktivitet och innefattar anestesi och kirurgiska manipulation av subkutant placerade katetrar omedelbart före experimentella inspelning samt fysiskt begränsande av möss under kursen i den experimentella protokoll nr12. Dessa faktorer är kända stressfaktorer som undviks helt med den nuvarande strategin, som säkerligen kan skräddarsys för inspelning av en mängd nerver av intresse utöver nedsatt nerver. Mer nyligen, sympatiska nerv mätningar i medvetna möss har rapporterats, dock dessa mätningar bedrivs till stor del timmar efter kirurgisk beredning, med inget omnämnande av smärtstillande administration22. Bortsett från dessa rapporter, har autonom funktion utvärderats annars uteslutande hos sövda möss. En grundlig genomgång av litteraturen ger en mångfald av metoder, timmar långa experimentella varaktighet, bedövningsmedel kombinationer eller doser, mekanisk ventilation och ofta kreativa åtgärder som vidtagits för att upprätthålla mössen i en stat som bär ett visst sken till den fysiologiska (dvs syre blåses direkt mot djurets näsa)23,24,25,26,27,28,29, 30,31. Bland dessa studier är rapporter om blodtryck värderar frånvarande eller bottenlöst låg - under det fysiologiska intervallet av systemiska arteriella trycket2. Detta är problematiskt på många nivåer, men framför allt så när riktig bedömning av autonom funktion i dessa djur är berörda, gett etablerade sambandet mellan blodtryck och autonoma tonen. Bedövningsmedel själva påverkar direkt sympatisk ton, med många rapporter tyder på att anestesi dämpar sympatisk aktivitet. Faktiskt bevis visar att uretan, det mest valda bedövningsmedlet för akut nerv inspelning experiment32, dos beroende minskar RSNA33 och hämmar den arteriella baroreflex34. Andra rapporter tyder däremot att uretan ökar sympatisk tonus35. Beviljats, sådana studier jämför vanligtvis experimentella nervaktivitet som en förändring från en inspelad baslinjen, men förändrad staten av det autonoma nervsystemet på ovan beskrivna villkor onekligen utgör hinder för detektion av diskreta förändringar i nerv verksamhet.
Utmaningen med denna metod ligger främst i den kirurgiska skicklighet som krävs för framgångsrik beredning av musen för medvetna nerv inspelning. Men investeringen i hening dessa färdigheter är mer än kompenseras av kvaliteten och tillförlitligheten av direkta RSNA data produceras. Detta synsätt kringgår helt de begränsningar som utgörs av indirekta bedömningar av autonom kontroll såsom katekolamin plasmanivåer, som är ganska labila i möss och begränsas av mängden blod som kan vara humant insamlade36. Dessutom plasma katekolamin nivå samt farmakologiska autonoma blockad uppskattning övergripande autonoma tone1 i motsats till diskreta bidrag från specifika nerv populationer, som i allmänhet av större intresse. Matematiska utvärdering av autonoma tonen via power spektralanalys av blodtryck och puls spår är användbar för att utvärdera autonom funktion hos försökspersoner, men denna teknik inte kan vara anpassningsbar för möss36,37. Direkt provtagning av nervaktivitet i en medveten, bekvämt vilande mus är därför perfekt som det nära reflekterar naturliga, intakt autonom status i ämnet och underlättar sofistikerade utvärdering av valda nerver till bidrag fysiologiska företeelser av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
S.M.H. stöddes av postdoktorala stipendier från den kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), hjärta & Stroke Foundation i Kanada (HSFC) och Alberta utvecklar Health Solutions (AiHS); J.E.H. stöds av ett bidrag från nationella hjärta, lungor och blod Institute PO1HL-51971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
References
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
