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Chemistry

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

Introduction

durch Scharen von hochaufgelösten Strukturen von mehreren Mitgliedern der Familie im Laufe der letzten zehn Jahre, das strukturelle Verständnis von pentamerem ligandengesteuerten Ionenkanäle (pLGIC) hat sprunghaft gewachsen. Wichtige Faktoren, die zu den aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet geführt sind, die Entdeckung von prokaryotischen pLGIC Kanäle, 1-3 großen Fortschritte in der Expression eukaryotischen Membranprotein, 4-6 und enorme Durchbrüche in der Strukturbestimmung Ansätze. 7 Diese Strukturen auf einen klaren Konsens schaffen die Gesamt Erhaltung der dreidimensionalen Architektur pLGIC. Allerdings sind zwei wichtige Bereiche, die sich hinter nachlaufen scheinen, sind die funktionelle Charakterisierung dieser Kanal Vorbereitungen und die mechanistische Beschreibung der Kanalfunktion.

Gating Konformationsänderungen sind komplex und treten über eine 60 Å Abstand entlang der Länge des Kanals und diese Übergänge werden in großem Umfang moduliert durchMembranlipiden. Insbesondere negativen Lipiden, Cholesterin und Phospholipide wurden , um die Funktion der pLGIC 8-11 zu modulieren gezeigt. Während die genaue Rolle dieser Lipidbestand in Kanalfunktion unbekannt bleibt, würde eine vollständige molekulare Verständnis der Gating diese Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Site-ESR-Spektroskopie (SDSL) und Elektronenspinresonanz (EPR) -Spektroskopie sind die Techniken der Wahl für die Proteindynamik in rekonstituierten Systemen zu studieren. EPR-Spektroskopie wird durch die Molekülgröße (wie NMR) oder die optische Eigenschaft der Probe (wie Fluoreszenzspektroskopie) und dadurch ermöglicht Messungen von Volllängen-Konstrukten rekonstituiert in nativen Lipid Bedingungen beschränkt. Die Technik ist extrem empfindlich und relativ geringen Probenanforderungen (im pico-Mol-Bereich). Beide Aspekte machen die Technik gut geeignet für die Untersuchung großer Membranproteine, die schwer über Milligramm auszudrücken inMengen.

Die Verwendung von EPR - Spektroskopie in Kombination mit ortsgerichtete Spinmarkierung wurde von Wayne Hubbell und Kollegen entwickelt und wurde für die Untersuchung einer Reihe von Proteinarten angepasst. 12-24 EPR - Daten verwendet wurden , Sekundärstrukturen, Veränderungen in dem Protein zu untersuchen , Konformation, membran Einstecktiefen und Protein-Protein / Protein-Ligand-Wechselwirkungen.

Das Verfahren beinhaltet das an den Positionen von Interesse durch ortsgerichtete Mutagenese Cystein-Substitution. Um die ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, ist es notwendig , nativen Cysteinen mit einer anderen Aminosäure zu ersetzen (z. B. Serin) ein Cystein-weniger Vorlage zu erstellen. Bei weitem ist die beliebteste Spin-Label eine Thiol-spezifische MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) Methanthiosulfonat, die durch eine Disulfidbrücke Brücke an das Protein misst. Aufgrund seiner hohen Spezifität, relativ geringe Größe (etwas größer als Tryptophan) und flexikeit des Linkers Region hat sich diese Spin-Label mit einer vergrabenen Cystein sogar ausgezeichnete Reaktivität haben gezeigt worden. Weiterhin Reaktivität zu maximieren, die Markierungsreaktion des Proteins in Detergens-solubilisierten Form. Nach der Abtrennung des überschüssigen Chromatographie Gratis-Spin-Label durch Größenausschluss wird das Protein in Liposomen oder Doppelschicht-ähnlichen Systeme von definierten Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Im allgemeinen wird Cystein Mutagenese auch in den meisten Teilen des Proteins toleriert, und die verhältnismäßig geringe Größe der Spin-Sonde verursacht minimale Störung der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Um sicherzustellen, dass die Modifikation Wildtyp Funktionen beibehalten, die markierten und rekonstituiert Kanäle können durch Patch-Clamp-Messungen untersucht werden.

Das markierte funktionellen Protein wird dann zu spektroskopischen Messungen unterzogen, die drei Arten von Informationen im Wesentlichen liefern: 12,14,15,20,22,23,25-27 Spinsondendynamik durch lineshAffe Analyse; Zugänglichkeit der Sonde an paramagnetischem Entspannungsmittel; und Abstandsverteilung. 27 EPR Abstände werden durch zwei verschiedene Methoden gemessen. Die erste basiert auf dem Continuous Wave (CW) Technik, bei der spektrale Verbreiterung von dipolaren Wechselwirkungen zwischen Spin-Labels (in der von 8 - 20 Å Entfernungsbereich) entstehen. Verwendet wird Entfernung zu bestimmen 28,29 Die zweite ist eine gepulste EPR Verfahren , bei dem Abstandsmessungen bis 70 Å verlängert werden kann. 30-34 im Doppel Electron Electron Resonanz (DEER), Schwingungen in der Spin-Echo - Amplitude analysiert Abstände und Abstandsverteilungen zu bestimmen. Hier wird das Spin-Echo bei der Frequenz der dipolaren Wechselwirkung moduliert. Gemeinsam werden diese Parameter verwendet, um Protein-Topologie, Sekundärstrukturelemente und Protein-Konformationsänderungen zu bestimmen.

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Protocol

1. zielgerichtete Mutagenese und Cys Mutations

  1. Klonierung und Mutagenese
    HINWEIS: GLIC Wildtyp (wt) 35 hat eine einzige native Cystein (C27), die zu Serin mutiert ist ein Cystein-weniger Hintergrund zu erstellen. Cystein- Mutationen werden auf der Cystein-less Hintergrund durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt , unter Verwendung von Primern , die ein Cystein - Kodon an der gewünschten Position 36 tragen.
    1. Mischungs 5 ul 10x Reaktionspuffer, 1 ul 100 ng / & mgr; l Cystein-less GLIC Templat - DNA 35, 0,5 ul von jeweils 40 uM Forward- und Reverse - Primer 36, 1 ul dNTPs (100 mM) und 41 & mgr; l deionisiertes Wasser . Pipettieren Sie die Probe ein paar Mal, es gründlich zu mischen, Spin (6.000 rpm) und schließlich fügen 1 ul DNA-Polymerase.
    2. Stellen Sie den Thermocycler dem folgenden Protokoll:
      1. Denaturierung bei 95 ° C für 4 min.
      2. Denaturierung bei 95 ° C für 30 Sekunden.
      3. annealing bei 55 ºC für 1 min.
      4. Dehnung bei 68 ° C für 10 min (ca. 1 min pro kb Plasmid Länge).
      5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2.2 - 1.1.2.4 für 18 Zyklen.
      6. Eine endgültige Dehnung bei 68 ºC für 10 min.
      7. Haltetemperatur bei 4 ºC
        HINWEIS: Die Glühtemperatur wird berechnet auf der Grundlage des Primers Tm.
    3. 1 & mgr; l DpnI zu dem Reaktionsgemisch, gründlich mischen durch Pipettieren und Spin-Down (6000 rpm) für 1 min. bei 37 ° C für 2 Stunden inkubieren.
  2. Transformation
    1. Thaw E. coli kompetente Zellen auf Eis. Aliquot 30 ul Zellen in eine 14 ml sterile Transformation Röhrchen eingewogen und 1 ul verdaute DNA in die Zellen. Mischen Sie, indem Sie auf der Seite des Rohres tippen. Inkubieren für 20 Minuten auf Eis.
    2. Das Röhrchen wird in einem 42 ° C Wasserbad für 45 Sekunden und dann für 2 Minuten zurück auf Eis legen. In 400 ul sterile SOC-Medium und schütteln Sie die Zellen in einem incubator bei 37 ºC für 1 Stunde.
    3. Platte 100 & mgr; l der Zellen auf LB-Platten, die Kanamycin (50 & mgr; M) und 1% Glucose. Inkubieren Sie die Platten O / N bei 37 ºC.
    4. Ernten Sie eine einzelne Kolonie von der Platte und impfen in 5 ml O / N-Kulturen, die LB / Kanamycin-Medien. Inkubieren Sie die O / N (~ 16 Stunden) bei 37 ° C in einem Inkubator-Schüttler.
    5. Extrahieren von DNA aus der O / N - Kultur durch Minipräparation 37. Quantifizierung der Ausbeute von DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers durch die Absorption bei 260 nm Wellenlänge gemessen wird. 200 ng / ul - Die Konzentration sollte ~ 100 sein. Bestätigen Sie die Anwesenheit der Mutation durch rekombinante Standard - DNA - Sequenzierung Strategien 38,39.

2. GLIC Expression und Reinigung

  1. Transformation
    1. Nach den beschriebenen Schritten in Abschnitt 1.2 Transformation 30 ul C43 kompetenten Zellen mit 1 & mgr; l (~ 100 bis 200 ng / ul) des Plasmids, das das Gen, das für GL enthaltendeIC zusammen mit einem humanen Rhinovirus (HRV) -3C Protease - Schnittstelle (für das Plasmid und Gensequenz, beziehen sich auf den Zusatztext) 35 (aus Schritt 1.2.5).
    2. Platte 100 & mgr; l der Zellen auf LB-Agar-Platten, die 1% Glucose und 50 ug / ml Kanamycin, und inkubieren O / N (~ 16 Stunden) bei 37 ºC in einem Inkubator.
    3. Überprüfen Sie visuell auf Kolonien und sicherzustellen, dass sie nicht über wachsene oder zeigen das Vorhandensein von Satelliten-Kolonien. Siegel Unverzüglich die Platten mit Parafilm und lagern Sie sie bei 4 ° C.
  2. Einrichten O / N-Kulturen und Herstellung von Nährmedien
    1. Wählen Sie eine einzelne isolierte Kolonie mit Schleife Impfen Draht und Transfer in einem 100 ml sterilen Kolben mit 20 ml Luria Broth (LB) Medien mit sterilem 1% Glucose ergänzt und 50 ug / ml Kanamycin. Inkubieren sie O / N (~ 16 Stunden) bei 37 ° C in einem Schüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute.
    2. Autoklav 900 ml Terrific Broth (TB) Medien (Siehe Medien und Pufferzusammensetzung) in 2,8L Fernbach Glasflaschen für die Bakterienkultur in Dampf-Kreislauf bei 121 ºC für 20 min.
  3. Einrichten große Wachstums Kulturen
    1. 100 ml sterilem Kaliumphosphatpuffer (siehe Medien und Pufferzusammensetzung) zu dem autoklaviert TB - Medien. Hinzufügen sterile Glucose (0,2% Endkonzentration), Kanamycin (50 ug / ml) und 10 ml des O / N-Kultur. Bei 37 ° C in einem Schüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute.
    2. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge (OD 600) unter Verwendung Densitometer oder einem Spektrophotometer jede Stunde bis 0,5 (~ 2 h) erreicht. An dieser Stelle die Geschwindigkeit auf 150 Upm reduzieren und die Temperatur auf 18 ºC zu senken. Überwachen Sie die OD 600 alle 30 Minuten , bis er erreicht 0,8 (~ 1 h).
    3. 50 ml Glycerol und weiterhin Schütteln der Kultur , bis die OD 600 erreicht 1,0-1,2 (~ 15 - 30 min).
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen dauert es etwa eine Stunde für die Kultur von 37 ºC 18 ºC zu erreichen. Es ist important daß Glycerin zu der Kultur hinzugefügt wird, nachdem es auf 18 ºC abgekühlt ist.
    4. Induzieren die Zellen mit 200 & mgr; M IPTG (Isopropyl-thio-β-galactosid) und stellen Sie den Schüttler zurück bis 250 Umdrehungen pro Minute und Inkubation weiter für ~ 16 Stunden lang bei 18 ºC.
  4. Proteinaufreinigung
    1. Stellen Sie sicher , dass die OD 600 am Ende von 16 Stunden ist ~ 16 - 18. Ernte die Zellen in 1,0 l - Zentrifugenflaschen durch bei 8.500 xg Spinnen, 4,0 ºC für 15 min. Den Überstand abgießen und wiegen Sie die Flasche mit dem Zellpellet. Berechnen des Gewichts des Pellets auf das Gewicht der leeren Flasche vom Gesamtgewicht abgezogen wird.
      HINWEIS: Die erwartete Zellpellet Gewicht ~ 30 - 35 g / L. Zwar ist es anzumerken, dass es möglicherweise Variabilität in der endgültigen OD 600 und Zellpelletgewicht über Mutanten sein.
    2. Re-suspendieren das Bakterienpellet in 150 ml eiskaltem Puffer A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) pro 1,0 l Kultur. Hinzufügen DNase I (100 ug / ml) und proteasInhibitoren e (Phenylmethylsulfonylfluorid (1 mM), Leupeptin (2,0 & mgr; g / ml), Aprotinin (2,0 & mgr; g / ml) und Pepstatin A (1 ug / ml)).
    3. Homogenisieren der Zellen, indem sie durch eine Zelle Disruptor in einem 4,0 ºC kalten Raum vorbei. Den Vorgang wiederholen dreimal so dass die meisten der Bakterien lysiert wird. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 14.000 × g für 15 min und pipettieren Sie den Überstand und ihre Übertragung in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet, das enthält nicht lysierten Zellen und Einschlusskörper.
    4. Zentrifugieren der Überstand bei 168.000 g für 1 Std. Vorsichtig dekantieren Sie den Überstand, ohne dass die Membranpellet zu stören.
    5. Becken Das Membranpellet aus 1 l Kultur und resuspendieren in Puffer A (mit 10% Glycerol) auf ein Endvolumen von 50 ml. Mit 0,5 g n-Dodecyl--β-D-maltopyranosid (DDM) zu der Membransuspension und nutiert 2 h bei 4,0 ºC.
    6. Nach Solubilisierung Membran, Zelltrümmer aus dem Lysat durch centrifug entfernenation bei 168.000 g für 1 Std. In der Zwischenzeit Amyloseharz vorzubereiten. Übertragung 3 ml Harz mit einer Pipette in ein leeres Polypropylen-Chromatographie Spalte. Das Harz wird mit 10 vorbei Bettvolumina Wasser 3-mal und dann mit 10 Bettvolumina Puffer A, der 0,5 mM DDM.
    7. Nach dem Zentrifugieren nehmen vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und in einen sauberen 50 ml konischen Röhrchen übertragen. Für chargenweise Bindung, fügen dem konischen Röhrchen voräquilibriert Amyloseharz. Binden, das extrahierte Protein zu Amylose-Harz, indem das Gemisch für 2 h bei 4,0 ºC Taumel.
    8. Übergeben Sie die gesamte Schlamm durch eine Chromatographie-Säule und sammeln die Durchfluss. Dann passieren die gesamte gesammelte Durchfluss über das Harz ein zweites Mal Bindung zu maximieren.
    9. Pass 10 Bettvolumina Puffer A mit 0,5 mM DDM, 0,5 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um ungebundene Proteine ​​zu entfernen.
    10. Eluieren des GLIC Protein mit 10 ml Buffer A 40 mM Maltose zusätzlich zu 0,5 mM DDM und 0,05 mM TCEP enthält. TCEP verhindert die Oxidation von Cystein-Seitenketten. Sammeln Sie die gesamte elute.
    11. Man konzentriert das eluierte Protein mit Zentrifugalkonzentrator (Molekulargewicht Cut-off = 50 KDa) auf 4 - 6 mg / ml, und fügen Sie HRV-3C-Protease (200 & mgr; g pro 10 mg Protein) und Inkubation O / N bei 4,0 ºC.
      HINWEIS: Ermitteln der Beendigung der Proteaseverdau , indem die Proben auf SDS PAGE - Gel läuft (siehe Schritt 2.5.5 und Abbildung 1).
  5. ESR-Spektroskopie-Kennzeichnung
    1. Machen Sie etwa 100 & mgr; l von 200 mM Lager (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) MTSL 40 in DMSO und speichern Sie die Lager bei -20 ° C in 25 ul Aliquots.
    2. Verwenden Sie die Protease-verdauten Probe für Spin-Markierung mit MTSL. In 10-fachen molaren Überschuss an MTSL Spin-Label (GLIC Monomer: MTSL 1:10 Molverhältnis). Inkubieren auf Eis für 1 Std. Fügen Sie einen zweiten Schuss von Spin-Label in einem 5-fachen molaren ÜberschussVerhältnis und eine weitere Stunde inkubiert.
      HINWEIS: vergrabene Positionen (mit geringer Spinmarkierungseffizienz, wie unten beschrieben), ein 30 - facher molarer Überschuß an Spinmarkierung hinzugefügt wird und das Protein wird für 6 Stunden inkubiert.
    3. Übergeben Sie die Probe durch eine Größenausschluss Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Säule, die mit Puffer A und 0,5 mM DDM zu trennen das gespaltene MBP und das überschüssige freie Spin-Label aus GLIC Pentamere voräquilibriert ist. Sammle Fraktionen von 1 ml für eine Gesamtmenge von 30 ml der Elution. Pool der Fraktionen , die GLIC Pentamere (Abbildung 1). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers die FPLC auszuführen.
    4. Bestimmung der Konzentration der Probe unter Verwendung eines Spektrophotometers durch die Absorption bei 280 nm Wellenlänge gemessen wird. Molaren Extinktionskoeffizienten und die geschätzte Molekulargewicht von GLIC Monomer 49.850 M -1 cm -1 und 36.380 Da, respectively. Konzentriere die Proteinlösung eine zentrifugale Konzentrators (MolecularGewicht Cut-off = 50 KDa) bis zu einer Endkonzentration von ~ 8-10 mg / ml, und legen Sie es auf Eis. Die Probe ist nun bereit für die Rekonstitution.
    5. Als zusätzliche Qualitätskontrolle, um sicherzustellen, dass die Zubereitung biochemisch homogen ist, führen Sie eine Verringerung (1,0% β-ME) SDS-PAGE-Gel.
      HINWEIS: Die Coomassie - gefärbtes Gel eine einzige Bande bei ~ 33 kDa entsprechend dem GLIC Monomer zeigen sollte (Abbildung 1).
    6. Für die Spin-markierte Mutanten der ausstellenden Dipolverbreiterung vermutet wird , unter-beschriften Sie die Proben in Gegenwart von diamagnetischen Etikett 41. Inkubieren der eluierten-Protein mit 0,1-fach MTSL und Inkubation auf Eis für 1,0 h. Danach werden 20-fachen molaren Überschuss an diamagnetischen Etikett (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) -methan Thiosulfonat.
      HINWEIS: Die diamagnetischen Reagenz hier ist iso-sterische zu dem paramagnetischen Etikett mit einer identischen Markierungschemie eingesetzt.
    7. Inkubieren Sie die Probe auf Eis für 2 Stunden. Übergeben Sie die Probe durch ein size exclusion chromatography Säule, die mit Puffer A und 0,5 mM DDM wie in Schritt 2.5.3 voräquilibriert ist.
  6. Die Effizienz der Spin-Labeling
    1. Spin-Markierungseffizienz wird als das Verhältnis des Spin-Label-Konzentration auf die Konzentration von Cystein-Seitenkette (GLIC-Monomer) definiert. Um die Effizienz der Spin-Markierung der Probe, die integrierte Intensität der Probe bestimmen, werden mit einem Standard bekannter Konzentration unter Verwendung einer Eichkurve verglichen werden. Stellen Lösungen eines EPR-Standard (wie 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) in einem Bereich von Konzentrationen (10-250 uM) durch Auflösen in Wasser.
    2. Messen Sie die EPR-Signal für jede dieser Lösungen und bestimmen die Fläche unter der Kurve (doppelte Integration des EPR-Signal) für jede Konzentration (wie in den Schritten 6.1). Generieren Sie eine Kalibrierungskurve durch den Messbereich in Abhängigkeit von der TEMPO-Konzentration aufgetragen und mit einer geraden Linie passt.
      HINWEIS: Das sindein unter einem Derivat EPR-Signal ist eine bessere Beschreibung der spektralen Intensität als die Spitze-Spitze-Amplitude. der ersten Ableitung EPR-Signal Integration wird das Absorptionsspektrum eine zweite Integrations geben dann die Fläche unter dem Absorptionsspektrum geben (die der Spin-Konzentration proportional ist). Stellen Sie sicher, einen konstanten Ausgangswert sowohl im Low-Bereich und Hochfeldbereich des Spektrums.
    3. Messen der Konzentration des spin-markierte Protein in dem Detergens unter Verwendung eines Spektrophotometers (wie in Schritt 2.5.4). Nun messen die EPR-Signal der Probe und dann den Bereich des Doppelintegral des in Abschnitt 6.1 folgende Schritte EPR-Signal bestimmen. Durch die Verwendung der Eichkurve, bestimmen die Konzentration des Markers, die mit dem gemessenen EPR-Signal entspricht. Berechne die Spinmarkierungseffizienz als das molare Verhältnis von Spin-Label und Proteinkonzentration.

3. GLIC Rekonstitution in Asolectin Membranes

  1. Spülen Sie mit einem sauberen 25 ml - Rundkolben mit 5 ml Chloroform und trocknen Sie den Kolben in einem Strom von N 2 -Gas in der Abzugshaube. Transfer 10 mg Asolectin (Soja polare Extrakt 25 mg / ml Brühe in Chloroform) in den Kolben und trocknen Sie die Lipide unter einem kontinuierlichen Strom von N 2 -Gas.
    HINWEIS: Die Auswahl von Lipiden zur Rekonstitution basiert auf Erkenntnissen aus Experimenten in Abschnitt 4.
  2. Wenn das Chloroform verdampft ist, wird der Kolben in einem Vakuum für 1 Stunde eine vollständige Trocknung zu gewährleisten. 1 ml der Rekonstitution Puffer A zu dem getrockneten Lipid und verwirbeln die Flasche kräftig die Lipid-Pellets in Suspension zu erhalten.
  3. Zur Herstellung von kleinen unilamellaren Vesikeln, beschallen die Lipidsuspension in einem kalten Ultraschallbad, bis das Vesikel-Lösung mehr oder weniger durchscheinend wird und keine Klumpen beobachtet (etwa 10 bis 15 min). Zu dieser Mischung hinzuzufügen DDM zu einer Endkonzentration von 4 mM und 30 min bei RT inkubiert.
<li> Rekonstitution
  1. Fügen Sie das gereinigte Protein aus Schritt 2.5.4 an der Lipid-Mischung.
    HINWEIS: Das Protein-zu-Lipid-Verhältnis von der Art des Experiments abhängt. Für makroskopische Strommessungen wurde eine 1: 10.000-Verhältnis verwendet wird. Für EPR-Studien, die Rekonstitution mit einer höheren Protein-zu-Lipid-Verhältnis durchgeführt (1: 2500), um das Signal zu maximieren. Es ist bereits , daß keine laterale Aggregation bei diesen Konzentrationen gezeigt, 42 beobachtet wird.
    HINWEIS: Typische Arbeitsmenge GLIC für EPR ist ~ 1 mg, obwohl basierend auf der Position sondiert, geringere Mengen als auch funktionieren würde.
  2. Inkubieren Sie die Probe bei 4 ° C für 1 Stunde mit leichter Rotation dann verdünnen Sie die Probe auf 15 ml mit Puffer A
    Hinweis: Dieser Schritt bringt die Waschmittelkonzentration unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration (CMC).
  3. Entfernen Sie das restliche Waschmittel in der Suspension durch Zugabe von Polystyrol-Kügelchen (mit hydrophoben Poren, die Trap-Waschmittel). In 80 mg sauber die Perlen und brüten die liposome Suspension O / N auf einem Nutator bei 4 ºC.
    1. Um die Perlen für die Verwendung vorzubereiten, wiegen ~ 100 mg und sie auf einem 50 ml konischen Röhrchen. In 10 ml Methanol, kräftig schütteln, drehen, um die Perlen bei 8000 × g für 2 min, und dekantiert die Methanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang von Methanol dreimal waschen. Wiederholen des gleichen Verfahrens mit 30 ml entionisiertem Wasser, Waschen dreimal.
  4. Am nächsten Tag übertragen das Liposom zu einer 25 ml Ultrazentrifugenröhrchen ein Säulenfilter mit den Perlen zu entfernen, und weiter um die Probe zu 25 ml verdünnt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 168.000 × g für 2 Stunden. Den Überstand abgießen und resuspendieren Sie das Pellet unter Verwendung von 100 & mgr; l Puffer B

4. Bestimmen Optimale Lipid-Zusammensetzung für die Rekonstitution von FRET

  1. Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) -basierte Assay, um die Membranzusammensetzung zu bestimmen, die das Protein monodisperse hält.
  2. Reinige Gew
  3. Folgende Schritte in Abschnitt 3.2 zur Rekonstitution herzustellen drei verschiedene Proben für jede Lipidzusammensetzung getestet werden, zuerst, Fluorescein-markiertes GLIC in einem Molverhältnis von 1:. 1,500 (Pentamer: Lipid) Zweitens Rhodamin-markiertes GLIC in einem Molverhältnis von 1: 1,500 (Pentamer: Lipid). Drittens mischen Reinigungsmittel solubilisiert Fluorescein und Rhodamin markierten GLIC (1: 1 Molverhältnis). Rekonstituieren diese Mischung in 1: 750 (Pentamer: Lipid-Verhältnis).
    HINWEIS: Wir haben drei Lipidsysteme: Asolectin, POPC: POPG (3: 1 Molverhältnis) und E. coli polare Extrakt. Das Protein-zu-Lipid-Verhältnis Rekonstitution in dem FRET-Experiment ist höher als die für EPR-Messungen verwendet (1: 750 im Vergleich zu 1: 1.500 für EPR-Studien verwendet werden).
  4. Verdünnendann die Probe in eine Quarzküvette Pipette und es in einem Fluorimeter, das Element Liposomensuspension (~ 5 ul in 995 ul Puffer A, um die Lichtstreuung Signal zu reduzieren).
  5. Stellen Sie die Anregungswellenlänge bei 490 (die für den Donor auf den Absorptionsmaxima entspricht: Fluorescein). Mit den Anweisungen des Herstellers, notieren Sie die Emissionsspektren von 500 nm bis 660 nm.
    HINWEIS: Für die fluoreszenzmarkierte GLIC Probe, erhalten Sie einen Peak bei 518 nm (entsprechend Fluoresceinemission) ohne Peak bei 572 nm zu sehen (Rhodamin-Emission entspricht). Für die rhodaminmarkierten GLIC Probe, werden Sie nicht mit einem Peak bei 518 nm statt bei 572 nm die sich aus direkten Anregung von Rhodamin bei 490 nm zu sehen. Für die Probe sowohl Fluorescein und Rhodamin Etiketten, eine Abnahme der Fluoreszenzspitzenintensität und eine entsprechende Erhöhung der Rhodamin peak enthält, ein FRET-Signal, das auf der Membran wahrscheinlich ein Indikator für die laterale Aggregation des Proteins ist.
  6. Überwachen Sie dieAmplitude der Rhodamin - Emission bei 572 nm zu verschiedenen Zeitintervallen (0 bis 24 h) Aufzeichnung zu jeder Stunde für die ersten 6 Stunden und dann nach O / N Inkubation (Abbildung 2). Für jedes Intervall, messen die Fluoreszenzintensität bei 572 nm (für Rhodamin: Ia) und bei 518 nm (für Fluorescein: Id). Subtrahiert den Beitrag der direkten Rhodamin Aktivierung (Probe 2 in Schritt 4.3) von Ia (IAC). Bestimmen Sie die FRET-Verhältnis als Iac / (IAC + Ib). Vergleichen FRET in unterschiedlichen Zeitintervallen und in unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen.
    HINWEIS: Als Kontrolle durchführen Schritt 4.5 und 4.6 für die Proben Detergenz solubilisiert und die Emissionsspektren mit denen aus rekonstituierten Liposomen vergleichen. Verwenden einer äquimolaren Mischung von markierten Proteins in Detergens (beschrieben in Schritt 4.3) und verdünnt in Puffer A mit 0,5 mM DDM ergänzt. Es wird erwartet, dass Waschmittelproben minimal FRET-Signals zeigen.

5. Funktionelle Messungen durch Patch-Clamp-Aufnahmen

  1. bereiten Sie proteoliposomes für Patch-Clamp-Messungen in genau der gleichen Weise wie für EPR-Studien (Abschnitt 3.1).
    HINWEIS: Allerdings, stellen Sie die Protein-Lipid-Verhältnis basierend auf der Art der Messung (Ein-Kanal vs makroskopische Aufnahmen) gemacht. Blitz gefrieren die Proteo in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Typischerweise Rekonstitution GLIC in 1: 10.000 Protein: Lipid (Mol-Verhältnis) für makroskopische Ströme und 1: 50.000 Mol-Verhältnis für einkanalige Aufnahmen.
  2. Thaw Liposomen auf Eis. Spülen Sie einen sauberen Glasobjektträger mit Wasser und Ethanol und vollständig trocknen. Legen Sie eine 10 ul Tropfen der Proteoliposoms auf der Mitte der Folie und trocken O / N in einem Exsikkator bei 4 ° C im Vakuum.
  3. Re-Hydrat die getrockneten Proteo durch Zugabe von 20 & mgr; l Puffer B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH-Wert 7,0) und legen Sie die Folie in einer petriplate auf einem feuchten Filterpapier. Decken Sie die Platte und lassen Sie die Rehydrierung für etwa 2 Stunden, um fortzufahren.
    Hinweis: Dieser Vorgang yields Riese multilamellaren Liposomen, die aus förderlich zu flicken sind.
  4. Ziehen Patch-Pipetten aus dünnwandigem Borosilicatglas Kapillaren (~ 1 bis 2 & mgr; m Spitzendurchmesser) unter Verwendung des Herstellers auf der Pipette Abzieher empfohlene Einstellung. Hitze-Politur mit einem Feuer schmieden zu einem Widerstand von 1,5 - 2MΩ, wenn sie mit Puffer B gefüllt
  5. Füllen Sie die Aufnahme Kammer mit Puffer B mit einer Pipette, und befestigen Sie die Ag / AgCl Masseelektrode. Mit einem 2 ul Pipettenspitze entfernen sanft die Liposomen vom Rand und Transfer 1 & mgr; l der Suspension auf der Aufzeichnungskammer. Warten Sie ein paar Minuten für die Liposomen mit dem Boden absetzen.
  6. Füllen Sie den Patch-Pipette mit Puffer B eine nichtmetallische Spritzennadel mit und bringen Sie es am Verstärkerkopf-Bühne. Identifizieren eines einzelnen isolierten Vesikel zu patchen. Tragen Sie einen leichten Überdruck der Patch-Pipette ein Verstopfen zu verhindern, und die Spitze in die Aufnahmekammer ein.
  7. Bewerben Testpulse die Pipette resista zu messennce und einen Ausgleich für die Pipette Offset-Spannung. Nähern Sie sich dem Vesikel, und wenn der Kontakt hergestellt ist, einen leichten Unterdruck anwenden, um sanft die Vesikel gegen die Patch-Pipette ziehen eine Gigaohm Dichtung zu bilden.
  8. Überwacht den Widerstand der Pipette während des gesamten Prozesses. Sobald die Gigaohm Dichtung gebildet wird, ziehen Sie die Pipette vorsichtig aus dem Liposom entfernt ein Inside-Out-Patch zu bilden. Schalten Sie den Testimpuls ab.
  9. Stellen Sie das Haltepotential auf -100 mV und einen pH-Impuls anzuwenden. Niedriger pH-Wert wurde unter Verwendung von 10 erhalten mM Natriumcitrat-Puffer C (150 mM NaCl, 10 mM Citrat, pH 3,0). (Figur 3)
    HINWEIS: Die Aufnahmen werden mit einer Abtastfrequenz von 10 kHz für makroskopische und 40 kHz für Einzelkanalmessungen vorgenommen.

6. EPR-Messungen

  1. Continuous-Wave EPR
    1. Übertragen Sie die Liposomensuspension aus Schritt 3.2 in einem 200 & mgr; l Rohr und Pellet die Proben unter Verwendung einer Zentrifuge. Entsorgen Sie die supernatant und Probe ist für EPR-Messungen bereit.
      HINWEIS: EPR-Messungen ist es wichtig, so viel Puffer aus der Liposom-Probe wie möglich zu entfernen. Da wässrige Proben absorbieren den elektrischen Teil der Mikrowelle in Heiz- und Empfindlichkeitsverlust führt.
    2. Zur Durchführung Pufferaustausch, Transfer 20 ul Liposomen-Pellet eine Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit. In 180 ul Puffer D (100 mM NaCl, 10 mM Citrat, pH-Wert 3,0) und Inkubation bei 42 ° C Wasserbad für 5 min. Zentrifugieren Sie die Probe, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, und wiederholen Sie den Vorgang dreimal kompletten Pufferaustausch zu gewährleisten.
      HINWEIS: Alternativ können Pufferaustausch, indem die Proben auf mehrere Frost / Tau-Zyklen durchgeführt werden.
    3. Gasdurchlässigen Kunststoff-Kapillaren sind geeignet für Messungen von sowohl Spektrallinie-Formen und Lösungsmittelzugänglichkeit. Tippen Sie auf die Kapillare auf die pelle Proteoliposoms die Probe zu ziehen innen und verschließen Sie das Ende mit Knochenwachs.
      NICHTE: Typische Probenvolumina sind ~ 5 & mgr; l und eine wünschenswerte Spinkonzentration beträgt 150 & mgr; M. Wenn es das Ziel Linienformen allein zu messen ist, kann man 0,4 mm OD Quarz Kapillaren verwenden. Gegebenenfalls könnte eine Pipette zum Füllen der Probe in der Kapillare verwendet werden.
    4. Betreiben Sie das Spektrometer
      1. Führen Sie CW-EPR-Messungen bei RT (292-297 K) auf einem X-Band-Spektrometer mit einem dielektrischen Resonator ausgestattet gemäß der Betriebsanleitung des Herstellers.
      2. Schalten Sie den Wasserkühler, Stromversorgung, und Mikrowelle Brückenkonsole. Ermöglichen das System thermisch für etwa 30 min vor der Aufzeichnung äquilibrieren. Öffnen Sie die Erfassungssoftware.
      3. Legen Sie die Probenröhrchen / Kapillare in den Resonator, stellen Sie sicher, dass der Abschnitt des Rohres mit der Probe in der Mitte des Resonators Hohlraum gefüllt ist. Stellen Sie den Resonator gemäß der Anweisung auf dem Spektrometer Handbuch.
      4. Nehmen Sie die erste Ableitung Absorptionsspektrum von Feld fegen anein einfallender Mikrowellenleistung von 1,0 mW, einer Modulationsfrequenz von 100 kHz und einer Sweep-Weite von 100 G. Bestimme die optimale Leistung für das Experiment durch eine progressive Leistungssättigungsversuchsdurchführung, wo der Peak-to-Peak-Höhe der ersten Ableitung CW EPR-Signal wird in Abhängigkeit von der Quadratwurzel der einfallenden Mikrowellenleistung gemessen.
        HINWEIS: Bei niedrigeren Mikrowellenleistungen, die Intensität des Signals steigt proportional zur Quadratwurzel der Macht, so lange das Gleichgewicht Bevölkerung der Spinzustände ist nicht betroffen. wenn die Leistung weiter erhöht wird, ist jedoch die Spin-Gitter-Relaxation kann nicht mehr das Gleichgewicht Bevölkerung Differenz der beiden Spinzustände und die Signalamplitude beginnt zu Plateau oder aufrechtzuerhalten "sättigen." Ab diesem Punkt kann die Signalamplitude verringern tatsächlich mit Energie zu erhöhen beobachten aufgrund Besetzungsinversion von Spin sättigt. Darüber hinaus ist für verbreiterten Spektren mit umfangreichen Flügeln, wo eine gut definierte flache Basislinie ist nicht viwortlich, erstrecken sich auf 150, um die Wobbelbreite - 200 G Flächenverlust zu verhindern.
      5. Starten Sie eine Modulationsamplitude von 1,0 G. mit der Verwendung
        Hinweis: Dieser Wert ist ein Beispielabhängig und eingestellt, um die Niederfrequenzrauschen in dem Signal zu verringern. Wenn ein zu großer Wert verwendet wird, kann es verzerren oder das Signal zu erweitern.
      6. Stellen Sie die Zeitkonstante und Wandlungszeit auf 20,48 ms, die Zeit bis 20,97 sec fegen, und die Auflösung auf 1024 Punkte.
        HINWEIS: Die Zeitkonstante ist ebenfalls auf der Probe bezogen und wird angepasst, um Hochfrequenzrauschen auszufiltern.
      7. Nach dem ersten Zyklus, stellen Sie in der Mitte des EPR-Signal, das das Center-Bereich und Wobbelbreite so wählen, dass die Spur des Signals und eine ausreichende Basislinie auf beiden Seiten umfasst.
        HINWEIS: Auch das Signal / Rausch-Verhältnis zu verbessern, erhöhen die Anzahl von Abtastungen auf der Stärke des EPR-Signals. Fügen Sie Sweep Breite und Anzahl der Punkte
      8. Messen Sie die Zugänglichkeit des Spin - Label Kollisions - Agenten entspannen O 2 27 in Schritt 6.1.4.4 beschrieben.
        HINWEIS: Bereiten Sie Niedda wie zuvor 26 beschrieben.
      9. Erste perfuse die Probe in den Hohlraum mit N 2 für 5 min (zu spülen , O 2). Messen Sie die Spektren für jede Mikrowellenleistung zwischen 5 - 35 dB in Schritten von 3 dB mit einem Sweep Breite von 30 G.
      10. Dann perfundieren die Probe in den Hohlraum mit Luft für 10 min und Messen der Spektren bei verschiedenen Mikrowellenleistungen (5 - 35 dB in Schritten von 3 dB), wie in dem Schritt 6.1.4.9.
      11. Inkubiere 20 ul Liposomen-Pellet mit 180 ul 50 mM Niedda (in Puffer B oder Puffer D) in einem 42 ºC Wasserbad für 5 min. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Legen Sie die Probe in die Kapillare und legen Sie es in dem Resonatorhohlraum. Wiederholen Sie Schritt 6.1.4.9.
        HINWEIS: Das Prinzip des Experiments ist, dass die Wechselwirkung mit paramagnetischem Relaxing Agenten durch Heisenspinaustausch würde die Sättigung des Signals und Besetzungsinversion zu verhindern. Wasserlösliche Niedda und lipidlöslichen molekularen O 2 werden als Reporter für Wasser (sowohl Bulk- und intraprotein Vorräume) und Membran exponierten Stellen auf dem Protein, verwendet wurden .
  2. Datenanalyse:
    HINWEIS: Die Analyse der EPR - Daten umfasst die folgenden Schritte: 14,22,23,25-27
    1. Berechne die Beweglichkeit der Spinsonde (& Dgr; H o -1), als das Inverse der mittleren Linienbreite der ersten Ableitung Absorptionsspektrum. & Delta; H o -1 reflektiert die Bewegungsfreiheit oder die Dynamik der Sonde.
    2. Berechnen der Zugänglichkeit Parameter (П), die eine Schätzung der Zugänglichkeit der Sonde zu anderen paramagnetischen collisional entspannenden Mitteln ist, unter Verwendung von unten beschriebenen Schritte.
      HINWEIS: Wechselwirkung der Spin-Sonde mit paramagnetischem entspannenden Mittelverbessert die Relaxationsrate Spin-Gitter (T 1) des Nitroxid durch Spinaustausch Heisen. 27
      1. Schätzen Sie die Zugänglichkeit Parameter (П) von der Stromsättigungsexperimenten (6.1.4.8) , in dem die vertikale Spitze-Spitze - Amplitude der Mittellinie der ersten Ableitung EPR - Spektrum bei unterschiedlichen Mikrowellenleistung gemessen. 25 Plot die Amplitude des Signals als eine Funktion der Quadratwurzel der Mikrowellenleistung und Passform mit der folgenden Gleichung 27.
        Gleichung 1
        HINWEIS: wobei A die Amplitude des Signals, ist ein Maß für die Homogenität der Sättigung der Resonanzlinie (die in der Regel zwischen 0,5 und 1,5), I ein Skalierungsfaktor ist, P die einfallende Leistung und die stellt die Wert, bei dem die erste Ableitung Amplitude ist die Hälfte seines ungesättigten Wert.
  3. berechnen AP 1/2 P - Werten in Gegenwart (O 2 oder Niedda) und in Abwesenheit von paramagnetischem relaxing Mittel (mit N 2 durchbluteten). Berechnen Sie die Zugänglichkeit Parameter (П) unter Verwendung der Gleichung:
    Gleichung 2
    ANMERKUNG: wo P 1/2 Referenz und & Delta; H o Referenz die Hälfte der maximalen Leistungssättigungswert und der mittlere Linienbreite sind jeweils für den Bezugsstandard (wie DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

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Representative Results

Biochemische Charakterisierung von Spin-markierten GLIC Mutants

Nach dem oben beschriebenen Protokoll würde typischerweise GLIC-MBP-Fusionsprotein in dem Bereich von 10 ergeben - 12 mg / l Kultur. Obwohl dieser Wert in den verschiedenen Mutanten unterscheiden können, besonders für innerhalb des Proteins verborgen Positionen kann die Ausbeute erheblich beeinträchtigt werden. In diesen Fällen kann es erforderlich Kulturvolumina Scaling-up. Die Spaltung des Fusionskonstrukts von HRV3C Protease aus O / N der Einfachheit halber erfolgt. Durch Ausführen der Proben auf SDS PAGE-Gel, fanden wir, dass diese Spaltung innerhalb von 30 abgeschlossen ist - 60 min. (1A). Gereinigtes GLIC auf Gelfiltrationssäule Größenausschluss eluierte überwiegend als Pentamer mit einem Retentionsvolumen von 11,3 ml. Der MBP Fraktion eluiert bei 15 ml und Aggregate eluieren im Hohlraumvolumen der Säule (~ 7,0 ml). Der Spin-Label kommt andas Ende der Elution (~ 24 ml) (1B)

FRET - basierten Assay für in verschiedene Membranlipide Aggregation von GLIC Rekonstituiertes Überwachung

FRET-Assay wird verwendet , um zu bewerten Aggregation von GLIC Pentamere in rekonstituierten Vesikel (kamen zusammen in einem Abstand <50 Å auf der Membran). 2 zeigt Daten aus GLIC wt (mit C27, markiert mit entweder Fluorescein oder Tetramethylrhodamin) und rekonstituiert in E .coli polare Lipide, POPC: POPG (3: 1), PAPST: POPG (3: 1) oder Asolectin. Die Fluoreszenzmessungen zeigen , dass GLIC Rekonstitution in Asolectin kein FRET zeigte und sogar Einfrieren / Auftauen der Probe (Bedingungen bekannt Aggregation zu fördern) erzeugt minimale Veränderung der FRET - Ebenen 43. Aus diesem Grund ist Asolectin das Lipidgemisch der Wahl für die funktionelle und spektroskopische Messungen in diesen stu verwendetstirbt.

Makroskopische Verhalten von GLIC in Proteoliposomen

Funktionelle Eigenschaften von gereinigtem GLIC werden durch Patch-Clamp-Messung in rekonstituierte Proteo gekennzeichnet. Repräsentative makroskopische aktuelle Aufnahme von wt GLIC von einem Inside-Out - Patch in Reaktion auf einen pH-Sprung ist in Abbildung 3 gezeigt , bei -100 mV Potential hält, auf pH 3,0 Pufferschalt schnell erzeugt Einwärtsströme aktiviert wird . (10-100 ms) , dass Zerfalls bis etwa 10% der Peak - Amplitude innerhalb von Sekunden 43 (1 - 3 sec, Abbildung 3). Currents erholen sich von diesem makroskopischen Zerfall oder Desensibilisierung durch auf einen neutralen pH-Schalt zurück. Während Kanäle in der inside-out-Patch im Bad pH-Wert auf Veränderungen empfindlich waren, gab es keine Wirkung der pH-Änderung in der Pipettenlösung (Daten nicht gezeigt) darauf hindeutet, dass GLIC überwiegend in einer dire orientiert warction, so dass die extrazelluläre Domäne des Bades / Lösung Tauscher im Patch konfrontiert.

Strukturänderungen während der Kanalaktivierung

Bei RT kann die Spin-Sonde mehrere rotameren Konformationen annehmen, und die spektrale Linienform ist empfindlich nicht nur auf die Bewegung von Spin-Label-Seitenketten relativ zu dem Peptid-Rückgrat, sondern auch Rückgrat Schwankungen und der globalen Proteinbewegungen. Daher können Veränderungen in EPR Linienformen sich als ein ausgezeichnetes diagnostisches Werkzeug sein Protein Konformationsänderungen zu überwachen. 4 zeigt Spektren an Position L241 (17) R1 in der extrazellulären hydrophoben Bereich des Poren Auskleiden M2 Region (Position hervorgehoben als schwarze Kreise in Figur 4 Inset) bei pH 7,0 und pH 3,0. Die Spektren zeigen Unterschiede unter den beiden Bedingungen, sowohl in der Signalamplitude und das Ausmaßmotional Verbreiterung. Wie bei funktionellen Messungen 42, sind die Konformationsänderungen durch die EPR - Signale auch berichtet , vollständig reversibel. Spektrale Verbreiterung betroffen ist sowohl von den Bewegungseinschränkungen der Sonde und durch dipolare Kopplung. Um zu bestimmen, ist der Beitrag der beiden, L241 (17) co-markiert mit einem diamagnetischen Spin-Label. Die unter markierten und voll-markierten Spektren bei pH 7,0 und pH 3,0 im Vergleich (4B). Das Ausmaß der Dipolverbreiterung an dieser Position nimmt ab, wenn die Kanäle unter markiert sind, die zwischen Spin-Labels unter den verschiedenen Untereinheiten eine Wechselwirkung angibt.

Figur 5 zeigt Spektren für zwei Positionen auf der M4 - Helix , die an der Peripherie des Kanals angeordnet ist. & Dgr; H o -1 ist als das Inverse der mittleren Linienbreite (gezeigt in Einschub) gemessen. Da die Nitroxid Rotationsbewegung reduziert wird, wie bei der Bildung erlebtvon tertiären oder quaternären Kontakte, die Linienbreite zunimmt (und somit & Dgr; H o -1 nimmt ab) für eine bestimmte Bewegungsgeometrie. Im Gegenteil, wird als eine Erhöhung in & Delta; H o -1 strukturellen Bewegungen zu einer Erhöhung in der Sonde Bewegungsfreiheit führt reflektiert. F312R1 ist mobiler, während R296R1 unbeweglich ist, im Einklang mit ihrer exponierten und sehr Umgebungen beschränkt sind.

Auf der Grundlage der Zugänglichkeit Parameter kann ein Spin-Label an eine bestimmte Position auf dem Protein als eine der folgenden klassifiziert werden: vergrabene innerhalb des Proteinkerns entweder an unzugänglichen Wasser oder Lipide, die auf der Oberfläche einer wässrigen Lösung ausgesetzt wird, oder auf die belichtenden Oberfläche Lipiden (5 und 6). Die Zugänglichkeit Parameter für eine Reihe von aufeinander folgenden Websites erhalten wird, kann dann die Sekundärstruktur einer Region zu bestimmen, verwendet werden, sondieren Bereiche von Protein-ProteinKontakt, messen die Neigung eines Proteins in der Membran, schätzen die Eintauchtiefe der Grenzflächenschleifen und Wasser Vorräume und lipidgebundene Taschen innerhalb der Transmembran - Helices. 26 Als Beispiel Einschalten Sättigungskurven in Figur 6 zeigen , zu identifizieren , die F312R1 hat eine relativ höhere P 1/2 für O 2, im Vergleich zu R296R1, die Seitenketten an der Position F312 darauf hindeutet sind lipid ausgesetzt. Darüber hinaus ist auch F312R1 zugänglicher Niedda im Vergleich zu R296R1 Einklang mit seiner Lage an der Lipid-Wasser-Grenzfläche. Auf der anderen Seite, L180R1 in der Schleife C-Region der extrazellulären Domäne ist beweglich und zugänglich Niedda, im Einklang mit seiner Lage in einem mit Wasser exponierten Schleife.

Sondendynamik und Zugänglichkeit Daten an einer vorgegebenen Position bereitzustellen lokalen strukturellen Informationen über die spezifische Position innerhalb des Gesamtprotein-fache. Diese Parameter bestimmt für alinear Sequenz der Reste entlang des Proteins kann weiter unter Verwendung analytischer Ansätze auf Fourier-Transformations-Verfahren auf der Basis analysiert werden. Diese Analysen sind nützlich, periodische Schwankungen in EPR Umweltparameter zu bewerten und zu führen, bei der Vorhersage und Ausrichten Sekundärstrukturen. Für ein bestimmtes Protein Segment eine diskrete Fourier-Leistungsspektrum P (ω) Transformation als Funktion des Winkels zwischen benachbarten Positionen (ω) in diesem Segment berechnet wird. Dieser Plot wird dann verwendet , um die Hauptwinkelfrequenzkomponente des Spektrums zu bestimmen , und im Vergleich zu den erwarteten (ω) Werte für eine α-Helix (80-120 º) oder β-Stränge (150-180 º).
Gleichung 3
wobei P ( 'ω') die Fourier - Leistungsspektrum als Funktion der Winkelfrequenz ω - Transformation, n ist die Anzahl der Rückstände in dem Segment ist Umgebungsparameters an der Position. P ('ω') wird für den Wert ω ausgewertet = Gleichung 6 dass maximiert P ( 'ω').

Ferner wird eine Periodizität Indexparameter (gibt die Bedeutung der vorhergesagten Sekundärstruktur) als ein Verhältnis der Fläche unter dem Leistungsspektrum für den Winkel berechnet, der von der Gesamtfläche des Spektrums eines gegebenen Strukturelement darstellt. Ein Schiebefenster-Verfahren wird dann verwendet, um den Anfang und das Ende eines gegebenen Sekundärstrukturelement zu identifizieren. Die relative Orientierung dieses Segment in Bezug auf den Rest des Proteins kann aus der Richtung der P ( "ω ') Augenblick geschätzt werden.

Für α-Helix:

Gleichung 4

Gleichung 5

Diese Verfahren wurden mehrere Systeme erfolgreich angewendet dreidimensionale Topologien zu bestimmen und vorherzusagen Konformationsänderungen zugrundeliegenden Proteinfunktion 14,23,24,41,44-53.

Die Bestimmung Entfernung Verteilung von EPR

Inter-Untereinheit Nitroxid Abstände können von Elektron-Elektron-dipolare Wechselwirkungen bestimmt werden. Im CW-EPR, wie in Abbildung 4, Wechselwirkungen durch den Raum dipolar gezeigt führen zu Spektralverbreiterung und sind eine Funktion der Nähe zwischen den Etiketten. Für Entfernungen bis zu ~ 15 bis 20 Å, das Ausmaß der Erweiterung (im Vergleich zwischen vollständig markierten Spektren und der unter-markierten Spektren) auf halb quantitativ abzuschätzen Distanzen verwendet werden, unter Verwendung vonFourier Dekonvolutionsverfahren. 28,29

Inter-Untereinheit Entfernungen (<50 Å) kann unter Verwendung von Doppel Elektron-Elektron - Resonanz (DEER) Verfahren gemessen werden. 30-34 ROTWILD Daten werden in Waschmittelproben oder zubereitetes in Nanoscheiben gesammelt , da der mit diesen Messungen in Liposomen assoziiert Begrenzungen 54. Für spin-markierten Proben in Detergens (~ 100 & mgr; M) in Puffer A mit 0,5 mM DDM, 30% (Gewicht / Volumen) Glycerin für Kryokonservierung verwendet. Die dipolare Zeitentwicklung Daten werden bei 83 K mit einem Standard - DEER Vierpuls - Protokoll (π / 2) mw1-τ1- (π) mw1-τ1- (π) mw2-τ2- (π) mw1-τ2-Echo - 55 erhalten auf einem gepulsten EPR-Spektrometer arbeitet bei Q-Band-Frequenz (33,9 GHz). Die Pulslängen (π / 2) MW1 und (π) MW1 sind 10 und 20 nsec bzw. und 40 nsec für (π) MW2. DEER Signale werden dann korrigiert Hintergrund ein 3D-homogenen backgro vorausgesetztund und analysiert durch die Tikhonov Regularisierung 31,56 zu bestimmen durchschnittlichen Entfernungen und Verteilungen in der Ferne.

Die intramolekulare Abstände für eine repräsentative Position in M4 (F314R1) durch DEER - Experimente bei pH 7,0 bestimmt sind in 7 gezeigt Da gibt es fünf Spin-Labels des GLIC Pentamer sind mindestens zwei Abstände zu erwarten. einer entsprechend den benachbarten Untereinheiten und die andere aus nicht benachbarten Untereinheiten, obwohl zusätzliche Peaks von alternativen rotameren Spinorientierungen entstehen können. Die HIRSCH Signal abklingt und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitsverteilungen dargestellt. Die erste Kurzstrecken Peak (~ 42A) darstellt Abstände zwischen benachbarten Untereinheiten, und der zweite Peak (~ 53A) entspricht dem nicht benachbarten Abstand. Der Peak für die diagonalen Abstand erscheint in kürzeren Abstand zu sein, und dies wahrscheinlich, weil zuverlässige Messungen über 60 Å zu unterschätzsind nicht unter den experimentellen Bedingungen aufgrund technischer Schwierigkeiten mit Grundkorrektur möglich.

Abbildung 1
Abbildung 1. Biochemische Charakterisierung Spin-markierten GLIC Mutants. (A) Repräsentative Gelfiltrationschromatogramm von Spin-markierten-GLIC nach der proteolytischen Spaltung von MBP - Tag. Die Spitzen entsprechen Pentamer und frei MBP GLIC. (B) SDS-PAGE zeigt ungeschnitten monomeren GLIC-MBP - Fusionsprotein (vor Gelfiltration) und MBP und GLIC Fraktionen aus der Gelfiltration gepoolt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 FR ET - basierte Assay zur Überwachung des Aggregatzustandes von GLIC Rekonstituiertes in verschiedene Membranlipiden. FRET - Messungen sind für die Proben nach O / N Rekonstitution (links) und nach dem Einfrieren / Auftauen der Proben (rechts) gezeigt. (Geändert von der ursprünglichen Abbildung). 43 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. makroskopische Verhalten von GLIC in Proteoliposomen. In einer von innen nach außen Rekonstitution herausgeschnitten Patch von Asolectin Vesikel wird GLIC durch pH - Wert aktiviert , um eine schnelle Lösung Tauscher Sprünge am . Die Kanäle sind zu sehen ~ 10 msec zu aktivieren, in und mit einer Zeitkonstante von 1 desensibilisieren - 3 sec. (Geändert von der ursprünglichen Abbildung). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Strukturänderungen während der Kanalaktivierung. (A) Repräsentative CW-EPR - Spektren für eine Position in der Pore M2 Helix Futter, zeigt Änderungen in der Amplitude und Linienformen in Reaktion auf pH - Änderungen. In jedem Fall sind die Spektren mit der Gesamtzahl von Spins normalisiert. Spin-markierte Position wird als schwarzer Kreis dargestellt. Nur zwei Untereinheiten sind aus Gründen der Klarheit gezeigt. (B) EPRspectra zeigen Dipolverbreiterung durch Spin-Spin - Wechselwirkungen. Die Spektren in gestrichelten Linien wurden unter markierten Kanäle (in Gegenwart von diamagnetischen Etiketten) und in durchgezogener Linie wurden aus vollständig markierten Kanälen. Der Einschub zeigt eine Überlagerung von amplituden normalisierte Spektren. unter vollständig markierten Bedingungen verbreitern hochbeleuchtet durch die Pfeile. Scanbreite beträgt 150 G. (modifiziert von der ursprünglichen Abbildung). 36 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Rückstands Spezifische Umweltmessparameter von Power Sättigung. Die Messungen der spektralen Breite (& Delta; H 0) und die Lösungsmittelzugänglichkeit (P 1/2) für zwei gegensätzliche Positionen in der M4 Helix der Transmembran - Domäne. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

Figur 6
Abbildung 6. Umwelt von ein Vertreter Loop - C - Rest in der extrazellulären Domäne von GLIC. Spin-normalisierte CW-Spektren und die entsprechenden Zugänglichkeit Messungen für L180R1. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7. Abstandsmessungen durch Pulsed-EPR - Ansätze (DEER). GLIC Struktur den Standort von Phe314 und entsprechenden Cß-Cß Distanzen für die benachbarten und nicht benachbarten Untereinheiten zeigt. CW-Spektren für diese Position auf der rechten Seite angezeigt. Hintergrund subtrahiert Hirsch- Echointensität gegen die Evolution Zeit aufgetragen ist und passen modellfreien Tikhonov Regularisierung für Proben in Reinigungsmittel. Die entsprechende inter-spin Abstandsverteilung (rechts).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

EPR-Spektroskopie hat sich als beispiellos strukturellen Ansatz zu sein, bei der Quantifizierung von Konformationsänderungen in Membranproteinen in einer nahezu nativen Umgebung. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, einen Blick in die molekularen Details der Proteindynamik, die in der hochauflösenden Strukturen von Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie verdeckt sind. Allerdings ist es wichtig, die technischen Grenzen dieses Ansatzes zu berücksichtigen, die die allgemeine Anwendbarkeit auf andere Systeme beeinflussen können und auch auf dem Weg die möglichen experimentellen Hindernisse im Auge zu behalten. Wir diskutieren einige dieser Aspekte unten zusammen mit den empfohlenen Strategien zur Fehlerbehebung.

Zu den häufigsten Fragen, die man trifft, mit einer Technik, in deren Rahmen umfassende Mutations Störungen die geringe Ausbeute und schlechte oligomere Stabilität des Proteins sind. Dieser Aspekt wird weiter verstärkt, wenn mit komplexen multimeren Membranproteine ​​wie Ionenkanäle arbeiten. Es ist therefore von entscheidender Bedeutung, diese beiden biochemischen Aspekte bevor sie sich auf eine weit verbreitete Mutagenese zu optimieren. Wir fanden , dass die Expression von toxischen GLIC Mutanten besser in C41 und C43 - Stämme BL21 - Zellen 3,36 Weitere toleriert wird, um die nach der Induktion Temperaturabsenkung . 15 - 18 ºC, die IPTG - Konzentration auf 100 & mgr; M abnimmt, einschließlich 5% Glycerin während der Induktion scheint mit Senkung der Proteinaggregation vermutlich durch eine Verlangsamung der Geschwindigkeit der Proteinexpression und reduziert das Ausmaß der Fehlfaltungen zu helfen. Cystein-Mutationen an bestimmten Stellen (insbesondere im Permeationsweg) wurden die konstitutive Aktivität des Kanals zu erhöhen gezeigt und diese Mutanten wahrscheinlich höhere Hürden bei der Expression darstellen. Die Verwendung von zweiwertigen Porenblocker (10-25 mM Ba 2+) während der Induktion mildert Toxizität und verbessert das Zellwachstum 57 Diese Strategien in vielen Fällen als wirksam erwiesen haben bei Ausbeute zu verbessern, Proteinaggregation zu senken und Oligo verbessern.meric Stabilität. 36,58

Ein weiterer wichtiger Schritt in SDSL ist die Effizienz des Markierungsprozesses. Während Oberfläche exponiert Cysteine ​​kein Problem in MTSL Reaktivität (> 90% Markierungsausbeuten) darstellen sollen, Positionen, wo die Cystein-Seitenketten vergraben sind und unzugänglich können höhere spin-Label-Konzentrationen und längere Inkubationszeiten. Eine Erhöhung der Spin-Label-Konzentration bis 30-fachen molaren Überschuss und Inkubation O / N bei 4 ° C hilft, die Markierungseffizienz bei der Verbesserung. Darüber hinaus ist es auch wichtig, um die Spektren der markierten Cys-less Vorlage zur Messung der Hintergrundbeitrag zu bestimmen. Für Websites, die schlecht markiert (<10%) sind, überwältigt das Hintergrundsignal die Gesamtspektren. Während die Spin-Markierungseffizienz Bestimmung beachten, dass die Genauigkeit durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst wird, das Probenvolumen, Proben Kapillardurchmesser, Positionierung der Kapillare innerhalb des Resonators, Hohlraumtemperatur und Resonator Q umfassenWert (das ist das Verhältnis der Energie in der es über die Energie dissipiert out gespeichert ist). Es muss diese Bedingungen identisch zwischen den Proben und Standard zu halten genommen werden. Weiterhin sollte, dass für immobile Seiten zu beachten, in denen die Spektren intrinsisch breit sind, sinkt die Genauigkeit der Markierungsmessung. Alternativ Liquid Chromatography-Flugzeit-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LCT-ESI-MS) können direkt verwendet werden Molekülmasse zu bestimmen, und folglich Markierung von Effizienzen. Jedoch ist die MS-Empfindlichkeit für Proben in Waschmitteln und dicht gefalteten Membranproteinen beeinträchtigt.

Nachdem die Mutanten als homogene Population gereinigt werden, ist es wichtig, die Funktionalität der Herstellung zu ermitteln. Patch-Clamp Messungen von Spin-markierten Mutanten in Schlüsselregionen des Kanals wird zeigen, die Wirkung der Störung auf Ligandenaffinitätschromatographie und Kanal-Gating. Alternativ Kanaleigenschaften können in Schwarz L untersucht werdenIPID Membranes (BLM) 59 oder durch Proteoliposomen in Oozyten und Messströme durch Zweielektroden - Spannungsklemmen einzuspritzen. 59-61 Wird festgestellt, daß das Cystein - Substitution und die Spin-Label an bestimmten Positionen Ligand-Empfindlichkeit oder Gating - Kinetik des alter Kanäle, experimentellen Bedingungen (Ligand-Konzentration, Modulatoren, Lipide Zusammensetzung) können in geeigneter Weise die Konformation unter Untersuchung zu stabilisieren variiert werden. Ferner ist es anzumerken, daß EPR-Messungen unter stationären Bedingungen hergestellt werden und ändert sich daher in schnelle Kinetik des Kanals weniger wahrscheinlich die strukturelle Interpretation auswirken.

Eindeutig ein großer Vorteil dieser Technik ist die Fähigkeit Kanaldynamik in Membranen definierter Zusammensetzung zu studieren und um direkt die Sonde, wie Lipid-vermittelte Effekte auf Dynamik Kanalfunktion verändert. Jedoch ist eine Einschränkung, dass einige Lipidzusammensetzungen laterale Aggregation der Kanäle o verursachenn die Membran und daher muss die Eignung von Lipiden ermittelt werden. 45 für Bedingungen , die Ursache Aggregation tun, Senken Protein-zu-Lipid - Verhältnis, die Rekonstitution bei einer niedrigeren Temperatur durchgeführt wird , und eine Verkürzung der Dauer der Rekonstitution Zeit kann helfen , die Kanäle bei der Aufrechterhaltung monodisperse 62 Alternativ können die Kanäle in Nanoscheiben rekonstituiert werden, die durch einen Ring von amphipathischen Membrangerüstprotein (Apolipoprotein A1). 63 durch Optimierung des Molverhältnisses des Kanalproteins, Lipidbestandteile, und Membrangerüstprotein umgeben Lipidanordnungen nanoskaligen sind, es ist möglich, eine homogene und monodispersen Population von Einzelkanaleinheiten in einzelne Nanoscheiben eingebaut zu erreichen. Dieses System hat mehrere zusätzliche Vorteile, dass die Nanoscheiben optisch klar sind und sowohl einen einfachen Zugang zu der intrazellulären bereitzustellen und extrazellulären Seite der Membran.

Schließlich auf der Ebeneder EPR-Messungen, könnte man mit CW-EPR-Spektren konfrontiert werden, die nicht einfach zu interpretieren sind, insbesondere für Positionen Mehrkomponenten- Spektren anzeigt. Solche Konformationsheterogenität von langsam Austausch Konformationen des Proteins oder / und mehrere Orientierungen des Spin-Label in einer gegebenen Proteinkonformation entstehen können. Den relativen Beitrag der beiden Szenarien zu bestimmen ist nicht trivial und kann die Verwendung von alternativen Spin-Label - Derivate oder wechselnden Versuchstemperatur, 64 Druck, 65 Feldstärken / Mikrowellenfrequenz, 66 oder durch Osmolyts Störung erforderlich. 67

Weiterhin ROTWILD Messungen in Liposomen können durch eine Anzahl von Faktoren begrenzt, einschließlich der geringeren Empfindlichkeit, höheren Beitrag Hintergrund von verbesserten intermolekularen Wechselwirkungen führt und eine Verringerung der meßbare Abstandsbereich (<50 Å). In der Regel für längere Distanzen (<50 Å), gibt es großeer die Unsicherheit in den Breiten der Abstandsverteilung aufgrund unzureichender dipolar Evolutionszeiten. Allerdings haben die Verwendung von Q - Band (34 GHz) Mikrowellenfrequenz und die Kennzeichnung mit einem bifunktionellen Spinmarkierung (mit reduzierter Eigendynamik) wurden einige dieser Einschränkungen gezeigt zu lindern. 54 Reconstituting in Nanoscheiben hat auch ROTWILD Empfindlichkeit gezeigt worden enorm verbessern , indem Hintergrund Beiträge Abnahme , die von inter Dipolwechselwirkung entsteht. 15

Trotz dieser Einschränkungen, SDSL / EPR-Untersuchungen, insbesondere in Systemen mit wenigen nativen Cysteine ​​haben, bewiesen bemerkenswert informativ. Zukünftige technologische Fortschritte sind darauf ausgerichtet, diese leistungsfähigen Ansatz zur Anpassung komplexer menschlicher Kanäle zu studieren, wo mutiert nativen Cysteine ​​nicht durchführbar sein kann. In diesem Zusammenhang, die Entwicklung von alternativen Markierungsstrategien wie solche auf Basis von ortsspezifischen Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren, 68 oder synthesis von Etiketten , die gegenüber anderen Aminosäuren ausgerichtet sind, erscheinen 69 große Versprechen zu halten.

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Acknowledgments

Wir sind sehr dankbar, dass die aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chakrapani Labor für das kritische Lesen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (1R01GM108921) und der American Heart Association (NCRP Scientist Entwicklungszuschuss 12SDG12070069) und SC unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

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References

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Chemie Ausgabe 113 pLGIC Cys-loop-Rezeptoren Membranlipiden die Rekonstitution patch-clamp Proteoortsgerichtete Spinmarkierung EPR-Spektroskopie Kanaldynamik Lipid-Protein-Wechselwirkung
Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle
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Basak, S., Chatterjee, S.,… More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

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