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Chemistry

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

Durante a última década, a compreensão estrutural dos canais iónicos dependentes de ligando pentaméricos (pLGIC) tem crescido nos trancos e barrancos, devido a multidões de estruturas de alta resolução de vários membros da família. Principais fatores que levaram aos avanços atuais no campo incluem a descoberta de canais pLGIC procariotas, 1-3 grandes avanços na expressão de proteína de membrana eucariótica, 4-6 e avanços tremendos em abordagens de determinação de estrutura. 7 Estas estruturas proporcionam um consenso claro sobre a conservação geral da arquitectura tridimensional de pLGIC. No entanto, duas grandes áreas que parecem arrastar para trás são a caracterização funcional destas preparações de canal e a descrição mecanicista da função do canal.

Gating alterações conformacionais são complexos e ocorrem a uma distância de 60 Â ao longo do comprimento do canal e estas transições são extensivamente modulada pelalípidos de membrana. Em particular, lipidos negativos, colesterol e fosfolípidos foram mostrados para modular a função de pLGIC 8-11. Embora o papel preciso destes constituintes lipídicos na função do canal permanece desconhecida, uma compreensão completa molecular de gating exigiria estudar estes canais no seu ambiente nativo. Spin Dirigido local Labeling (SDSL) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) espectroscopia são as técnicas de escolha para o estudo da dinâmica de proteínas em sistemas reconstituídos. espectroscopia de EPR não é limitada pelo tamanho molecular (como é NMR) ou a propriedade óptica da amostra (como é a espectroscopia de fluorescência), e, assim, permite medições de construções de comprimento total reconstituído em condições nativas lipídicas. A técnica é extremamente sensível e tem requisitos relativamente baixos de amostra (no intervalo de pico-molar). Ambos estes aspectos tornar a técnica bem adequado para o estudo de proteínas de membrana grandes que são difíceis de expressar em mais miligramaquantidades.

A utilização de espectroscopia de EPR em combinação com marcação de spin dirigida ao local foi desenvolvido por Wayne Hubbell e colegas, e foi adaptado para o estudo de uma variedade de tipos de proteínas. 12-24 os dados de RPE foram utilizados para investigar estruturas secundárias, mudanças na proteína conformação, profundidades de inserção de membrana, e proteína-proteína / interacções proteína-ligando.

O método envolve a substituição de cisteína nas posições de interesse por mutagénese dirigida ao local. Para garantir a etiquetagem específica do local, é necessário substituir cisteínas nativas com outro aminoácido (por exemplo., Serina) para criar um modelo de cisteína-menos. De longe, o marcador de spin mais popular é um MTSL específico tiol-: (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metanotiosulfonato que se liga à proteína através de uma ponte de ligação de dissulfureto. Devido à sua elevada especificidade, de tamanho relativamente pequeno (ligeiramente maior do que o triptofano), e flexidade da região de ligante, este marcador de spin tem sido mostrado ter uma excelente reactividade, mesmo com uma cisteína enterrado. Além disso, para maximizar a reactividade, a reacção de marcação da proteína é realizada sob a forma detergente solubilizado. Depois da separação do excesso de rotação livre do rótulo por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, a proteína é reconstituído em lipossomas ou sistemas que mimetizam a bicamada lipídica de composição definida. Em geral, cisteína mutagênese é bem tolerada na maioria das partes da proteína, e o tamanho relativamente pequeno do spin-sonda provoca perturbação mínima para as estruturas secundárias e terciárias. Para assegurar que a modificação retido funções de tipo selvagem, os canais marcados e reconstituídas pode ser avaliado por medidas de patch-clamp.

A proteína marcada-funcional é então sujeita a medições espectroscópicas, que fornecem essencialmente três tipos principais de informação: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-sonda dinâmica por lineshanálise de macaco; acessibilidade da sonda para agentes de relaxamento paramagnético; e a distância de distribuição. 27 distâncias EPR são medidos por duas abordagens diferentes. A primeira baseia-se na técnica de onda contínua (CW), onde alargamento espectral resultantes de interacções dipolares entre spin-etiquetas (no 8 - gama de distâncias de 20 Â). É usada para determinar a distância 28,29 A segunda é uma pulsado-EPR método em que as medições de distância pode ser estendida até 70 Å. 30-34 em Duplo Electron Electron ressonância (DEER), oscilações na amplitude spin-echo são analisados ​​para determinar distâncias e distribuições de distância. Aqui o eco de spin é modulado na frequência da interação dipolar. Juntos, estes parâmetros são utilizados para determinar a topologia de proteína, elementos estruturais secundários, e as alterações da proteína-conformacional.

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Protocol

1. Site-Directed Mutagênese e Cys Mutações

  1. Clonagem e mutagénese
    NOTA: GLIC tipo selvagem (wt) 35 tem uma única cisteína nativo (C27), que é mutado para serina para criar um fundo cisteína-menos. Mutações de cisteína são introduzidos no fundo de cisteína-menos por mutagénese dirigida ao local, utilizando iniciadores que transportam um codão de cisteína na posição 36 desejada.
    1. Dissolvem-se 5 ul de tampão 10x reacção, 1 ul de 100 ng / mL de cisteína-menos GLIC molde de ADN 35, 0,5 ul de cada um de 40 uM para a frente e o iniciador inverso 36, 1 ul de dNTPs (100 mM), e 41 ul de água desionizada . Pipetar a amostra algumas vezes para misturá-lo completamente, rotação (6.000 rpm) e, finalmente, adicionar 1 ml da DNA polimerase.
    2. Definir o termo-cycler com o protocolo seguinte:
      1. Desnaturação a 95 ºC durante 4 min.
      2. Desnaturação a 95 ºC durante 30 segundos.
      3. recozering a 55 ºC durante 1 min.
      4. Alongamento a 68 ºC durante 10 minutos (cerca de 1 min por comprimento plasmídeo kb).
      5. Repita os passos 1.1.2.2 - 1.1.2.4 durante 18 ciclos.
      6. A alongamento final a 68 ºC durante 10 min.
      7. Segurando a temperatura a 4 ºC
        NOTA: temperatura de recozimento é calculado com base no iniciador de Tm.
    3. Adicionar 1 ml de Dpnl à mistura de reacção, misturar bem por pipetagem, e girar para baixo (6.000 rpm) durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Transformação
    1. Thaw E. As células competentes de E. coli em gelo. Aliquota de 30 uL de células para um tubo de 14 ml estéril transformação e adicionar 1 ul de ADN digerido para as células. Misture tocando no lado do tubo. Incubar durante 20 min em gelo.
    2. Colocar o tubo em banho-maria 42 ºC por 45 segundos e, em seguida, colocá-lo de volta no gelo por 2 min. Adicionar 400 mL de mídia SOC estéril e agitar as células em uma incubator a 37 ºC durante 1 hora.
    3. Placa de 100 ul de células em placas de LB contendo canamicina (50? M) e 1% de glucose. Incubar as placas O / N a 37 ºC.
    4. Colher uma única colónia da placa e inocular em 5 ml O / N culturas contendo meio LB / canamicina. Incubar a cultura D / N (~ 16 horas) a 37 ºC num agitador incubadora.
    5. Extrair DNA a partir da cultura O / N por minipreparação 37. Quantificar o rendimento de ADN utilizando um espectrofotómetro através da medição da absorvância a 260 nm de comprimento de onda. A concentração deve ser de ~ 100-200 ng / mL. Confirmar a presença da mutação por meio de estratégias de sequenciamento de DNA recombinante convencionais 38,39.

2. Expressão e Purificação GLIC

  1. Transformação
    1. Seguindo as etapas descritas na secção 1.2, transformar 30 ul de células competentes C43 com 1 pi (~ 100-200 ng / ul) do plasmídeo contendo o gene que codifica para a GLIC, juntamente com um local de clivagem de rinovírus humano (HRV) -3c protease (para a sequência de plasmideo e de gene, referem-se ao texto suplementar) 35 (a partir do passo 1.2.5).
    2. Placa de 100 ul de células em placas de LB-agar contendo 1% de glucose e 50 ug / ml de canamicina, e incubar-los S / N (~ 16 horas) a 37 ºC numa incubadora.
    3. Verifique visualmente para colônias e garantir que eles não estão sobre-crescido ou mostrar a presença de colónias por satélite. Prontamente selar as placas com parafilme e armazená-los a 4 ºC.
  2. Configurando O / N-culturas e Preparação de meio de crescimento
    1. Escolher uma única colónia isolada usando fio inoculando loop e transferir para um balão estéril de 100 ml contendo 20 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com glucose meios estéreis 1% e 50 ug / ml de canamicina. Incubar los O / N (~ 16 horas) a 37 ºC num agitador a 250 rpm.
    2. Media autoclave de 900 ml Terrific Broth (TB) (Veja Mídia e composição do tampão) em 2,8frascos de vidro G Fernbach para a cultura bacteriana no ciclo de vapor a 121 ° C durante 20 min.
  3. A criação de grandes culturas de crescimento
    1. Adicione 100 ml de tampão fosfato de potássio estéril (Veja Mídia e composição do tampão) para a mídia TB autoclavado. Adicionar estéril de glucose (0,2% concentração final), canamicina (50 ug / ml), e 10 ml da cultura D / N. Incubar a 37 ° C num agitador a 250 rpm.
    2. Verifique a densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda (OD600) usando um densitómetro ou espectrofotómetro a cada hora até atingir 0,5 (~ 2 h). Neste ponto, reduzir a velocidade para 150 rpm e abaixe a temperatura para 18 ºC. Monitorar a OD a 600 a cada 30 min até atingir 0,8 (~ 1 h).
    3. Adicionar 50 ml de glicerol e continuar agitando a cultura até que a DO600 atinge 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      NOTA: Sob estas condições, leva cerca de uma hora para a cultura para atingir 18 ºC de 37 ºC. É important que o glicerol é adicionado à cultura, após o arrefecimento para 18 ° C.
    4. Induzir as células com 200 mM IPTG (isopropil-tio-β-galactósido) e redefinir o agitador de volta para 250 rpm e incubar mais para ~ 16 horas a 18 ºC.
  4. Protein Purification
    1. Certifique-se de que o OD 600 no final de 16 horas é de ~ 16 - 18. colher as células em frascos de centrífuga de 1,0 L por centrifugação a 8500 xg, a 4,0 ° C durante 15 min. Decantar o sobrenadante e pesar o frasco com o sedimento celular. Calcule o peso da pelete, subtraindo o peso da garrafa vazia do peso total.
      NOTA: O peso da pelota celular esperado é ~ 30 - 35 g / L. No entanto, é de notar que pode haver variação na final DO600 e sedimento celular peso entre mutantes.
    2. Re-suspender o sedimento bacteriano em 150 ml de gelo-tampão A frio (NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,4) por 1,0 L de cultura. Adicionar ADNase I (100 ug / ml) e proteasinibidores E (fluoreto de fenilmetilsulfonilo (1 mM), leupeptina (2,0 jig / ml), aprotinina (2,0 ng / ml) e pepstatina A (1 ug / ml)).
    3. Homogeneizar as células fazendo-as passar através de um disruptor de células numa sala fria 4,0 ºC. Repetir o processo de três vezes de modo a que a maior parte das bactérias são lisadas. Centrifugar as células a 14.000 xg durante 15 min e pipeta-se o sobrenadante para fora e transferir para um tubo de centrífuga limpo. Descartar o pellet, que contém células não-lisadas e corpos de inclusão.
    4. Centrifuga-se o sobrenadante a 168000 xg durante 1 h. Cuidadosamente decantar o sobrenadante sem perturbar o pelete de membrana.
    5. Reúnem-se os sedimento de membranas a partir de 1 L de cultura e re-suspender em tampão A (suplementado com 10% de glicerol) até um volume final de 50 ml. Adicionar 0,5 g de n-dodecilo-β-D-maltopiranósido (DDM) para a suspensão de membrana e nutar durante 2 horas a 4,0 ° C.
    6. Após solubilização da membrana, remover os detritos celulares a partir do lisado por centrifugção de 168.000 g durante 1 hora. Enquanto isso preparar a resina de amilose. Transferência de 3 ml de resina, utilizando uma pipeta para uma coluna de cromatografia de polipropileno vazio. Lava-se a resina fazendo passar 10 volumes de leito de água 3 vezes e, em seguida, com 10 volumes de leito de tampão A contendo 0,5 mM de DDM.
    7. Após centrifugação, o sobrenadante cuidadosamente levar a cabo utilizando uma pipeta e transferir para um tubo de 50 ml limpo. Para por lotes de ligação, adicione resina de amilose pré-equilibrada com o tubo cônico. Ligar a proteína extraída a resina de amilose por nutação a mistura durante 2 h a 4,0 ° C.
    8. Passar toda a suspensão através de uma coluna de cromatografia e recolher o fluxo de passagem. Em seguida, passe todo o fluxo através da resina recolhida durante um segundo tempo para maximizar a ligação.
    9. Passa 10 volumes do leito de tampão A com DDM 0,5 mM, 0,5 mM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), para remover as proteínas não ligadas.
    10. Eluir a proteína GLIC com 10 ml de Buffer A contendo maltose 40 mM além DDM 0,5 mM e TCEP 0,05 mM. TCEP evita a oxidação das cadeias laterais de cisteína. Recolher todo o eluato.
    11. Concentra-se a proteína eluida usando concentrador centrífugo (Peso molecular cut-off = 50 kDa) a 4-6 mg / ml e adicionar protease de HRV-3C (200 ug por 10 mg de proteína) e incubar O / N a 4,0 ° C.
      NOTA: Verificar a conclusão da digestão protease, executando as amostras em gel de SDS PAGE (Veja o passo 2.5.5 e Figura 1).
  5. Dirigido local Spin-rotulagem
    1. Adicione cerca de 100 ul de estoque de 200 mM de (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) MTSL 40 em DMSO e armazenar o material a -20 ° C em alíquotas de 25 ul.
    2. Use a amostra digerida-protease para o spin-marcação com MTSL. Adicionar excesso de 10 vezes molar de marcador de spin-MTSL (GLIC monómero: MTSL na razão molar 01:10). Incubar em gelo durante 1 hr. Adicione um segundo tiro de marcador de spin em um excesso molar de 5 vezesproporção e incubar durante mais uma hora.
      NOTA: Para posições enterradas (com baixa eficiência de marcação de spin, descritos a seguir), a 30 vezes o excesso molar do marcador de spin é adicionada e a proteína é incubada durante 6 h.
    3. Fazer passar a amostra através de uma coluna de exclusão de tamanho rápido Protein Liquid Chromatography (FPLC), que é pré-equilibrada com Tampão A e DDM 0,5 mM para separar a MBP clivada e o excesso de livre rotação do rótulo de pentâmeros GLIC. Recolher fracções de 1 ml para um total de 30 ml de eluição. Reunir as fracções contendo pentâmeros GLIC (Figura 1). Siga as instruções do fabricante para executar o FPLC.
    4. Determinar a concentração da amostra, utilizando um espectrofotómetro através da medição da absorvância a 280 nm de comprimento de onda. Coeficiente de extinção molar e o peso molecular estimado de monómero GLIC são 49850 M-1 cm-1 e 36380 Da, respectivamente. Concentra-se a solução de proteína utilizando um concentrador centrífugo (MolecularLimiar de peso = 50 kDa) até uma concentração final de ~ 8-10 mg / ml e colocá-lo em gelo. A amostra está agora pronto para a reconstituição.
    5. Como uma verificação adicional de qualidade para assegurar que a preparação é homogénea bioquimicamente, executar um (β-ME a 1,0%) em gel de SDS-PAGE redutor.
      NOTA: O gel de Coomassie corados deve mostrar uma única banda a ~ 33 kDa correspondente ao monómero GLIC (Figura 1).
    6. Para os mutantes marcadas com rotação suspeitos de apresentar alargamento dipolar, sub-rotular as amostras na presença de etiqueta 41 diamagnético. Incubar a-proteína eluída com MTSL 0,1 vezes e incuba-se em gelo durante 1,0 h. Em seguida, adicionar um excesso molar de 20 vezes de etiqueta diamagnético (1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metano tiossulfonato.
      NOTA: O reagente utilizado aqui diamagnético é iso-estérica para o marcador paramagnético com uma química idêntica rotulagem.
    7. Incubar a amostra em gelo durante 2 hr. Passe a amostra através de um sizcoluna de cromatografia de exclusão e que é pré-equilibrada com Tampão A e DDM 0,5 mM como no Passo 2.5.3.
  6. Eficiência da rotulagem de spin
    1. eficiência de rotulagem da rotação é definido como a razão entre a concentração-marcador de spin para a concentração de cisteína da cadeia lateral (GLIC-monómero). Para determinar a eficiência de spin-etiquetagem da amostra, a intensidade integrada da amostra irá ser comparado com um padrão de concentração conhecida, utilizando uma curva de calibração. Adicione soluções de um padrão EPR (tais como 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinyloxyl: TEMPO) em uma gama de concentrações (10 - 250 um) por dissolução em água.
    2. Medir o sinal EPR de cada uma destas soluções e determinar a área sob a curva (dupla integração do sinal EPR) para cada concentração (como descrito nos Passos 6.1). Gerar uma curva de calibração representando graficamente a área medida como uma função da concentração de TEMPO e encaixe com uma linha recta.
      NOTA: O sãoum sob um sinal de EPR derivado é uma melhor descrição da intensidade espectral do que o pico de amplitude de pico. Integrando o primeiro derivado do sinal EPR dará ao espectro de absorção, uma segunda integração dará então a área sob o espectro de absorção (que é proporcional à concentração de rotação). Certifique-se de uma linha de base constante tanto no baixo campo e região de alto campo do espectro.
    3. Medir a concentração da proteína marcada por rotação no detergente utilizando um espectrofotómetro (como no passo 2.5.4). Agora medir o sinal EPR da amostra e, em seguida, determinar a área da dupla integral do sinal EPR seguindo os passos na secção 6.1. Ao utilizar a curva de calibração para determinar a concentração da etiqueta que corresponde ao sinal EPR medido. Calcula-se a eficiência de marcação de spin como a razão molar de marcador de spin e concentração de proteína.

3. GLIC Reconstituição em Asolectin Membranas

  1. Lavar de 25 ml de fundo redondo limpo balão com 5 ml de clorofórmio e seca-se o balão numa corrente de N 2 gasoso no exaustor de fumos. Transferem-se 10 mg de (asolectin soja extracto polar de 25 mg / ml em clorofórmio) para o balão e secar os lipidos sob uma corrente contínua de N 2 gasoso.
    NOTA: A escolha de lipídios para reconstituição é baseada nos resultados de experimentos na seção 4.
  2. Quando o clorofórmio foi evaporado, colocar o balão no vácuo durante 1 hora para assegurar a secagem completa. Adicionar 1 ml de Tampão A reconstituição para o lípido seco e o frasco vigorosamente vortex para obter o sedimento em suspensão lipídica.
  3. Para preparar pequenas vesículas unilamelares, sonicar a suspensão de lípido num sonicador de banho frio até a solução de vesículas torna-se mais ou menos translúcidos e não há aglomerados são observados (cerca de 10 - 15 min). A esta mistura, adicionar DDM a uma concentração final de 4 mM e incubar à TA durante 30 min.
<li> Reconstituição
  1. Adicionar a proteína purificada a partir do passo 2.5.4 à mistura de lípidos.
    NOTA: A relação proteína-to-lipídico depende do tipo de experimento. Para medições de correntes macroscópicas, uma proporção de 1: 10.000 é usado. Para os estudos de EPR, a reconstituição é feito a uma proteína maior a proporção de lípidos (1: 2500) para maximizar o sinal. É previamente demonstrado que a estas concentrações, nenhuma agregação lateral é observada 42.
    NOTA: quantidade de trabalho típico de GLIC para EPR é de aproximadamente 1 mg, embora com base na posição sondado, valores mais baixos iria funcionar tão bem.
  2. Incubar a amostra a 4 ºC durante 1 h com rotação suave, em seguida, diluir a amostra de 15 ml com tampão A.
    NOTA: Este passo traz a concentração de detergente abaixo da concentração micelar crítica (CMC).
  3. Remover o detergente residual na suspensão pela adição de esferas de poliestireno (com poros hidrofóbicos que o detergente armadilha). Adicionar 80 mg de limpar as contas e incubar os liposome suspensão O / N em um nutator a 4 ºC.
    1. Para preparar os grânulos para uso, pesar ~ 100 mg e transferi-los para um tubo de 50 ml. Adicionar 10 ml de metanol, agitar vigorosamente, girar as contas a 8.000 xg por 2 minutos, e decantar o metanol. Repita esse processo de metanol lavar três vezes. Repetir o mesmo processo com 30 ml de água desionizada, lavagem três vezes.
  4. No dia seguinte, o lipossoma transferir para um tubo de ultracentrifugação de 25 ml utilizando um filtro de coluna para remover as esferas e diluir a amostra de 25 ml. Centrifugar as amostras a 168.000 xg durante 2 hr. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento utilizando 100 pi de tampão B.

4. Determinar Optimal Lipid Composição para reconstituição por FRET

  1. Usar uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) com base na análise para determinar a composição de membrana que mantém a proteína monodispersa.
  2. purificar wt
  3. Seguindo os passos na secção 3.2 para reconstituição, preparar três amostras diferentes para cada composição lipídica a ser testado; Primeiro, fluoresceína marcado GLIC numa razão molar de 1:. 1500 (pentâmero: lípido) Em segundo lugar, GLIC numa proporção molar marcado com rodamina de 1: 1,500 (pentâmero: lípido). Em terceiro lugar, misturar detergente solubilizado fluoresceína e rodamina marcado GLIC (proporção de 1: 1 molar). Reconstituir esta mistura em 1: 750 (pentâmero: lípido) proporção.
    NOTA: Foram utilizados três sistemas de lipídios: asolectin, POPC: POPG (proporção de 3: 1 molar), e E. extracto polar coli. A proporção de proteína para a reconstituição de lípidos no ensaio FRET é maior do que o utilizado para as medições de EPR (1: 750, em comparação com 1: 1500 usado para estudos de EPR).
  4. Diluira suspensão de lipossomas (para reduzir o sinal de dispersão de luz; ~ 5 uL em 995 uL de tampão A), em seguida, pipetar a amostra numa cuvete de quartzo e colocá-lo em um fluorímetro.
  5. Definir o comprimento de onda de excitação a 490 (o que corresponde aos valores máximos de absorção para o doador: fluoresceína). Utilizando as instruções do fabricante, registar o espectro de emissão de 500 nm a 660 nm.
    NOTA: Para a amostra GLIC marcado com fluoresceína, você vai ver um pico em 518 nm (correspondente a emissão de fluoresceína) sem pico a 572 nm (correspondente a emissão de rodamina). Para a amostra GLIC marcada com rodamina, você não vai ver um pico a 518 nm, mas sim a 572 nm resultante da excitação direta de rodamina a 490 nm. Para a amostra contendo ambas as fluoresceína e rodamina rótulos, uma diminuição da intensidade de pico de fluoresceína e um aumento correspondente no pico de rodamina é um sinal de FRET, que é provável que um indicador de agregação lateral da proteína na membrana.
  6. monitorar oamplitude da emissão de rodamina a 572 nm a vários intervalos de tempo (0-24 h) de gravação em cada hora durante as primeiras 6 h e, em seguida, após incubação S / N (Figura 2). Para cada intervalo, medir a intensidade de fluorescência a 572 nm (para a rodamina: Ia) e a 518 nm (para a f luoresceina: Id). Subtrair a contribuição de activação rodamina direta (amostra 2 na etapa 4.3) a partir de Ia (IAC). Determinar a proporção de FRET como Iac / (Iac + Ib). Compare FRET em intervalos de tempo diferentes e em composições de lípidos diferentes.
    NOTA: Como um controlo, efectuar o passo 4.5 e 4.6 para amostras de detergente solubilizado e comparar o espectro de emissão para aqueles a partir dos lipossomas reconstituídos. Utilize uma mistura equimolar de proteína marcada em detergente (descrito no passo 4.3) e diluir em tampão A, suplementado com 0,5 mM de DDM. Espera-se que as amostras de detergente irá mostrar FRET sinal mínimo.

5. As medições funcionais por Gravações patch-clamp

  1. Prepare proteoliposomes para medições de patch-clamp em exatamente da mesma forma como para estudos de EPR (Seção 3.1).
    NOTA: No entanto, ajustar a proteína: lípido proporção com base no tipo de medição a ser feita (de canal único vs gravações macroscópicas). Flash-congelar os proteolipossomos em azoto líquido e armazenar a -80 ºC até à sua utilização. Normalmente, reconstituir GLIC em 1: 10.000 proteína: lipídio (razão molar) para as correntes macroscópicas e 1: 50.000 razão molar para gravações de canal único.
  2. lipossomas descongelamento em gelo. Lavar a lâmina de vidro limpa com água e etanol e secar completamente. Colocar uma gota de 10 ul do proteolipossoma no centro da lâmina e ó seco / N em um exsicador a 4 ° C sob vácuo.
  3. Re-hidratar os proteolipossomas seca por adição de 20 ul de Tampão B (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0) e colocar a lâmina numa petriplate no topo de um papel de filtro húmido. Cobrir a placa e permite a rehidratação a prosseguir durante cerca de 2 h.
    NOTA: Este processo Yields gigantes lipossomas multi-lamelares que são favoráveis ​​para corrigir a partir.
  4. Puxe pipetas de patch dos capilares de paredes finas de vidro de borosilicato (~ 1-2 mm de diâmetro ponta) usando Fabricante de configuração recomendada no extrator pipeta. Heat-polonês usando um fogo-forjar a uma resistência de 1,5 - 2MΩ quando preenchido com tampão B.
  5. Encha a câmara de gravação com tampão B, utilizando uma pipeta e anexar o eléctrodo de terra Ag / AgCl. Utilizando uma ponta de pipeta de 2 uL, gentilmente desalojar os lipossomas a partir da borda e transferência de 1 ul da suspensão na câmara de gravação. Aguarde alguns minutos para que os lipossomas para liquidar o fundo.
  6. Encha o patch-pipeta com tampão B, utilizando uma agulha de seringa não-metálicos e montá-la no amplificador cabeça-stage. Identificar uma vesícula single-isolado para corrigir. Aplicar uma pressão positiva leve para evitar que o patch-pipeta de entupimento, e insira a ponta na câmara de gravação.
  7. Aplicar impulsos de teste para medir o trabalho a prova pipetance e compensar o deslocamento de tensão pipeta. Aproxime-se da vesícula, e quando o contato é feito, aplique uma ligeira pressão negativa para puxar delicadamente a vesícula contra a pipeta patch para formar um selo gigaohm.
  8. Monitorizar a resistência da pipeta durante todo o processo. Uma vez que o selo é formado gigaohm, retirar-se a pipeta com cuidado de distância a partir do lipossoma para formar um remendo de dentro para fora. Desligue o pulso de teste.
  9. Definir o potencial segurando a -100 mV, e aplicar um pulso de pH. Um pH baixo foi obtido utilizando 10 mM de citrato de sódio Tampão C (NaCl 150 mM, citrato 10 mM, pH 3,0). (Figura 3)
    NOTA: As gravações são feitas com uma frequência de amostragem de 10 kHz para macroscópica e 40 kHz para medições de canal único.

6. Medidas de EPR

  1. Continuous-Wave EPR Spectroscopy
    1. Transferir a suspensão de lipossomas a partir do passo 3.2 para um tubo de 200 ul e sedimentar as amostras utilizando uma centrifugadora. Descartar o supernatant e amostra está pronta para medidas de RPE.
      NOTA: Para medições de EPR, é importante remover tanta tampão da amostra de lipossomas quanto possível. Uma vez que as amostras aquosas absorver a parte eléctrica do forno de microondas, resultando em aquecimento e perda de sensibilidade.
    2. Para levar a cabo a troca de tampão, transferir 20 ul de pelete de lipossomas utilizando uma pipeta para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 180 mL de tampão D (NaCl a 100 mM, citrato 10 mM, pH 3,0) e incuba-se a 42 ° C banho-maria durante 5 min. Centrifugar a amostra, remover o sobrenadante utilizando uma pipeta e repita o processo três vezes para assegurar a troca completa de tampão.
      NOTA: Como alternativa, a permuta de tampão pode ser feita submetendo as amostras a vários ciclos de congelamento / descongelamento.
    3. Gás permeáveis ​​capilares de plástico são adequados para medições de ambos line-formas espectral e acessibilidade solvente. Toque no capilar para o proteolipossomos peletizada para desenhar a amostra dentro e selar a extremidade com cera de osso.
      NÃOE: típica volumes de amostras são ~ 5 mL e uma concentração de spin desejável é 150? M. Se o objetivo é medir formas de linha sozinho, pode-se usar tubos de OD de quartzo capilares 0,4 mm. Se necessário, uma pipeta pode ser utilizada para encher a amostra no interior do capilar.
    4. Operar o espectrômetro
      1. Realizar medições CW-EPR à temperatura ambiente (292-297 K) em um espectrômetro de banda X equipado com um ressonador dielétrico de acordo com o manual de instruções dos fabricantes.
      2. Ligue o refrigerador de água, fornecimento de energia, e consola de ponte de microondas. Permitir que o sistema equilibrar termicamente durante cerca de 30 min antes da gravação. Abra o software de aquisição.
      3. Inserir o tubo de amostra / capilar para dentro do ressonador, certifique-se de que a secção do tubo cheio com a amostra está no centro da cavidade de ressonância. Sintonize o ressonador de acordo com as instruções no manual do espectrômetro.
      4. Grave o primeiro espectro de absorção derivado de varredura de campo emuma potência incidente microondas de 1,0 mW, a modulação de frequência de 100 kHz e uma largura de varredura de 100 G. Determine a potência ideal para o experimento através da realização de um experimento de saturação de potência progressiva, onde a altura do pico-a-pico do primeiro CW derivado sinal EPR é medida como uma função da raiz quadrada da energia de microondas incidente.
        NOTA: Para potências de microondas inferiores, a intensidade de sinal aumenta proporcionalmente à raiz quadrada da energia desde a população de equilíbrio dos estados de spin não é afectada. No entanto, se o poder é ainda maior, o relaxamento spin-estrutura já não pode manter a diferença de população de equilíbrio dos dois estados de spin e a amplitude do sinal começa a estagnar ou "saturar". Para além deste ponto, a amplitude de sinal pode realmente diminuir com o aumento do poder observar devido à inversão de população de sates rotação. Além disso, para os espectros alargado com asas extensas onde uma linha de base plana bem definida não é VIvel, aumentar a largura da varredura para 150-200 G para evitar a perda de área.
      5. Comece com o uso de uma amplitude de modulação de 1,0 G.
        Nota: Este valor é sample-dependente e ajustado para diminuir o ruído de baixa frequência no sinal. Se for muito grande um valor for usado, ele pode distorcer ou ampliar o sinal.
      6. Defina o tempo constante e conversão tempo de 20,48 ms, varrer tempo de 20,97 segundos, e resolução de até 1024 pontos.
        Nota: A constante de tempo também é baseada na amostra e é ajustado para filtrar o ruído de alta frequência.
      7. Depois de o primeiro exame, definir o campo de centro no centro do sinal EPR e escolher largura de varrimento de tal modo que o rastreio inclui o sinal de linha de base e suficiente em ambos os lados.
        NOTA: Para além disso, para melhorar a relação sinal / ruído, aumentar o número de verificações com base na força do sinal EPR. Incluem largura de varredura eo número de pontos
      8. Medir a acessibilidade do marcador de spin para colisão agentes relaxante O 2 27 descrito no passo 6.1.4.4.
        NOTA: Prepare Niedda como descrito anteriormente 26.
      9. Primeiro perfundir a amostra na cavidade com N 2 durante 5 min (a expulsar O 2). Medir os espectros para cada potência de microondas entre 5-35 dB, em passos de 3 dB com uma largura de varrimento de 30 G.
      10. Então perfundir a amostra na cavidade com ar durante 10 minutos e medir os espectros em diferentes potências de microondas (5-35 dB em passos de 3 dB) como no passo 6.1.4.9.
      11. Incubar 20 ul do sedimento com 180 ul de lipossomas de Niedda 50 mM (em tampão B ou tampão D), numa 42 ° C em banho-maria durante 5 min. Centrifugar a amostra e remover o sobrenadante utilizando uma pipeta. Carregar a amostra no capilar e colocá-la no interior da cavidade do ressonador. Repita o passo 6.1.4.9.
        NOTA: O princípio por trás do experimento é que a interação com relaxina paramagnéticag agentes por meio de troca de spin Heisenberg seria evitar a saturação da inversão de sinal e população. Água Niedda solúvel e lipídico O peso molecular solúvel 2 são usados ​​como repórteres para a água (tanto a granel e antessalas intraprotein) e da membrana posições na proteína expostos, respectivamente.
  2. Análise de dados:
    NOTA: A análise dos dados EPR envolve os seguintes passos: 14,22,23,25-27
    1. Calcula-se a mobilidade da sonda de rotação (AH S-1), como o inverso da largura da linha central do primeiro espectro de absorção no derivado. AH o -1 é o reflexo da liberdade motional ou a dinâmica da sonda.
    2. Calcular o parâmetro de acessibilidade (П), que é uma estimativa da acessibilidade da sonda com outros agentes relaxantes colisional paramagnéticas, utilizando os passos descritos abaixo.
      NOTA: Interação do spin-sonda com agentes paramagnéticos relaxanteaumenta a taxa de relaxação spin-rede (T 1) do nitróxido por troca de spin Heisenberg. 27
      1. Estimar o parâmetro de acessibilidade (П) a partir de experiências de saturação de alimentação (6.1.4.8) em que a amplitude vertical pico-a-pico da linha central do primeiro espectro de EPR derivado é medido em diferentes potência de microondas. 25 Lote da amplitude do sinal como uma função da raiz quadrada da potência de microondas e se encaixam com a seguinte equação 27.
        equação 1
        NOTA: Quando A é a amplitude do sinal, é uma medida da homogeneidade da saturação da linha de ressonância (o que é normalmente entre 0,5 e 1,5), que é um factor de escala, P é a energia incidente, e a representa o valor em que o primeiro derivado de amplitude é metade do seu valor insaturado.
  3. Calcular AP 1/2 na presença (O 2 ou Niedda) e ausência (perfundidos com N 2) de agentes paramagnéticos relaxante. Calcular o parâmetro de acessibilidade (П) usando a equação:
    equação 2
    NOTA: Onde P 02/01 de referência e de referência O AH é a metade valor de saturação máxima potência e a largura de linha central, respectivamente, para o padrão de referência (tais como o DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)) 27.

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Representative Results

Caracterização bioquímica dos Mutantes GLIC marcado por rotação

Seguindo o protocolo descrito acima seria normalmente produzem proteína de fusão MBP-GLIC na gama de 10 - 12 mg / L de cultura. Embora este valor pode variar entre os diferentes mutantes, em particular para as posições enterradas no interior da proteína, o rendimento pode ser significativamente comprometida. Nestes casos, os volumes de cultura pode necessitar de aumento de escala. A clivagem da construção de fusão por HRV3C protease é efectuada S / N, por conveniência. Ao executar as amostras em gel de SDS-PAGE, descobrimos que esta clivagem é completa dentro de 30 - 60 min. (Figura 1A). GLIC purificado em coluna de exclusão de tamanho de filtração em gel elui predominantemente como um pentâmero, com um volume de retenção de 11,3 ml. A fracção MBP elui a 15 ml e agregados eluída no volume vazio da coluna (~ 7,0 ml). O rótulo de spin vem ao fim da eluição (~ 24 ml) (Figura 1B)

FRET Based Assay de Monitoramento Agregação de GLIC reconstituída em vários lípidos da membrana

FRET ensaio é utilizado para avaliar a agregação de pentâmeros GLIC em vesículas reconstituídos (veio em conjunto dentro de uma distância <50 A na membrana). A Figura 2 mostra os dados de GLIC em peso (com C27, marcada ou com fluoresceína ou tetrametilrodamina) e reconstituído em E. lípidos polares .coli, POPC: POPG (3: 1), o Papa: POPG (3: 1) ou asolectin. As medições de fluorescência mostram que GLIC reconstituído em asolectin não mostrou FRET e até congelar / descongelar a amostra (as condições conhecidas para promover a agregação) produziu alterações mínimas nos níveis de FRET 43. Por esta razão, é asolectin a mistura de lípidos de eleição para as medições espectroscópicas e funcionais utilizados nestes Stumorre.

Comportamento macroscópica da GLIC em proteolipossomos

Propriedades funcionais de GLIC purificados são caracterizados por medição de patch-clamp na proteolipossomas reconstituídos. Representante de gravação actual macroscópica da GLIC em peso de um remendo de dentro para fora em resposta a um pH de salto é mostrado na Figura 3 a -100 mV, segurando potencial, a mudança para tampão pH 3,0 produz rapidamente activação correntes de entrada. (10 - 100 ms) que decomposição a cerca de 10% da amplitude de pico dentro de 43 segundos (1-3 seg, Figura 3). Correntes recuperar desta decadência macroscópica ou dessensibilização, alternando de volta para pH neutro. Enquanto canais na amostra de dentro para fora eram sensíveis a alterações no pH do banho, não houve qualquer efeito da alteração do pH na solução de pipeta (dados não mostrados), sugerindo que GLIC foi predominantemente orientados em uma direç ã o de tal modo que no remendo o domínio extracelular enfrentou o permutador de banho / solução.

Rearranjos estruturais durante a ativação do canal

À TA, o spin-sonda podem adoptar conformações múltiplas rotaméricas, e a forma de linha espectral é sensível não só para o movimento de rotação do rótulo cadeias laterais relativos ao esqueleto do péptido, mas também com as flutuações da espinha dorsal e a movimentos globais da proteína. Portanto, as alterações na lineshapes EPR pode provar ser uma excelente ferramenta de diagnóstico para monitorizar as alterações conformacionais da proteína. A Figura 4 mostra os espectros na posição L241 (17) R1 na região hidrofóbica extracelular da região de revestimento do poro M2 (posição destacada como círculos pretos em a Figura 4, inserção) a pH 7,0 e pH 3,0. As diferenças espectros mostra sob as duas condições, tanto na amplitude do sinal e a extensão daampliação motional. Tal como acontece com medidas funcionais 42, as alterações conformacionais relatados pelos sinais EPR também são totalmente reversíveis. alargamento espectral é afetada tanto pelas limitações dinâmicas da sonda e por acoplamento dipolar. Para determinar a contribuição dos dois, L241 (17) é co-marcadas com uma etiqueta de spin-diamagnético. Os espectros marcado com e sob totalmente marcadas são comparados a pH 7,0 e pH 3,0 (Figura 4B). A extensão da alargamento dipolar nesta posição diminui quando os canais estão sob marcado, o que indica uma interação entre spin-rótulos entre diferentes subunidades.

A Figura 5 mostra os espectros de duas posições na hélice M4, que está localizado na periferia do canal. O -1 AH é medido como o inverso da largura de linha central (mostrado em detalhe). À medida que o movimento de rotação nitróxido é reduzida, como se verificou durante a formaçãode contactos terciários ou quaternários, a largura da linha aumenta (e, portanto, ÔH O -1 diminui) para qualquer geometria motional particular. Pelo contrário, os movimentos estruturais que conduzem a um aumento da liberdade de movimento da sonda é reflectido como um aumento na AH O -1. F312R1 é mais móvel, enquanto R296R1 é imóvel, de acordo com seus ambientes expostos e altamente restritas, respectivamente.

Com base nos parâmetros de acessibilidade, um rótulo de rotação numa posição específica sobre a proteína pode ser classificado como um dos seguintes: enterrado dentro do núcleo da proteína inacessível a água ou lípidos, sobre a superfície exposta a uma solução aquosa, ou na expostos a lipídios de superfície (Figuras 5 e 6). Os parâmetros de acessibilidade obtidos para uma série de campos consecutivos, em seguida, pode ser utilizado para determinar a estrutura secundária de uma região, sondar áreas de proteína-proteínacontacto, medir a inclinação de uma proteína na membrana, estimar a profundidade de imersão dos lacetes interfaciais, e identificam vestíbulos água e bolsos ligados a lípidos dentro das hélices transmembranares. 26 Como um exemplo, as curvas de potência-de saturação na Figura 6 mostram que F312R1 possui um relativamente mais elevada P 02/01 de o 2, em comparação com R296R1, sugerindo que as cadeias laterais na posição F312 são expostos-lípido. Além disso, F312R1 também é mais acessível para Niedda em comparação com R296R1 consistente com a sua localização na interface lípido-água. Por outro lado, L180R1 na região da volta de C do domínio extracelular é móvel e acessível a Niedda, consistente com a sua localização num circuito expostos à água.

dinâmica de sondas e dados de acessibilidade em uma determinada posição fornecer informações estruturais local sobre que posição específica dentro da proteína-fold geral. Estes parâmetros determinados para alINEAR sequência de resíduos ao longo da proteína pode ser ainda analisada utilizando abordagens analíticas com base em métodos de transformação de Fourier. Estas análises são úteis para avaliar as variações periódicas nos parâmetros ambientais EPR e orientar na previsão e orientando estruturas secundárias. Para um segmento de proteína particular, uma transformada discreta de Fourier espectro de potência P (ω) é calculado como uma função do ângulo entre posições adjacentes (Q) em que o segmento. Este lote é então usado para determinar o componente de frequência angular principal do espectro e em comparação com os (co) valores esperados para uma α-hélice (80 - 120 º) ou p-fios (150 - 180 °).
equação 3
onde P ( 'ω') é a transformada de Fourier do espectro de potência em função da frequência angular ω, n é o número de resíduos no segmento, é o parâmetro ambiental na posição. P ('ω') fica avaliado para o valor ω = equação 6 que maximiza P ( 'ω').

Além disso, um parâmetro índice de periodicidade (dá o significado da estrutura secundária prevista) é calculado como a razão entre a área sob o espectro de potência para o ângulo que representa um determinado elemento estrutural a que da área total do espectro. Um método de janela deslizante, é então utilizado para identificar o início e o fim de um dado elemento estrutural secundário. A orientação relativa deste segmento em relação ao resto da proteína pode ser estimada a partir da direcção do P ( 'ω') momento.

Para α-hélice:

equação 4

equação 5

Estes métodos têm sido aplicados com sucesso em vários sistemas para determinar três topologias dimensionais e prever as mudanças conformacionais subjacentes a função da proteína 14,23,24,41,44-53.

Determinando Distribuição Distância do EPR

distâncias de nitróxido-subunidade Inter pode ser determinada a partir de electrão-electrão interacções dipolares. Em CW-EPR, como se mostra na Figura 4, através do espaço interacções dipolares levar a alargamento espectral e são uma função da proximidade entre as etiquetas. Para distâncias até ~ 15 - 20 Â, a extensão da alargamento (comparação entre os espectros totalmente marcado e os espectros marcado com menos) pode ser utilizado para estimar semi-quantitativamente usando distânciasMétodos de Fourier deconvolução 28,29.

Distâncias inter-subunidades (<50 A) pode ser medida usando métodos Duplo elétron-elétron Ressonância (DEER). 30-34 de dados veados são recolhidos em amostras de detergente ou reconstituído em nanodiscs devido às limitações associadas a estas medidas em lipossomas 54. Para as amostras marcadas com rotação em detergente (~ 100 uM) em tampão A com DDM 0,5 mM, 30% (peso / volume) de glicerol é utilizado para crioprotecção. Os dados evolução temporal dipolar são obtidos em 83 K usando um cervo protocolo padrão de quatro pulso (π / 2) mw1-τ1- (π) mw1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) mw1-τ2-echo 55 num espectrómetro de RPE pulsada operando a frequências da banda Q (33,9 GHz). Os comprimentos de pulso para (π / 2) mw1 e mw1 (π) são 10 e 20 nanossegundos, respectivamente, e 40 nanossegundos para (π) MW2. sinais de veados são, em seguida, fundo corrigida assumindo um backgro homogênea 3Dund e analisadas pela regularização Tikhonov 31,56 para determinar distâncias médias e distribuições em distância.

Distâncias intramoleculares para uma posição representativa em M4 (F314R1) determinado por experiências Deer at pH 7.0 são mostrados na Figura 7 Uma vez que existem cinco spin-etiquetas dentro do pentâmero GLIC, pelo menos, duas distâncias são esperados.; uma correspondente às sub-unidades adjacentes e o outro a partir de subunidades não adjacentes, embora picos adicionais podem surgir a partir de orientações de spin rotaméricas alternados. O sinal DEER decai e as distribuições de probabilidades correspondentes são mostrados. O primeiro pico de curta distância (~ 42A) representa as distâncias entre as subunidades adjacentes, e o segundo pico (~ 53a) corresponde à distância não adjacentes. O pico para a distância diagonal parece ser a uma distância mais curta, e este é susceptível de ser subestimada porque as medições fiáveis ​​para além de 60 Ånão são viáveis ​​sob as condições experimentais devido a dificuldades técnicas com correcção de fundo.

figura 1
Figura 1. A caracterização bioquímica de spin-rotulados GLIC mutantes. (A) Cromatograma representativas de filtração em gel marcado com spin-GLIC depois da clivagem proteolítica da MBP tag. Os picos correspondem a GLIC MBP pentâmero e livre. (B) SDS-PAGE mostrando proteína sem cortes monomérica GLIC-MBP fusão (antes de filtração em gel) e frações MBP e GLIC reunido de filtração em gel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. FR ET Based Assay para monitorar o estado de agregação de GLIC reconstituída em vários lípidos da membrana. FRET medições são mostrados para amostras após O / reconstituição N (à esquerda) e após o congelamento / descongelamento das amostras (direita). (Modificado a partir da figura original). 43 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Comportamento macroscópica da GLIC em proteolipossomos. Em um patch de dentro para fora excisada reconstituído asolectin vesículas, GLIC é activado por pH saltos usando um trocador de solução rápida. Os canais são vistos para activar em ~ 10 ms e dessensibilizar com uma constante de tempo de 1-3 segundos. (Modificado a partir da figura original). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Durante rearranjos estruturais Canal de activação. (A) representativas espectros de EPR-CW para uma posição na poro forro M2 hélice, exibindo alterações na amplitude e formas de linha em resposta a alterações de pH. Em cada um dos casos, os espectros são normalizados para o número total de rotações. posição marcada com rotação é mostrado como um círculo preto. Apenas duas subunidades são mostrados por motivos de clareza. (B) EPRspectra mostrar alargamento dipolar por interações spin-spin. Os espectros em linha tracejada eram de canais de sub-marcados (na presença de etiquetas diamagnéticos) e em linha sólida eram de canais totalmente rotulados. A inserção mostra uma sobreposição de espectros de amplitude normalizada. Ampliando sob condições totalmente marcado é altailuminado por setas. Largura da digitalização é de 150 G. (modificado a partir da figura original). 36 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Resíduos parâmetros específicos de ambiente, medida pelo Poder saturação. As medições de largura espectral (AH 0) e acessibilidade de solvente (P 1/2) para duas posições contrastantes na hélice M4 do domínio transmembranar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Ambiente de um representante de Loop C Resíduo no domínio extracelular de GLIC. Gire-normalizado CW-espectros e as medidas de acessibilidade correspondentes para L180R1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. medições de distância por Pulsed-EPR Abordagens (veados). Estrutura GLIC mostrando a localização de Phe314 e distâncias Cp-Cp para as subunidades adjacentes e não adjacentes correspondentes. CW-espectros para esta posição são mostradas à direita. Fundo subtraído DEER- echo intensidade é registada em função do tempo de evolução e se encaixam usando livre de modelo de regularização de Tikhonov para amostras em detergente. A distribuição distância entre-spin correspondente (à direita).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

espectroscopia EPR tem provado ser uma abordagem estrutural inigualável em quantificar mudanças conformacionais em proteínas de membrana em um ambiente quase nativo. Esta abordagem permite-nos uma espiada nos detalhes moleculares da dinâmica de proteínas que são obscurecidos em estruturas de alta resolução a partir de cristalografia de raios X e microscopia Cryo-elétron. No entanto, é importante considerar as limitações técnicas dessa abordagem que possa afetar a aplicabilidade geral para outros sistemas e também para manter em mente os possíveis obstáculos experimentais ao longo do caminho. Discutimos alguns desses aspectos abaixo, juntamente com as estratégias recomendadas para solução de problemas.

Entre as questões mais comuns que se encontra com uma técnica que envolve amplas perturbações de mutação estão o baixo rendimento e pobres estabilidade oligomérica da proteína. Este aspecto é ainda mais exacerbada quando se trabalha com proteínas de membrana multim�icas complexos, tais como canais iônicos. É therefore crucial para otimizar estes dois aspectos bioquímicos antes de embarcar em uma mutagênese generalizada. Descobrimos que a expressão de mutantes de GLIC tóxicos é melhor tolerada em estirpes C41 e C43 de células BL21 3,36 Além disso, a diminuição da temperatura de pós-indução de 15 -. 18 ° C, diminuindo a concentração de IPTG até a 100? M, e incluindo 5% de glicerol durante a indução parece ajudar com a redução agregação de proteínas presumivelmente por abrandar o ritmo da expressão da proteína e reduzir a extensão da dobragem incorrecta. mutações de cisteína nas posições determinadas (particularmente na via de permeação) foram mostrados para aumentar a actividade constitutiva do canal e estes mutantes são susceptíveis de apresentar maiores dificuldades na expressão. Uso de bloqueadores bivalente poros (10 - Ba 25 mM 2+) durante a indução alivia toxicidade e melhora o crescimento de células 57 Estas estratégias têm se mostrado eficazes em muitos casos, a melhorar o rendimento, diminuindo a agregação da proteína e aumentar oligo.estabilidade Meric. 36,58

Um outro passo crucial na SDSL é a eficiência do processo de marcação. Enquanto cisteínas expostos superfície não deve apresentar nenhum problema na reatividade MTSL (> 90% os rendimentos de rotulagem), as posições onde as cadeias laterais de cisteína são enterrados e inacessíveis pode exigir concentrações de rótulo de rotação mais elevadas e tempos de incubação mais longos. O aumento da concentração de rótulo giro para excesso molar de 30 vezes e incubação O / N a 4 ºC ajuda com a melhoria da eficiência de marcação. Além disso, é também importante para medir o espectro do molde Cys-menos marcado para determinar a contribuição de fundo. Para sites que são mal marcados (<10%), o sinal de fundo domina o espectro total. Embora a determinação da eficiência de rotulagem rotação, note que a precisão é afectado por um número de factores, que incluem volume de amostra, amostra-diâmetro capilar, o posicionamento do capilar no interior do ressonador, temperatura cavidade, e Q do ressonadorvalor (que é a razão entre a energia armazenada na mesma sobre a energia dissipada para fora). Deve ser tomado cuidado para manter estas condições idênticas entre as amostras e o padrão. Além disso, deve notar-se que para sítios imobilizados, em que os espectros são intrinsecamente amplo, a precisão da medição da rotulagem cai ainda mais. Alternativamente, Cromatografia Líquida de Time of Flight-Ionização por Electrospray Mass Spectrometry (LCT-ESI-MS) pode ser utilizado directamente para determinar a massa molecular e, consequentemente, a eficiência de rotulagem. No entanto, a sensibilidade MS está comprometida para amostras em detergentes e de proteínas de membrana firmemente cruzados.

Uma vez que os mutantes foram purificados como uma população homogénea, que é importante para determinar a funcionalidade da preparação. medições de patch-clamp de mutantes marcadas com rotação em regiões-chave do canal irá revelar o efeito de perturbação na afinidade do ligando e gating canal. Em alternativa, as propriedades de canal pode ser estudada em Black LIPID membranas (BLM) ou por injecção 59 proteolipossomas em oócitos e a medição de correntes de dois eléctrodos por grampo de voltagem. 59-61 Se se verificar que a substituição de cisteína e o marcador de spin em certas posições alterar o ligando de sensibilidade ou de propagação da cinética canais, as condições experimentais (concentração de ligando, moduladores, composição de lípidos) pode ser variada apropriadamente para estabilizar o estado conformacional sob investigação. Além disso, é de notar que as medições são feitas EPR sob condições de estado estacionário e, por conseguinte, muda em rápida cinética do canal têm menos probabilidade de impacto a interpretação estrutural.

Claramente, a grande vantagem desta técnica é a capacidade de estudar a dinâmica de canais em membranas de composição definida e para sondar diretamente como os efeitos mediada por lípidos sobre a dinâmica altera a função do canal. No entanto, uma limitação é que algumas composições de lipidos pode causar a agregação lateral do Os canais de On a membrana e, portanto, a adequação de lipidos tem de ser determinado. 45 Para condições que causam a agregação, baixando proteína-se lípido razão, a realização de reconstituição a temperatura mais baixa, e encurtando a duração do tempo de reconstituição pode ajudar a manter os canais monodisperso 62 em alternativa, os canais podem ser reconstituídos em nanodiscs, que são os conjuntos de lípidos em nanoescala rodeado por um anel de proteína anfipática andaime membrana (apolipoproteína A1). 63 ao optimizar a razão molar da proteína de canal, componentes lipídicos e proteínas andaimes membrana, é possível obter uma população homogénea e mono-dispersa de unidades de canal único incorporados nanodiscs individuais. Este sistema tem várias vantagens adicionais em que os nanodiscs sejam opticamente claros e proporcionam acesso fácil tanto para o intracelular e extracelular lados da membrana.

Finalmente, ao níveldas medidas de RPE, pode ser confrontado com CW-EPR espectros que não são fáceis de interpretar, especialmente para posições exibindo espectros multicomponente. Tal heterogeneidade conformacional pode surgir a partir de troca lentamente conformações da proteína e / ou múltiplas orientações relativas ao rótulo rotação numa dada conformação da proteína. Determinar a contribuição relativa dos dois cenários não é trivial e pode exigir a utilização de derivados de alternativas de rótulo rotação, ou alterar a temperatura experimental, 64 de pressão, 65 intensidades de campo / freqüência de microondas, 66 ou por perturbação osm�ito. 67

Além disso, as medições cervo em lipossomas pode ser limitada por uma série de fatores, incluindo a sensibilidade mais baixa, maior contribuição fundo resultante de interações intermoleculares melhoradas, e uma redução na faixa de distância mensuráveis ​​(<50a). Em geral, para distâncias mais longas (<50 A), há grandeer incerteza nas larguras da distribuição da distância devido à insuficiência de tempos de evolução dipolares. No entanto, a utilização de Q da banda (34 GHz) frequências de microondas e etiquetagem com um marcador de spin bifuncional (com dinâmica intrínseca reduzidas) foram mostrados para aliviar algumas destas limitações. 54 Reconstituting em nanodiscs também foi mostrado para melhorar enormemente sensibilidade cervos por diminuindo as contribuições de fundo que surge a partir de interações dipolares intermoleculares. 15

Apesar destas limitações, SDSL / estudos de EPR, particularmente em sistemas com poucos cisteínas nativas, têm provado ser extremamente informativo. avanços tecnológicos futuros são voltados para adaptar esta abordagem poderosa para estudar canais humanos mais complexos, onde mutantes cisteína nativos podem não ser viável. Neste sentido, o desenvolvimento de estratégias de rotulagem alternativos, tais como aqueles baseados em incorporação específica do local de aminoácidos não naturais, ou 68 Synthesis de etiquetas que são direcionados para outros aminoácidos, 69 parecem uma grande promessa.

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Acknowledgments

Estamos muito gratos aos membros atuais e antigos do laboratório Chakrapani para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção (1R01GM108921) e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 12SDG12070069) e SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

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References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

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Química Edição 113 pLGIC receptores Cys-ansa lípidos da membrana de reconstituição de patch-clamp proteolipossomos rotulagem de spin sítio dirigida espectroscopia EPR dinâmica de canais interação lipídio-proteína
Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion
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Basak, S., Chatterjee, S.,More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

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