Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على مدى العقد الماضي، نمت فهم الهيكلي من القنوات الأيونية بوابات يجند pentameric (pLGIC) في قدم وساق، وذلك بسبب تعدد الهياكل عالية الدقة من عدد من أعضاء الأسرة. العوامل الرئيسية التي أدت إلى التطورات الراهنة في مجال تشمل، اكتشاف قنوات pLGIC بدائية النواة، 1-3 تقدمات كبيرة في التعبير البروتين غشاء حقيقية النواة و4-6 واختراقات هائلة في النهج تحديد الهيكل. 7 وتوفر هذه الهياكل إجماع واضح على حفظ الشامل للبنية ثلاثية الأبعاد من pLGIC. ومع ذلك، مجالين رئيسيين التي يبدو أنها تتخلف وراء هي توصيف وظيفي لهذه الاستعدادات القناة ووصف الآلية وظيفة القناة.

النابضة التغييرات متعلق بتكوين معقدة وتحدث على مسافة 60 Å على طول القناة، والتضمين هذه التحولات على نطاق واسع من قبلنسبة الدهون في غشاء. على وجه الخصوص، وقد ثبت أن نسبة الدهون في السلبية، والكولسترول، والدهون الفوسفاتية لتعديل وظيفة pLGIC 8-11. في حين أن الدور الدقيق لهذه المكونات الدهنية في وظيفة القناة لا يزال غير معروف، فإن فهم الجزيئية كاملة من النابضة يتطلب دراسة هذه القنوات في بيئتهم المحلية. سبين موقع الموجه وصفها (SDSL) والكترون ممغطس الرنين (الثوري) الطيفي هي التقنيات من اختيار لدراسة ديناميات البروتين في النظم تشكيلها. الجيش الشعبي الثوري الطيفي لا يقتصر على حجم الجزيئية (كما هو NMR) أو الممتلكات البصرية من العينة (كما هو مضان الطيفي)، وبالتالي يسمح قياسات يبني كامل طول تشكيلها في الظروف الدهون الأم. تقنية حساسة للغاية ولها متطلبات عينة منخفضة نسبيا (في حدود بيكو الخلد). كل من هذه الجوانب تجعل هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة بروتينات الغشاء الكبيرة التي يصعب التعبير في أكثر من مليغرامكميات.

وقد تم تطوير استخدام التحليل الطيفي EPR في تركيبة مع زيادة ونقصان وصفها موقع الموجه من قبل واين هوبيل والزملاء، وتم تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من أنواع البروتين. وقد استخدمت 12-24 البيانات الثوري للتحقيق في الهياكل الثانوية، والتغيرات في البروتين التشكل، أعماق غشاء الإدراج، والبروتين البروتين / تفاعلات البروتين يجند.

الأسلوب ينطوي على استبدال السيستين في مواقف الفائدة بمقدار الطفرات موقع الموجه. لضمان وضع العلامات الخاصة بالموقع، فمن الضروري أن تكون بديلا cysteines الأصلي مع حامض أميني آخر (على سبيل المثال، سيرين) لإنشاء قالب السيستين أقل. حتى الآن، وتسمية تدور الأكثر شعبية هي MTSL-ثيول محددة: (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) methanethiosulfonate التي يعلقها على البروتين من خلال جسر ثاني كبريتيد السندات. نظرا لخصوصيته العالية، وصغر حجمها نسبيا (أكبر قليلا من التربتوفان)، والمرنبيليتي من المنطقة رابط، وقد تبين هذه التسمية تدور لديهم القابلية للتفاعل ممتاز حتى مع وجود السيستين دفن. وعلاوة على ذلك، لتحقيق أقصى قدر من التفاعل، ويتم وضع العلامات رد فعل من البروتين في شكل المنظفات بالفاعلات. بعد انفصال الزائدة حرة تدور التسمية من قبل اللوني حجم الإقصاء، وإعادة تشكيل البروتين في جسيمات شحمية أو أنظمة محاكاة طبقة ثنائية من تكوين الدهون محددة. بشكل عام، والسيستين الطفرات جيد التحمل في معظم أجزاء من البروتين، وحجم صغير نسبيا من زيادة ونقصان مسبار يسبب الحد الأدنى من اضطراب للهياكل الثانوية والثالثية. للتأكد من أن تعديل الاحتفاظ ظائف نوع البرية، وقنوات وصفت وأعيد يمكن دراستها عن طريق القياسات التصحيح، المشبك.

ثم يتعرض البروتين المسمى وظيفية لقياسات الطيفية، والتي توفر أساسا ثلاثة أنواع رئيسية من المعلومات: 12،14،15،20،22،23،25-27 ديناميات تدور التحقيق من قبل lineshتحليل القرد. إمكانية الوصول إلى التحقيق لعوامل الاسترخاء ممغطس. يتم قياس المسافة وتوزيع 27 مسافات الثوري التي كتبها نهجين مختلفين. ويستند أولا على تقنية موجة مستمرة (CW)، حيث الطيفية توسيع الناجمة عن التفاعلات ثنائي القطب بين تدور العلامات (في 8-20 مجموعة بعد). ويستخدم لتحديد مسافة 28،29 والثاني هو نابض-EPR طريقة حيث قياسات المسافة التي يمكن أن تمتد ما يصل الى 70 Å. 30-34 وفي نقرا الكترون الكترون الرنين (غزلان)، ويتم تحليل التذبذبات في السعة تدور الصدى لتحديد المسافات والتوزيعات بعد. هنا هو منظم صدى تدور في وتيرة التفاعل ثنائي القطب. معا، وتستخدم هذه المعايير لتحديد طوبولوجيا البروتين والعناصر الهيكلية الثانوية، والتغيرات البروتين بتكوين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الموقع الموجه الطفرات والسيستئين الطفرات

  1. الاستنساخ والطفرات
    ملاحظة: GLIC النوع البري (وزن) 35 له السيستين وحيد الأم (C27)، والذي تحور لسيرين لإنشاء خلفية السيستين أقل. وأدخلت الطفرات السيستين على خلفية السيستين أقل من الطفرات موقع الموجه باستخدام بادئات التي تحمل كودون السيستين في الموضع المطلوب 36.
    1. مزيج 5 ميكرولتر من العازلة 10X رد فعل، 1 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر السيستين-أقل GLIC قالب DNA 35، 0.5 ميكرولتر كل من 40 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي 36، 1 ميكرولتر من dNTPs (100 ملم)، و 41 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات . ماصة العينة عدة مرات لمزجها جيدا، وتدور (6000 دورة في الدقيقة)، وأخيرا إضافة 1 ميكرولتر من بوليميريز الحمض النووي.
    2. تعيين الحرارية cycler على أن البروتوكول التالي:
      1. تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
      2. تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      3. حمىجي في 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      4. استطالة عند 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (تقريبا 1 دقيقة لكل كيلوبايت طول البلازميد).
      5. كرر الخطوات 1.1.2.2 - 1.1.2.4 لمدة 18 دورات.
      6. واستطالة النهائية في 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      7. عقد درجة حرارة 4 درجات مئوية
        ملاحظة: يتم احتساب درجة حرارة التليين على أساس التمهيدي تيم.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من DpnI إلى خليط التفاعل، مزيج دقيق من قبل pipetting، وتدور باستمرار (6000 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. تحويل
    1. ذوبان الجليد E. الخلايا المختصة القولونية على الجليد. قسامة 30 ميكرولتر من الخلايا في 14 مل أنبوب التحول المعقم وإضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي المهضوم إلى الخلايا. مزيج من قبل التنصت على جانب الأنبوب. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    2. وضع أنبوب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ثم ضعه مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 400 ميكرولتر وسائل الاعلام SOC العقيمة ويهز الخلايا في incuباتور في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحات LB تحتوي على كانامايسين (50 ميكرون) و 1٪ جلوكوز. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.
    4. حصاد مستعمرة واحدة من لوحة وتلقيح في 5 مل O / N الثقافات التي تحتوي على LB وسائل الاعلام / كانامايسين. احتضان الثقافة O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة.
    5. استخراج الحمض النووي من يا ثقافة / N من minipreparation 37. قياس العائد من الحمض النووي باستخدام معمل عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر الطول الموجي. يجب أن يكون التركيز ~ 100-200 نانوغرام / ميكرولتر. تأكد من وجود طفرة باستراتيجيات تسلسل الحمض النووي المؤتلف القياسية 38،39.

2. التعبير GLIC وتنقية

  1. تحويل
    1. اتباع الخطوات الموضحة في قسم 1.2، وتحويل 30 ميكرولتر من الخلايا المختصة C43 مع 1 ميكرولتر (~ 100-200 نانوغرام / ميكرولتر) من البلازميد التي تحتوي على الجين الترميز لGLIC جنبا إلى جنب مع فيروسات الانف الإنسان (الهريفي) -3C البروتيني الموقع الانقسام (للالبلازميد والجينات تسلسل، الرجوع إلى النص الإضافي) 35 (من الخطوة 1.2.5).
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على LB-أجار لوحات تحتوي على 1٪ جلوكوز و 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، واحتضان لهم O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في حاضنة.
    3. تحقق بصريا على المستعمرات، وضمان أن لا تزرع الإفراط في هم أو تظهر وجود المستعمرات الفضائية. على الفور ختم لوحات مع parafilm وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. وضع O / N-الثقافات وإعداد وسائط النمو
    1. اختيار مستعمرة معزولة واحدة باستخدام حلقة سلك بتلقيح ونقل إلى 100 مل قارورة معقمة تحتوي على 20 مل من مرق لوريا (LB) وسائل الإعلام تستكمل مع معقم 1٪ جلوكوز و 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين. احتضان لهم O / N (~ 16 ساعة) في 37 درجة مئوية في شاكر في 250 دورة في الدقيقة.
    2. الأوتوكلاف 900 مل رائع مرق (السل) وسائل الاعلام (انظر وسائل الإعلام والعازلة التكوين) في 2.8قوارير الزجاج L Fernbach للثقافة البكتيرية في دورة البخار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. إعداد الثقافات نمو كبيرة
    1. إضافة 100 مل من العازلة فوسفات البوتاسيوم معقم (انظر وسائل الإعلام والعازلة التكوين) إلى وسائل الإعلام السل تعقيمها. إضافة الجلوكوز المعقم (تركيز النهائي 0.2٪)، كانامايسين (50 ميكروغرام / مل)، و 10 مل من O / N الثقافة. احتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر في 250 دورة في الدقيقة.
    2. تحقق الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي (OD 600) باستخدام جهاز قياس شدة الضوء أو معمل كل ساعة حتى يصل 0.5 (~ 2 ساعة). في هذه المرحلة تقليل السرعة إلى 150 دورة في الدقيقة وخفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية. مراقبة OD 600 كل 30 دقيقة حتى تصل إلى 0.8 (~ 1 ساعة).
    3. إضافة 50 مل من الجلسرين ومواصلة هز الثقافة حتى OD 600 تصل إلى 1،0-1،2 (~ 15-30 دقيقة).
      ملاحظة: في ظل هذه الظروف، فإنه يأخذ حوالي ساعة للثقافة لتصل إلى 18 درجة مئوية من 37 درجة مئوية. ومن عفريتortant وأضاف أن الجلسرين للثقافة بعد أن تبرد إلى 18 درجة مئوية.
    4. لحث الخلايا مع 200 ميكرومتر IPTG (الآيزوبروبيل-ثيو-β-غالاكتوزيد) وإعادة شاكر إلى 250 دورة في الدقيقة وزيادة احتضان ل~ 16 ساعة على 18 درجة مئوية.
  4. البروتين تنقية
    1. تأكد من أن OD 600 في نهاية 16 ساعة هو ~ 16 - 18. حصاد الخلايا في زجاجات الطرد المركزي 1.0 لتر من الغزل في 8500 x ج، 4.0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب طاف وتزن زجاجة مع بيليه الخلية. حساب وزن بيليه بطرح وزن زجاجة فارغة من الوزن الكلي.
      ملاحظة: يتوقع وزن الخلية بيليه هو ~ 30 - 35 جم / لتر. على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه قد يكون هناك تقلب في النهائي OD 600 وبيليه خلية الوزن عبر المسوخ.
    2. إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 150 مل من الجليد الباردة العازلة ألف (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4) لكل 1.0 لتر من الثقافة. إضافة الدناز الأول (100 ميكروغرام / مل)، وبروتسمثبطات ه (فلوريد السلفونيل phenylmethyl (1 ملم)، leupeptin (2.0 ميكروغرام / مل)، أبروتينين (2.0 ميكروغرام / مل)، وpepstatin ألف (1 ميكروغرام / مل)).
    3. التجانس الخلايا عن طريق تمريرها من خلال ديسروبتر خلية في غرفة باردة 4.0 درجة مئوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات حتى أن معظم البكتيريا وهي lysed. الطرد المركزي الخلايا في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة وماصة طاف بها ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. تجاهل بيليه، الذي يحتوي على خلايا هي lysed الامم المتحدة والهيئات إدراج.
    4. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 168000 x ج لمدة 1 ساعة. صب بعناية طاف دون الإخلال بيليه الغشاء.
    5. تجمع بيليه غشاء من 1 لتر من الثقافة وإعادة تعليق في الواق ألف (تستكمل مع 10٪ الجلسرين) إلى الحجم النهائي من 50 مل. إضافة 0.5 غرام من ن Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) إلى تعليق الغشاء وnutate لمدة 2 ساعة في 4.0 درجة مئوية.
    6. بعد ذوبان الغشاء، وإزالة الحطام خلية من المحللة التي كتبها centrifugأوجه في 168000 x ج لمدة 1HR. في هذه الأثناء إعداد الراتنج أميلوز. نقل 3 مل من راتنج باستخدام ماصة في عمود البولي بروبلين اللوني فارغة. غسل الراتنج عن طريق تمرير 10 مجلدات سرير من الماء 3 مرات وبعد ذلك مع 10 مجلدات السرير من الاحتياطي وتحتوي على 0.5 ملي DDM.
    7. بعد الطرد المركزي، واتخاذ بلطف طاف بها باستخدام ماصة ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي نظيف. لدفعة من الحكمة ملزمة، إضافة معايرتها قبل الراتنج أميلوز إلى أنبوب مخروطي الشكل. ربط البروتين المستخرج من الراتنج أميلوز من الإيماء الخليط لمدة 2 ساعة في 4.0 درجة مئوية.
    8. تمرير الطين بأكمله من خلال عمود اللوني وجمع من خلال تدفق. ثم تمرير كامل جمع التدفق من خلال أكثر من الراتنج مرة ثانية لتعظيم ملزمة.
    9. تمرير 10 مجلدات السرير العازلة ومع 0.5 ملي DDM، 0.5 ملي تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لإزالة البروتينات غير منضم.
    10. أزل البروتين GLIC مع 10 مل من BUFفر والتي تحتوي على 40 ملي المالتوز بالإضافة إلى 0.5 ملي DDM و 0.05 ملي TCEP. TCEP يمنع أكسدة السيستين الجانب سلاسل. جمع أزل بأكمله.
    11. تركيز بروتين مزال استخدام المكثف الطرد المركزي (الوزن الجزيئي الانشطارية = 50 كيلو دالتون) إلى 4-6 ملغ / مل وإضافة البروتيني الهريفي-3C (200 ميكروغرام لكل 10 ملغ من البروتين)، واحتضان O / N عند 4.0 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من إتمام عملية الهضم البروتيني عن طريق تشغيل العينات على هلام PAGE SDS (راجع الخطوة 2.5.5 والشكل 1).
  5. موقع الموجه سبين وضع العلامات
    1. جعل حوالي 100 ميكرولتر من 200 الأسهم ملي من (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) MTSL 40 في DMSO وتخزينها السهم عند -20 درجة مئوية في 25 مكل.
    2. استخدام عينة هضمها البروتيني لتدور وضع العلامات مع MTSL. إضافة فائض الرحى 10 أضعاف من MTSL تدور التسمية (GLIC مونومر: MTSL في 01:10 نسبة الرحى). احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. إضافة الطلقة الثانية من التسمية تدور في 5 أضعاف الفائض المولينسبة واحتضان لمدة ساعة أخرى.
      ملاحظة: للحصول على مناصب دفن (مع انخفاض كفاءة تدور وضع العلامات، هو موضح أدناه)، يتم إضافة 30 مرة فائض المولي التسمية تدور وحضنت البروتين لمدة 6 ساعة.
    3. تمرير العينة من خلال البروتين سريع عمود الحجم الاستبعاد اللوني السائل (FPLC) التي هي قبل معايرتها مع العازلة وو 0.5 ملي DDM لفصل MBP المشقوق والزائدة حرة تدور التسمية من pentamers GLIC. جمع 1 مل الكسور ليصبح المجموع 30 مل شطف. تجميع الكسور التي تحتوي pentamers GLIC (الشكل 1). اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتشغيل FPLC.
    4. تحديد تركيز العينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر الطول الموجي. معامل الانقراض المولي ويقدر الوزن الجزيئي للGLIC مونومر هم 49850 م -1 سم -1 و 36380 دا على التوالي. التركيز على حل البروتين باستخدام مكثف الطرد المركزي (الجزيئيةالوزن قص قبالة = 50 كيلو دالتون) إلى التركيز النهائي من ~ 8-10 ملغ / مل ووضعه على الجليد. العينة هي الآن جاهزة للإعادة.
    5. كما في اختبار الجودة إضافية لضمان إعداد متجانسة كيميائيا، تشغيل الحد (1.0٪ β-ME) هلام SDS-PAGE.
      ملاحظة: هلام commassie الملون يجب أن تظهر فرقة واحدة في ~ 33 كيلو دالتون الموافق مونومر GLIC (الشكل 1).
    6. لالمسوخ المسمى تدور يشتبه في معرض توسيع ثنائي القطب، تحت تسمية العينات في وجود التسمية diamagnetic 41. احتضان البروتين مزال مع MTSL 0.1 أضعاف، واحتضان على الجليد لمدة 1.0 ساعة. بعد ذلك، إضافة فائض الرحى 20 أضعاف من التسمية diamagnetic (1-acetoxy-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) الميثان thiosulfonate.
      ملاحظة: كاشف diamagnetic المستخدمة هنا هي ايزو الفراغية إلى التسمية ممغطس مع وضع العلامات الكيمياء متطابقة.
    7. احتضان العينة على الجليد لمدة 2 ساعة. تمرير العينة من خلال الاحجامالبريد استبعاد العمود اللوني الذي هو قبل معايرتها مع العازلة وو 0.5 ملي DDM كما في الخطوة 2.5.3.
  6. كفاءة العلامات تدور
    1. ويعرف كفاءة تدور وضع العلامات على أنها نسبة تركيز تدور التسمية إلى تركيز السيستين جانب سلسلة (GLIC-مونومر). لتحديد كفاءة تدور وضع العلامات من العينة، وسيتم مقارنة شدة المتكاملة للعينة مع مستوى تركيز معروف يستخدم مؤامرة المعايرة. جعل حلول ذات مستوى EPR (مثل 2،2،6،6-ميثيل-1-piperidinyloxyl: TEMPO) في مجموعة من تركيزات (10-250 ميكرون) عن طريق إذابة في الماء.
    2. قياس إشارة الثوري لكل من هذه الحلول وتحديد المساحة تحت منحنى (التكامل المزدوج للإشارة الثوري) لكل تركيز (كما هو موضح في الخطوات 6.1). توليد منحنى المعايرة من قبل المتهم بالتآمر في منطقة محسوبة بوصفها وظيفة من تركيز TEMPO والمناسب مع خط مستقيم.
      ملاحظة: لوتحت إشارة الثوري مشتقة هو أفضل وصف لشدة الطيفية من الذروة إلى الذروة السعة. ودمج الأولى المشتقة إشارة الثوري إعطاء طيف الامتصاص، فإن التكامل الثاني ثم إعطاء المنطقة تحت طيف الامتصاص (والذي يتناسب مع تركيز تدور). ضمان خط الأساس المستمر سواء في الميدان منخفضة والمنطقة ميداني على مستوى عال من الطيف.
    3. قياس تركيز البروتين المسمى تدور في المنظفات باستخدام مقياس الطيف الضوئي (كما في الخطوة 2.5.4). الآن قياس إشارة الثوري من العينة ومن ثم تحديد مجال تكامل المزدوج للإشارة الثوري الخطوات التالية في القسم 6.1. باستخدام مؤامرة المعايرة، وتحديد تركيز التسمية التي تتطابق مع إشارة الثوري قياسها. حساب الكفاءة تدور وضع العلامات، نسبة المولي من التسمية تدور وتركيز البروتين.

3. GLIC إعادة إعماره في Asolectin الأغشية

  1. شطف 25 مل قارورة أسفل جولة نظيفة مع 5 مل من الكلوروفورم وتجفيف قارورة في تيار من غاز N 2 في غطاء الدخان. نقل 10 ملغ من asolectin (فول الصويا القطبي استخراج 25 ملغ / مل الأسهم في الكلوروفورم) في قارورة وتجفيف الدهون تحت دفق مستمر من N 2 الغاز.
    ملاحظة: يعتمد اختيار الدهون لإعادة على النتائج المستخلصة من التجارب في القسم 4.
  2. عندما تبخرت الكلوروفورم، ضع قارورة في فراغ لمدة 1 ساعة لضمان التجفيف الكامل. إضافة 1 مل من إعادة العازلة ألف من الدهون المجففة ودوامة القارورة بقوة للحصول على بيليه الدهون إلى تعليق.
  3. لإعداد الحويصلات unilamellar صغيرة، يصوتن تعليق الدهون في sonicator الحمام البارد حتى يصبح الحل حويصلة أكثر أو أقل شفافة ولوحظ عدم وجود كتل (حوالي 10-15 دقيقة). إلى هذا الخليط، إضافة DDM إلى تركيز النهائي من 4 مم واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
<لى> إعادة إعماره
  1. إضافة البروتين المنقى من الخطوة 2.5.4 إلى خليط الدهن.
    ملاحظة: نسبة البروتين إلى الدهون تعتمد على نوع من التجربة. لقياس الحالية العيانية، 1: يستخدم نسبة 10،000. للدراسات الثوري، ويتم إعادة في البروتين العالي لنسبة الدهون (1: 2500) لتعظيم إشارة. وأظهرت في وقت سابق أنه في هذه التركيزات، يتم احترام أي تجميع الجانبي 42.
    ملاحظة: كمية العمل نموذجي GLIC لالثوري هي ~ 1 ملغ، على الرغم من أن يستند إلى موقف بحثها، وكميات أقل ستعمل أيضا.
  2. احتضان العينة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع دوران طيف ثم تمييع العينة إلى 15 مل مع الواق A.
    ملاحظة: هذه الخطوة يرتفع تركيز المنظفات أقل من تركيز micellar الحرجة (CMC).
  3. إزالة المنظفات المتبقية في تعليق بإضافة الخرز البوليسترين (مع المسام مسعور هذا الفخ المنظفات). إضافة 80 ملغ من تنظيف الخرز واحتضان liposلى بعد تعليق O / N على nutator في 4 درجة مئوية.
    1. لإعداد الخرز للاستخدام، تزن ~ 100 ملغ ونقلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 10 مل من الميثانول، هزة بقوة، وتدور أسفل حبات في 8000 x ج لمدة 2 دقيقة، وصب الميثانول. كرر هذه العملية من الميثانول يغسل ثلاث مرات. كرر نفس العملية مع 30 مل من الماء منزوع الأيونات، وغسل ثلاث مرات.
  4. في اليوم التالي، ونقل الجسيمات الشحمية لأنبوب نابذة 25 مل باستخدام فلتر العمود لإزالة الخرز وزيادة تمييع العينة إلى 25 مل. الطرد المركزي العينات في 168000 x ج لمدة 2 ساعة. صب طاف وإعادة تعليق بيليه باستخدام 100 ميكرولتر من الاحتياطي B.

4. تحديد الأمثل الدهن تكوين لإعادة إعماره من قبل الحنق

  1. استخدام مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) فحص المستندة إلى تحديد تكوين الغشاء الذي يحافظ على البروتين monodisperse.
  2. تنقية بالوزن
  3. الخطوات التالية في القسم 3.2 لإعادة، وإعداد ثلاث عينات مختلفة لكل تركيبة الدهون لفحصها، أولا، فلوريسئين المسمى GLIC في نسبة المولي من 1: 1500 (مخموس: الدهن) GLIC في نسبة المولي الثانية، وصفت رودامين- 1: 1500 (مخموس: الدهن). الثالث، خلط المنظفات بالفاعلات فلوريسئين ورودامين المسمى GLIC (نسبة 1: 1 المولي). إعادة تشكيل هذا الخليط في 1: 750 (مخموس: الدهن) النسبة.
    ملاحظة: استخدمنا ثلاثة أنظمة الدهون: asolectin، POPC: POPG (3: 1 نسبة الرحى)، و E. استخراج القطبي القولونية. هذا البروتين الدهني نسبة إعادة في التجربة الحنق أعلى من تلك المستخدمة لقياس الثوري (1: 750 بالمقارنة مع 1: 1500 تستخدم للدراسات الثوري).
  4. تمييعتعليق الحويصلية (للحد من إشارة تشتت الضوء؛ ~ 5 ميكرولتر في 995 ميكرولتر من الاحتياطي أ) ثم ماصة العينة إلى كوفيت الكوارتز ووضعه في مقياس التألق.
  5. تعيين الطول الموجي الإثارة في 490 (والتي تتطابق مع ماكسيما امتصاص للمتبرع: فلوريسئين). باستخدام تعليمات الشركة الصانعة، تسجيل الأطياف الانبعاثات من 500 نانومتر إلى 660 نانومتر.
    ملاحظة: للحصول على GLIC عينة المسمى فلوريسئين، سترى الذروة في 518 نانومتر (الموافق الانبعاثات فلوريسئين) مع عدم وجود ذروة في 572 نانومتر (الموافق الانبعاثات رودامين). لGLIC عينة المسمى رودامين، فإنك لن ترى ذروته في 518 نانومتر ولكن بدلا من ذلك في 572 نانومتر الناشئة عن الإثارة المباشرة لرودامين في 490 نانومتر. بالنسبة للعينة تحتوي على كل فلوريسئين ورودامين التسميات، وانخفاض في كثافة الذروة فلوريسئين وزيادة مقابلة في ذروة رودامين هو إشارة الحنق الذي من المرجح مؤشر التجميع الجانبي للبروتين في الغشاء.
  6. مراقبةاتساع الانبعاثات رودامين في 572 نانومتر على فترات زمنية مختلفة (0-24 ساعة) تسجيل في كل ساعة لساعة 6 الأولى ثم بعد O / N الحضانة (الشكل 2). لكل فترة، وقياس كثافة مضان في 572 نانومتر (لرودامين: الأولى أ) وفي 518 نانومتر (لفلوريسئين: إيد). طرح مساهمة تفعيل رودامين المباشر (نموذج 2 في الخطوة 4.3) من الأولى أ (IAC). تحديد نسبة الحنق كما IAC / (IAC + رطل). مقارنة الحنق على فترات زمنية مختلفة، وعبر تركيبة الدهون المختلفة.
    ملاحظة: كعنصر تحكم، نفذ الخطوة 4.5 و 4.6 لعينات المنظفات بالفاعلات والمقارنة بين أطياف الانبعاثات لتلك الجسيمات الشحمية من تشكيلها. استخدام مزيج متساوي المولية من البروتين المسمى في المنظفات (كما هو موضح في الخطوة 4.3) وتمييع العازلة وتستكمل مع 0.5 ملي DDM. ومن المتوقع أن عينات المنظفات سوف تظهر الحد الأدنى من إشارة الحنق.

5. القياسات الوظيفية من قبل تسجيلات التصحيح، المشبك

  1. إعداد العلاقات العامةoteoliposomes لقياس التصحيح، المشبك تماما بنفس الطريقة التي لدراسات الثوري (القسم 3.1).
    ملاحظة: ومع ذلك، وضبط البروتين: الدهون نسبة على أساس النوع من القياس تبذل (قناة واحدة، مقابل التسجيلات مجهري). فلاش تجميد proteoliposomes في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. عادة، إعادة GLIC في 1: 10،000 البروتين: الدهون (نسبة المولي) لالتيارات العيانية و 1: 50000 نسبة المولي للتسجيلات قناة واحدة.
  2. الجسيمات الشحمية ذوبان الجليد على الجليد. شطف شريحة زجاجية نظيفة مع الماء والإيثانول ويجف تماما. وضع قطرة 10 ميكرولتر من proteoliposome في وسط الشريحة ويا جاف / N في مجفف في 4 درجة مئوية تحت فراغ.
  3. إعادة ترطيب proteoliposomes المجففة بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي ب (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.0) ووضع شريحة في petriplate على رأس ورقة مرشح رطبة. تغطية لوحة، والسماح للالإماهة المضي قدما لمدة حوالي 2 ساعة.
    ملاحظة: هذا yie عمليةلدس الجسيمات الشحمية العملاقة متعددة رقائقي التي تؤدي إلى تصحيح من.
  4. سحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية رقيقة الجدران البورسليكات الزجاج (~ 1-2 ميكرون قطر الحافة) باستخدام المصنع أوصى وضع على مجتذب ماصة. للحرارة البولندية باستخدام النار المضي إلى المقاومة من 1.5 - 2MΩ عندما تمتلئ العازلة B.
  5. تملأ الغرفة مع تسجيل B الاحتياطي باستخدام ماصة ونعلق القطب الأرض حج / أجكل. باستخدام 2 ميكرولتر ماصة، طرد بلطف الجسيمات الشحمية من على حافة ونقل 1 ميكرولتر من تعليق على غرفة تسجيل. انتظر بضع دقائق للالجسيمات الشحمية لتستقر في القاع.
  6. ملء التصحيح، ماصة مع B الاحتياطي باستخدام إبرة حقنة غير المعدنية وتركيبها على مكبر للصوت وجها المرحلة. تحديد حويصلة واحدة معزولة لرأب الصدع. تطبيق ضغط إيجابي طفيف لمنع التصحيح، ماصة من انسداد، وإدراج معلومات سرية إلى غرفة تسجيل.
  7. تطبيق نبضات اختبار لقياس المقاومة ماصةالامتحانات التنافسية الوطنية وتعويض الجهد ماصة الإزاحة. الاقتراب من حويصلة، وعندما يتم الاتصال، وتطبيق ضغط سلبي طفيف لسحب بلطف الحويصلة ضد ماصة التصحيح على شكل خاتم gigaohm.
  8. مراقبة مقاومة ماصة خلال العملية برمتها. مرة واحدة يتم تشكيل ختم gigaohm، سحب ماصة بعناية بعيدا عن الجسيمات الشحمية لتشكيل التصحيح من الداخل إلى الخارج. إيقاف نبض الاختبار.
  9. تعيين إمكانية عقد ل-100 بالسيارات، وتطبيق نبض درجة الحموضة. تم الحصول على انخفاض الرقم الهيدروجيني باستخدام 10 ملي سيترات الصوديوم العازلة C (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 3.0). (الشكل 3)
    تتم التسجيلات على تردد أخذ العينات من كيلوهرتز 10 لالعيانية و 40 كيلو هرتز لقياس قناة واحدة: ملاحظة.

6. القياسات الثوري

  1. استمرار الموجة الثوري الطيفي
    1. نقل تعليق الحويصلية من الخطوة 3.2 في أنبوب ميكرولتر 200 وبيليه العينات باستخدام جهاز للطرد المركزي. تجاهل supernataالإقليم الشمالي ونموذج جاهز للقياسات الثوري.
      ملاحظة: للحصول على قياسات الثوري، فمن المهم لإزالة أكبر قدر من العازلة من عينة الحويصلية وقت ممكن. منذ عينات مائية تمتص جزء الكهربائية الموجات الدقيقة مما يؤدي إلى تسخين وفقدان الحساسية.
    2. لتنفيذ الصرف عازلة، ونقل 20 ميكرولتر من بيليه الحويصلية باستخدام ماصة لأنبوب microfuge. إضافة 180 ميكرولتر من الاحتياطي D (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 3.0)، واحتضان في حمام الماء 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لعينة، وإزالة طاف باستخدام ماصة وتكرار هذه العملية ثلاث مرات لضمان تبادل عازلة كاملة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إجراء صرف عازلة بإخضاع عينات لعدة دورات تجميد / الذوبان.
    3. الغاز الشعيرات البلاستيكية قابلة للاختراق هي مناسبة لقياس كل الأطياف خط الأشكال والوصول المذيبات. اضغط على شعري على proteoliposome مكعبات لرسم عينة داخل وختم نهاية بالشمع العظام.
      ليسE: نموذجي أحجام العينة هي ~ 5 ميكرولتر وتركيز تدور المرغوب فيه هو 150 ميكرومتر. إذا كان الهدف هو قياس الأشكال خط وحدها، يمكن للمرء استخدام 0.4 ملم أنابيب OD الكوارتز الشعرية. إذا لزم الأمر، ماصة يمكن أن تستخدم لملء عينة داخل الشعيرات الدموية.
    4. تشغيل مطياف
      1. إجراء قياسات CW-الثوري في RT (292-297 ك) على مطياف X-فرقة مجهزة عازلة مرنان وفقا لدليل التعليمات الصانعين.
      2. بدوره على الماء المبرد، وإمدادات الطاقة، وحدة جسر الميكروويف. السماح للنظام لكي تتوازن حراريا لمدة 30 دقيقة قبل تسجيل. فتح البرنامج الاستحواذ.
      3. إدراج نموذج أنبوب / الشعرية في مرنان، تأكد من أن قسم من أنبوب مملوء العينة في وسط تجويف مرنان. ضبط مرنان وفقا للتعليمات على دليل مطياف.
      4. تسجيل أول امتصاص الطيف مشتق من الاجتياح الميداني فيقوة الميكروويف الحادث من 1.0 ميغاواط، وتضمين التردد من 100 كيلو هرتز وعرض اكتساح 100 G. تحديد القوة المثلى للتجربة من خلال تنفيذ التقدمية التجربة التشبع السلطة حيث ذروة الذروة إلى الذروة من أول CW المشتقة يتم قياس إشارة الثوري بوصفها وظيفة من الجذر التربيعي للطاقة الميكروويف الحادث.
        ملاحظة: في القوى الميكروويف أقل، وشدة الزيادات في إشارة يتناسب مع الجذر التربيعي للطاقة طالما السكان التوازن في حالة دوران لا تتأثر. ومع ذلك، إذا تم زيادة الطاقة أبعد من ذلك، والاسترخاء تدور شعرية لم تعد قادرة على الحفاظ على فارق السكان التوازن الدول تدور اثنين ويبدأ السعة إشارة إلى هضبة أو "تشبع". بعد هذه النقطة، واتساع إشارة قد يقلل فعلا مع زيادة مراقبة السلطة بسبب انعكاس سكان يشبع زيادة ونقصان. وبالإضافة إلى ذلك، لأطياف وسعت مع أجنحة واسعة حيث الأساس شقة واضحة المعالم ليست السادسsible، تمديد عرض الاجتياح إلى 150 - 200 G لمنع فقدان المنطقة.
      5. تبدأ باستخدام تعديل السعة من 1.0 G.
        ملاحظة: هذه القيمة هي عينة التي تعتمد وتعدل لتقليل ضوضاء منخفضة التردد في الإشارة. إذا تم استخدام كبيرة جدا قيمة، فإنه يمكن أن تشوه أو توسيع الإشارة.
      6. ضبط الوقت وقت ثابت والتحول إلى 20.48 ميللي ثانية، اكتساح الوقت لل20.97 ثانية، وقرار 1024 نقطة.
        ملاحظة: وقت ثابت يستند أيضا على العينة وتعديلها لتصفية الضوضاء العالية التردد.
      7. بعد الفحص الأول، تعيين الحقل مركز في وسط إشارة الثوري واختيار عرض الاجتياح بحيث تتبع يتضمن إشارة والأساس كافية على أي من الجانبين.
        ملاحظة: أيضا، لتحسين إشارة نسبة / الضجيج، وزيادة عدد المسح على أساس قوة الإشارة الثوري. يشمل العرض واكتساح عدد من النقاط
      8. قياس إمكانية الوصول إلى تسمية تدور لالتصادم وكلاء الاسترخاء O 2 27 وصفت في الخطوة 6.1.4.4.
        ملاحظة: إعداد NIEDDA كما هو موضح سابقا (26).
      9. أولا يروي العينة في تجويف مع N 2 لمدة 5 دقائق (لطرد O 2). قياس أطياف لكل قوة الميكروويف بين 5-35 ديسيبل في الخطوات من 3 ديسيبل مع عرض اكتساح 30 G.
      10. ثم يروي العينة في تجويف مع الهواء لمدة 10 دقيقة وقياس الأطياف والقوى الميكروويف مختلفة (5-35 ديسيبل في الخطوات من 3 ديسيبل) كما في الخطوة 6.1.4.9.
      11. احتضان 20 ميكرولتر من بيليه الحويصلية مع 180 ميكرولتر من 50 ملي NIEDDA (في الواق الواق B أو D) في 42 درجة مئوية حمام مائي لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لعينة وإزالة طاف باستخدام ماصة. تحميل العينة إلى الشعرية ووضعه في تجويف مرنان. كرر الخطوة 6.1.4.9.
        ملاحظة: المبدأ الكامن وراء هذه التجربة هو أن التفاعل مع الريلاكسين ممغطسأن وكلاء ز من خلال هايزنبرغ الصرف تدور منع تشبع من انعكاس إشارة والسكان. وتستخدم للذوبان في الماء NIEDDA والدهون القابلة للذوبان يا الجزيئية (2)، للصحفيين المياه (على حد سواء بكميات كبيرة والقاعات intraprotein) وغشاء تتعرض مواقع على البروتين، على التوالي.
  2. تحليل البيانات:
    ملاحظة: تحليل البيانات الثوري تتضمن الخطوات التالية: 14،22،23،25-27
    1. حساب التنقل لجنة التحقيق تدور (ΔH س -1)، وعكس عرض الخط المركزي لأول امتصاص الطيف مشتق. ΔH س -1 هو انعكاس لحرية الحركي أو ديناميات التحقيق.
    2. حساب المعلمة إمكانية الوصول (П)، وهو تقدير من الوصول لجنة التحقيق إلى وكلاء الاسترخاء تصادم ممغطس الآخرين، وذلك باستخدام الخطوات الموضحة أدناه.
      ملاحظة: تفاعل تدور مسبار مع وكلاء ممغطس الاسترخاءيعزز معدل الاسترخاء تدور شعرية (T 1) من nitroxide التي كتبها هايزنبرج صرف زيادة ونقصان. 27
      1. تقدير المعلمة إمكانية الوصول (П) من التجارب تشبع الطاقة (6.1.4.8) والتي تقاس السعة من الذروة إلى الذروة العمودي للخط وسط لأول الطيف EPR المشتقة في السلطة الميكروويف مختلفة. 25 قطعة أرض اتساع إشارة بوصفها وظيفة من الجذر التربيعي للطاقة الميكروويف وتتناسب مع المعادلة التالية (27).
        المعادلة 1
        ملاحظة: حيث A هي السعة للإشارة، هي مقياس لمدى تجانس تشبع من خط الرنين (والذي هو عادة بين 0.5 و 1.5)، الأول هو عامل التحجيم، ف هي قوة الحادث، ويمثل القيمة التي أول السعة المشتقة هي نصف قيمته غير المشبعة.
  3. حساب ΔP 1/2 القيم في وجود (O 2 أو NIEDDA) وغياب (مع perfused N 2) وكلاء ممغطس الاسترخاء. حساب المعلمة إمكانية الوصول (П) باستخدام المعادلة:
    المعادلة 2
    ملاحظة: أين P 1/2 المرجعية وΔH س المرجعية هي نصف القصوى قيمة التشبع السلطة وعرض الخط المركزي، على التوالي، على مستوى المرجعية (مثل DPPH (2،2-ثنائي-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

توصيف الكيمياء الحيوية من المسوخ GLIC المسمى سبين

بعد بروتوكول صفها أعلاه سوف تسفر عادة GLIC-م ب ب البروتين الانصهار في حدود 10-12 ملغ / لتر من الثقافة. على الرغم من أن قد تختلف هذه القيمة عبر طفرات مختلفة، لاسيما في المناصب دفن داخل البروتين، والعائد قد يكون خطر كبير. في هذه الحالات، قد يتطلب كميات ثقافة الارتقاء. انشقاق الانصهار بناء من قبل ويتم HRV3C البروتيني من O / N للراحة. عن طريق تشغيل العينات على هلام PAGE SDS، وجدنا أن هذا الانقسام اكتمال ضمن 30 - 60 دقيقة. (الشكل 1A). GLIC تنقيته على استبعاد حجم العمود هلام الترشيح elutes في الغالب باعتبارها مخموس مع حجم الإبقاء على 11.3 مل. elutes جزء م ب ب ب 15 مل والمجاميع أزل في حجم الفراغ من العمود (~ 7.0 مل). وتأتي تدور التسمية فينهاية شطف (~ 24 مل) (الشكل 1B)

الحنق القائم على الفحص للتجميع من GLIC المعاد الرصد في الدهون غشاء مختلفة

يستخدم منشار-فحص لتقييم تجميع pentamers GLIC في الحويصلات المعاد (جاء معا على مسافة 50 <Å على الغشاء). ويوضح الشكل 2 بيانات من GLIC وزن (مع C27، وصفت مع أي فلوريسئين أو tetramethylrhodamine) وأعاد في E الدهون القطبية .coli، POPC: POPG (3: 1)، البابا: POPG (3: 1) أو asolectin. وتشير القياسات مضان أن GLIC تشكيلها في asolectin لم تظهر أي الحنق وحتى تجمد / ذوبان العينة (الشروط المعروفة لتعزيز التجميع) تنتج الطفيف في مستويات الحنق 43. لهذا السبب، asolectin هو خليط الدهن من خيار للقياسات الفنية والطيفية المستخدمة في هذه ستويموت.

السلوك العيانية من GLIC في Proteoliposomes

تتميز الخصائص الفنية للتنقية GLIC بقياس التصحيح، المشبك في proteoliposomes تشكيلها. يتم عرض تمثيلي التسجيل الحالي العيانية من وزن GLIC من التصحيح من الداخل إلى الخارج استجابة لدرجة الحموضة قفزة في الشكل (3) وفي -100 بالسيارات عقد الإمكانات، والتحول إلى درجة الحموضة 3.0 عازلة تنتج تفعيل بسرعة التيارات الداخل. (10-100 ميللي ثانية) التي تسوس إلى حوالي 10٪ من السعة القصوى في غضون ثوان 43 (1-3 ثانية، الشكل 3). التيارات التعافي من هذا الاضمحلال العيانية أو الحساسية عن طريق التحول إلى الرقم الهيدروجيني محايدة. في حين كانت القنوات في التصحيح من الداخل إلى الخارج حساسة للتغيرات في درجة الحموضة حمام، لم يكن هناك أي تأثير تغير درجة الحموضة في حل ماصة (لا تظهر البيانات) مما يشير إلى أن GLIC كانت في الغالب موجهة في خيمة واحدةction هذا أن في التصحيح واجه المجال خارج الخلية مبادل حمام / الحل.

إعادة ترتيب الهيكلية خلال تفعيل القناة

في RT، يمكن أن تدور مسبار تعتمد متعددة التشكل rotameric، وشكل خط طيفي حساس ليس فقط لحركة تدور التسمية الجانب سلاسل النسبية على العمود الفقري الببتيد، ولكن أيضا لتقلبات العمود الفقري والاقتراحات البروتين العالمية. لذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في lineshapes الثوري يثبت أنه أداة تشخيصية ممتازة لرصد التغيرات متعلق بتكوين البروتين. ويبين الشكل 4 الأطياف في موقف L241 (17) R1 في المنطقة مسعور خارج الخلية في المنطقة M2-بطانة المسام (موقف أبرز كدوائر سوداء في الرقم 4، أقحم) في 7.0 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 3.0. الخلافات تظهر الأطياف تحت شرطين، سواء في السعة إشارة ومدىتوسيع الحركي. كما هو الحال مع القياسات الوظيفية 42، والتغيرات متعلق بتكوين التي أبلغ عنها إشارات الثوري هي أيضا قابلة للعكس تماما. توسيع الطيفي يتأثر كل من القيود الحركي لجنة التحقيق واقتران ثنائي القطب. لتحديد مساهمة من اثنين، L241 (17) هو-شارك المسمى مع diamagnetic تدور التسمية. تتم مقارنة أطياف المسمى تحت وصفت بالكامل في درجة الحموضة 7.0 ودرجة الحموضة 3.0 (الشكل 4B). مدى توسيع ثنائي القطب في هذا الموقف يقلل عندما وصفت القنوات تحت، مما يدل على وجود تفاعل بين تدور العلامات بين مفارز مختلفة.

ويبين الشكل 5 الأطياف للموقعين على الحلزون M4 الذي يقع في محيط القناة. ΔH س -1 يقاس معكوس عرض الخط المركزي (كما هو موضح في الشكل). كما يتم تقليل الحركة الدورانية nitroxide، كما شهدنا خلال تشكيلالاتصالات الثالثة أو الرباعية، ويزيد عرض الخط (وبالتالي ΔH س -1 الانخفاضات) لأي الهندسة الحركي معينة. على العكس من ذلك، والاقتراحات الهيكلية التي تؤدي إلى زيادة في حرية التحقيق في التنقل وينعكس كزيادة في ΔH س -1. F312R1 هو أكثر قدرة على الحركة في حين R296R1 غير قادرة على الحركة، بما يتفق مع بيئاتها المكشوفة ومقيدة للغاية، على التوالي.

وبناء على المعلمات وسهولة الوصول، تدور التسمية في موضع معين على البروتين يمكن أن تصنف على أنها واحدة من التالية: دفن داخل نواة البروتين لا يمكن الوصول إليها إما الماء أو الدهون، وعلى السطح المعرض للمحلول مائي، أو على تتعرض لنسبة الدهون السطحية (أرقام 5 و 6). ويمكن بعد ذلك المعلمات الوصول الحصول على سلسلة من المواقع متتالية أن تستخدم لتحديد هيكل الثانوي من المنطقة، تحقيق مجالات البروتين البروتينالاتصال، وقياس الميل للبروتين في الغشاء، ويقدر عمق الغمر من الحلقات بينية، وتحديد القاعات المياه وجيوب محددة الدهون داخل اللوالب عبر الغشاء. 26 وكمثال على ذلك، والمنحنيات السلطة التشبع في الشكل (6) تبين أن F312R1 لديها وأعلى نسبيا P 1/2 لO بالمقارنة مع R296R1، مما يشير إلى سلاسل الجانب في موقف F312 هي المعرضة للدهن. وبالإضافة إلى ذلك، F312R1 هي أيضا في متناول NIEDDA بالمقارنة مع R296R1 تتفق مع موقعه في واجهة المياه الدهون. من ناحية أخرى، L180R1 في المنطقة حلقة C المجال خارج الخلية هو المحمول ويمكن الوصول إلى NIEDDA، بما يتفق مع موقعها في حلقة المعرضة للمياه.

ديناميات التحقيق وبيانات الوصول في موقف معين توفر المعلومات الهيكلية المحلية عن أن موقف محدد داخل الشامل بروتين أضعاف. هذه المعايير المحددة لآلتسلسل inear من المخلفات على طول البروتين يمكن تحليلها باستخدام أساليب تحليلية على أساس تحويل فورييه الأساليب. هذه التحليلات هي مفيدة لتقييم التغيرات الدورية في العوامل البيئية الثوري وتوجيه في التنبؤ وتوجيه الهياكل الثانوية. بالنسبة لشريحة بروتين معين، وتحويل فورييه المنفصل طيف الطاقة P (ω) يتم احتساب بوصفها وظيفة من الزاوية بين مواقع مجاورة (ω) في هذا الجزء. ثم يتم استخدام هذه المؤامرة لتحديد عنصر التردد الزاوي الرئيسي من الطيف، وبالمقارنة مع (ω) القيم المتوقعة للحلزون α (80-120 درجة) أو β-خيوط (150-180 درجة).
المعادلة 3
حيث P ( 'ω') هو تحويل فورييه طيف الطاقة بوصفها وظيفة من ω التردد الزاوي، n هو عدد من المخلفات في هذا الجزء، هو المعلمة البيئية في هذا المنصب. ف ( 'ω') يحصل على تقييم للω قيمة = المعادلة 6 الذي يزيد P ( 'ω').

وعلاوة على ذلك، معلمة مؤشر دورية (يعطي أهمية للهيكل الثانوي توقع) يحسب كنسبة من المنطقة الخاضعة لطيف الطاقة للزاوية التي تمثل العنصر الهيكلي نظرا إلى أن من المساحة الكلية من الطيف. ثم استخدمت طريقة نافذة انزلاق لتحديد بداية ونهاية العنصر الهيكلي الثانوي معين. التوجه النسبي هذا القطاع فيما يتعلق تبقى من البروتين يمكن تقدير من اتجاه P ( 'أوم') لحظة.

لألفا حلزون:

المعادلة 4

-page = "1"> للβ-حبلا:

المعادلة 5

وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح إلى العديد من أنظمة لتحديد ثلاثة طبولوجيا الأبعاد والتنبؤ بالتغيرات بتكوين الكامنة وراء وظيفة البروتين 14،23،24،41،44-53.

تحديد توزيع المسافة من الجيش الشعبي الثوري

مسافات nitroxide بين فرعية يمكن تحديده من بين الإلكترونات التفاعلات ثنائي القطب. في CW-الثوري، كما هو مبين في الشكل (4)، من خلال الفضاء التفاعلات ثنائي القطب تؤدي إلى توسيع الطيفي وهي وظيفة التقريب بين التسميات. لمسافات تصل إلى ~ 15-20 Å، ومدى توسيع (مقارنة بين أطياف المسمى بالكامل وأطياف المسمى تحت) يمكن استخدامها لشبه كمي تقدير المسافات باستخدامطرق فورييه deconvolution. 28،29

المسافات بين فرعية (<50 أ) يمكن قياسها باستخدام مزدوج الكترون الكترون الرنين أساليب (غزلان). ويتم جمع البيانات 30-34 غزلان في عينات المنظفات أو تشكيلها في nanodiscs بسبب القيود المرتبطة بهذه القياسات في الجسيمات الشحمية 54. للحصول على عينات المسمى تدور في المنظفات (~ 100 ميكرومتر) في المخزن ومع 0.5 ملي DDM، يتم استخدام 30٪ (وزن / حجم) الجلسرين لcryoprotection. يتم الحصول على بيانات تطور الزمن ثنائي القطب في 83 K باستخدام غزلان بروتوكول قياسي أربعة نبض (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2 الصدى 55 على مطياف EPR نابض تعمل على تردد Q-الفرقة (33.9 غيغاهرتز). أطوال نبض ل(π / 2) MW1 و(π) MW1 هي 10 و 20 NSEC، على التوالي، و 40 NSEC ل(π) MW2. ثم يتم تصحيح إشارات غزلان خلفية افتراض backgro متجانسة 3Dاوند وتحليلها من قبل تنظيم تيخونوف 31،56 لتحديد متوسط ​​المسافات والتوزيعات في المسافة.

وتظهر مسافات ضمجزيئي لمنصب تمثيلي في M4 (F314R1) من خلال التجارب غزلان العزم على 7.0 درجة الحموضة في الشكل 7 وبما أن هناك خمسة العلامات تدور داخل مخموس GLIC، ومن المتوقع اثنين على الأقل من مسافات؛ واحد المقابلة لمفارز المجاورة وغيرها من وحدات فرعية غير متجاورة، على الرغم من قمم إضافية قد تنشأ من بديلة التوجهات تدور rotameric. إشارة غزلان يضمحل ويتم عرض التوزيعات الاحتمالية المقابلة. أول قمة لمسافات قصيرة (~ 42A) تمثل المسافات بين الوحدات الفرعية المجاورة، والذروة الثانية (~ 53A) يناظر مسافة غير متجاورة. تظهر ذروة المسافة قطري لتكون على مسافة أقصر، وهذا من المرجح أن يمكن الاستهانة بها لأن قياسات موثوقة وراء 60 Åليست مجدية في ظل الظروف التجريبية نظرا لصعوبات تقنية مع تصحيح الخلفية.

شكل 1
الشكل 1. توصيف البيوكيميائية سبين-صفت GLIC المسوخ. (أ) الممثل هلام الترشيح اللوني من المسمى تدور GLIC بعد انشقاق بروتين العلامة MBP. قمم تتوافق مع GLIC م ب ب مخموس وحرة. (ب) SDS-PAGE تظهر تقطيعه أحادى GLIC-م ب ب بروتين الانصهار (قبل الترشيح هلام) وم ب ب وGLIC الكسور المجمعة من الترشيح هلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. FR ET القائم على الفحص لمراقبة الدولة تجميع من GLIC تشكيلها في الدهون غشاء مختلفة. الحنق وأظهرت قياسات للعينات بعد O / N إعادة (يسار) وبعد تجميد / ذوبان العينات (يمين). (معدلة من الرقم الأصلي). 43 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. السلوك العيانية من GLIC في Proteoliposomes. وفي التصحيح من الداخل إلى الخارج رفعه من تشكيلها asolectin الحويصلات، يتم تنشيط GLIC من درجة الحموضة يقفز باستخدام مبادل حل سريع. وتعتبر القنوات لتنشيط في ~ 10 ميللي ثانية وتوعي مع ثابت وقت 1-3 ثانية. (معدلة من الرقم الأصلي). 43ig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الترتيب البنائي أثناء تنشيط القناة. (A) الممثل أطياف CW-EPR لشغل منصب في المسام بطانة M2 الحلزون، تظهر عليها تغيرات في السعة وخط الأشكال في استجابة للتغيرات درجة الحموضة. في كل حالة، والأطياف هي تطبيع لعدد من يدور. ويظهر موقف المسمى تدور على شكل دائرة سوداء. وتظهر مفارز اثنين فقط من أجل الوضوح. (ب) EPRspectra إظهار توسيع ثنائي القطب من التفاعلات تدور تدور. كان الأطياف في خط متقطع من القنوات تحت المسمى (في وجود تسميات diamagnetic) وفي خط الصلبة كانوا من قنوات وصفت بالكامل. يظهر أقحم تراكب من أطياف-السعة تطبيع. توسيع ظل ظروف وصفت تماما عاليةأضاءت السهام. عرض المسح الضوئي هو 150 غ (معدلة من الرقم الأصلي). 36 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. بقايا محددة البيئية المعلمات تقاس قوة التشبع. قياسات العرض الطيفي (ΔH 0) وسهولة الوصول إليها مذيب (P 1/2) لمدة المواقف المتناقضة في الحلزون M4 المجال عبر الغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. البيئة ممثل حلقة C بقايا في المجال خارج الخلية من GLIC. سبين تطبيع CW-الأطياف والقياسات الوصول المقابلة للL180R1. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الشكل 7. قياسات المسافة التي كتبها النهج نابض-الثوري (غزلان). هيكل GLIC تبين موقع Phe314 والمسافات cβ cβ لمفارز المجاورة وغير المجاورة المقابلة. وترد CW-الأطياف لهذا المنصب على اليمين. طرح خلفية DEER- صدى يتم رسم شدة مع الزمن تطور وتناسب باستخدام خالية من نموذج تيخونوف تنظيم للعينات في صناعة المنظفات. توزيع المسافة بين تدور المقابلة (يمين).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد ثبت الطيفي EPR أن يكون النهج الهيكلي لا مثيل لها في قياس التغيرات متعلق بتكوين بروتينات الغشاء في البيئة القريبة من مسقط رأسه. هذا الأسلوب يتيح لنا نظرة خاطفة في التفاصيل الجزيئية ديناميات البروتين الذي يتم حجب في هياكل عالية الدقة من البلورات بالأشعة السينية والمجهر البرد الإلكترون. ومع ذلك، فمن المهم النظر في القيود التقنية لهذا النهج التي قد تؤثر على تطبيقها بصفة عامة على الأنظمة الأخرى وأيضا أن نأخذ في الاعتبار الحواجز التجريبية المحتملة على طول الطريق. نناقش بعض هذه الجوانب أدناه مع الاستراتيجيات الموصى بها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

من بين القضايا الأكثر شيوعا التي يواجهها المرء مع تقنية تشمل اضطرابات طفرة واسعة هي انخفاض المحصول والاستقرار الفقراء بلازميدة قليلة القسيمات من البروتين. هذا الجانب تتفاقم عند العمل مع بروتينات الغشاء multimeric معقدة مثل القنوات الأيونية. ومن الerefore حاسمة لتحسين هذه الجوانب الحيوية اثنين قبل الشروع في الطفرات واسعة النطاق. وجدنا أن التعبير عن المسوخ GLIC السامة والتسامح أفضل في C41 و C43 سلالات الخلايا BL21 3،36 علاوة على ذلك، خفض درجة الحرارة بعد الاستقراء إلى 15 - 18 درجة مئوية، والحد من تركيز IPTG إلى 100 ​​ميكرومتر، وبما في ذلك 5٪ الجلسرين خلال تحريض يبدو للمساعدة في خفض تراكم بروتين يفترض أن تباطؤ معدل تعبير البروتين والحد من مدى misfolding. وقد ثبت أن الطفرات السيستين في مواقف معينة (خصوصا في مسار تخلل) لزيادة النشاط التأسيسي للقناة ومن المرجح أن تشكل عقبات أكبر في التعبير هذه المسوخ. استخدام حاصرات ثنائي التكافؤ المسام (10 - 25 ملي با 2+) خلال تحريض يخفف سمية ويحسن من نمو الخلايا 57 هذه الاستراتيجيات التي أثبتت فعاليتها في العديد من الحالات إلى تعزيز الغلة، وخفض تراكم بروتين وتعزيز بنسبة ضئيلة.استقرار مركب بسيط. 36،58

خطوة حاسمة أخرى في SDSL هي كفاءة عملية وضع العلامات. في حين يتعرض سطح cysteines يجب أن لا تشكل أي مشكلة في MTSL التفاعلات (> غلة 90٪ التوسيم) والمواقف التي دفن فيها الجانب سلاسل السيستين ويصعب الوصول إليها قد تتطلب أعلى تركيزات تدور التسمية وحضانة مرات أطول. زيادة تركيز تدور التسمية إلى زيادة الرحى 30 أضعاف واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية يساعد على تحسين كفاءة وصفها. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا أن قياس أطياف القالب السيستئين-أقل المسمى لتحديد مساهمة الخلفية. للمواقع التي وصفت سيئة (<10٪)، وإشارة الخلفية تغمر أطياف العام. في حين تحديد كفاءة تدور وضع العلامات، لاحظ أن دقة يتأثر بعدد من العوامل التي تشمل حجم العينة، وقطره عينة الشعرية، وتحديد المواقع الشعرية داخل مرنان، ودرجة الحرارة تجويف، ومرنان سالقيمة (التي هي نسبة من الطاقة المخزنة فيه على الطاقة تبدد الخروج). يجب توخي الحذر للحفاظ على هذه الشروط متطابقة بين العينات والمعايير. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن لمواقع متحركة، حيث أطياف واسعة في جوهرها، دقة قياس العلامات قطرات أبعد من ذلك. بدلا من ذلك، الكروماتوجرافي السائل الوقت من الطيران-Electrospray التأين الطيف الكتلي (LCT-ESI-MS) يمكن استخدامها لتحديد مباشرة الكتلة الجزيئية، وبالتالي وصفها الكفاءة. ومع ذلك، يتم المساس حساسية MS للعينات في المنظفات وللبروتينات غشاء مطوية بإحكام.

وحالما يتم تنقية المسوخ كما يبلغ عدد سكانها متجانسة، من المهم للتأكد من وظائف من التحضير. وقياسات التصحيح، المشبك من المسوخ المسمى تدور في المناطق الرئيسية لقناة تكشف عن تأثير الاضطراب على تقارب يجند وقناة النابضة. بدلا من ذلك، خصائص قناة يمكن دراستها في الأسود LIPID الأغشية (بلم) 59 أو عن طريق حقن proteoliposomes إلى البويضات وقياس التيارات من قبل اثنين من القطب المشبك الجهد. 59-61 إذا ما تبين أن استبدال السيستين وتدور التسمية في بعض المواقف يغير يجند حساسية أو النابضة حركية القنوات، والظروف التجريبية (تركيز يجند، جهري، والدهون التكوين) يمكن أن تختلف بشكل مناسب لتحقيق الاستقرار في الدولة بتكوين قيد التحقيق. علاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن يتم إجراء قياسات الثوري تحت ظروف الحالة المستقرة، وبالتالي يتغير في حركية السريعة للقناة هم أقل عرضة للتأثير على تفسير الهيكلي.

ومن الواضح أن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دراسة ديناميات قناة في أغشية تكوين المعرفة وللتحقيق بشكل مباشر على مدى الآثار بوساطة الدهون على ديناميات يغير وظيفة القناة. ومع ذلك، فإن الحد هو أن بعض التراكيب الدهون قد يسبب تجميع الجانبي للقنوات سن الغشاء، وبالتالي مدى ملاءمة الدهون لا بد من التأكد. 45 لالظروف التي لا سبب التجميع، خفض البروتين إلى الدهون النسبة، تنفيذ إعادة في درجة حرارة أقل، وتقصير مدة من الزمن إعادة قد تساعد في الحفاظ على قنوات monodisperse 62 بدلا من ذلك، قنوات يمكن تشكيلها في nanodiscs، والتي هي تجمعات الدهون النانوية تحيط به حلقة من متقابلة الزمر بروتين الغشاء سقالة (ئي A1). 63 عن طريق تحسين نسبة المولي من البروتين قناة، مكونات الدهون، وغشاء البروتين السقالات، فمن الممكن لتحقيق السكان متجانسة وأحادية تفريق الوحدات قناة واحدة تدمج nanodiscs فرد. هذا النظام له العديد من المزايا الإضافية في أن nanodiscs واضحة بصريا وتوفير سهولة الوصول إلى كل من داخل وخارج الخلية الجانبين من الغشاء.

وأخيرا، على مستوىمن القياسات الثوري، يمكن للمرء أن يكون واجه مع CW-الثوري الأطياف التي ليست واضحة لتفسير، خاصة بالنسبة للمواقع التي تظهر أطياف متعدد المكونات. وقد تنشأ هذه التجانس بتكوين من تبادل ببطء التشكل من البروتين و / أو توجهات متعددة من تدور التسمية في التشكل بروتين معين. تحديد المساهمة النسبية للسيناريوهين ليست تافهة وقد تتطلب استخدام المشتقات بديلة تدور التسمية، أو تغيير درجة الحرارة التجريبية، 64 ضغط، 65 شدة المجال / تردد الموجات الدقيقة، 66 أو اضطراب osmolyte 67

وعلاوة على ذلك، والقياسات غزلان في الجسيمات الشحمية قد تكون محدودة بسبب عدد من العوامل، بما في ذلك أقل حساسية، مساهمة خلفية ارتفاع الناتجة عن التفاعلات بين الجزيئات محسنة، وانخفاض في نطاق مسافة قابلة للقياس (<50A). بشكل عام، لمسافات أطول (<50 أ)، هناك شيء عظيمعدم اليقين إيه في الاعراض من توزيع المسافة نظرا لعدم كفاية الأوقات تطور ثنائي القطب. ومع ذلك، فقد ثبت استخدام س الفرقة (34 غيغاهرتز) تردد الموجات الدقيقة ووضع العلامات مع تسمية تدور bifunctional (مع انخفاض ديناميات الجوهرية) لتخفيف بعض هذه القيود. وقد أظهرت 54 إعادة تشكيل في nanodiscs أيضا إلى تحسين كبير حساسية غزلان من قبل انخفاض المساهمات الخلفية التي تنشأ من التفاعلات بين الجزيئات ثنائي القطب. 15

وعلى الرغم من هذه القيود، SDSL / دراسات الثوري، وخاصة في الأنظمة مع قليل من cysteines الأصلي، وقد ثبت أن تكون مفيدة بشكل ملحوظ. تتجه التطورات التكنولوجية في المستقبل نحو التكيف مع هذه طريقة فعالة لدراسة قنوات الإنسان أكثر تعقيدا، حيث يتحور cysteines الأصلي قد لا يكون ممكنا. في هذا الصدد، وتطوير استراتيجيات العلامات بديلة مثل تلك التي تقوم على تأسيس مواقع محددة من الأحماض الأمينية غير طبيعي، 68 أو synthesis من التسميات التي تستهدف الأحماض الأمينية الأخرى، 69 تظهر لعقد وعدا كبيرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون جدا لأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chakrapani للقراءة وتعليقات نقدية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (1R01GM108921) وجمعية القلب الأميركية (NCRP التنمية العلماء غرانت 12SDG12070069) وSC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter