Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

Introduction

בעשור האחרון, ההבנה המבנית של תעלות יונים ליגנד מגודרת pentameric (pLGIC) גדלה בצעדים ענקים, בשל המוני מבנים ברזולוציה גבוהה של כמה מחברי המשפחה. גורמים מרכזיים אשר הובילו ההתקדמות הנוכחית בתחום כוללים, גילוי ערוצי pLGIC פרוקריוטים, 1-3 התקדמות מרכזית ביטוי חלבון קרום האיקריוטים, 4-6 ופריצות דרך עצומות בגישות קביעת מבנה. 7 מבנים אלו מספקים קונסנסוס ברור על השימור הכולל של הארכיטקטורה תלת-הממדים של pLGIC. עם זאת, שני תחומים עיקריים שנראים נשרכים הם האפיון הפונקציונלי של הכנות אלו בערוץ והתיאור מכניסטית של פונקצית ערוץ.

שינויי מרחביים gating הם מורכבים המתרחשים על פני מרחק 60 Å לאורכו של הערוץ ומעברים אלה הם מווסתים על ידי בהרחבהליפידים קרום. בפרט, שומנים שליליים, כולסטרול, פוספוליפידים הוכחו לווסת את תפקוד pLGIC 8-11. בעוד התפקיד המדויק של מרכיבי השומנים האלה בתפקוד ערוץ נותר עלום, הבנה מולקולרית מלאה של gating תדרוש לימוד תעלות אלה בסביבת מולדתם. לאתר בימוי ספין תיוג (SDSL) ואלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הן טכניקות של בחירה ללימוד הדינמיקה חלבון במערכות מחדש. ספקטרוסקופיה EPR אינה מוגבל על ידי הגודל המולקולרי (כמו NMR) או הנכס האופטי של המדגם (כמו ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי), ובכך מאפשרת מדידות של מבנים באורך מלא מחדש בתנאי שומני ילידים. הטכניקה היא רגישה מאוד ויש לו דרישות מדגם נמוכות יחסית (בטווח פיקו-השומה). שני היבטים אלה להפוך את הטכניקה גם מתאימה ללימוד חלבונים בממברנה גדול שקשה לבטא בלמעלה מיליגרםכמיות.

שימוש ספקטרוסקופיה EPR בשילוב עם תיוג ספין מכוון אתר נבנה על ידי וויין Hubbell ועמיתים, הותאם בלימוד מגוון של סוגי חלבון. 12-24 נתונים EPR שמשו לחקור מבנים משניים, שינויים בחלבון קונפורמציה, עומק קרום-הכנסה, וכן חלבונים / אינטראקציות ליגנד חלבון.

השיטה כרוכה החלפת ציסטאין בעמדות של הריבית על ידי mutagenesis באתר ביים. כדי להבטיח תיוג אתר ספציפי, יש צורך להחליף cysteines הילידים עם חומצת אמינו נוספת (למשל., סרין) כדי ליצור תבנית ציסטאין-פחות. By רחוק, את תווית הספין הפופולרית ביותר היא MTSL תיאול ספציפי: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-מתיל) methanethiosulfonate שמתחבר החלבון דרך גשר אג"ח דיסולפיד. בשל סגולי הגבוה שלה, גודל קטן יחסית (מעט גדול יותר טריפטופן), ו Flexibility של האזור המקשר, התווית ספין זה הוכח יש תגובתיות מעולה אפילו עם ציסטאין קבור. יתר על כן, על מנת למקסם את תגובתיות, תגובת התיוג של החלבון מתבצעת בצורה דטרגנט-solubilized. לאחר ההפרדה של ספין-תווית חינם עודף ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל, החלבון מחדש לתוך ליפוזומים או מערכות מחקי bilayer של רכב שומנים מוגדר. באופן כללי, mutagenesis ציסטאין נסבל היטב ברוב החלקי של החלבון, ואת הגודל קטן יחסית של-חללית ספין גורם הפרעות מינימאליות למבנים השניוניים ושליישונים. כדי להבטיח כי השינוי שומר פונקציות סוג ברות, הערוצים שהכותרת ומשוחזרים ניתן ללמוד על ידי מדידות תיקון- clamp.

החלבון הנקרא תפקודי אז הוא נתון מדידות ספקטרוסקופיות, אשר למעשה לספק שלושה סוגים עיקריים של מידע: 12,14,15,20,22,23,25-27 דינמיקת ספין-חללית על ידי lineshניתוח קוף; נגישות של החללית לסוכני הרפיה פאראמגנטיים; ומרחק הפצה. 27 מרחקי EPR נמדדים על פי שתי גישות שונות. הראשון מבוסס על טכניקת הגל (CW) הרציפה, שבו הרחבת ספקטרלי הנובעת מתגובות בין dipolar בין ספין-תוויות (ב 8 - טווח מרחק 20 א). משמשת לקביעת מרחק 28,29 השני הוא פעם-EPR שיטה שבה מדידות מרחק יכולות להתארך עד 70. 30-34 בכפול אלקטרוני אלקטרוני תהודה (צבי), תנודות משרעת-הד הספין מנותחות כדי לקבוע מרחקי הפצות מרחק. כאן הד הספין הוא מווסת בתדר של אינטראקצית dipolar. יחד, פרמטרים אלה משמשים כדי לקבוע טופולוגיה חלבון, אלמנטים מבניים משניים, ושינויי חלבון-קונפורמציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mutagenesis לאתר בימוי ומוטציות Cys

  1. שיבוט mutagenesis
    הערה: סוג בר GLIC (WT) 35 יש ציסטאין חד הילידים (C27), אשר עובר מוטציה כדי סרין כדי ליצור רקע ציסטאין-פחות. מוטציות ציסטאין מוצגים על רקע ציסטאין-פחות על ידי mutagenesis באתר ביים באמצעות פריימרים שנושאים קודון ציסטאין במיקום הרצוי 36.
    1. מערבבים 5 μl של חיץ התגובה 10x, 1 μl של 100 ng / μl ציסטאין-פחות DNA תבנית GLIC 35, 0.5 μl כל אחד 40 מיקרומטר קדימה לאחור תחל 36, 1 μl של dNTPs (100 מ"מ), ו -41 μl של מים ללא יונים . פיפטה מדגם כמה פעמים כדי לערבב אותו ביסודיות, ספין (6,000 סל"ד) ולבסוף להוסיף 1 μl של פולימראז ה- DNA.
    2. הגדר את-Cycler תרם לפרוטוקול הבא:
      1. Denaturation ב 95 ºC למשך 4 דקות.
      2. Denaturation ב 95 ºC למשך 30 שניות.
      3. לְחַשֵׁלing ב 55 ºC דקות 1.
      4. התארכות 68 ºC למשך 10 דקות (בערך 1 דקות לכל אורך פלסמיד kb).
      5. חזור על שלבים 1.1.2.2 - 1.1.2.4 עבור 18 מחזורים.
      6. התארכות סופית ב 68 ºC למשך 10 דקות.
      7. החזקת הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס
        הערה: טמפרטורת חישול מחושבת על בסיס פריימר TM.
    3. הוסף 1 μl של DpnI לתערובת התגובה, לערבב היטב על ידי pipetting, ספין למטה (6,000 סל"ד) 1 דקות. דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. טרנספורמציה
    1. הפשרת E. תאים מוסמכים coli על קרח. Aliquot 30 μl של תאים לתוך צינור טרנספורמציה סטרילי 14 מ"ל ולהוסיף 1 μl של ה- DNA מעוכל על התאים. מערבבים על ידי הקשה על הצד של הצינור. דגירה במשך 20 דקות על קרח.
    2. מניחים את הצינור בתוך אמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ולאחר מכן למקם אותו בחזרה על קרח במשך 2 דקות. להוסיף 400 μl סטרילי תקשורת SOC ולנער את התאים בתוך incuבטור ב 37 ºC עבור שעה 1.
    3. פלייט 100 μl של תאים על צלחות LB המכיל kanamycin (50 מיקרומטר) וגלוקוז 1%. דגירה צלחות O / N ב 37 ºC.
    4. קציר מושבה אחת מהצלחת ולחסן ב 5 מ"ל O / תרבויות N המכיל התקשורת LB / kanamycin. דגירה O / N תרבות (~ 16 שעות) בשעה 37 ºC ב שייקר אינקובטור.
    5. תמצית ה- DNA מתרבות O / N ידי minipreparation 37. לכמת את התשואה של ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר ידי מדידה הספיגה באורך גל 260 ננומטר. הריכוז צריך להיות ~ 100 - 200 ng / μl. לאשר את קיומו של מוטציה על ידי אסטרטגיות רצפי DNA סטנדרטיות רקומביננטי 38,39.

2. ביטוי טיהור GLIC

  1. טרנספורמציה
    1. ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 1.2, להפוך 30 μl של תאים המוסמכות C43 עם 1 μl (~ 100 - 200 ng / μl) של פלסמיד המכיל את הגן המקודד GLIC יחד עם אתר מחשוף פרוטאז -3C האדם rhinovirus (HRV) (עבור רצף פלסמיד גנים, מתייחסים לטקסט משלימה) 35 (משלב 1.2.5).
    2. פלייט 100 μl של תאים על צלחות LB-אגר המכיל גלוקוז 1% ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin, דגירה אותם O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ºC באינקובטור.
    3. בדוק חזותי עבור מושבות ולוודא כי הם אינם יתר גדל או להראות הנוכחות של מושבות בלווין. מייד לאטום את הצלחות עם parafilm ולאחסן אותם ב 4 ºC.
  2. הגדרת O / N-תרבויות הכנת תקשורת צמיחה
    1. פיק מושבה אחת מבודדת באמצעות לולאת חוט ייחס ולהעביר לתוך בקבוק סטרילי 100 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של לוריא מרק (LB) בתקשורת בתוספת גלוקוז 1% סטרילי 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin. דגירה אותם O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ºC שייקר ב 250 סל"ד.
    2. מרק נהדר חיטוי 900 מיליליטר (TB) מדיה (ראה מדיה ורכב Buffer) ב 2.8L Fernbach צלוחיות זכוכית עבור התרבות חיידקים במחזור קיטור ב 121 ºC למשך 20 דקות.
  3. הגדרת תרבויות צמיחה גדולות
    1. הוספת 100 מ"ל של חיץ פוספט אשלגן סטרילי (ראה מדיה והרכב Buffer) לתקשורת TB autoclaved. להוסיף גלוקוז סטרילית (0.2% ריכוז סופי), kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל), ו -10 מ"ל של התרבות O / N. לדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר ב 250 סל"ד.
    2. בדוק את צפיפות אופטית באורך גל 600 ננומטר (OD 600) densitometer באמצעות או ספקטרופוטומטר כל שעה עד שהוא מגיע 0.5 (~ 2 שעות). בשלב זה להפחית את המהירות ל 150 סל"ד ו להנמיך את הטמפרטורה ל -18 מעלות צלזיוס. לפקח על OD 600 כל 30 דקות עד שהוא מגיע 0.8 (~ 1 שעה).
    3. הוסף 50 מ"ל של גליצרול ולהמשיך רועד התרבות עד OD 600 מגיע 1.0 - 1.2 (~ 15 - 30 דקות).
      הערה: בתנאים אלה, זה לוקח בערך שעה לתרבות להגיע 18 ºC מ -37 ºC. זה שדortant גליצרול כי מתווסף בתרבות לאחר שהכל התקרר ל -18 ºC.
    4. להשרות את התאים עם 200 מיקרומטר IPTG (איזופרופיל- thio-β-galactoside) ולאפס את שייקר חזרה 250 סל"ד ו דגירה נוספת עבור ~ 16 שעות ב 18 ºC.
  4. טיהור חלבון
    1. ודא כי OD 600 בסוף 16 שעות הוא ~ 16 - 18. קציר התאים בקבוקי צנטריפוגות 1.0 L ידי ספינינג ב 8,500 XG, 4.0 ºC במשך 15 דקות. למזוג supernatant ולשקול את הבקבוק עם תא גלולה. לחשב את המשקל של הגלולה על ידי הפחתת משקל של הבקבוק הריק מן המשקל הכולל.
      הערה: משקל תא הגלול הצפוי הוא ~ 30 - 35 גר '/ ל. אמנם, זה יש לציין כי ייתכנו השתנות במשקל OD 600 ותא גלולה הסופי ברחבי מוטציות.
    2. Re- להשעות את גלולה חיידקים 150 מ"ל של חיץ קר כקרח (100 mM NaCl, 20 מ"מ טריס, pH 7.4) לכל 1.0 ליטר של תרבות. הוסף DNase אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו proteasמעכבי דואר (פלואוריד phenylmethyl sulfonyl (1 מ"מ), leupeptin (2.0 מיקרוגרם / מ"ל), aprotinin (2.0 מיקרוגרם / מ"ל), ו pepstatin A (1 מיקרוגרם / מ"ל)).
    3. Homogenize התאים על ידי העברת אותם באמצעות משבש תא בחדר 4.0 ºC קר. חזור על התהליך שלוש פעמים, כך רוב החיידקים הוא lysed. צנטריפוגה התאים ב 14,000 XG במשך 15 דקות ו פיפטה supernatant החוצה ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגות נקי. וזורק את הכדור, אשר מכיל תאים בלתי lysed וגופי הכללה.
    4. צנטריפוגה supernatant ב 168,000 XG במשך שעה 1. בזהירות למזוג supernatant מבלי להפריע גלולת הקרום.
    5. פינת גלולת הקרום מ 1 ליטר של תרבות מחדש להשעות אותו ההצפה (בתוספת גליצרול 10%) לנפח סופי של 50 מיליליטר. הוסף 0.5 גרם של n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) על השעיית הממברנה nutate עבור שעה 2 ב 4.0 מעלות צלזיוס.
    6. לאחר solubilization הממברנה, להסיר שאריות תאים מן lysate ידי centrifugation ב 168,000 XG עבור 1 שעות. בינתיים להכין שרף amylose. העברת 3 מ"ל של שרף בעזרת פיפטה לתוך עמודה כרומטוגרפיה פוליפרופילן ריק. שטוף את השרף על ידי העברת 10 כרכי מצע המים 3 פעמים ולאחר מכן עם 10 כרכי מצע ההצפה המכילים 0.5 המ"מ DDM.
    7. לאחר צנטריפוגה, בעדינות להוציא את supernatant בעזרת פיפטה ולהעביר לצינור 50 מ"ל חרוטי נקי. עבור אצווה חכם מחייב, להוסיף שרף amylose מראש equilibrated אל צינור חרוטי. לחייב את חלבון חילוץ שרף amylose ידי nutating את התערובת במשך שעה 2 ב 4.0 מעלות צלזיוס.
    8. לעבור את התערובת הדלילה כולו דרך עמודת כרומטוגרפיה לאסוף את הזרימה דרך. ואז לעבור את הזרימה דרך שנאספו כולו על שרף בשנית על מנת למקסם מחייב.
    9. לעבור 10 כרכי מיטה של ​​חיץ עם 0.5 המ"מ DDM, 0.5 טריס מ"מ (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) ו -1 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) להסיר חלבונים מאוגדים.
    10. Elute החלבון GLIC עם 10 מ"ל של bufFer a המכיל 40 מ"מ מלטוז בנוסף 0.5 מ"מ DDM ו 0.05 מ"מ TCEP. TCEP מונע חמצון של רשתות בצד ציסטאין. אסוף את elute כולו.
    11. תתרכז החלבון eluted באמצעות רכז צנטריפוגלי (משקל מולקולרי חתוכים = 50 KDA) - 4 6 מ"ג / מ"ל ​​ולהוסיף פרוטאז HRV-3C (200 מיקרוגרם לכל 10 מ"ג חלבון) דגירה O / N ב 4.0 ºC.
      הערה: לברר את השלמת העיכול פרוטאז ידי הפעלת דוגמאות על ג'ל עמוד SDS (ראה שלב 2.5.5 ואיור 1).
  5. לאתר בימוי ספין-תיוג
    1. הפוך על 100 μl של 200 מ"מ המניות של (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-מתיל) MTSL 40 ב DMSO ולאחסן את המניה ב -20 ºC ב 25 aliquots μl.
    2. השתמש מדגם מתעכל-פרוטאז עבור ספין תיוג עם MTSL. להוסיף עודף טוחן פי 10 של MTSL הספין-label (מונומר GLIC: MTSL ב 01:10 יחס טוחן). לדגור על הקרח במשך שעה 1. אם מוסיפים שוט השני של התווית ספין על עודף פי 5 טוחנתיחס דגירה במשך שעה נוספת.
      הערה: לקבלת עמדות קבורות (עם יעילויות תיוג ספין נמוכות, המתואר להלן), 30 פעמים עודפות טוחנת של התווית ספין הוא הוסיפה את החלבון וטופח במשך 6 שעות.
    3. להעביר את המדגם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר בגודל הדרה עמודה (FPLC) כי הוא-equilibrated מראש עם הצפת ו -0.5 מ"מ DDM להפריד בין MBP ביקע ואת הספין-תווית חינם עודף pentamers GLIC. אסוף 1 מ"ל שברים עבור סכום כולל של elution 30 מ"ל. פינת השברים המכילים pentamers GLIC (איור 1). פעל על פי ההוראות של היצרן כדי להפעיל את FPLC.
    4. קבע את הריכוז של המדגם באמצעות ספקטרופוטומטר ידי מדידה הספיגה באורך גל 280 ננומטר. מקדם הכחדה טוחנת ועל המשקל המולקולרי המוערך של מונומר GLIC הוא 49,850 M -1 cm -1 ו 36,380 דא, בהתאמה. תתרכז פתרון החלבון באמצעות concentrator צנטריפוגלי (מולקולרימשקל Cut-off = 50 KDA) לריכוז סופי של ~ 8-10 מ"ג / מ"ל ​​ומניחים אותו על קרח. המדגם הוא מוכן כעת כינון מחדש.
    5. כמו בדיקת איכות נוספת כדי להבטיח שההכנה היא הומוגנית מבחינה ביוכימית, להריץ צמצום (1.0% β-ME) ג'ל SDS-PAGE.
      הערה: מוכתם Commassie הג'ל צריך להראות להקה אחת ב ~ 33 kDa מתאים מונומר GLIC (איור 1).
    6. עבור המוטציות שכותרתו ספין חשודים מפגינים הרחבת dipolar, תחת תווית הדגימות בנוכחות תווית diamagnetic 41. דגירה-חלבון eluted עם MTSL 0.1 פי דגירה על קרח למשך 1.0 שעות. לאחר מכן, להוסיף עודף טוחנת פי 20 של תווית diamagnetic (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-מתיל) thiosulfonate מתאן.
      הערה: מגיב diamagnetic משמש כאן היא iso-סטרית לתווית פאראמגנטיים עם כימית תיוג זהה.
    7. דגירה המדגם על קרח במשך 2 שעות. להעביר את המדגם דרך sizהעמודה כרומטוגרפיה דואר הדרה כלומר עם טרום equilibrated הצפת ו -0.5 מ"מ DDM כמו שלב 2.5.3.
  6. יעילות של תיוג ספין
    1. יעילות ספין-תיוג מוגדר כיחס בין ריכוז-תווית לסיבוב כדי ריכוז של שרשרת הצד ציסטאין (GLIC-מונומר). כדי לקבוע את היעילות של ספין-תיוג של המדגם, העוצמת המשולבת של המדגם תושווה עם רמת הריכוז ידוע באמצעות עלילת כיול. הפוך פתרונות של תקן EPR (כגון 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) במגוון ריכוזים (10 - 250 מיקרומטר) על ידי המסה במים.
    2. מדוד את האות EPR לכל הפתרונות הללו ולקבוע את השטח מתחת לעקומה (אינטגרציה כפולה של האות EPR) עבור כל ריכוז (כמתואר שלבים 6.1). ליצור עקומת כיול על ידי התוויית באזור נמדד כפונקציה של ריכוז TEMPO והתאמת עם קו ישר.
      הערה: הםתחת אות נגזרת EPR הוא תיאור טוב יותר של עוצמת רפאים מאשר שיא המשרעת שיא. שילוב האות הראשונה נגזר EPR ייתן את ספקטרום הבליעה, אינטגרציה שנייה ואז תיתן את השטח מתחת ספקטרום הספיגה (אשר עומד ביחס לריכוז הספין). ודא בסיס קבוע הוא השדה הנמוך באזור שדה הגבוה של הספקטרום.
    3. למדוד את ריכוז של חלבון הנקרא ספין הדטרגנטים באמצעות ספקטרופוטומטר (כמו בשלב 2.5.4). עכשיו למדוד את אות EPR של המדגם ולאחר מכן לקבוע את האזור של אינטגרל הכפול של אות EPR ביצוע השלבים בסעיף 6.1. באמצעות עלילת הכיול, לקבוע את הריכוז של התווית אשר תואמת את האות הנמדדת EPR. חשב את יעילות תיוג ספין כיחס הטוחן של התווית ספין ריכוז חלבון.

3. כינון GLIC בממברנות Asolectin

  1. לשטוף בקבוק עגול תחתית 25 מ"ל נקי עם 5 מ"ל של כלורופורם לייבש את הבקבוק בתוך זרם של גז N 2 במנדף. העברת 10 מ"ג של asolectin (תמצית קוטב סויה 25 מ"ג / מ"ל המניות כלורופורם) לתוך הבקבוק ולייבש את השומנים תחת זרם רציף של גז N 2.
    הערה: הבחירה של שומני כינון מחדש מבוססת על ממצאים מניסויים בסעיף 4.
  2. כאשר כלורופורם התאדה, למקם את הבקבוק בתוך חלל ריק עבור שעה 1 כדי להבטיח ייבוש מלא. הוסף 1 מיליליטר של כינון מחדש הצפה אל השומנים היבשים מערבולת הבקבוק בחוזקה כדי להאיץ את גלולת השומנים לתוך השעיה.
  3. כדי להכין שלפוחית ​​unilamellar קטנה, sonicate השעית השומנים בתוך sonicator אמבטיה קרה עד פתרון השלפוחית ​​הופך פחות או יותר שקוף ולא גושים הם נצפו (בערך 10 - 15 דקות). לתערובת זו, להוסיף DDM לריכוז סופי של 4 מ"מ ו לדגור על RT למשך 30 דקות.
<li> כינון
  1. מוסיפים את החלבון מטוהרים משלב 2.5.4 לתערובת השומנים.
    הערה: יחס חלבון-ל-שומנים תלויים בסוג הניסוי. למדידות זרם מקרוסקופית, יחס של 1: 10,000 משמש. עבור מחקרי EPR, כינון מחדש נעשה חלבון גבוה יחס שומנים (1: 2,500) על מנת למקסם את האות. הוא בעבר הראו כי בריכוזים אלה, אין צבירה לרוחב הוא ציין 42.
    הערה: כמות עבודה טיפוסית של GLIC עבור EPR היא ~ 1 מ"ג, למרות המבוססת על המיקום חקר, כמויות נמוכות תעבודנה גם כן.
  2. דגירה מדגם ב 4 ºC עבור שעה 1 עם סיבוב עדין ואז לדלל את המדגם ל -15 מ"ל עם הצפת א
    הערה: צעד זה מביא את ריכוז חומרי הניקוי מתחת ריכוז micellar הקריטי (CMC).
  3. להסיר את נוזל הכלים השיורי ההשעיה על ידי הוספת חרוזי פוליסטירן (עם נקבוביות הידרופובי כי חומר ניקוי מלכודת). הוסף 80 מ"ג של נקי חרוזי דגירת liposשת ההשעיה O / N על nutator ב 4 ºC.
    1. כדי להכין את החרוזים לשימוש, שוקל ~ 100 מ"ג ולהעבירם צינור חרוטי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של מתנול, לנער במרץ, ספין למטה חרוזים ב 8000 XG במשך 2 דקות, למזוג מתנול. חזור על תהליך זה של מתנול לשטוף שלוש פעמים. חזור על אותו התהליך עם 30 מ"ל מים ללא יונים, שטיפת שלוש פעמים.
  4. למחרת, להעביר את liposome לצינור ultracentrifuge 25 מ"ל באמצעות מסנן עמודה כדי להסיר את החרוזים ובהמשך לדלל את המדגם ל -25 מ"ל. צנטריפוגה דגימות ב 168,000 XG במשך שעה 2.. למזוג supernatant מחדש להשעות גלולה באמצעות 100 μl של הצפת B.

4. לקבוע רכב ליפידים אופטימלי עבור כינון ידי סריג

  1. השתמש תהודת העברת אנרגית פלואורסצנטי (סריג) assay המבוסס לקביעת רכב הממברנה אשר שומר על החלבון monodisperse.
  2. לטהר WT
  3. בעקבות הנחיות מפורטות בסעיף 3.2 עבור כינון מחדש, להכין שלושה מדגמים שונים עבור כל רכב שומנים להיבדק; ראשית, והעמסה שכותרתו GLIC ב טוחן יחס של 1:. 1,500 (pentamer: שומנים בדם) שנית, rhodamine שכותרתו GLIC על יחס טוחן של 1: 1,500 (pentamer: שומנים בדם). והעמסה ו rhodamine solubilized דטרגנט שלישי, לערבב שכותרתו GLIC (1: 1 יחס טוחן). לשקם את התערובת ב 1: 750 (pentamer: שומנים בדם) יחס.
    הערה: השתמשנו בשלוש מערכות שומנים: asolectin, POPC: POPG (3: 1 יחס טוחן), וא ' תמצית קוטב coli. החלבון כדי שומני יחס הכינון מחדש בניסוי הסריג גבוה מזה המשמש למדידות EPR (1: 750 לעומת 1: 1,500 המשמשים לימודי EPR).
  4. לְדַלֵלההשעיה liposome (כדי להפחית את האות פיזור אור; ~ 5 μl ב 995 μl של הצפת) אז פיפטה מדגם לתוך קובט קוורץ ומניחים אותו בתוך fluorimeter.
  5. קבע את אורך גל העירור ב 490 (אשר תואם את המקסימום הקליט התורמת: וההעמסה). באמצעות הוראות היצרן, להקליט את ספקטרום הפליטה מ 500 ננומטר עד 660 ננומטר.
    הערה: למדגם GLIC שכותרתו והעמסה, תראה לשיא ב 518 ננומטר (המקביל ל פליטה והעמסה) ללא לשיא 572 ננומטר (המקביל ל פליטת rhodamine). למדגם GLIC שכותרתו rhodamine, לא תראה לשיא ב 518 ננומטר אבל במקום ב 572 ננומטר הנובעים עירור ישיר של rhodamine ב 490 ננומטר. עבור המדגם המכיל שני התוויות והעמסה ו rhodamine, ירידה בעוצמת שיא והעמסה ו גידול מקביל לשיא rhodamine היא אות סריג שעשויה אינדיקטור הצבירה לרוחב של החלבון על הממברנה.
  6. לפקח עלמשרעת של פליטת rhodamine ב 572 ננומטר במרווחי זמן שונים (בין 0 - 24 שעות) הקלטה בכל שעה במשך 6 השעות הראשונות ולאחר מכן לאחר O / דגירת N (איור 2). עבור כל מרווח, למדוד את עוצמת הקרינה ב 572 ננומטר (עבור rhodamine: Ia) ועל 518 ננומטר (עבור והעמסה: Id). הפחת את תרומת ההפעלה rhodamine ישירה (מדגם 2 בשלב 4.3) מ Ia (IAC). קבע את יחס סריג כמו בינ"ל / (IAC + Ib). השוואת סריג במרווחי זמן שונה ועל פני קומפוזיציות שומנים שונות.
    הערה: כביקורת, לבצע שלב 4.5 ו -4.6 עבור דגימות חומר ניקוי solubilized ולהשוות את ספקטרום הפליטה לאלה מן ליפוזומים מחדש. השתמש תערובת equimolar של חלבון הנקרא דטרגנט (כמתואר בשלב 4.3) ו לדלל ב הצפת בתוספת 0.5 מ"מ DDM. צפוי כי דגימות חומר ניקוי יראת אות סריג מינימאלית.

5. מדידות תפקודיות על ידי הקלטות תיקון מהדק

  1. כן proteoliposomes למדידות-מהדק תיקון בדיוק באותה צורה כמו ללימודי EPR (סעיף 3.1).
    הערה: עם זאת, להתאים את החלבון: שומנים יחס בהתאם לסוג מדידה שנעשה (Single-ערוץ vs הקלטות מאקרוסקופיים). פלאש להקפיא את proteoliposomes בחנקן נוזלי חנות ב -80 ºC עד השימוש. בדרך כלל, לשקם GLIC ב 1: 10,000 חלבון: שומני בדם (יחס טוחן) עבור זרמי מקרוסקופית 1: 50,000 יחס טוחן להקלטות חד ערוצים.
  2. ליפוזומים להפשיר על הקרח. יש לשטוף שקופית זכוכית נקייה עם מים ואתנול ויבש לחלוטין. מניחים ירידה 10 μl של proteoliposome על מרכז של השקופית ויבש O / N ייבוש ב 4 o C תחת ואקום.
  3. Re מימה proteoliposomes מיובש על ידי הוספת 20 μl של הצפת B (150 mM NaCl, 10 HEPES מ"מ, pH 7.0) ומניחים את השקופית petriplate על גבי נייר סינון לח. מכסים את הצלחת ולאפשר התייבשות להמשיך במשך כ -2 שעות.
    הערה: זה תהליך YieLDS ליפוזומים רב שבשבת ענקית תורם תיקון מ.
  4. משוך טפטפות תיקון מתוך נימי זכוכית בורוסיליקט בעלי קירות דקים (~ 1 - 2 בקוטר טיפ מיקרומטר) באמצעות יצרן של המליצה להעמיד על חולץ פיפטה. משחת חום באמצעות אש לזייף התנגדות של 1.5 - 2MΩ כאשר מלא עם הצפת B.
  5. ממלא את חדר ההקלטה עם ההצפה B בעזרת פיפטה ולצרף את האלקטרודה קרקע Ag / AgCl. בעזרת קצה פיפטה 2 μl, לעקור את ליפוזומים בעדינות מהקצה והעברת 1 μl של השעיה על חדר ההקלטה. מתן מספר דקות עד ליפוזומים כדי ליישב לתחתית.
  6. מלאו את פיפטה תיקון עם הצפת B באמצעות מחט המזרק אל מתכתיים ולעגן אותה על הבמה ראש מגבר. זהה את שלפוחית ​​יחידה מבודד לתקן. החל לחץ חיובי קל כדי למנוע את פיפטה התיקון מפני שסתם, והכנס את הקצה לתוך תא ההקלטה.
  7. החל פולסים הבדיקה למדוד את פיפטה עמידNCE ולפצות על מתח פיפטה לקזז. מתקרב השלפוחית, וכאשר נוצר מגע, להחיל לחץ שלילי קל למשוך את השלפוחית ​​בעדינות נגד פיפטה את התיקון כדי ליצור חותם gigaohm.
  8. צג את ההתנגדות של פיפטה במהלך התהליך כולו. כאשר הסוגר gigaohm נוצר, למשוך את פיפטה בזהירות מן ליפוזום לגבש תיקון מבפנים החוצה. כבה את הדופק לבדוק.
  9. הגדר את הפוטנציאל החזיק ל -100 mV, ולהחיל דופק pH. pH נמוך הושג באמצעות 10 מ"מ נתרן ציטרט חיץ C (150 mM NaCl, 10 ציטראט מ"מ, pH 3.0). (איור 3)
    הערה: הקלטות מבוצעות בתדר דגימה של 10 קילוהרץ עבור מקרוסקופית 40 kHz למדידות ערוץ יחידים.

6. מדידות EPR

  1. ספקטרוסקופיה גל רציף EPR
    1. מעבירים את ההשעיה liposome משלב 3.2 לתוך צינור μl 200 ו גלולה דגימות באמצעות צנטריפוגות. מחק את supernataNT מדגם מוכן למדידות EPR.
      הערה: עבור מדידות EPR, חשוב להסיר כמה שיותר חיץ מן המדגם liposome ככל האפשר. מאז דגימות מימיות לספוג חלק החשמלי של המיקרוגל וכתוצאה מכך חימום ואיבוד תחושה.
    2. כדי לבצע חילופי חיץ, להעביר 20 μl של גלולה ליפוזום בעזרת פיפטה לצינור microfuge. להוסיף 180 μl של הצפת D (100 mM NaCl, 10 ציטראט מ"מ, pH 3.0) ו לדגור על אמבט מים 42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צנטריפוגה מדגם, להסיר את supernatant בעזרת פיפטה וחזור על התהליך שלוש פעמים כדי לוודא חילופי חיץ מוחלט.
      הערה: לחילופין, חילופי חיץ יכול להתבצע על ידי העמדת דגימות מחזורים להקפיא / להפשיר מרובים.
    3. נימי גז פלסטיק חדירות מתאימות למדידות הוא קו-צורות רפאים ונגישות ממס. קש על הנימים על proteoliposome pelleted התבצע המדגם בתוך ולאטום הסוף בשעוות עצם.
      לֹאE: כרכי מדגם אופייני הם ~ 5 μl וריכוז ספין רצוי הוא 150 מיקרומטר. אם המטרה היא למדוד צורות קו לבד, אפשר להשתמש צינורות נימי קוורץ 0.4 מ"מ OD. במידת צורך, פיפטה יכול לשמש למילוי המדגם בתוך הנימים.
    4. הפעילו את ספקטרומטר
      1. בצע מדידות CW-EPR ב RT (292 - 297 K) על ספקטרומטר X-band מצויד מהוד דיאלקטרי לפי במדריך ההוראות של היצרנים.
      2. הפעל את Chiller מים, אספקת החשמל, וקונסולת גשר מיקרוגל. מאפשר למערכת תרמית לאזן במשך כ -30 דקות לפני ההקלטה. פתח את תוכנת הרכישה.
      3. הכנס את הצינור / נימי מדגם לתוך המהוד, לוודא כי הסעיף של הצינור מלא מדגם הוא במרכז של חלל המהוד. Tune מהוד לפי ההוראות על במדריך ספקטרומטר.
      4. רשום את ספקטרום הספיגה הנגזרת הראשונה לפי תחום לטאטא בכוח מיקרוגל אירוע של 1.0 mW, תדר אפנון של 100 kHz רוחב לטאטא של 100 ג 'קבע את הכח האופטימלי עבור הניסוי על ידי ביצוע ניסוי כוח רווי ומתקדם שיא-לשיא הגובה של CW הנגזרת הראשונה אות EPR נמדדת כפונקציה של השורש הריבועי של כוח מיקרוגל האירוע.
        הערה: בשעה סמכויות מיקרוגל נמוכות, עוצמת עליות האות בפרופורציה לשורש הריבועי של הכח כל עוד אוכלוסיית שיווי המשקל של מדינות הספין היא מעושה. עם זאת, אם הכח הוא גדל עוד יותר, הרפית ספין-הסריג כבר לא יכולה לשמור על הפרש אוכלוסיית שיווי המשקל של שתי מדינות הספין ואת משרעת האות מתחילה רמה או "להרוות". מעבר לנקודה זו, משרעת האות עלולה לקטון עם ההגדלה להתבונן כוח בשל היפוך אוכלוסייה של Sates ספין. בנוסף, עבור ספקטרום התרחב עם כנפיים נרחבות שבו בסיס שטוח מוגדר היטב אינו visible, להאריך את רוחב לטאטא אל 150 - 200 G כדי למנוע אובדן באזור.
      5. התחל עם באמצעות אפנון משרעת של 1.0 ג '
        הערה: ערך זה הוא מדגם תלוי והותאם להקטין את הרעש בתדר הנמוך של האות. אם גדול מדי נעשה שימוש בערך, זה עלול לעוות או להרחיב את האות.
      6. הגדר את הזמן הקבוע ומרת זמן 20.48 msec, לטאטא זמן 20.97 שניות, ורזולוציה של 1024 נקודות.
        הערה: בפעם המתמדת מבוססת גם על המדגם מותאם לסנן רעש בתדר גבוה.
      7. לאחר הסריקה הראשונה, להגדיר את מרכז השדה במרכז אות EPR ולבחור רוחב לטאטא כך הזכר כולל את אות בסיס מספיק צידיו.
        הערה: כמו כן, על מנת לשפר את האות / רעש היחס, להגדיל את מספר סריקות על בסיס עוצמת אות EPR. כלול רוחב לטאטא ומספר נקודות
      8. מדוד את הנגישות של התווית לסיבוב כדי collisional מרגיע סוכנים O 2 27 כמתואר בשלב 6.1.4.4.
        הערה: כן NiEDDA כפי שתואר לעיל 26.
      9. ראשית perfuse המדגם בחלל עם N 2 למשך 5 דקות (כדי לשטוף את O 2). מדוד את הספקטרום עבור כל כוח מיקרוגל בין 5 - 35 dB בקפיצות של 3 dB עם רוחב לטאטא של 30 ג '
      10. ואז perfuse המדגם בחלל עם באוויר במשך 10 דקות ולמדוד את הספקטרום על סמכויות מיקרוגל שונות (5 - 35 dB בקפיצות של 3 dB) כמו בשלב 6.1.4.9.
      11. דגירה 20 μl של גלולה ליפוזום עם 180 μl של 50 מ"מ NiEDDA (ב הצפת B או הצפת D) בבית-באמבט מים 42 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה מדגם ולהסיר את supernatant בעזרת פיפטה. טען את המדגם לתוך הנימים ולמקם אותו חלל המהוד. חזור על שלב 6.1.4.9.
        הערה: העיקרון מאחורי הניסוי הוא כי האינטראקציה עם relaxin פאראמגנטייםסוכנים גרמו באמצעות חילופי ספין הייזנברג ימנעו רוויה של היפוך אות אוכלוסייה. מסיסים במים NiEDDA ו- O 2 המולקולרי המסיס השומנים משמשים לכתבי מים (הוא בכמויות לפרוזדור intraprotein) קרום חשוף עמדות על החלבון, בהתאמה.
  2. ניתוח נתונים:
    הערה: ניתוח נתוני EPR כולל את השלבים הבאים: 14,22,23,25-27
    1. חשב את הניידות של החללית ספין (ΔH o -1), כמו ההופכי של רוחב הקו המרכזי של ספקטרום הספיגה בנגזרת הראשונה. ΔH o -1 משקף את חופש motional או את הדינמיקה של החללית.
    2. חשב את פרמטר נגישות (П), שהוא אומדן של הנגישות של החללית לסוכנים מרגיע collisional פאראמגנטיים אחרים, באמצעות השלבים המתוארים להלן.
      אינטראקציה של ספין-בדיקה עם סוכני מרגיע פאראמגנטיים: הערהמשפר את שיעור הרפיה ספין-סריג (T 1) של nitroxide ידי חילופי ספין הייזנברג. 27
      1. לאמוד את הפרמטר נגישות (П) מניסויים רוויים כוח (6.1.4.8) בו את המשרעת שיא אל השיא האנכי של הקו המרכזי של ספקטרום EPR בנגזרת הראשון נמדדת בהספק מיקרוגל שונה. 25 מגרש את המשרעת של האות כפונקציה של השורש המרובע של כוח המיקרוגל ובכושר עם המשוואה הבאה 27.
        משוואה 1
        הערה: כאשר A הוא המשרעת של האות, הוא מדד של ההומוגניות של הרוויה של קו התהודה (שהיא בדרך כלל בין 0.5 ו -1.5), אני מהווה גורם קנה מידה, P הוא כוח האירוע, ואת מייצג את השווי שבו משרעת הנגזרת הראשונה הוא מחצית המערכה בלתי הרוויה שלה.
  3. חישוב ΔP 1/2 ערכים בנוכחות (O 2 או NiEDDA) והיעדר (perfused עם N 2) סוכני מרגיע פאראמגנטיים. חשב את פרמטר נגישות (П) באמצעות המשוואה:
    משוואה 2
    הערה: איפה התייחסות P 1/2 ו ΔH o התייחסות הם ערך כוח הרוויה מקסימלי וחצי ורוחב קו מרכזי, בהתאמה, עבור תקן הפניה (כגון DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון ביוכימיים של מוטאנטים GLIC שכותרתו ספין

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל בדרך כלל יניב חלבון היתוך GLIC-MBP בטווח של 10 - 12 מ"ג / L של התרבות. למרות הערך עשוי להשתנות על פני מוטנטים שונים, במיוחד עבור עמדות הקבורות בתוך החלבון, התשואה עלולה לסכן באופן משמעותי. במקרים אלה, כרכי התרבות עשויים לדרוש בגמלון. המחשוף של ההיתוך לבנות ידי פרוטאז HRV3C מתבצע O / N מטעמי נוחות. על ידי הפעלת הדגימות על ג'ל עמוד SDS, מצאנו כי הפיצול הזה יושלם בתוך 30 - 60 דקות. (איור 1 א). GLIC מטוהרים על עמודה סינון ג'ל גודל הדרה elutes בעיקר כאל pentamer עם נפח השמירה של 11.3 מ"ל. השבר MBP elutes ב 15 מ"ל ו אגרגטים elute בווליום הריק של הטור (~ 7.0 מ"ל). הספין-התווית מגיעהסוף elution (~ 24 מ"ל) (איור 1 ב)

סריג Assay מבוסס לניטור Aggregation של GLIC מחדש ב ליפידים שונים ממברנה

Assay סריג משמש להערכת צבירה של pentamers GLIC ב שלפוחית ​​מחדש (התאחדו במרחק <50 Å על הממברנה). תרשים 2 מציג נתונים מ WT GLIC (עם C27, שכותרתו גם עם והעמסת או tetramethylrhodamine) ומשוחזר ב E שומנים קוטביים .coli, POPC: POPG (3: 1), אפיפיור: POPG (3: 1) או asolectin. מדידות קרינה מראות כי GLIC מחדש ב asolectin לא הראה סריג ואף להקפיא / מפשיר המדגם (תנאי מורים לקדם צבירה) המיוצר שינוי מזערי רמות הסריג 43. מסיבה זו, asolectin היא תערובת שומני בחירה למדידות פונקציונליות ספקטרוסקופיות המשמשות סטה אלהמת.

התנהגות מקרוסקופית של GLIC ב Proteoliposomes

תכונות פעילות של מטוהרים GLIC מאופיינים המדידה תיקון- clamp ב proteoliposomes מחדש. הקלטה מקרוסקופית הנוכחי נציג מ WT GLIC מתוך תיקון מבפנים החוצה בתגובה לקפוץ pH מוצג באיור 3 ב -100 mV מחזיק פוטנציאליים, מעבר חיץ pH 3.0 מייצרת הפעלת זרמים פנימה במהירות. (10 - 100 msec) כי ריקבון לכ 10% של המשרעת שיא בתוך שניות 43 (1 - 3 שניות, איור 3). זרמים להתאושש ריקבון מקרוסקופית זו או הקהיה ידי עובר חזרה pH ניטרלי. בעוד ערוצי בחלקת מבפנים החוצה היו רגישים לשינויים ב- pH אמבטיה, לא היתה השפעה של שינוי pH בתמיסה פיפטה (מידע לא מוצג) דבר המצביע על כך GLIC היה מכוון בעיקר אחד קשהction כך בחלקת התחום התאי מתמודד מחליף אמבטיה / פתרון.

Rearrangements המבנית במהלך הפעלת הערוץ

ב RT, את חללית הספין יכולה לאמץ תצורות rotameric מרובות, ואת צורת הקו ספקטרלי רגישה לא רק התנועה של רשתות בצד ספין-תווית ביחס לשדרת פפטיד, אלא גם לתנודות עמוד שדרה ואת תנועות חלבון העולמיות. לכן, שינויים lineshapes EPR יכולים להוות כלי אבחון מצוינים לעקוב אחר שינויי קונפורמציה בחלבון. איור 4 מראים ספקטרום במיקום L241 (17) R1 באזור הידרופובי התאי של אזור M2-הנקבובי (מיקום מסומן כעיגולים שחורים איור 4, הבלעה) ב- pH 7.0 ו- pH 3.0. ההבדלים להראות ספקטרום תחת שני התנאים, הוא משרעת האות והמידההרחבת motional. כמו מדידות תפקודיות 42, שינויי קונפורמציה שדווחו על ידי אותות EPR גם הפיכים לחלוטין. הרחבת ספקטרלית מושפעת הוא אילוצי motional של החללית ועל ידי צימוד dipolar. כדי לקבוע את התרומה של השניים, L241 (17) הוא שכותרתו שיתוף עם ספין-תווית diamagnetic. שכותרתו-פי ספקטרום שכותרתו מלא מושווים ב- pH 7.0 ו- pH 3.0 (איור 4). היקף הרחבת dipolar בעמדה זו פוחתת כאשר הערוצים מסומנים תחת, אשר מצביע על אינטראקציה בין ספין-תוויות בין יחידות משנה שונות.

איור 5 מראה ספקטרום עבור שתי עמדות על סליל M4 אשר ממוקמת בפריפריה של הערוץ. ΔH o -1 נמדד כמו ההופכי של רוחב הקו המרכזי (שמוצג הבלעה). כמו התנועה הסיבובית nitroxide מצטמצמת, כמו עדים במהלך ההיווצרותמגעים שליישונים או הרביעון, מגדילת רוחב קו (ומכאן ΔH o -1 ירידות) עבור כל גיאומטרית motional בפרט. להפך, תנועות מבניות מובילות לעלייה בחופש התנועה של החללית מתבטאות כגידול ΔH o -1. F312R1 הוא נייד יותר בעוד R296R1 הוא נייח, עולה בקנה אחד עם הסביבות מוגבלות החשופות שלהם מאוד, בהתאמה.

בהתבסס על הפרמטרים הנגישים, א-התווית ספין במיקום ספציפי על החלבון יכולה להיות מסווגת אחת מהפעולות הבאות: קבור בתוך ליבת החלבון הנגישה מים או שומנים, על פני השטח נחשף בתמיסה מימית, או על משטח חשוף שומנים (איורים 5, 6). הפרמטרים הנגישים המתקבלים עבור שורה של אתרים רצופים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את המבנה המשני של אזור, לחקור אזורים של חלבוניםקשר, מודד את נטייתו של חלבון המצויות בממברנה, לאמוד את עומק הטבילה של לולאות interfacial, ולזהות לפרוזדור מים וכיסים נכנסי שומנים בתוך הסלילים הטרנסממברני. 26 כדוגמא, עקומות כוח-הרוויה באיור 6 הראה כי יש F312R1 1/2 P יחסית גבוה עבור O 2, בהשוואה R296R1, דבר המצביע על-שרשראות צד ב F312 של המיקום הוא חשוף השומנים. בנוסף, F312R1 הוא גם נגיש יותר NiEDDA בהשוואה R296R1 בקנה אחד עם מיקומו על קו התפר השומנים-מים. מצד השני, L180R1 באזור הלולאה C של התחום התאי הוא נייד ונגיש NiEDDA, ​​עולה בקנה אחד עם מיקומו בתוך לולאת מים חשופות.

דינמיקת Probe ונתוני נגישות במיקום נתון לספק מידע מבני מקומי על זה במיקום ספציפי בתוך החלבון פי הכללי. פרמטרים אלו נקבעו לאלרצף inear של שאריות לאורך החלבון ניתן לנתח עוד יותר באמצעות גישות אנליטיות מבוססות על התמרת שיטות. ניתוחים אלה שימושיים להעריך וריאציות תקופתיות בפרמטרי EPR סביבתיים להנחות בניבוי ואת מכוונת מבנים משניים. עבור פלח חלבון מסוים, פורה דיסקרטי מרת P ספקטרום הספק (ω) מחושב כפונקציה של הזווית בין עמדות הסמוכות (ω) במגזר זה. עלילה זה משמשת לאחר מכן כדי לקבוע את רכיב תדירות הזוויתית הראשי של הספקטרום לעומת הערכים (ω) הצפויים עבור סליל α (80 - 120 º) או β-גדילים (150 - 180 º).
משוואה 3
שם P ( 'ω') הוא התמר ספקטרום הספק כפונקציה של ω תדירות הזוויתית, n הוא מספר השאריות במגזר, הוא פרמטר סביבתי במיקום. P ( 'ω') מקבל הערכה עבור ω ערך = משוואה 6 הממקסם P ( 'ω').

יתר על כן, פרמטר מדד מחזוריות (נותן את המשמעות של המבנה המשני חזה) מחושב כיחס של אזור נתון ספקטרום הכח עבור הזווית שמייצגת אלמנט מבני נתונה לזו של השטח הכולל של הספקטרום. שיטת חלון זזה מכן נעשתה שימוש כדי לזהות את ההתחלה ואת הסוף של אלמנט מבנים משני נתון. האוריינטציה יחסית במגזר זה ביחס לשאר החלבון יכול להיות מוערך מן הכיוון של P ( 'ω') רגע.

עבור סליל α:

משוואה 4

-page = "1"> עבור β-גדיל:

משוואה 5

שיטות אלו יושמו בהצלחה מספר מערכות לקבוע שלוש טופולוגיות ממדית ולחזות שינויים מרחביים שבבסיס חלבון פונקצית 14,23,24,41,44-53.

קביעת חלוקת מרחק EPR

מרחקים nitroxide אינטר-למקטע ניתן לקבוע מאינטראקציות dipolar אלקטרון-אלקטרון. ב CW-EPR, כפי שמוצג באיור 4, דרך-שטח אינטראקציות dipolar להוביל רחבת רפאים הן פונקציה של קרבה בין המדבקות. למרחקים של עד ~ 15 - 20 A, היקף הרחבת (בהשוואה בין ספקטרומים שכותרתו מלא הספקטרום שכותרתו תחת) ניתן להשתמש כדי חצי כמותית להעריך מרחקים באמצעותשיטות deconvolution הפורה. 28,29

מרחקים בין-למקטע (<50 א) ניתן למדוד באמצעות זוגי אלקטרונים-אלקטרוני תהודה (צבי) שיטות. 30-34 נתוני DEER נאספים דגימות חומר ניקוי או משוחזר ב nanodiscs בגלל המגבלות קשורות למדידות אלה ליפוזומים 54. לקבלת דוגמיות שכותרתו ספין דטרגנט (~ 100 מיקרומטר) ב הצפת עם 0.5 מ"מ DDM, 30% (משקל / נפח) גליצרול משמש cryoprotection. נתוני אבולוצית dipolar הזמן מתקבלים על 83 K באמצעות DEER תקן פרוטוקול ארבעה דופק (π / 2) mw1-τ1- (π) mw1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) mw1-τ2-הד 55 על ספקטרומטר פעם EPR הפעלה בתדירות Q-band (33.9 GHz). אורכי הדופק במשך (π / 2) mw1 ו (π) mw1 הם 10 ו -20 NSEC, בהתאמה, ו -40 NSEC עבור (π) MW2. אותות DEER אז הם הרקע תיקן בהנחה backgro 3D הומוגניתund ונותח על ידי הסדרת טיחונוב 31,56 לקבוע מרחקי הפצות ממוצעים מבחינת מרחק.

מרחקים intramolecular לתפקיד נציג M4 (F314R1) נקבע על ידי ניסויים DEER ב- pH 7.0 מוצגים באיור 7 מאז ישנם חמישה ספין-תוויות בתוך pentamer GLIC, לפחות שני מרחקים צפויים.; אחד התואם את יחידות המשנה הסמוכות והשני מ יחידות משנה שאינו סמוכים, למרות פסגות נוספות לנבוע אורינטציות ספין rotameric חלופיות. אות DEER דועכת ואת ההסתברויות המקבילות מוצגות. השיא קצר למרחקים הראשון (~ 42 א) מייצג מרחקים בין יחידות משנה הסמוכות, ואת השיא השני (~ 53a) מתאים למרחק שאינו סמוך זה לזה. השיא עבור המרחק האלכסוני שנראה ממרחק קצר יותר, והדבר עשוי לזלזל כי מדידות אמינות מעבר בסעיף 60 א 'לא הם ריאליים תחת תנאי הניסוי בשל קשיים טכניים עם תיקון ברקע.

איור 1
אפיון באיור 1. ביוכימיים ספין שכותרתו מוטאנטים GLIC. (א) chromatogram סינון ג'ל נציג של שכותרתו ספין-GLIC לאחר מחשוף פרוטאוליטים של תג MBP. פסגות מתאימות GLIC MBP pentamer וחופשי. (ב) SDS-PAGE להראות חלבון היתוך monomeric GLIC-MBP נימול (לפני סינון ג'ל) ושברים MBP ו GLIC ונקווה מ סינון ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. FR ET מבוסס Assay עבור ניטור Aggregation מדינת GLIC מחדש ב ליפידים ממברנה שונים. סריג מדידות מוצגים עבור דגימות לאחר O / הכינון מחדש N (משמאל) ואחרי הקפאה / הפשרה דגימות (מימין). (שונה מן הדמות המקורית). 43 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. התנהגות מקרוסקופית של GLIC ב Proteoliposomes. בשנת רטייה מהפנים לחוץ נכרת מן מחדש asolectin שלפוחית, GLIC מופעל על ידי pH קפיצות באמצעות מחליפי פתרון מהיר. הערוצים נראים להפעיל ב ~ 10 msec ואת רמת רגישות עם קבוע זמן של 1 - 3 שניות. (שונה מן הדמות המקורית). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
Rearrangements איור 4. מבנית במהלך הפעלת ערוץ. (א) ספקטרה נציג CW-EPR למשרה הנקבובית הרירית סליל M2, מוצגת שינויים בצורות משרעת קו בתגובה לשינויי pH. בכל מקרה, את הספקטרום מנורמל למספר הכולל של ספינים. עמדת ספין שכותרתו מוצגת עיגול שחור. רק שתי יחידות משנה מוצגות לבהירות. (ב) EPRspectra להראות רחבת dipolar ידי אינטראקציות ספין-ספין. ספקטרום מקווקווים היו מערוצים תחת שכותרתו (בנוכחות תוויות diamagnetic) וב-קו מוצק היו מערוצים שכותרתו לחלוטין. מראה הבלעת כיסוי של ספקטרה מנורמלת משרעת. ההרחבה בתנאי שכותרתו מלאה היא גבוההמואר על ידי חצים. רוחב סריקה הוא 150 ג '(שונה מן הדמות המקורית). 36 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. פרמטרי שאריות סביבתיים ספציפיות נמדדו על ידי כוח רווי. מדידות של רוחב ספקטרלי (ΔH 0) ונגישות ממס (P 1/2) עבור שתי עמדות מנוגדות סליל M4 של התחום הטרנסממברני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6
איור 6. סביבה של משקע C נציג Loop באחוזה התאית של GLIC. ספין-מנורמלת-CW ספקטרה ואת מידות נגישות המקביל עבור L180R1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
מדידות איור 7. מרחק ידי פעם-EPR גישות (צבי). מבנה GLIC המראים את המיקום של Phe314 המקבילים מרחקי cβ-cβ עבור יחידות משנה הסמוכים שאינם סמוכים זה לזה. CW-ספקטרה לתפקיד זה מוצגת בצד הימין. רקע מופחתי צביי ההד עוצם זמם נגד זמן אבולוציה ולהשתלב באמצעות הסדרה טיחונוב חינם-מודל דגימות חומר ניקוי. חלוקת המרחק בין-ספין המקביל (מימין)."Target =" pload / 54,127 / 54127fig7large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ספקטרוסקופיה EPR הוכיחה להיות גישה מבנית ללא תחרות בכימות שינויי קונפורמציה החלבונים בממברנה בסביבה כמעט טבעית. גישה זו מאפשרת לנו הצצה אל תוך הפרטים המולקולריים של הדינמיקה חלבון כי הם מוסתרים במבנים ברזולוציה גבוהה מ קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים. עם זאת, חשוב לשקול את המגבלות הטכניות של גישה זו שעשויה להשפיע על התחולה הכללית למערכות אחרות וגם לזכור מחסומים פוטנציאל הניסיונות לאורך הדרך. אנו דנים כמה היבטים אלה בהמשך יחד עם אסטרטגיה מומלצת תקלות.

בין הבעיות נפוצות יותר כי אחד מפגשים עם טכניקה של פרעות מוטציוני נרחבות הן התשואה הנמוכה ויציבות oligomeric עניים של החלבון. היבט זו מחריפה עוד יותר כאשר עובדים עם חלבונים בממברנה Multimeric מורכבות כגון תעלות יונים. זה הerefore חשוב לבצע אופטימיזציה של שני היבטים ביוכימיים אלה לפני היציאה mutagenesis נפוצה. מצאנו כי ביטוי של מוטציות רעילות GLIC נסבל טוב יותר זני C41 ו- C43 של תאי BL21 3,36 יתר על כן, הורדת הטמפרטורה שלאחר האינדוקציה עד 15 -. 18 ºC, ומקטין את ריכוז IPTG ל -100 מיקרומטר, וכולל גליצרול 5% במהלך האינדוקציה נראה לעזור עם הפחתת הצטברות חלבון מן הסתם על ידי האטת קצב ביטוי חלבון והפחתת היקף misfolding. מוטציות ציסטאין על עמדות מסוימות (במיוחד במסלול החלחול) הוכחו להגדיל את הפעילות המכוננת של ערוץ המוטציות אלה צפויות להוות משוכים יותר בביטוי. השימוש בחוסמי הנקבוביות divalent (10 - 25 מ"מ Ba 2+) במהלך אינדוקציה מקל רעילות ומשפר צמיחת תאים 57 אסטרטגיות אלה הוכיחו יעילות במקרים רבים שיפור התשואה, הפחתת הצטברות חלבון ושיפור אוליגו.יציבות Meric. 36,58

עוד שלב קריטי SDSL הוא היעילות של תהליך התיוג. בעוד cysteines משטח חשוף צריך להוות שום בעית תגובתיות MTSL (> 90 תשואות תיוג%), עמדות שבו הצד-שרשרות ציסטאין קבורות ולא נגישות עשויות לדרוש ריכוזי תווית-ספין גבוהים יותר וזמני דגירה כבר. הגדלת ריכוז התווית-ספין לשוכרה טוחן פי 30 דוגרי O / N ב 4 ºC עוזר בשיפור יעילות התיוג. בנוסף, זה גם חשוב למדוד את הספקטרום של תבנית Cys-פחות שכותרתו כדי לקבוע את התרומה ברקע. עבור אתרים שאינם מסומנים גרוע (<10%), את אות הרקע מציפה את הספקטרום הכולל. בעת קביעת יעילות התיוג-ספין, יש לשים לב שהדיוק מושפע ממספר גורמים הכוללים נפח דגימה, מדגם-נימי קוטר, מיצוב של הנימים בתוך המהוד, טמפרטורה של חלל, ו- Q מהודערך (שהוא היחס של האנרגיה האצורה בו במרוצת אנרגיה התפוגג החוצה). יש להקפיד לשמור על תנאים אלה זהים בין הדגימות הסטנדרטיות. יתר על כן, יש לציין כי עבור אתרים נייחים, שבו ספקטרה הם מיסודם רחב, את הדיוק של מדידת תיוג טיפות נוספת. לחלופין, נוזלי כרומטוגרפיה זמן של טיסה-electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (LCT-ESI-MS) יכול לשמש כדי לקבוע מסה מולקולרית ישירות ומכאן היעילות תיוג. עם זאת, הרגישות MS נפגעת עבור דגימות דטרגנטים עבור חלבונים בממברנה שלובות בחוזקה.

לאחר מוטנטים הם מטוהרים כמו אוכלוסייה הומוגנית, חשוב לברר את הפונקציונליות של התכשיר. מדידות תיקון מהדק של מוטציות שכותרתו ספין באזורי מפתח של הערוץ תחשוף את השפעת ההפרעות על זיקה ליגנד gating ערוץ. לחלופין, תכונות ערוץ ניתן ללמוד בשחור Lממברנות ipid (BLM) 59 או על ידי הזרקת proteoliposomes לתוך ביציות ומדידת זרמים ידי מהדק מתח שתי אלקטרודות. 59-61 אם יתברר כי החלפת ציסטאין התווית-הספין על עמדות מסוימות לשנות קינטיקה ליגנד רגישה או gating של ערוצים, תנאי ניסוי (ריכוז ליגנד, מאפננים, רכב שומנים) יכולים להיות מגוונים כראוי כדי לייצב את מדינת קונפורמציה תחת חקירה. יתר על כן, זה יש לציין, כי מדידות EPR נעשות בתנאים יציבים ולכן שינויי קינטיקה מהירה של הערוץ נוטות פחות להשפיע על הפרשנות המבנית.

ברור כי יתרון עיקרי של שיטה זו היא היכולת ללמוד דינמיקת ערוץ בממברנות של רכב מוגדר לחקור ישירות כיצד תופעות בתיווך שומנים על דינמיקה משנות פונקצית ערוץ. עם זאת, הגבלה היא כי כמה קומפוזיציות שומנים עלולות לגרום צבירה לרוחב של o הערוציםn הממברנה ולכן התאמתו של שומנים צריכה להיות הוברר. 45 לקבלת תנאים לעשות אגרגציה גורם, הפחתת חלבון ל-שומני יחס, בביצוע כינון מחדש בטמפרטורה נמוכה, וקיצור משך זמן כינון מחדש יכול לעזור בשמירה על הערוצים monodisperse 62 לחלופין, ניתנים מחדש הערוצים nanodiscs, אשר הם מכלולי שומני ננו המוקפים annulus של חלבון פיגום קרום amphipathic (A1 אפוליפופרוטאין). 63 על ידי אופטימיזציה של היחס הטוחן של חלבון הערוץ, מרכיבים של שומנים, חלבוני פיגומים הממברנה, אפשר להשיג אוכלוסייה הומוגנית וחד-לפזר יחידות ערוץ יחידות שולבו nanodiscs פרט. במערכת זו יש מספר יתרונות נוספים כי nanodiscs הם אופטיים ברור ולספק גישה קלה הן תאיים הצדדים תאיים של הממברנה.

לבסוף, ברמהמדידות EPR, עלול לעמוד בפני אחד עם ספקטרום CW-EPR שאינם פשוטים לפרש, במיוחד לתפקידים המוצגים ספקטרה multicomponent. ההטרוגניות קונפורמציה כאלה עשויות לנבוע החלפת תצורות לאט של החלבון או / ו אורינטציות מרובות של התווית-ספין קונפורמציה חלבון נתון. קביעת התרומה היחסית של שני התרחישים אינה טריוויאלי ועלולה לחייב את השימוש בנגזרי ספין-תווית חלופיות, או שינוי טמפרטורה ניסיונית, 64 בלחץ, 65 עוצמת שדה / מיקרוגל תדירות, 66 או על ידי הפרעות אוסמוליט. 67

יתר על כן, מדידות צביים ליפוזומים עשויות להיות מוגבלות על ידי מספר הגורמים, כוללים רגישות נמוכה, תרומתה רקע גבוהה הנובעת אינטראקציות מולקולאריים משופרות, צמצום טווח המרחק המדיד (<50 א). באופן כללי, למרחקים ארוכים יותר (<50 א), שם הוא נהדרודאות er ב הרוחבית של חלוקת המרחק בשל פעמי אבולוצית dipolar מספיק. עם זאת, השימוש של להקת Q (34 GHz) תדר מיקרוגל וסימון עם תווית ספין bifunctional (עם דינמיקה פנימית מופחתת) הוכח להקל קצת על המגבלות האלה. 54 reconstituting ב nanodiscs גם הוכח כדי לשפר את רגישות DEER מאוד על ידי ירידת תרומות רקע המתעוררות מאינטראקציות dipolar מולקולאריים. 15

למרות מגבלות אלה, SDSL / מחקרים EPR, במיוחד במערכות עם כמה cysteines הילידים, הוכיחו להיות אינפורמטיבי להפליא. התקדמות טכנולוגית עתיד מכוונת התאמה גישה זו עצמה ללמוד ערוצי אנושיים מורכבים יותר, שבו cysteines יליד המוטציה עלול להיות לא ריאלי. בהקשר זה, פיתוח אסטרטגיות תיוג חלופיים כגון אלו המבוססים על שילוב אתר ספציפי של חומצות אמינו לא טבעיות, 68 או synthesis של במדבקות ממוקדות כלפי חומצות אמינו אחרות, 69 מופיעים להחזיק הבטחה גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנחנו מאוד מודים לחברים בהווה ובעבר מעבדת Chakrapani לקריאה והערות קריטיות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק (1R01GM108921) ואת איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 12SDG12070069) וכדי SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Tags

כימיה גיליון 113 pLGIC קולטנים Cys הלולאה שומני קרום תא כינון מחדש תיקון- clamp proteoliposomes תיוג ספין באתר ביים ספקטרוסקופיה EPR דינמיקת ערוץ אינטראקצית שומני חלבון
תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S.,… More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter