Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af Umodne, Modne og tolerogeniske dendritiske celler med forskellige Metabolic fænotyper

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54128
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Abstract

Immunrespons resultater fra et komplekst samspil mellem antigenet uspecifikke medfødte immunsystem og antigenspecifikke adaptive immunsystem. Immunsystemet er en konstant balance i at opretholde tolerance over for selv-molekyler og hurtig reaktion på patogener. Dendritiske celler (DC'er) er kraftige professionelle antigenpræsenterende celler, der linker det medfødte immunsystem til det adaptive immunsystem og balance den adaptive respons mellem selv og ikke-selv. Afhængigt af modning signaler, kan umodne dendritiske celler selektivt stimuleret til at differentiere til immunogene eller tolerogene DC'er. Immunogene dendritiske celler tilvejebringer spredning signaler til antigenspecifikke T-celler til klonal ekspansion; mens tolerogene dendritceller regulere tolerance ved antigen-specifik T-celle-deletion eller klonal ekspansion af regulatoriske T-celler. På grund af denne unikke egenskab, er dendritiske celler meget efterspurgt som terapeutiske midler mod cancer og autoimmune diseases. Dendritiske celler kan belastes med specifikke antigener in vitro og injiceret i det menneskelige legeme til at montere et specifikt immunrespons både immunogen og tolerogen. Dette arbejde viser et middel til at generere in vitro fra monocytter, umodne monocyt dendritiske celler (moDCs), toleranceudviklende og modne moDCs der afviger i overflademarkør ekspression, funktion og metaboliske fænotyper.

Introduction

DC blev først beskrevet af Paul Langerhans (Langerhanske celler) i slutningen af det nittende århundrede som der refereres til af Jolles 1 og præget af Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som anerkendt dem som professionelle antigen-præsenterende celler 2. DC'er er fundet i perifert blod og i de fleste væv i kroppen, navnlig rigelige i væv, der udsættes for det eksterne miljø, såsom huden (til stede som Langerhanske celler) og i garnering i næsen, lunger, mave og tarme, der muliggør dem at støde ydre antigener. Umodne DC'er har endocytisk kapacitet, men relativt lav kapacitet til at stimulere T-celler 3. Umodne DC'er udtrykker forskellige mønstergenkendelse receptorer (PRRS) at fange patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) eller skade-associeret molekylære mønstre (dæmper) 4. Aktivering faresignaler drive modning mod immunogene DC'er mens selv-molekyler resulterer i T-celle unresponsiveness og apoptose 5. Immunogene DC'er er kendetegnet ved opregulering af MHC-molekyler og co-stimulatoriske overflademolekyler og deres evne til prime naive T-celler 6,7.

Umodne DC'er kan også modnet til en Treg-inducerende eller tolerogen tilstand som reaktion på vitamin D3-metabolitten 1a, 25 (O) 2-D3 og visse immunsuppressive midler som interleukin-10 (IL-10), dexamethason og rapamycin 8-9. Tolerogeniske DC'er er kendetegnet ved deres ekspression af immunoreceptor tyrosin-baserede inhibitoriske motiver (ITIM'er) indeholdende overfladereceptorer og ligander. Signal transduktion af ITIM'er indeholder ILT familiemedlemmer, ILT3 og ILT4 i tolerogeniske udviklingslandene hæmmer alloproliferation og køre Foxp3 + treg ekspansion 10,11. Disse unikke egenskaber af tolerogeniske DC'er fører til deres dybe potens in vivo, nemlig evnen til at inducere varig tolerance over for transplanterede allogene transplantater og supprESS udviklingen af ​​autoimmune sygdomme. Tolerogeniske DC'er kan ses derfor som en undertype af modne polariseret DC'er, som fungerer ved inhibering af immunaktivering.

I øjeblikket er der to generelle undergrupper af dendritiske celler i humant perifert blod: plasmacytoide DC'er og myeloide DC'er 12. Cirkulerende DC'er er sjældne konstituerende til mindre end 2% af leukocytter i menneskeblod, og dette udgør en vanskelighed til isolering af et passende antal DC'er at studere deres immunregulatoriske funktioner. For at overvinde dette problem, er monocyt differentieres DC'er anvendes som en in vitro model for studiet af dendritiske celle funktion. Disse in vitro DC'er har lignende receptorer og funktioner i forhold til in vivo DC'er. Detaljeret sammenligning af in vivo DC'er og in vitro genererede monocytderiverede DC'er (moDCs) er undersøgt af andre laboratorier 13, 14, 15. Det er også rapporteret, at moDCs og CD1c + DCs svarede på antigen-præsenterende og inducere T-celle funktion 15.

I dette papir, beskriver vi en fremgangsmåde til generering af umodne moDCs fra perifere blodmonocytter og derefter differentiere dem i immunogene og tolerogeniske DC'er. Disse monocytafledte dendritiske celler (moDCs) er karakteriseret ved deres overflademarkører, cytokinprofil, immunregulatoriske funktioner og metaboliske tilstande. Immunogene og tolerogene dendritiske celler producerer forskellige cytokiner, som resulterer i udvidelse af enten allogene T-celler eller regulatoriske T-celler. I dette papir, er cytokin profilering udført med systemer, der anvender multiplex teknologi. Vækstmedium af celler inkuberes med antistof immobiliseret farvekodede perler og læse i en kompakt analysator. Metaboliske tilstande af DC'er analyseres med ekstracellulære flux analysatorer, der måler oxygenforbrugshastighed, en indikator for cellulær respiration, og ekstracellulære forsuringshastighed som afspejler glycolytiskeflux i dendritiske celler. Måling af disse bioenergetik satser tilvejebringer et middel til at spore ændringer i cellulær metabolisme, der er afgørende i dendritisk celle udvikling og funktion.

Protocol

Denne forskning blev godkendt af Institutional Review Board (NUS-IRB 10-250).

1. Isolering af perifere mononucleære blodceller (PBMC'er)

  1. Fremstilling af reagens
    1. Forbered PBS / EDTA: phosphatpufret saltopløsning (PBS) og supplere med 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Steriliseres opløsningen ved filtrering gennem et 0,2 um filter. Bemærk at lagre PBS / EDTA ved 4 ° C og opvarmes til stuetemperatur inden brug.
    2. Forbered farvning buffer: phosphatbufret saltopløsning (PBS) supplere med 2% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Steriliseres opløsningen ved filtrering gennem et 0,2 um filter.
  2. Saml Blod fra Blood Cone
    Bemærk: Keglen blod indeholder hvide blodlegemer, der er indsamlet efter pladeletpheresis fra hospitalet. Hvis blod opsamles i heparin eller EDTA rør, fortyndes blod med PBS i forholdet 1: 1 og fortsæt til trin 1,3; hvis buffy coat modtages, fortyndes buffy coat med PBS i 1: 2 forhold og fortsæt til trin 1.3.
    1. Skær de to ender af keglen for at tillade blod at strømme ud i et 50 ml rør. Bemærk, at keglen normalt indeholder 10 ml blod.
    2. Brug en stump ende injektionssprøjte indeholdende 30 ml PBS / EDTA at vaske keglen og samles i en 50 ml rør.
    3. Fortynd blod yderligere med PBS / EDTA til et slutvolumen på 80 ml.
  3. Isolering af PBMC'er ved densitetscentrifugering 16
    1. Afmål 15 ml Ficoll hver til 4 friske 50 ml rør.
    2. Bruge en 25 ml serologisk pipette for at tilføje 20 ml fortyndet blod over Ficoll-laget. Vær opmærksom på at holde 50 ml rør ved en 45 vinkel og sørge for at ikke forstyrre interfasen.
    3. Centrifuger rørene ved 805 xg uden bremser i 30 min, 20 ° C.
    4. Fjernplasmalag og indsamle ringen af ​​PBMC'er liggende lige under plasma lag med en Pasteur-pipette. Kombiner fire rør af PBMC'er i to 50 ml rør. Bemærk at undgå at indsamle det transparente lag under PBMC'er.
    5. Tilføj PBS / EDTA til et endeligt volumen på 50 ml pr rør af PBMC'er og der centrifugeres ved 548 xg med bremser i 10 min, 20 ° C.
    6. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i hvert rør med 25 ml farvning puffer og kombinere til en 50 ml rør.
    7. Centrifuger ved 367 xg med bremser til 5 min, 4 ° C.
    8. Aspirer supernatanten og resuspender pellet med 10 ml farvning puffer.

2. Monocyt berigelse af Magnetic Separation 17

  1. Bestem Cell Antal
    1. Tag 20 pi PBMC cellesuspension og bland med 20 pi trypanblåt for at tælle antallet af levende celler under anvendelse cytometer.
    2. Centrifuge celle suspension ved 367 xg med bremseri 10 minutter, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspender cellepelleten til en koncentration på 10 7 celler pr 80 pi farvning puffer.
  2. Magnetisk Mærkning
    1. Tilsæt 20 pi CD14 mikroperler pr 10 7 celler, bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 2 - 8 ° C.
    2. Vask cellerne ved tilsætning af 1 ml farvning buffer per 10 7 celler og centrifuger ved 367 xg med bremser til 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspender cellepelleten i en koncentration på 10 7 celler pr 50 pi farvning puffer.
  3. magnetisk separation
    1. Brug medium størrelse kolonne i højst 2 x 10 8 totale celler.
      Bemærk: Vælg en passende søjle og Separator ifølge antallet af totale celler, og antallet af CD14 + celler anbefalet i dataarket.
    2. Placer kolonne i magnetfeltet ofa egnet separator og forberede kolonne ved skylning med 500 pi farvning puffer.
    3. Pipette cellesuspensionen på søjlen og indsamle umærkede celler, der passerer gennem søjlen med en 15 ml rør.
    4. Erstatte en ny 15 ml rør i kolonnen og vask kolonne 3 gange med 500 pi farvning puffer. Sørg for, at kolonnen reservoir er tom, før du tilføjer ny farvning buffer mellem vaske.
    5. Fjern kolonne fra separatoren og placere den på en frisk 15 ml rør.
    6. 1 ml af farvning puffer på søjlen. Skyl straks de magnetisk mærkede celler ved fast at trykke stemplet (følger med kittet) i kolonnen.
    7. Gentag trin 2.3.2 til 2.3.6 ved hjælp af den eluerede fraktion på en ny kolonne for at øge renheden af ​​CD14 + celler. Bemærk at perlerne automatisk vil blive frigivet fra cellerne i kultur under trin 3.2.

3. Differentiering af dendritiske celler til forskellige Activation STates

  1. Forberedelse af reagens (Endotoksin Level skal være mindre end 0,1 EU / ml i alle Reagenser)
    1. Forbered cellekulturmedium: RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) og 0,05 mM 2-mercaptoethanol (2ME). Steriliseres opløsningen ved filtrering gennem et 0,2 um filter.
    2. Forbered cytokiner: rekonstituere IL-4 og GM-CSF i celle-kultur kvalitet vand til en koncentration på 0,25 mg / ml under aseptiske betingelser. Alikvote cytokiner i 200 ul mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C.
    3. Forbered vitamin D3 lager: rekonstituere vitamin D3 i celle-kultur kvalitet vand til en koncentration på 100 mM under aseptiske forhold. Portion D3-vitamin i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
    4. Forbered dexamethason lager: rekonstituere dexamethason i celle-kultur kvalitet vand til en koncentration på 10 mM under aseptiske betingelser. alikvot dexamethasone i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
    5. Forbered LPS: rekonstituere Lipopolysaccharider (LPS) i celle-kultur kvalitet vand til en koncentration på 1 mg / ml under aseptiske betingelser. Alikvote LPS i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
  2. Generering Forskellige moDCs
    1. Seed 4 sæt af CD14 + monocytter i koncentration på 0,3 - 0,5 x 10 6 / ml cellekultur-medium suppleret med 200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4 i 6-brønds plader. Bemærk, at dette er dag 0 og volumenet af mediet i hver 6 brønd er 2 ml.
    2. Inkuber i vævskultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Fjern 850 pi medium fra kulturen på dag 4 og centrifugeres ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 1 ml cellekulturmedium indeholdende 2x (200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4). Tilføj denne celle blandingen tilbagetil kulturen. Bemærk, at 2x koncentration tilsat for GM-CSF og IL-4 bliver 1x når 1 ml medium sættes tilbage i kulturen.
    4. Tilsæt 1 pi vitamin D3 lager og 1 pi af dexamethason lager pr ml medium til to af sættene på dag 5 for at generere tolerogene moDCs. Bemærk, at den endelige koncentration af vitamin D3 er 100 nM og dexamethason er 10 nM; tilsætning af GM-CSF og IL-4 er ikke påkrævet på dag 5.
    5. Tilsæt 200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4 til alle sættene på dag 6.
    6. Tilsæt 1 ug / ml af LPS til et af sættene behandlet med kun GM-CSF og IL-4 på dag 6 for at generere modne moDCs.
    7. Tilsæt 1 ug / ml LPS til et sæt af de tolerogeniske moDCs på dag 6 for at generere LPS-tolerogene moDCs.
    8. Høst de forskellige typer af moDCs på dag 7 ved at skylle dyrkningsskål med PBS, EDTA til flowcytometri eller andre undersøgelser. Bemærk, at kun ikke-adhærente celler høstes. Vær opmærksom på, at procentdelen udbytte fra CD14 + monocytes for umodne moDCs, modne moDCs, tolerogeniske moDCs og LPS-tolerogeniske DC'er er omkring 90%, 50%, 60% og 60% og varierer mellem bloddonorer og FBS masse.

4. flowcytometri

  1. Celleoverflademarkøren Karakterisering på moDCs
    1. Frigøre celler fra dyrkningsskål ved pipettering. Vask cellerne én gang med PBS / EDTA og resuspender cellerne i en koncentration på 5 x 10 5 celler pr 50 pi farvning puffer i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Inkuber 0,5 x 10 6 celler portioner med PerCP-konjugeret HLADR (1: 100), PE-konjugeret CD80 (1:50), PE-konjugeret CD83 (01:25), PE-konjugeret CD86 (1:50), APC konjugeret CD11 (1:50), PE-konjugeret CD14 (1:50) og PE-konjugeret BDCA3 (1:50) og APC-konjugeret ILT3 (1:25) i mørke i 30 minutter ved 4 ° C. Isotype-matchet PerCP-konjugeret MAb (1:20), PE-konjugeret MAb (1:11), vil APC-konjugeret MAb (01:11) tjener som negative kontroller.
    3. Detect ekspressionsniveauerne af de overflademarkører bruger flowcytometer 18.
  2. Analyse af mitokondrier membranpotentiale af moDCs
    1. Forbered stamopløsning af 1 mM Red chlormethyl-X-rosamine (CMXRos) ved tilsætning 94.1 pi dimethylsulfoxid (DMSO) pr 50 ug lyofiliseret Red CMXRos.
    2. Inkuber 2 x 10 5 moDCs med 100 nM Red CMXRos i 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i 30 minutter ved 37 ° C i 15 ml rør.
    3. Der tilsættes 2 ml PBS / EDTA til celler og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter, stuetemperatur. Gentag 2 gange. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 300 pi PBS, EDTA, 2% FCS til flowcytometrianalyse. Vær opmærksom på at bruge PE-kanal til at analysere Red CMXRos signal.
  3. Marker Karakterisering af T-celler
    1. Inkuber 50 pi 1,2 x 10 6 CFSE-mærket allo CD4 + T-celler (genereret fratrin 5.6) med PerCP-konjugeret CD3 (1: 200), PE / Cy7-konjugeret CD4 (1: 400) og APC / Cy7-konjugeret CD25 (1: 100) i mørke i 30 minutter ved 4 ° C. Stain T-celler under anvendelse af et kommercielt kit med Foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) i mørke i 1 time ved stuetemperatur.

5. Alloreaction Studies

  1. Forbered 5 mM stamopløsning af carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ved tilsætning 18 pi DMSO til lyofiliseret CFSE, ifølge producentens protokol.
  2. Oprense CD4 + T-celler fra PBMC'er
    1. Bestem celleantallet ved at tage 20 pi PBMC cellesuspension og bland med 20 pi trypanblåt for at tælle antallet af levende celler under anvendelse af et cytometer.
    2. Centrifuger cellesuspensionen ved 367 xg med bremser til 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspender cellepelleten i en koncentration på 5 x 10 7 celler pr 1 ml farvning puffer i et 5 ml polystyrene rør.
    4. Tilføj humane CD4 + T-celle berigelse Cocktail ved 50 pl / ml celler. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur (15 - 25 ° C) i 10 minutter.
    5. Vortex magnetiske partikler i 30 sekunder og tilføje magnetiske partikler ved 100 pl / ml celler. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    6. Tilføj farvning puffer til cellesuspensionen til et samlet volumen på 2,5 ml. Bland cellerne i røret ved forsigtigt at pipettere op og ned 2 - 3 gange. Reagensglasset anbringes magneten og inkuber i 5 minutter.
    7. Invert magnet med rør og dekanteres suspensionen (indeholder T-celler) i en ny 5 ml polystyrenrør.
  3. Bestem celleantal og inkuber 1,2 x 10 6 CD4 + T-celler med 5 pM CFSE i 1 ml PBS i 20 minutter ved 37 ° C, beskyttet mod lys.
  4. Tilføj fem gange den oprindelige farvning rumfang celledyrkningsmedium (fremstillet ifølge trin 3.1.1) til cellerne og inkuberes i 5 min.
  5. centrifugaluge ved 300 xg i 5 min, 4 ° C og resuspender pellet i celledyrkningsmedium i en koncentration på 2 x 10 5 per 75 pi.
  6. Tilføj 75 pi 2 x 10 5 CFSE-mærkede CD4 + T-celler til hver MoDC kultur indeholdende 75 pi cellekulturmedium med 0, 2,5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 og 40 x 10 3 moDCs i 96 brønds U-bundede plader. Dyrkning i 6 dage i vævskultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
  7. Høst ved pipettering CD4 + T-celler i 15 ml rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. Samle bundfald for cytokin analyse og resuspender cellepelleten i 2 ml PBS / EDTA og centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C.

6. cytokinanalyse 19

  1. Saml supernatanter fra alloreaction studier som beskrevet i trin 5.5.
  2. Fremstilling af Reagens til human Cytokine / Chemokine Magnetic Analysis Panel
    1. Til fremstilling af blanding flaske antistof-immobiliserede perler til individuelle hætteglas med perler (inkluderet i kittet), vortex i 1 min. Tilføj 60 pi fra hvert antistof perle hætteglas til blanding flaske (inkluderet i sættet) og bringe til et endeligt volumen på 3 ml med Bead Diluent (medfølger).
    2. Til forberedelse af kvalitetskontrol, rekonstituere Kvalitetskontrol 1 og Quality Control 2 (inkluderet i sættet) med 250 pi deioniseret vand.
    3. Til fremstilling af vaskebuffer fortyndes 30 ml af 10X vaskebuffer (inkluderet i kittet) med 270 ml deioniseret vand.
    4. Til fremstilling af humant cytokin Standard, rekonstituere det humane cytokin standard (inkluderet i kittet) med 250 pi deioniseret vand til opnåelse af en 10.000 pg / ml koncentration.
      1. Der tilsættes 50 pi 10.000 pg / ml humant cytokin standard til 200 pi assay buffer (leveret med kittet) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør at gøre 2.000 pg / ml arbejdsstandard. Transfer 50 pi 2.000 pg / ml human cytokin standard til 200 pi assay buffer (leveret med kittet) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør at gøre 400 pg / ml arbejdsstandard.
      2. Transfer 50 pi 400 pg / ml humant cytokin standard til 200 pi assay buffer (leveret med kittet) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør at gøre 80 pg / ml arbejdsstandard. Transfer 50 pi 80 pg / ml humant cytokin standard til 200 pi assay buffer (leveret med kittet) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør at gøre 16 pg / ml arbejdsstandard.
      3. Transfer 50 pi 16 pg / ml humant cytokin standard til 200 pi assay buffer (leveret med kittet) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør at gøre 3,2 pg / ml arbejdsstandard. 0 pg / ml arbejdsstandard har kun 200 pi assay buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Pre våd filterplade (inkluderet i kittet) ved pipettering 200 pi assay buffer (billede) i hver brønd af filteretplade. Seal og placere filterpladen på en pladeryster i 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Aspirer Assay buffer, og der tilsættes 25 pi af hver standard eller Kvalitetskontrol i de relevante brønde.
  5. Tilsæt 25 pi cellekulturmedium (fremstillet ifølge trin 3.1.1) til baggrunden, standarder og kontrolbrønde.
  6. Tilsæt 25 pi assay buffer til prøvebrøndene og tilsættes 25 pi prøve i de passende prøvebrønde.
  7. Vortex blanding flaske indeholdende antistof-immobiliserede perler og tilsættes 25 pi af de blandede perler til hver brønd. Seal plade og inkuber med omrøring på en pladeryster natten over ved 4 ° C.
  8. Aspirer væske og vask pladen 2 gange ved tilsætning af 200 pl / brønd af vaskepuffer og opsugning fluidet.
  9. Tilsæt 25 pi detektionsantistoffer (forudsat) i hver brønd. Forsegl og inkuberes med omrøring på en pladeryster i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Tilføj 25 pi af Streptavidin- phycoerythrin (provIDed) til hver brønd indeholdende 25 pi detektionsantistoffer. Forsegl og inkuberes med omrøring på en pladeryster i 30 min ved stuetemperatur.
  11. Aspirer væske og vask plade som beskrevet i trin 6.8.
  12. Tilføj 150 pi / brønd af sheathvæske til alle brønde og resuspender perler på en pladeryster i 5 minutter.
  13. Detect fluorescensintensitet af perler ved anvendelse af en 3D-system 20. Analyser median fluorescerende data intensitet ved hjælp af en fem-parameter log-logistisk kurve-fitting metode til beregning cytokin / kemokiner koncentrationer i prøver 21.

7. Real-time Oxygen Forbrug Rate (OCR) og ekstracellulære Forsuring Rate (ECAR) Målinger

  1. Reagensfremstilling / materialer
    1. Forbered OCR medium: Assay medium suppleret med 25 mM glucose og 1 mM natriumpyruvat (pH 7,35). Steriliseres opløsningen ved filtrering gennem et 0,2 um filter. Vær opmærksom, at dette medie er prepared uden FBS fordi komponenter i FBS er komplekse og varierer fra et parti til anther masse.
    2. Forbered ECAR medium: Base medium suppleret med 2 mM L-glutamin (pH 7,35). Steriliseres opløsningen ved filtrering gennem et 0,2 um filter. Vær opmærksom på, at dette medie er forberedt uden bikarbonat, glucose, pyruvat og FBS. Bemærk, at FBS har bufferkapacitet og vil forstyrre den ECAR læsning.
    3. Forbered forbindelser til OCR-målinger: Resuspender oligomycin med 630 ul OCR medium til at gøre 100 uM stamopløsning og fortyndes med OCR medium til 16 uM arbejder koncentration. Gensuspendér carbonyl cyanid 4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) med 720 ul OCR medium til at gøre 100 uM stamopløsning og fortyndes med OCR medium til 4,5 uM arbejder koncentration. Resuspender rotenon / antimycin med 540 ul OCR medium til at gøre 50 uM stamopløsning og fortyndes med OCR medium til 10 uM arbejder koncentration.
    4. Forberedeforbindelser til ECAR målinger: Resuspender glucose med 3 ml ECAR medium til at gøre 100 mM stamopløsning og fortyndes til 80 mM arbejder koncentration. Resuspender oligomycin med 720 ul ECAR medium til at gøre 100 uM stamopløsning og fortyndes til 18 mM arbejder koncentration. Resuspender 2-deoxy-D-glucose med 1,5 ml ECAR medium at gøre 1,000 mM stamopløsning.
    5. Pipetter 200 pi kalibrant i hver brønd i kassetten og opbevares ved 37 ° C uden CO2 dagen før målingerne.
  2. Real-time OCR Målinger
    1. Harvest moDCs og resuspender hver type moDCs i OCR-medium ved en koncentration på 60 x 10 3 pr 150 pi OCR medium.
    2. Seed 60 x 10 3 celler / brønd i en poly-D-lysin-coatede 96-brønds fladbundet plade og inkuber i en ikke-CO2-inkubator i 1 time ved 37 ° C. Vær opmærksom på at bruge 50 pi 50 ng / ml poly-D-lysin til at coate plade i 1 time og vask medsterilt vand. Hold plade tør i 2 timer ved stuetemperatur før brug.
    3. Pipette 25 pi OCR medium til indsprøjtningsåbning A for alle brønde; 25 pi OCR medium indeholdende 16 uM oligomycin i indsprøjtningsåbning B for alle brønde; 25 pi OCR medium indeholdende 4,5 uM af (FCCP) i indsprøjtningsåbning C i alle brønde og 25 pi OCR-medium indeholdende 10 mM rotenon / antimycin i indsprøjtningsåbning D for alle brønde. Bemærk, at den endelige brønd koncentration for oligomycin er 2 uM, FCCP er 0,5 um og rotenon / antimycin A er 1 uM.
    4. Placer pladen i ekstracellulær flux analysator og køre en komplet OCR studie med alle moDCs samtidigt i fire på hinanden følgende faser: basal respiration (efter medium injektion fra port A), mitokondrie kompleks V hæmning (efter intravenøs stofbrug fra port B), maksimal respiration induktion (efter drug indsprøjtning fra havn C) og elektron transportkæden hæmning (efter lægemiddel fra port D) 22. Vær opmærksom på, at der er 3 cycles i mellem injektioner og 6 min interval mellem målingerne.
  3. Real-time ECAR Målinger
    1. Harvest moDCs og resuspender hver type moDCs i ECAR medium i en koncentration på 60 x 10 3 pr 150 pi ECAR medium.
    2. Seed 6 x 10 4 celler / brønd i en poly-D-lysin-coatede 96-brønds fladbundet plade og inkuber i en ikke-CO2-inkubator i 1 time ved 37 ° C.
    3. Pipette 25 pi ECAR medium til indsprøjtningsåbning A for alle brønde; 25 pi ECAR medium indeholdende 10 mM glucose i indsprøjtningsåbning B for alle brønde; 25 pi ECAR medium indeholdende 18 uM oligomycin i indsprøjtningsåbning C i alle brønde og 25 pi OCR medium indeholdende 1,000 mM 2-deoxy-D-glucose i indsprøjtningsåbning D for alle brønde. Bemærk, at den endelige brønd koncentration for glucose er 10 uM, oligomycin er 2 um og 2-deoxy-D-glucose er 100 mM.
    4. Placer pladen i ekstracellulær flux analysator og køre enkomplet ECAR studie med alle moDCs samtidigt i fire på hinanden følgende faser: basal respiration (efter medium injektion fra port A), glykolyse induktion (efter intravenøs stofbrug fra port B), maksimal glykolyse induktion (efter intravenøs stofbrug fra havn C) og glykolyse hæmning (efter lægemiddel fra port D) 22.
    5. Analysere statistiske forskelle ved hjælp af en-vejs ANOVA med en Tukey multipel sammenligning post-test.

Representative Results

Monocyt Oprensning og dendritiske celle Differentiering

Monocytter blev oprenset fra PBMC'er ved densitetscentrifugering af perifert blod (figur 1A) efterfulgt af CD14 + positiv selektion magnetisk separation (figur 1B) og dyrket i komplet medium i nærvær af GM-CSF og IL-4 til opnåelse af umodne dendritiske celler ( Figur 2A). Tilsætning af vitamin D3 og dexamethason efter GM-CSF og IL-4 resulterede i differentieringen af umodne moDCs i tolerogeniske moDCs (figur 2B). LPS blev tilsat for at inducere modning af umodne moDCs til modne moDCs (figur 2C) og tolerogeniske moDCs blev stimuleret med LPS for at verificere resistens mod modning (figur 2D). Blodprøverne anvendes i dette arbejde blev opnået fra raske donorer med tidligere informeretsamtykke.

MoDC Karakterisering

Overflademarkør Karakterisering ved flowcytometri

Analyse af DC overflademarkører viste, at modne moDCs udtrykte de højeste niveauer af modning markører HLA-DR, CD83 og CD86 i forhold til LPS-behandlede tolerogeniske moDCs, tolerogeniske moDCs og umodne moDCs (Figur 3). Disse resultater viste, at tolerogeniske moDCs var resistente over for modning i forhold til umodne moDCs følgende LPS-stimulering. Desuden LPS-behandlede tolerogeniske moDCs og tolerogeniske moDCs viste forøget ekspression af CD14, BDCA3 (CD141) og immunglobulin-lignende transkript (ILT) 3 sammenlignet med umodne og modne moDCs. De tolerogeniske moDCs at vi genereret her er i overensstemmelse med tidligere rapporter 23.

Funktionel karakterisering af moDCs

moDCs induceret til modning bliver immunogene og frigive cytokiner, der fremmer proliferation af CD4 + T-celler. Vi vurderede immunogeniciteten af ​​de forskellige MoDC undertyper ved måling af proliferationen af ​​samdyrket T-celler. Tolerogeniske moDCs var dårligt immunogene sammenlignet med modne moDCs, som vist ved lav alloproliferation af CD4 + T-celler (figur 4A). Tolerogeniske moDCs er kendetegnet ved deres lave IFN-Γ, lav IL-12p40, og høj IL-10 cytokinproduktion i alloreaction co-kulturer med CD4 + T-celler (figur 4B). Desuden øger antallet af tolerogeniske moDCs i samarbejde-kulturer af modne moDCs induceret allospecifik CD4 + T-celler øges frekvensen af CD25 høj Foxp3 + regulatoriske T-celler (Figur 4C).

Analyse af mitokondrie aktivitet

Rød CMXRos bruges til at afspejle den mitokondrielle aktivitet til at analysere mitokondriemembranen potentielle niveauer i moDCs. Tolerogeniske moDCs blev observeret at have højere mitokondriel aktivitet sammenlignet med de andre MoDC differentierede undertyper (figur 5A). Dernæst hastigheden af ​​mitokondrie iltforbrug (OCR) vurderes for de forskellige MoDC undertyper ved hjælp af en Bioanalyzer. OCR-målinger tillader indsigt høj opløsning til den metaboliske profil, der giver oplysninger, herunder men ikke begrænset til basal respiration, reservedele respiratorisk kapacitet, proton læk og ikke-mitokondrie respiration. Målingen af ​​OCR tilvejebringer et middel til at vurdere cellernes evne til at reagere på stress. Cellerne metabolisk forstyrres ved tilsætning af tre forskellige forbindelser i træk. Den første injektion Oligomycin (ATP Coupler), som hæmmer kompleks V i elektrontransportkæden (ETC), inhibering ATP-syntese. Dette trin adskiller procentdelen af ​​oxygen forbruges til ATP-syntese og procentdelen af ​​oxygen, der forbruges til at overvinde proton lækage hen over indre mitokondrielle membran. Den anden injektion er FCCP (ETC accelerator), der afbryder ATP-syntese ved at transportere hydrogenioner tværs mitokondriemembranen stedet for gennem proton kanal Complex V. kollaps af mitochondriemembranpotential fører til en hurtig forbrug af energi og oxygen, uden generation af ATP. FCCP behandling kan anvendes til at beregne den ekstra respiratoriske kapacitet af celler. Vedligeholdelse af overskydende respiratorisk kapacitet under stress betingelser er afgørende for celle overlevelse. Denne kapacitet er bestemt af flere faktorer, herunder tilgængeligheden af ​​substrat og funktionsevne af de involverede i ETC. enzymer Den tredje injektion er en kombination af Rotenon, et komplex I-inhibitor, og Antimycin A, et kompleks III-hæmmer. Denne kombination lukker mitokondrielle respiration og OCR er observeret at falde som følge af nedsat mitokondriefunktionen (figur 5C). Tolerogene moDCs vises højere basale OCR niveauer end modne moDCs (Figur 5D). Desuden tolerogenisk, LPS-tolerogenisk, og umodne moDCs viste øget overskydende respiratorisk kapacitet i forhold med modne moDCs (Figur 5E).

Metabolisk karakterisering af moDCs

Fordi mælkesyre og protoner frigives fra celler under glycolyse, analyserede vi den glycolytiske aktivitet af moDCs ved at udføre en real-time analyse af graden af ekstracellulær forsuring (ECAR) (figur 6B). I nærvær af glucose, øget den glycolytiske sats for alle moDCs sammenlignet med den basale stadium, medmodne moDCs udviser højere glykolytisk end umodne moDCs (figur 6D). Tolerogent og umodne moDCs udviste højere maksimal glycolyse (induceret af oligomycin i nærvær af glucose) sammenlignet med LPS-behandlede moDCs (figur 6B). Den glycolytiske kapacitet tolerogeniske og umodne moDCs var højere end modne moDCs (Figur 6E). I modsætning til deres høje glycolytisk sats, glykolytisk reserve var det laveste i modne moDCs (Figur 6F).

figur 1
Figur 1:. Monocyte Oprensning fra perifert blod (A) 25 ml blod omhyggeligt lagdelt på 15 ml Ficoll per 50 ml rør før centrifugering. PBMC'er er koncentreret i et lag under plasma efter densitetscentrifugering. (B) PBMC'er inkuberet med mikroperler, der er conj ugated til monoklonale humane CD14 antistoffer (isotype: mus IgG2a). og derefter sat på en kolonne, der er placeret i det magnetiske felt af et Separator at isolere CD14 + monocytter Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Morfologisk karakterisering af moDCs. (A) 200 ng / ml GM-CSF og IL-4 sættes til oprensede CD14 + monocytter på dag 0, 4 og 6 til at generere umodne moDCs; og (B) et yderligere trin med stimulering med 100 nM vitamin D3 og 10 nM dexamethason på dag 5 genererer tolerogene moDCs. Umodne moDCs og tolerogeniske moDCs stimuleres med en pg / ml LPS på dag 6 for at generere (C) modne moDCs og (D) LPS-tolerogene moDCs.siden ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Overflademarkør Karakterisering ved flowcytometri Ekspressionsniveauer af overflademarkører HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 og LT3 i toleranceudviklende (grøn), LPS-tolerogeniske (sort), umodne (rød), moden (blå) moDCs. Isotypekontroller er vist med gråt. Individuel histogram for hver celletype er afbildet med Y-aksen celletal mod X-aksen log over fluorophor intensitet og overlejret. Alle histogrammer er repræsentative for fire uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (juni 1, 2015). Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Copyright 2015. Den amerikanske sammenslutning afImmunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Funktionel karakterisering af moDCs. (A) Kvantificering af alloproliferation hyppigheden af CD4 + -T-celler induceret ved co-dyrkning med stigende antal toleranceudviklende (TOL, grøn), LPS-tolerogenisk (L-TOL, sort), umodne (IMM, rød) og modne (MAT ; blå) moDCs. Data blev samlet fra fire uafhængige eksperimenter; betyde + SEM Statistiske forskelle mellem alle moDCs versus modne moDCs blev analyseret ved to-vejs ANOVA med Dunnett multipel sammenligning post-test. (B) Cytokine analyse af IFN-Γ (venstre panel), IL-12p40 (midterste panel) og Il- 10 (højre rudel) i supernatanter fra alloreactions mellem CD4 + T-celler co-dyrket med stigende antal af enten tolerogen (grøn), umodne (rød) eller modne (blå) moDCs. Data blev samlet fra seks uafhængige forsøg; middel ± SEM (C) CD4 + T-celle alloproliferation og regulatoriske T-celler ekspansion induceret ved co-dyrkning med modne moDCs i nærvær af stigende antal tolerogene moDCs. Venstre Y-aksen, hyppigheden af CD4 + T-celle-proliferation. Højre Y-aksen, frekvensen af CD25 høj Foxp3 + celler gatet på proliferativ CD4 + -T-celler. Dataene blev puljet fra tre uafhængige forsøg; middelværdi ± SEM Statistiske forskelle mellem tilstedeværelse versus fravær af tolerogeniske moDCs blev analyseret ved envejs ANOVA med Dunnett multipel sammenligning post-test. (D) CD4 + T-celle alloproliferation (venstre) og hyppigheden af CD25highFoxP3 + -celler (højre) induceret af co- kultur med tolerogene moDCsi nærværelse af stigende antal modne moDCs. Dataene blev samlet fra to til tre uafhængige forsøg; middelværdi ± SEM Statistiske forskelle mellem tilstedeværelsen versus fravær af modne moDCs blev analyseret ved to-vejs ANOVA med Dunnett multipel sammenligning post-test. Dette tal er blevet ændret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (juni 1, 2015). Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Analyse af mitokondrie Aktivitet af moDCs. (A) Niveauer af mitochondriemembranpotential (Red CMXRos) i moDCs blev opnået ved flav cytometrisk analyse. Dataene i fire uafhængige forsøg blev samlet. Middelværdi ± SEM (B) Skematisk repræsentation af en real-time mitokondriel respiration. OCR-analyse ud fra basal respiration og efter tilsætningen af ​​oligomycin (kompleks V hæmning), FCCP (maksimal respiration induktion), og rotenon / antimycin blanding (elektrontransportkæden [ETC] inhibering). Den mitokondrie SRC (maksimal basal fratrækkes maksimal respiration) er afledt af OCR-kurven. (C) Repræsentant kinetisk undersøgelse af mitokondrier OCR (pmol / min) i toleranceudviklende (TOL, grøn), LPS-tolerogenisk (L-TOL, sort) , umoden (IMM, rød) og modne (MAT, blå) moDCs ved hjælp sekventiel tilsætning af oligomycin (Olig), FCCP, og rotenon / antimycin (Rot-AA). (D) OCR kvantificering af basal respiration moDCs og ( E) skåne respiratorisk kapacitet moDCs. Dataene blev puljet fra fem uafhængige forsøg. Middelværdi ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (juni 1, 2015). Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Metabolisk Karakterisering af moDCs. (A) Skematisk repræsentation af real-time glykolyse. ECAR analyse starter fra basal ECAR, hvori cellerne blev inkuberet i glucose-frit medium, efterfulgt af tilsætning af glucose (glycolyse induktion), oligomycin (som inducerer maksimal celle glykolyse og kompleks V-inhibering), og endelig 2-deoxy-D- glukose(Glycolyse inhibering). Glycolytiske sats (glycolyse induktion fratrækkes basal ECAR), glycolytiske kapacitet (maksimal glycolyse fratrækkes basal ECAR), og glycolytiske reserve (maksimal glycolyse fratrækkes glycolyse induktion) er afledt af ECAR kurven. (B) repræsentant kinetisk undersøgelse af glycolyse-afhængige ECAR (mph / min) i toleranceudviklende (TOL, grøn), LPS-tolerogenisk (L-TOL, sort), umodne (IMM, rød), og modne (MAT, blå) moDCs ved hjælp sekventiel tilsætning af glukose (Gluc), oligomycin (Olig), og 2-DG. (C) Bars viser basale ECAR niveauer (D) glykolytisk sats (E) glykolytisk kapacitet, og (F) glykolytisk reserve af moDCs. Dataene blev puljet fra tre uafhængige forsøg; betyder 6 SEM. Statistiske forskelle blev analyseret ved envejs ANOVA med en Tukey multipel sammenligning post-test. Dette tal er blevet ændret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 jun 2015). Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Copyright 2015. American Association of immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette papir beskriver en metode til at generere fra monocytter umodne moDCs, tolerogeniske moDCs og modne moDCs. De vigtige skridt i denne protokol er diskuteret i detaljer i de følgende afsnit. Det er vigtigt at bemærke, at humant perifert blod anvendes som udgangsmateriale i denne protokol og universelle forholdsregler for håndtering af humant blod bør praktiseres. Selv om det er teknisk muligt at udlede DC'er fra knoglemarv hos mennesker 24, er in vitro DC differentiering af celler fundet i perifert blod foretrækkes på grund af tilgængeligheden af perifert blod sammenlignet med knoglemarv. Blandt de celler findes i perifert blod, er hæmatopoietiske CD34 + stamceller og monocytter almindeligt anvendt til in vitro generering af DC'er. Hæmatopoietiske CD34 + stamceller dyrkes med GM-CSF og TNF-α til at udlede CD1a + og CD14 + delmængder, som derefter yderligere differentieret i Langerhanslignende celler og dendritiske celler. Omvendt monocytter dyrkes i GM-CSF og IL-4 til at generere umodne moDCs. Flere protokoller anvendes til berigelse af monocytter fra perifert blod; for eksempel ved tilslutning til plast retter, slæmning og isolation kits 25, 26 Fordelene ved vedhæftning protokollen er minimale skader på celler og relativt omkostningseffektivt dog celle renhed kan blive kompromitteret.; og en ekstra trin er nødvendigt at løsne cellerne til yderligere forsøg. Elutriation er en teknik, der adskiller celler baseret på deres størrelse og tæthed. Fordelene ved slæmning er cellelevedygtighed og monocytter kan let anvendes til yderligere forsøg; men denne teknik er begrænset af tilgængeligheden af ​​en elutriator og den manglende evne til at separere forskellige populationer af celler (T-celler og monocytter) med lignende bundfældelsesparametrene. Kommercielt tilgængelige isolation kits anvender magnetiske mikroperler til enten positivt vælge ellervælge den monocytiske befolkning negativt. Nogle protokoller er forudindtaget mod monocyt isolation ved hjælp af den negative udvælgelse som de isolerede monocytter forblive "uberørt" (ikke bundet af markører eller mikrokugler). I denne protokol, blev CD14 perler brugt til positive udvalgte humane monocytter fra PBMC'er. CD14 mangler et cytoplasmatisk domæne og binding af antistof til CD14 ikke udløser signaltransduktion. Desuden vil mikroperlerne løsnes fra monocytter efter dyrkning og dermed ikke hindrer differentieringsprocessen. Desuden er CD14 kraftigt udtrykt på de fleste monocytter og svagt på neutrofiler og nogle myeloide dendritiske celler, derfor denne fremgangsmåde til isolation resulterer i højere celle renhed end de andre metoder 17.

Blodmonocytter kan opdeles i DC'er eller makrofager og skæbne monocytter i høj grad afhænger af cytokin miljø. I dette papir, er moDCs genereres ved tilsætning af granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) Og Interleukin 4 (IL-4) til humane perifere blodmonocytter. GM-CSF er påkrævet for monocyt overlevelse og IL-4 udøver en inhiberende aktivitet på makrofag differentiering; og det kombinatoriske tilsætning af GM-SCSF og IL-4 til monocytter giver en større procentdel af umodne moDCs sammenlignet med individuel cytokin 27. Der er andre protokoller, der genererer moDCs ved tilsætning tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) og interleukin 13 (IL-13) til perifere blodmonocytter 28, 29, 30. Kombinationen af ​​GM-CSF og IL-4 blev optimeret i 1990'erne og nu en accepteret protokol, der genererer plast umodne DC'er differentieret i immunogene eller tolerogeniske moDCs og polariseret i Th1, Th2 eller Th17 fremme moDCs.

Umodne moDCs er differentieret i tolerogeniske moDCs ved tilsætning af vitamin D3 og dexamethason. Der er flere protokoller til at generere tolerogeniske DC'er for eksempel vianuklear faktor-kappa B (NF-kB) inhibering, β-catenin-aktivering, vitamin D3, Dexamethason og rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Selvom både vitamin D3 og dexamethason alene er blevet rapporteret at inducere en tolerogenisk virkning på DC'er, kombinationen af ​​vitamin D3 og dexamethason resultere i en større undertrykkelse af alloproliferation end når der anvendes individuelle lægemidler. Derfor blev den eksisterende protokol for frembringelse af toleranceudviklende DC'er modificeret til en kombination af vitamin D3 og dexamethason. Denne metode er ved at blive accepteret som en model for humane tolerogeniske DC'er med et terapeutisk værktøj. Det er også vigtigt at bemærke, at den rekonstituerede vitamin D3 og dexamethason har en kort holdbarhed.

I denne protokol, blev Lipopolysaccharider (LPS) tilsat som en DC modning inducer. Umodne moDCs kan også induceres til modning bruge pro-inflammatorisk cocktail:(TNF-α), Interleukin 1-beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) og prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-a og interferon gamma (IFN-Γ)). Pro-inflammatoriske cocktail genererer modne moDCs med høj co-stimulerende og migrerende funktioner, men de producerer relativt lave niveauer af IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ alene ikke er i stand til at inducere en stabil dendritisk fænotype 39. LPS stimulerer Toll-lignende receptor 4 (TLR4), medierer aktiveringen af ​​NF-kB og mitogenaktiveret proteinkinaser (MAPK'er) for at inducere DC modning. DC modning induceret af LPS viser en opregulering af DC modning markører (CD83, CD86, HLA-DR) og førte også til produktionen af ​​IL-12p70. Desuden kan dette trin modificeres yderligere til at parre LPS med TLR3 agonister til at producere modne DC'er til kliniske cancervacciner. I dette papir, er tolerogeniske DC'er vist at være resistente over for modning ved LPS behandling. Disse semi-modne lignende DC'er er ikke immunogene og ikke ReleaSE proinflammatoriske cytokiner 40.

Begrænsningerne ved denne protokol ligge i differentieringsprocessen. Processen tager 8 dage fra dag 0 til dag 7, som udgør en vanskelighed, der skal tilpasses til high throughput analyser. En ændring i protokollen er forpligtet til at forkorte differentiering processen endnu give høje antal af levedygtige DC'er i de forskellige stater. For det andet er de udviklingslandene genereres ved tilsætning af cytokiner i denne protokol, og disse cytokiner ikke opretholde DC befolkning i længere tid. Endvidere er cytokiner anvendes i koncentrationer meget højere end in vivo og kunne resultere i forudindtaget udvikling af veje, der ikke er fysiologisk identisk med in vivo DC'er. For eksempel in vitro kulturer af DC-forstadier er blevet vist at reagere på GM-CSF, som ikke er en væsentlig cytokin for normal DC differentiering in vivo 41. Ikke desto mindre kan cytokinstimulering være en nyttig metode til gensats høje antal af DC in vitro for eksperimenter. Evnen til at underkaste disse celler genereret fra denne protokol til andre analyser såsom immunfluorescensfarvning, flowcytometri, allo reaktion studier og metaboliske undersøgelser øger anvendeligheden af ​​denne metode. Disse in vitro udviklingslandene tjene som en god model for at forbedre kendskabet til DC udvikling, modning og antigen præsentation, som er tidligere vanskeligt at gøre med de sjældne antal in vivo DC'er.

DCs 'evne til at regulere immunologisk immunitet versus tolerance gør dem attraktive kandidater i terapi mod cancer og autoimmune sygdomme 42, 43, 44, 45. Immunogene DC'er genereret på denne protokol kan bruges til at forbedre vaccination effektivitet mod infektionssygdomme og tumorer; mens tolerogeniske DC'er kan anvendes til at styre uønsket T-cellereaktioner og forebygge afvisninger efter transplantation. Den indvikledebalance mellem immunitet og tolerance afhænger uhyre på DC differentiering status. DC differentiering er et koordineret cellulært program, der er styret af flere signalveje og stofskiftet. Forskellige differentieringsfaktorer tilstande af DC forskellige i bioenergetic og biosyntese behov; for eksempel aktiverede DC'er kræver mere energiske metaboliske tilpasninger vigtige for overlevelse og migration i forhold til udviklingslandene på hviletilstand. Det er vigtigt at bemærke, at vitamin D3, dexamethason og rapamycin er kendt for deres evne til at inducere tolerogeniske DC'er, er blevet beskrevet at påvirke DC metabolisme. I dette papir, blev den energiske metabolisme af moDCs fra forskellige differentieringsfaktorer tilstande karakteriseret ved anvendelse ekstracellulære flux analysatorer og tolerogeniske moDCs udviste den højeste metaboliske plasticitet og LPS-induceret modning faldt denne plasticitet. Anabolske stofskifte understøtter DCs modning mens kataboliske metabolisme påvirkninger toleranceudviklende DC fungerer 46. de DC'ergenereret fra denne protokol kan bruges til at vurdere, om ændring af det metaboliske tilstand udviklingslandene er nøglen til at ændre immunitet og tolerance i terapi. Afslutningsvis præsenterede vi en protokol til generering af umodne, toleranceudviklende og modne moDCs afgørende for at studere DC'er 'immunregulatoriske funktioner.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Styrelsen for Videnskab, Teknologi og Reasearch Core Funding (til JEC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 ml centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 ml falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 ml falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline		 Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab		 BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel		 Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 ml Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

Tags

Immunologi tolerogenisk moDCs Ældre moDCs Umodne moDCs Immunity Tolerance Metabolism
Generering af Umodne, Modne og tolerogeniske dendritiske celler med forskellige Metabolic fænotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sim, W. J., Malinarich, F.,… More

Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. M., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter