Abstract
Immunrespons resultat från ett komplext samspel mellan antigenet ospecifika medfödda immunsystemet och antigenet specifikt adaptiva immunsystemet. Immunsystemet är en konstant balans upprätthålla tolerans mot själv molekyler och reagera snabbt för patogener. Dendritiska celler (DC) är kraftfulla professionella antigenpresenterande celler som länkar det medfödda immunförsvaret att det adaptiva immunsystemet och balansera den adaptiva svar mellan själv och icke-själv. Beroende på mognadssignaler kan omogna dendritiska celler selektivt stimuleras att differentiera till immunogena eller tolerogena DC. Immunogena dendritiska celler ger spridningssignaler till antigenspecifika T-celler för klonal expansion; medan tolerogena dendritiska celler reglerar tolerans genom antigenspecifik deletion T-cell eller klonal expansion av regulatoriska T-celler. På grund av denna unika egenskap är dendritiska celler mycket eftertraktade som terapeutiska medel för cancer och autoimmuna diseases. Dendritiska celler kan laddas med specifika antigener in vitro och injiceras i människokroppen för att montera ett specifikt immunsvar både immunogen och tolerogena. Detta arbete presenterar ett sätt att generera in vitro från monocyter, omogna monocyt härledda dendritiska celler (moDCs), tolerogen och mogna moDCs som skiljer sig i ytan markör uttryck, funktion och metaboliska fenotyper.
Introduction
DC beskrevs först av Paul Langerhans (Langerhans celler) i slutet av artonhundratalet som refereras av Jolles en och kännetecknas av Ralph Steinman och Zanvil Cohn 1973 som kände igen dem som professionella antigenpresenterande celler 2. DCs finns i perifert blod och i de flesta vävnader i kroppen, särskilt riklig i vävnader som är utsatta för den yttre miljön, såsom huden (närvarande som Langerhans celler) och i foder i näsan, lungor, mage och tarmar som gör det möjligt dem att stöta yttre antigener. Omogna DC har endocytiska kapacitet men relativt låg kapacitet att stimulera T-celler 3. Omogna DC uttrycka olika mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) som fångar patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) eller skada associerade molekylära mönster (dämpas) 4. Aktivera varningssignaler kör mognad mot immunogena DC medan själv molekyler resulterar i T-cells unresponsiveness och apoptos 5. Immunogena DCs kännetecknas av uppreglering av MHC-molekyler och sam-stimulerande ytmolekyler och deras förmåga att prime naiva T-celler 6,7.
Omogna DC kan också mognat till en Treg framkallande eller tolerogena tillstånd som svar på vitamin D3-metaboliten 1a, 25 (O) 2 D3 och vissa immunosuppressiva medel som interleukin-10 (IL-10), dexametason och rapamycin 8-9. Tolerogena DCs kännetecknas av sin expression av immunoreceptor tyrosin-baserade inhiberande motiv (ITIMs) innehållande ytreceptorer och ligander. Signalöverföring av ITIMs innehåller ILT familjemedlemmar, ILT3 och ILT4 i tolerogena DCs hämmar alloproliferation och kör Foxp3 + Treg expansionen 10,11. Dessa unika egenskaper hos tolerogena DCs leda till att de djupgående potens in vivo, nämligen förmågan att inducera varaktig tolerans mot transplanterade allogena transplantat och supprESS utvecklingen av autoimmuna sjukdomar. Tolerogen DCs kan ses därför som en subtyp av mogna polariserade DCs som fungerar på hämning av immunaktivering.
För närvarande finns det två allmänna undergrupper av dendritiska celler i humant perifert blod: plasmacytoid DCS och myeloida DCs 12. Cirkulerande DCs är sällsynta utgör till mindre än 2% av leukocyter i blod från människa, och detta utgör en svårighet till isolering av ett lämpligt antal DC: er att studera deras immunregulatoriska funktioner. För att övervinna detta problem, är monocyt differentierade DCs används som en modell för studier av dendritisk cellfunktion in vitro. Dessa in vitro DCs har liknande receptorer och funktioner jämfört med in vivo DC. Detaljerad jämförelse av in vivo DCs och som härstammar från monocyter in vitro genererade DC (moDCs) undersöks av andra laboratorier 13, 14, 15. Det har också rapporterats att moDCs och CD1c + DC var motsvarande vid antigenpresenterande och inducera T-cellsfunktionen 15.
I detta dokument beskriver vi en metod för att generera omogna moDCs från perifera blodmonocyter och därefter differentiera dem till immunogena och tolerogena DCs. Dessa härstammar från monocyter dendritiska celler (moDCs) kännetecknas av deras ytmarkörer, cytokin profil, immunreglerande funktioner och metaboliska tillstånd. Immunogena och tolerogena dendritiska celler producerar olika cytokiner som resulterar i expansion av antingen allogena T-celler eller regulatoriska T-celler. I detta dokument är cytokin profilering utförs med system som använder multiplex teknik. Tillväxtmediet för celler inkuberas med antikropp immobiliserad färgkodade pärlor och läsa i en kompakt analysator. Metabola stater DCs analyseras med extracellulära flödesmätare som mäter syreförbrukningen, en indikator på cellandning, och extracellulära försurning takt som speglar glykolytiskaflux i dendritiska celler. Mätning av dessa priser bioenergetik ger en möjlighet att spåra förändringar i cellulär metabolism som är viktiga i dendritiska celler utveckling och funktion.
Protocol
Denna forskning godkändes av Institutional Review Board (NUS-IRB 10-250).
1. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Framställning av reagens
- Förbereda PBS / EDTA: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och komplettera med 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Sterilisera lösningen genom filtrering genom ett 0,2 pm filter. Observera att lagra PBS / EDTA vid 4 ° C och värm till rumstemperatur före användning.
- Förbereda färgning buffert: fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) komplettera med 2% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) och 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Sterilisera lösningen genom filtrering genom ett 0,2 pm filter.
- Samla blod från blod Cone
Obs: Blod kon innehåller vita blodcellkomponenter som samlats in efter plattaletpheresis från sjukhuset. Om blod samlas i heparin eller EDTA-rör, späd blodet med PBS i förhållandet 1: 1 och gå vidare till steg 1,3; om buffy coat tas emot, späd buffy coat med PBS i förhållandet 1: 2 och gå vidare till steg 1,3.- Skära de två ändarna av könen för att tillåta blod att strömma ut i en 50 ml tub. Notera att kon innehåller vanligtvis 10 ml av blod.
- Använd en trubbig ände spruta innehållande 30 ml PBS / EDTA för att tvätta konen och samla upp i ett 50 ml rör.
- Späd blod ytterligare med PBS / EDTA till en slutlig volym av 80 ml.
- Isolering av PBMC genom densitetscentrifugering 16
- Alikvotera 15 ml Ficoll vardera till 4 nya 50 ml rör.
- Använd en 25 ml serologisk pipett för att lägga till 20 ml utspätt blod över Ficoll skiktet. Notera att hålla 50 ml rör i 45 vinkel och vara noga med att inte störa interfas.
- Centrifugera rören vid 805 xg utan bromsar i 30 min, 20 ° C.
- Ta bortplasmaskiktet och samla ringen av PBMC ligger strax under plasmaskiktet med en Pasteur-pipett. Kombinera fyra rör av PBMC i två 50 ml rör. Observera att undvika att samla det transparenta skiktet under PBMC.
- Lägga PBS / EDTA till en slutlig volym av 50 ml per rör av PBMC och centrifugera vid 548 xg med bromsar i 10 min, 20 ° C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i varje rör med 25 ml färgningsbuffert och kombinera till ett 50 ml rör.
- Centrifugera vid 367 xg med bromsar för 5 min, 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med 10 ml färgningsbuffert.
2. Monocyt Berikning genom magnetisk separation 17
- Bestäm mobilnummer
- Ta 20 pl PBMC cellsuspensionen och blanda med 20 pl trypanblå att räkna antalet levande celler med hjälp av cytometer.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 367 xg med bromsarunder 10 min, 4 ° C.
- Aspirera supernatanten fullständigt och återsuspendera cellpelleten till en koncentration av 10 7 celler per 80 | il färgningsbuffert.
- magnetisk märkning
- Tillsätt 20 | il av CD14 mikropärlor per 10 7-celler, blanda väl och inkubera under 15 minuter vid 2-8 ° C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml färgningsbuffert per 10 7-celler och centrifugera vid 367 xg med bromsar för 10 min, 4 ° C.
- Aspirera supernatanten fullständigt och återsuspendera cellpelleten i en koncentration av 10 7 celler per 50 pl färgningsbuffert.
- magnetisk separation
- Använd kolumn medelstora högst 2 x 10 8 totala celler.
Obs: Välj en lämplig kolonn och separator i enlighet med antalet av totala celler och antalet CD14 + celler som rekommenderas i databladet. - Placera kolumnen i magnetfältet ofa lämplig separator och förbereda kolumn genom att skölja med 500 pl färgningsbuffert.
- Pipett cellsuspensionen på kolonnen och samla omärkta celler som passerar genom kolonnen med en 15 ml tub.
- Byt en ny 15 ml tub i kolumnen och tvätta kolumn 3 gånger med 500 pl färgningsbuffert. Se till att kolonnbehållaren är tom innan du lägger till nya färgning buffert mellan tvättar.
- Ta kolumn från separatorn och placera den på ett nytt 15 ml rör.
- Pipettera 1 ml färgningsbuffert på kolonnen. Skölj omedelbart ut magnetiskt märkta cellerna genom fast trycka kolven (tillhandahållet i kitet) i kolonnen.
- Upprepa steg 2.3.2 till 2.3.6 med hjälp av den eluerade fraktionen på en ny kolumn för att öka renheten hos CD14 + celler. Notera att pärlorna kommer att frigöras från cellerna automatiskt i kultur under steg 3,2.
- Använd kolumn medelstora högst 2 x 10 8 totala celler.
3. Differentiering av dendritiska celler till olika aktiverings States
- Framställning av reagens (Endotoxin nivå måste vara mindre än 0,1 EU / ml i alla reagenser)
- Förbered cellodlingsmedium: RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA) och 0,05 mM 2-merkaptoetanol (2ME). Sterilisera lösningen genom filtrering genom ett 0,2 pm filter.
- Förbereda cytokiner: rekonstituera IL-4 och GM-CSF i cell-odlingsgrad vatten till en koncentration av 0,25 mg / ml under aseptiska betingelser. Alikvotera cytokiner i 200 pl mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
- Förbereda vitamin D3 lager: rekonstituera vitamin D3 i cellodlings kvalitet vatten till en koncentration av 100 mM under aseptiska förhållanden. Alikvotera vitamin D3 i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda dexametason lager: rekonstituera dexametason i cellodlings kvalitet vatten till en koncentration av 10 mM under aseptiska förhållanden. alikvot dexamethasone i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda LPS: rekonstituera Lipopolysackarider (LPS) i cell-odlingsgrad vatten till en koncentration av 1 mg / ml under aseptiska betingelser. Alikvotera LPS i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
- Generering Olika moDCs
- Seed 4 uppsättningar av CD14 + monocyter i koncentration av 0,3 till 0,5 x 10 6 / ml cellodlingsmedium kompletterat med 200 ng / ml av GM-CSF och 200 ng / ml av IL-4 i 6-brunnsplattor. Observera att detta är Dag 0 och volymen av mediet i varje 6 brunn är 2 ml.
- Inkubera cellerna i vävnadskultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Avlägsna 850 | il medium från odlingen vid dag 4 och centrifugera vid 300 xg under 5 min, 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml cellkulturmedium innehållande 2x av (200 ng / ml av GM-CSF och 200 ng / ml av IL-4). Lägg till detta cellblandning tillbakatill odlingen. Notera att 2x koncentration tillsättes för GM-CSF och IL-4 kommer att bli 1x när en ml medium sättes tillbaka in i kulturen.
- Tillsätt 1 l av vitamin D3 lager och 1 pl av dexametason lager per ml medium till två av uppsättningarna på dag 5 för att generera tolerogena moDCs. Observera att den slutliga koncentrationen av vitamin D3 är 100 nM och dexametason är 10 nM; tillsats av GM-CSF och IL-4 är inte nödvändig på dag 5.
- Tillsätt 200 ng / ml av GM-CSF och 200 ng / ml av IL-4 till alla uppsättningar på dag sex.
- Tillsätt 1 | j, g / ml av LPS till en av uppsättningarna som behandlats med enbart GM-CSF och IL-4 vid dag 6 för att generera mogna moDCs.
- Lägg 1 | ig / ml LPS till en uppsättning av de tolerogena moDCs vid dag 6 för att generera LPS-tolerogena moDCs.
- Skörda de olika typerna av moDCs vid dag 7 genom att spola odlingsskål med PBS, EDTA för flödescytometri eller andra studier. Observera att endast icke-vidhäftande celler skördas. Notera att procentuella avkastningen från CD14 + monocytes för omogna moDCs, mogna moDCs, tolerogena moDCs och LPS-tolerogena DC är omkring 90%, 50%, 60% respektive 60% och varierar mellan blodgivare och FBS mycket.
4. Flödescytometri
- Cellytmarkör Karaktärisering på moDCs
- Lösgöra cellerna från odlingsskål genom pipettering. Tvätta cellerna en gång med PBS / EDTA och återsuspendera cellerna i en koncentration av 5 x 10 5 celler per 50 | il färgningsbuffert i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Inkubera 0,5 x 10 6 celler portioner med PerCP-konjugerad HLADR (1: 100), PE-konjugerad CD80 (1:50), PE-konjugerad CD83 (1:25), PE-konjugerad CD86 (1:50), APC- konjugerad CD11c (1:50), PE-konjugerad CD14 (1:50) och PE-konjugerad BDCA3 (1:50) och APC-konjugerad ILT3 (1:25) i mörker under 30 minuter vid 4 ° C. Isotypmatchad PerCP-konjugerad Mab (1:20), PE-konjugerade MAb (1:11), kommer APC-konjugerade MAb (01:11) tjänar som negativa kontroller.
- Detektera de expressionsnivåer av de ytmarkörer med användning av en flödescytometer 18.
- Analys av mitokondrier membranpotential av moDCs
- Bereda stamlösning av 1 mM Red klormetyl-X-rosamine (CMXRos) genom att tillsätta 94,1 pl av dimetylsulfoxid (DMSO) per 50 ^ g av lyofiliserad Red CMXRos.
- Inkubera 2 x 10 5 moDCs med 100 nM Red CMXRos i 1 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i 30 min vid 37 ° C i 15 ml rör.
- Tillsätt 2 ml PBS / EDTA till celler och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter, rumstemperatur. Upprepa 2 gånger. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 300 | il PBS, EDTA, 2% FCS för flödescytometrianalys. Notera att använda PE-kanal för att analysera Red CMXRos signal.
- Marker karakterisering av T-celler
- Inkubera 50 pl av 1,2 x 10 6 CFSE-märkt allo CD4 + T-celler (som genererats frånsteg 5,6) med PerCP-konjugerad CD3 (1: 200), PE / Cy7-konjugerad CD4 (1: 400) och APC / Cy7-konjugerad CD25 (1: 100) i mörker under 30 minuter vid 4 ° C. Fläcken T-celler med användning av ett kommersiellt kit med Foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) i mörker under 1 h vid rumstemperatur.
5. Alloreaction Studier
- Förbereda 5 mM stamlösning av karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) genom att tillsätta 18 | il DMSO till lyofiliserades CFSE, enligt tillverkarens protokoll.
- Rena CD4 + T-celler från PBMC
- Bestämma antalet celler genom att ta 20 | il av PBMC cellsuspension och blanda med 20 pl av trypanblått för att räkna antalet levande celler med användning av en cytometer.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 367 xg med bromsar för 10 minuter, 4 ° C.
- Aspirera supernatanten fullständigt och återsuspendera cellpelleten i en koncentration av 5 x 10 7 celler per 1 ml färgningsbuffert i en 5 ml Bansrene röret.
- Lägg Human CD4 + T-cell Anrikning Cocktail vid 50 ml / ml celler. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur (15 - 25 ° C) under 10 min.
- Vortex magnetiska partiklar för 30 sek och lägga magnetiska partiklar vid 100 pl / ml celler. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Lägg färgning buffert till cellsuspensionen till en total volym av 2,5 ml. Blanda cellerna i röret genom att försiktigt pipettera upp och ned 2 - 3 gånger. Placera röret i magnet och inkubera i 5 min.
- Vänd magnet med röret och dekantera suspensionen (innehåller T-celler) i en ny 5 ml polystyrenrör.
- Bestäm antalet celler och inkubera 1,2 x 10 6 CD4 + T-celler med 5 iM CFSE i 1 ml PBS under 20 minuter vid 37 ° C, skyddat från ljus.
- Tillsätt fem gånger det ursprungliga färgningsvolymen cellodlingsmedium (framställt enligt steg 3.1.1) till cellerna och inkubera i 5 min.
- centrifugeuge vid 300 xg under 5 min, 4 ° C och återsuspendera pelleten i cellodlingsmedium vid en koncentration av 2 x 10 5 per 75 ul.
- Lägga 75 ul 2 x 10 5 CFSE-märkta CD4 + T-celler till varje moDC odling innehållande 75 | il av cellkulturmedium med 0, 2,5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 och 40 x 10 3 moDCs i 96 väl U-bottenplattor. Odling under 6 dagar i vävnadskultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Skörd genom att pipettera CD4 + T-celler i 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min, 4 ° C. Samla in supernatanten för cytokinanalys och återsuspendera cellpelleten i 2 ml PBS / EDTA och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
6. Cytokine Analys 19
- Samla supernatanter från alloreaction studier som beskrivs i steg 5,5.
- Framställning av reagens för Human Cytokine / Chemokine Magnetisk Analys Panel
- För framställning av blandningsflaska av antikropps immobiliserade pärlor för individuella ampuller av pärlor (ingår i satsen), vortex under 1 min. Tillsätt 60 pl från varje antikropp pärla flaskan till blandningsflaska (ingår i satsen) och ta med till en slutlig volym av 3 ml med Bead Diluent (medföljer).
- För framställning av kvalitetskontroller, rekonstituera Kvalitetskontroll 1 och kvalitetskontroll 2 (ingår i satsen) med 250 pl avjoniserat vatten.
- För beredning av tvättbuffert, späd 30 ml 10X tvättbuffert (ingår i satsen) med 270 ml avjoniserat vatten.
- För beredning av humant cytokin Standard, rekonstruera den mänskliga cytokin standard (ingår i satsen) med 250 pl avjoniserat vatten för att ge en 10.000 pg / ml koncentration.
- Tillsätt 50 pl av 10.000 pg / ml humant cytokin standard till 200 pl analysbuffert (tillhandahållet i kitet) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör att göra 2000 pg / ml arbetsstandard. Överför 50 ul av 2000 pg / ml humant cytokin standard till 200 pl analysbuffert (tillhandahållet i kitet) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör att göra 400 pg / ml arbetsstandard.
- Överför 50 ul av 400 pg / ml humant cytokin standard till 200 pl analysbuffert (tillhandahållet i kitet) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör att göra 80 pg / ml arbetsstandard. Överför 50 ul av 80 pg / ml humant cytokin standard till 200 | il analysbuffert (tillhandahållet i kitet) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för att göra 16 pg / ml arbetsstandard.
- Överför 50 ul av 16 pg / ml humant cytokin standard till 200 pl analysbuffert (tillhandahållet i kitet) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör att 3,2 pg / ml arbetsstandard. 0 pg / ml arbetsstandard har endast 200 | il analysbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Pre våt filterplatta (ingår i satsen) genom att pipettera 200 pl analysbuffert (tillgänglig) i varje brunn av filtertallrik. Försegla och placera filterplattan på en plattskakanordning under 10 min vid rumstemperatur.
- Aspirera analys buffert och tillsätt 25 fil av varje standard eller kvalitetskontroll i lämpliga brunnar.
- Tillsätt 25 | il cellodlingsmedium (framställt enligt steg 3.1.1) till bakgrunden, standarder och kontrollbrunnar.
- Tillsätt 25 | il analysbuffert till provbrunnarna och tillsätt 25 ul av provet i de lämpliga provbrunnar.
- Virvelblandningsflaska innehållande antikropps immobiliserade pärlor och tillsätt 25 | il av de blandade pärlor till varje brunn. Försegla plattan och inkubera under skakning på en plattskakanordning över natten vid 4 ° C.
- Aspirera vätska och tvätta plattan 2 gånger genom tillsats av 200 | j, l / brunn tvättbuffert och aspire fluiden.
- Tillsätt 25 pl detektionsantikroppar (medföljer) i varje brunn. Täta och inkubera under omröring på en plattskakanordning under 1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt 25 | il av Streptavidin- fykoerytrin (provIDed) till varje brunn innehållande de 25 | il av detektionsantikroppar. Täta och inkubera under omröring på en plattskakanordning under 30 min vid rumstemperatur.
- Aspirera vätska och tvätta plattan enligt beskrivningen i steg 6,8.
- Tillsätt 150 | il / brunn av omslutande vätska till alla brunnar och återsuspendera pärlor på en plattskakanordning under 5 min.
- Identifiera fluorescensintensitet av pärlor med hjälp av en 3D-system 20. Analysera medianfluorescensintensitet data med hjälp av en fem parameter log-logistiska kurvanpassningsmetod för att beräkna cytokin / kemokiner koncentrationer i prover 21.
7. realtid syreförbrukningen (OCR) och extracellulär Försurning Rate (ECAR) Mätningar
- Framställning av reagens / Material
- Förbered OCR medium: analysmedium kompletterat med 25 mM glukos och 1 mM natriumpyruvat (pH 7,35). Sterilisera lösningen genom filtrering genom ett 0,2 pm filter. Notera att detta medium är prepared utan FBS eftersom komponenter i FBS är komplexa och varierar från ett parti till anther mycket.
- Förbered ECAR medium: Base-medium kompletterat med 2 mM L-glutamin (pH 7,35). Sterilisera lösningen genom filtrering genom ett 0,2 pm filter. Notera att detta medium framställs utan bikarbonat, glukos, pyruvat och FBS. Observera att FBS har buffertkapacitet och kommer att störa ECAR läsning.
- Framställa föreningar för OCR mätningar: Resuspendera oligomycinkänslig med 630 pl OCR medium för att göra 100 iM stamlösning och späd med OCR-medium till 16 iM arbetar koncentration. Resuspendera karbonyl cyanid 4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) med 720 pl av OCR medium för att göra 100 iM stamlösning och späd med OCR-medium till 4,5 iM arbetar koncentration. Resuspendera rotenon / antimycin A med 540 pl OCR medium för att göra 50 iM förrådslösning och späd med OCR-medium till 10 iM arbetar koncentration.
- Förberedaföreningar för ECAR mätningar: Resuspendera Glukos med 3 ml ECAR mediet för att göra 100 mM stamlösning och späd till 80 mM arbetskoncentration. Resuspendera oligomycinkänslig med 720 pl ECAR medium för att göra 100 iM stamlösning och späd till 18 mM arbetskoncentration. Resuspendera 2-deoxi-D-glukos med 1,5 ml ECAR mediet för att göra 1000 mM stamlösning.
- Pipettera 200 | il av kalibrerings i varje brunn av patronen och förvara vid 37 ° C utan CO2 ett dygn före mätningarna.
- Realtids OCR Mätningar
- Harvest moDCs och återsuspendera varje typ av moDCs i OCR-medium vid en koncentration av 60 x 10 3 per 150 pl OCR medium.
- Frö 60 x 10 3 celler / brunn i en poly-D-lysin-belagda 96-brunnars flatbottnad platta och inkubera i en icke-CO2-inkubator under 1 h vid 37 ° C. Notera att använda 50 pl 50 ng / ml poly-D-lysin för att belägga plattan under 1 timme och tvätta medsterilt vatten. Hålla plattan torka i 2 timmar vid rumstemperatur före användning.
- Pipett 25 ul OCR medium i injektionsöppningen A för alla brunnar; 25 l OCR-medium innehållande 16 | iM av oligomycinkänslig i insprutningsöppningen B till alla brunnar; 25 l OCR-medium innehållande 4,5 | iM (FCCP) i insprutningsöppningen C för alla brunnar och 25 pl OCR-medium innehållande 10 mM rotenon / antimycin A i insprutningsöppningen D för alla brunnar. Observera att den slutliga väl koncentrationen för oligomycin är 2 | iM, är FCCP 0,5 | iM och rotenon / antimycin A är ett ^ M.
- Placera plattan i extracellulära flödes analysator och köra en komplett OCR studie med alla moDCs samtidigt i fyra på varandra följande steg: basrespiration (efter medel injektion från port A), mitokondriella komplex V inhibition (efter injektion av läkemedel från port B), maximal andning induktion (efter injektion av läkemedel från hamn C) och elektrontransportkedja inhibition (efter läkemedel från hamn D) 22. Notera att det finns tre cycles in mellan injektionerna och 6 minuters intervall mellan mätningarna.
- Realtids ECAR Mätningar
- Harvest moDCs och återsuspendera varje typ av moDCs i ECAR medium vid en koncentration av 60 x 10 3 per 150 | il ECAR medium.
- Frö 6 x 10 4 celler / brunn i en poly-D-lysin-belagda 96-brunnars flatbottnad platta och inkubera i en icke-CO2-inkubator under 1 h vid 37 ° C.
- Pipett 25 ul ECAR medium i injektionsöppningen A för alla brunnar; 25 pl ECAR medium innehållande 10 mM glukos i insprutningsöppningen B till alla brunnar; 25 | il ECAR medium innehållande 18 | iM av oligomycin i injektionsöppningen C i alla brunnar och 25 mikroliter OCR-medium innehållande 1000 mM 2-deoxi-D-glukos i injektionsöppningen D för alla brunnar. Observera att den slutliga väl koncentrationen för glukos är 10 ^ M, är oligomycin 2 | iM och 2-deoxi-D-glukos är 100 mM.
- Placera plattan i extracellulära flödes analysator och köra enkomplett ECAR studie med alla moDCs samtidigt i fyra på varandra följande steg: basrespiration (efter medel injektion från port A), glykolys induktion (efter injektion av läkemedel från port B), maximal glykolys induktion (efter injektion av läkemedel från hamn C) och glykolys inhibition (efter läkemedel från port D) 22.
- Analysera statistiska skillnader med användning av en envägs ANOVA med ett Tukey multipeljämförelse efter provet.
Representative Results
Monocyt Rening och dendritiska celler Differentiering
Monocyter renades från PBMC genom densitetscentrifugering av perifert blod (figur 1 A), följt av CD14 + positiv selektering magnetisk separation (Figur 1B) och odlades i fullständigt medium i närvaro av GM-CSF och IL-4 för erhållande av omogna dendritceller ( Figur 2A). Tillsats av vitamin D3 och dexametason stolpen GM-CSF och IL-4 resulterade i differentieringen av omogna moDCs till tolerogena moDCs (figur 2b). LPS tillsattes för att inducera mognaden av omogna moDCs mogna moDCs (Figur 2C) och tolerogena moDCs stimulerades med LPS för att kontrollera motståndet mot mognad (figur 2D). Blodproverna användes i detta arbete erhölls från friska donatorer med tidigare informeradesamtycke.
moDC Karakterisering
Ytmarkör Karakterisering med flödescytometri
Analys av DC ytmarkörer visade att mogna moDCs uttryckte de högsta nivåerna av mognadsmarkörer HLA-DR, CD83 och CD86 jämfört med LPS-behandlade tolerogena moDCs, tolerogena moDCs och omogna moDCs (Figur 3). Dessa resultat visade att tolerogena moDCs var resistenta mot mognad jämfört med omogna moDCs följande LPS-stimulering. Dessutom, LPS-behandlade tolerogena moDCs och tolerogena moDCs visas ökat uttryck av CD14, BDCA3 (CD141) och immunoglobulin-liknande transkript (ILT) 3 jämfört med omogna och mogna moDCs. De tolerogena moDCs som vi genereras här överensstämmer med tidigare rapporter 23.
Funktionell karakterisering av moDCs
moDCs inducerade för mognad blir immunogena och frisätta cytokiner som främjar proliferationen av CD4 + T-celler. Vi bedömde immunogeniciteten för de olika moDC subtyper genom att mäta spridningen av samodlade T-celler. Tolerogena moDCs var svagt immunogena jämfört med mogna moDCs, såsom visas genom låga alloproliferation av CD4 + -T-celler (Figur 4A). Tolerogena moDCs kännetecknas av deras låga IFN-Γ, låg IL-12p40, och hög-IL-10 cytokinproduktion i alloreaction samodlingar med CD4 + T-celler (Figur 4B). Dessutom ökar antalet tolerogena moDCs i samodlingar av mogna moDCs inducerade allospecifik CD4 + T-celler ökade frekvensen av CD25 hög foxp3 + regulatoriska T-celler (Figur 4C).
Röd CMXRos används för att återspegla den mitokondriella aktiviteten för att analysera de mitokondriella membranpotentialnivåer i moDCs. Tolerogena moDCs observerades att ha högre mitokondriell aktivitet jämfört med de andra moDC differentierade subtyper (figur 5A). Därefter hastigheten av mitokondriell syreförbrukning (OCR) bedömdes med avseende på de olika moDC subtyper genom att använda en Bioanalyzer. OCR mätningar tillåter högupplösta insikter till metaboliska profilen, ger information, inklusive men ej begränsat till basrespiration, reservlungkapacitet, proton läcka och icke-mitokondriell andning. Mätningen av OCR tillhandahåller ett medel för att bedöma förmågan hos celler att svara på stress. Cellerna metaboliskt störs genom tillsats av tre olika föreningar i följd. Den första injektionen är Oligomycin (ATP Coupler) som inhiberar komplex V i elektrontransportkedjan (ETC), inhibering av ATP-syntes. Detta steg skiljer den procentuella andelen syre som förbrukas för syntes av ATP och andelen syre som förbrukas för att övervinna proton läcka över det inre mitokondriemembranet. Den andra injektionen är FCCP (ETC accelerator) som stör ATP-syntesen genom att transportera vätejoner över mitokondriemembranet i stället för genom protonkanal av Complex V. Kollapsen av mitokondriell membranpotential leder till en snabb förbrukning av energi och syre, utan generering av ATP. FCCP behandling kan användas för att beräkna den reservandningskapacitet av celler. Underhåll av reservlungkapacitet under stressförhållanden är avgörande för cellöverlevnad. Denna förmåga bestäms av flera faktorer, bland annat tillgängligheten av substrat och funktionsförmåga av enzymer som är involverade i ETC. Den tredje injektion är en kombination av Rotenon, ett Complex I hämmare, och antimycin A, en komplex III-hämmare. Denna kombination stängs mitokondrie andning och OCR observeras att minska till följd av nedsatt mitokondriefunktion (figur 5C). Tolerogena moDCs visas högre basala OCR nivåer än mogna moDCs (figur 5D). Dessutom tolerogena, LPS-tolerogen och omogna moDCs visade ökad reservandningskapacitet jämfört med mogna moDCs (Figur 5E).
Metabolisk Karakterisering av moDCs
Eftersom mjölksyra och protoner frisätts från celler under glykolys, analyserade vi den glykolytiska aktiviteten hos moDCs genom att utföra en realtidsanalys av hastigheten av extracellulär försurning (ECAR) (Figur 6B). I närvaro av glukos, ökade den glykolytiska graden för alla moDCs jämfört med basalstadiet, medmogna moDCs uppvisar högre glykolytiska takt än omogna moDCs (figur 6D). Tolerogen och omogna moDCs uppvisade högre maximal glykolys (inducerad genom oligomycinkänslig i närvaro av glukos) jämfört med LPS-behandlade moDCs (Figur 6B). Den glykolytiska kapacitet tolerogena och omogna moDCs var högre än mogna moDCs (figur 6E). I motsats till sin höga glykolytiska takt, var glykolytiska reserv de lägsta i mogna moDCs (Figur 6F).
Figur 1:. Monocyte Rening från perifert blod (A) 25 ml blod är noggrant skiktas på 15 ml Ficoll per 50 ml rör före centrifugering. PBMC är koncentrerade till ett lager under plasma efter densitetscentrifugering. (B) PBMC inkuberas med mikropärlor som konj ugated till monoklonala humana CD14-antikroppar (isotyp: mus IgG2a). och sedan lastas på en kolonn som är placerad i det magnetiska fältet av en separator för att isolera CD14 + monocyter Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Morfologisk karakterisering av moDCs. (A) 200 ng / ml GM-CSF och IL-4 tillsätts till renade CD14 + monocyter på dag 0, 4 och 6 för att generera omogna moDCs; och (B) ett ytterligare steg av stimulering med 100 nM vitamin D3 och 10 nM dexametason på Dag 5 genererar tolerogena moDCs. Omogna moDCs och tolerogena moDCs stimuleras med en | ig / ml LPS på dag 6 för att generera (C) mogna moDCs och (D) LPS-tolerogena moDCs.TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Surface Marker Karakterisering av flödescytometri uttrycksnivåer av ytmarkörer HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 och LT3 i tolerogena (grön), LPS-tolerogena (svart), omogna (röd), mogna (blå) moDCs. Isotypkontrollerna visas i grått. Individuell histogram för varje celltyp plottas med Y-axeln kroppar mot X-axeln logg över fluoroforen intensitet och över. Alla histogram är representativa för fyra oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni, 2015). Reproduceras och publiceras med copyright tillstånd. Copyright 2015. American Association ofImmunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Funktionell karakterisering av moDCs. (A) Kvantifiering av alloproliferation frekvensen av CD4 + T-celler inducerade genom samodling med ökande antal tolerogena (TOL, grön), LPS-tolerogena (L-TOL, svart), omogna (IMM; röd) och mogna (MAT ; blå) moDCs. Data slogs samman från fyra oberoende försök; medelvärde + SEM Statistiska skillnader mellan alla moDCs kontra mogna moDCs analyserades med två-vägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse efter provet. (B) Cytokin-analys av IFN-Γ (vänster fält), IL-12p40 (mittenpanelen) och Il- 10 (högra rutanl) i supernatanter från alloreactions mellan CD4 + T-celler samodlade med ökande antal av antingen tolerogena (grön), omogna (röd) eller mogna (blå) moDCs. Data samlades från sex oberoende experiment; medelvärde ± SEM (C) CD4 + T-cells alloproliferation och reglerande T-celler expansionen inducerad genom samodling med mogna moDCs i närvaro av ökande antal tolerogena moDCs. Vänstra Y-axeln, frekvensen av CD4 + T-cellproliferation. Högra Y-axeln, frekvens av CD25 hög Foxp3 + celler gated på proliferativ CD4 + T-celler. Data samlades från tre oberoende experiment; medelvärde ± SEM Statistiska skillnader mellan närvaro versus frånvaro av tolerogena moDCs analyserades med envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse efter provet. (D) CD4 + T-cells alloproliferation (vänster) och frekvensen av CD25highFoxP3 + celler (höger) inducerad av co- kultur med tolerogena moDCsi närvaro av ökande antal mogna moDCs. Data samlades från två till tre oberoende försök; medelvärde ± SEM Statistiska skillnader mellan närvaron versus frånvaro av mogna moDCs analyserades genom tvåvägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelse efter provet. Denna siffra har ändrats från J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni, 2015). Reproduceras och publiceras med copyright tillstånd. Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av mitokondrie aktivitet av moDCs. (A) Nivåer av mitokondriell membranpotential (Red CMXRos) i moDCs erhölls genom flåg cytometrisk analys. Data för fyra oberoende experiment poolades. Medelvärde ± SEM (B) Schematisk representation av en realtids mitokondriell andning. OCR analys utgående från basrespiration och efter tillsats av oligomycinkänslig (komplex V inhibition), FCCP (maximal andning induktion), och rotenon / antimycin En blandning (elektrontransportkedja [ETC] inhibition). Mitokondriella SRC (maximal basal subtraheras från maximal andning) härrör från OCR-kurvan. (C) representant kinetisk studie av mitokondrier OCR (pmol / min) i tolerogena (TOL, grön), LPS-tolerogena (L-Tol, svart) , omogna (IMM, röd) och mogna (MAT, blå) moDCs med hjälp av sekventiell tillsats av oligomycinkänslig (olig), FCCP, och rotenon / antimycin A (Rot-AA). (D) OCR kvantifiering av basrespiration av moDCs och ( E) skona andningskapacitet moDCs. Data samlades från fem oberoende experiment. Medelvärde ± SEM. Denna siffra har ändrats från J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni, 2015). Reproduceras och publiceras med copyright tillstånd. Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Metabolisk karakterisering av moDCs. (A) Schematisk representation av realtid glykolys. ECAR analys startar från basal ECAR, i vilket cellerna inkuberades i glukosfritt medium, följt av tillsats av glukos (glykolys induktion), oligomycin (som inducerar maximal cell glykolys och komplex V inhibition), och slutligen 2-deoxi-D- glukos(Glykolys inhibition). Glykolytiska takt (glykolysen induktion subtraheras för basal ECAR), glykolytiska kapacitet (maximal glykolys subtraheras för basal ECAR), och glykolytiska reserv (maximal glykolys subtraheras för glykolys induktion) härrör från ECAR kurvan. (B) representant kinetisk studie av glykolysen beroende ECAR (mph / min) i tolerogena (TOL, grön), LPS-tolerogena (L-Tol, svart), omogna (IMM, röd), och mogna (MAT, blå) moDCs med hjälp av sekventiell tillsats av glukos (Gluc) oligomycinkänslig (olig), och 2-DG. (C) Staplarna visar basala ECAR nivåer (D) glykolytiska takt (E) glykolytiska kapacitet, och (F) glykolytiska reserv av moDCs. Data samlades från tre oberoende experiment; betyda sex SEM. Statistiska skillnader analyserades genom en-vägs ANOVA med ett Tukey multipeljämförelse efter provet. Denna siffra har ändrats från J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 jun 2015). Reproduceras och publiceras med copyright tillstånd. Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta dokument beskriver en metod för att generera från monocyter omogna moDCs, tolerogena moDCs och mogna moDCs. De viktiga stegen i detta protokoll diskuteras i detalj i de följande styckena. Det är viktigt att notera att humant perifert blod används som utgångsmaterial i detta protokoll och universella försiktighetsåtgärder för hantering av mänskligt blod bör praktiseras. Även om det är tekniskt möjligt att härleda DC från benmärg hos människor 24 är DC differentiering från celler som finns i perifert blod in vitro att föredra på grund av tillgången till perifert blod jämfört med benmärg. Bland de celler som återfinns i perifert blod, är hematopoietiska CD34 + stamceller och monocyter som vanligen används för generering av DC: er in vitro. Hematopoietiska CD34 + stamceller odlas med GM-CSF och TNF-α att härleda CD1a + och CD14 + subuppsättningar, vilka sedan ytterligare differentieras till Langerhansliknande celler och dendritiska celler. Omvänt, monocyter odlas i GM-CSF och IL-4 för att generera omogna moDCs. Flera protokoll används för anrikning av monocyter från perifert blod; t ex genom anslutning till plastskålar, elutriation och isoleringssatser 25, 26 Fördelarna med följsamhet protokollet är minimal skada på celler och relativt kostnadseffektiv men cell renhet kan äventyras. och en extra steg krävs för att lösgöra cellerna för ytterligare experiment. Slamning är en teknik som separerar celler baserat på deras storlek och täthet. Fördelarna med slamning är cellviabiliteten och monocyter lätt kan användas för ytterligare experiment; emellertid denna teknik är begränsad genom tillgängligheten av en elutriator och oförmågan att separera olika populationer av celler (T-celler och monocyter) med liknande sedimenteringsparametrar. Kommersiellt tillgängliga isolerings kit använder magnetiska mikropärlor till antingen positivt välja ellerVälj den monocytiska befolkningen negativt. Vissa protokoll är förspända mot monocyt isolering med hjälp av negativt urval som isolerade monocyter förblir "orörd" (inte bundet av markörer eller mikropärlor). I detta protokoll, var CD14 pärlor användes till positiva utvalda humana monocyter från PBMC. CD14 saknar en cytoplasmatisk domän och bindning av antikropp till CD14 utlöser inte signaltransduktion. Dessutom kommer mikropärlorna lossnar från monocyter efter kultur och därmed hindrar inte differentieringsprocessen. Dessutom är CD14 uttrycks starkt på de flesta monocyter och svagt på neutrofiler och vissa myeloida dendritiska celler, hence denna metod för isolering resulterar i högre cell renhet än de andra metoderna 17.
Blodmonocyter kan differentieras till DC eller makrofager och öde monocyter beror i hög grad på cytokin miljön. I detta dokument är moDCs genereras genom tillsats av granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) Och interleukin 4 (IL-4) till humana perifera blodmonocyter. GM-CSF krävs för monocyt överlevnad och IL-4 utövar en hämmande aktivitet på makrofagdifferentiering; och kombinato tillsats av GM-SCSF och IL-4 till monocyter ger en högre procentandel av omogna moDCs jämfört med individuell cytokin 27. Det finns andra protokoll som genererar moDCs genom tillsats av tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) och interleukin 13 (IL-13) till perifera blodmonocyter 28, 29, 30. Kombinationen av GM-CSF och IL-4 har optimerats på 1990-talet och nu ett erkänt protokoll som genererar plast omogna DC differentierade till immunogena eller tolerogena moDCs och polariserade i Th1, Th2 eller Th17 främjar moDCs.
Omogna moDCs differentieras till tolerogena moDCs genom tillsats av vitamin D3 och dexametason. Det finns flera protokoll att generera tolerogena DC till exempel vianukleär faktor-kappa B (NF-kB) hämning, β-catenin aktivering, vitamin D3, dexametason och Rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Även om både vitamin D3 och dexametason ensamt har rapporterats att inducera en tolerogen effekt på DCs, kombinationen av vitamin D3 och dexametason resulterar i en större dämpning av alloproliferation än när enskilda läkemedel används. Därför var det existerande protokoll för generering av tolerogena DCs modifierad för att en kombination av vitamin D3 och dexametason. Denna metod är för närvarande accepteras som en modell för mänskliga tolerogena DCs med terapeutisk användbarhet. Det är också viktigt att notera att den rekonstituerade Vitamin D3 och dexametason har en kort hållbarhetstid.
I detta protokoll, var Lipopolysackarider (LPS) tillsattes som en DC-mognad inducerare. Omogna moDCs kan också förmås att mognad att använda pro-inflammatoriska cocktail:(TNF-α), interleukin 1 beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) och prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriska cytokiner (TNF-a och interferon gamma (IFN-Γ)). Proinflammatorisk cocktail genererar mogna moDCs med hög samstimulerande och flyttande funktioner men de producerar relativt låga nivåer av IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ är ensamt inte inducera en stabil dendritisk fenotyp 39. LPS stimulerar Toll-like receptor 4 (TLR4), förmedlar aktivering av NF-kB och mitogenaktiverat proteinkinaser (MAPK) att inducera DC mognad. DC mognad som induceras av LPS visar en upp-reglering av likströmsmognads markörer (CD83, CD86, HLA-DR) och ledde också till produktion av IL-12p70. Dessutom kan detta steg modifieras ytterligare för att koppla ihop LPS med TLR3 agonister för att producera mogna DC för kliniska cancervacciner. I detta dokument är tolerogena DCs visat sig vara resistent mot mognad på LPS behandling. Dessa semi mogna som DC är inte immunogena och inte ReleaSE proinflammatoriska cytokiner 40.
Begränsningarna i detta protokoll ligga i differentieringsprocessen. Processen tar 8 dagar från dag 0 till dag 7 som utgör en svårighet anpassas till hög genomströmning analyser. En modifiering i protokollet är skyldig att förkorta differentieringsprocessen ännu ge ett stort antal livskraftiga DC i de olika staterna. För det andra är DCs genereras genom tillsats av cytokiner i detta protokoll och dessa cytokiner inte upprätthålla DC population för lång tid. Dessutom är cytokiner användas i koncentrationer mycket högre än in vivo och skulle kunna resultera i förspänd utveckling av banor som inte är fysiologiskt identiska med in vivo-DCs. Till exempel in vitro kulturer av DC prekursorer har visat sig svara på GM-CSF, som inte är en väsentlig cytokin för normal DC differentiering in vivo 41. Ändå kan cytokinstimulering vara en användbar metod för att genengradera ett stort antal DC in vitro för experiment. Förmågan att utsätta dessa celler som genereras från detta protokoll till andra analyser såsom immunofluorescens färgning, flödescytometri, allo reaktionsstudier och metaboliska studier ökar användbarheten av denna metod. Dessa in vitro DCs tjäna som en bra modell för att förbättra kunskapen om DC utveckling, mognad och antigenpresentation som är tidigare svårt att göra med de sällsynta antal in vivo DC.
DCs förmåga att reglera immunologisk immunitet mot tolerans gör dem attraktiva kandidater i terapi mot cancer och autoimmuna sjukdomar 42, 43, 44, 45. Immunogena DC genereras i detta protokoll kan användas för att förbättra vaccinations effekt mot infektionssjukdomar och tumörer; medan tolerogena DCs kan användas för att styra cellsvar oönskad T och förhindra avstötning efter transplantation. den intrikatabalans mellan immunitet och tolerans beror oerhört på DC differentieringsstatus. DC differentiering är ett samordnat cellulär program som styrs av flera signalvägar och metabolism. Olika differentieringstillstånd DC skiljer sig bioenergetiska och biosyntes behov; till exempel aktiverade DCs kräver mer energiska metaboliska anpassningar viktiga för överlevnad och migration jämfört med utvecklingsländerna i vilotillstånd. Det är viktigt att notera att vitamin D3, dexametason och rapamycin är kända för sin förmåga att inducera tolerogena DC, har beskrivits att påverka DC metabolism. I detta papper, var den energiska metabolism moDCs från olika differentieringstillstånd som kännetecknas med hjälp av extracellulära flödesmätare och tolerogena moDCs uppvisade den högsta metaboliska plasticitet och LPS-inducerad mognaden minskade denna plasticitet. Anabola metabolism stöder DCs mognad medan katabola metabolism påverkar tolerogena DC fungerar 46. DCSgenereras från detta protokoll kan användas för att bedöma huruvida ändra metaboliska tillstånd av DC håller nyckeln till att modifiera immunitet och tolerans i terapi. Avslutningsvis presenterade vi ett protokoll för generering av omogna, tolerogen och mogna moDCs avgörande för att studera DCS "immunfunktioner.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av byrån för vetenskap, teknologi och Reasearch basfinansiering (till JEC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
| Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
| 1.5 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
| 15 ml falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
| 50 ml falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
| 0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
| MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
| MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
| Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
| RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
| FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
| Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
| NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
| EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
| HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
| Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
| GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
| IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
| Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
| Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
| LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
| trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
| PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
| PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
| PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
| APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
| Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
| Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
| Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
| cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
| APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
| PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
| PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
| EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
| EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
| Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
| Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
| Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
| 5 ml Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
| Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
| FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
| MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
| XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
| XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
| L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
| Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
| XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
| XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
| Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |
References
- Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
- Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
- Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
- Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
- Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
- Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
- Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
- Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
- Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
- Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
- Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
- Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
- Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
- Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
- Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
- Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
- Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
- Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
- Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
- Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
- Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
- Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
- Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
- Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
- Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
- Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
- HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
- Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
- Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
- Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
- Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).
