Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54128
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Abstract

Antijen spesifik olmayan doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve antijene spesifik adaptif bağışıklık sistemi arasında karmaşık bir etkileşim immün yanıt ile sonuçlanır. Bağışıklık sistemi kendinden moleküllere tolerans korumak ve patojenlere karşı hızla tepki sabit bir dengedir. Dendritik hücreler (DC) uyarlayıcı bağışıklık sisteminin doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağlantı ve kendine ile kendi-olmayan arasındaki uyumlu tepki dengesi güçlü bir profesyonel antijen sunan hücrelerdir. matürasyon sinyallerine bağlı olarak, olgun olmayan dendritik hücreler, seçici olarak immünojenik veya tolerojenik DH'lere ayırt etmek için uyarılabilir. Immünojenik dendritik hücreler klonal genişleme için antijene özel T hücrelerinin proliferasyon sinyallerinin sağlanması; tolerojenik dendritik hücreler, antijene spesifik T-hücresi silinmesi veya düzenleyici T hücrelerinin klonal büyümesi ile tolerans düzenler ise. Sahip olduğu bu özelliği, dendritik hücreler, yüksek kanser ve otoimmün dise gibi terapötik maddeler arananases. Dendritik hücreler, in vitro olarak spesifik antijenlerle yüklendi ve imünojenik ve tolerojenik hem belirli bir bağışıklık tepkisi oluşturmak için, insan vücudu içine enjekte edilebilir. Bu çalışma yüzeyi işaretleyici ifade, fonksiyon ve metabolik fenotipleri farklı monositler, olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücreler (MoDC'ler), tolerojenik ve olgun MoDC'ler gelen in vitro oluşturmak için bir araç sunuyor.

Introduction

Jolles 1 tarafından başvurulan ve profesyonel antijen sunan hücreler 2 olarak tanınan 1973 yılında Ralph Steinman ve Zanvil Cohn tarafından karakterize edilen DC ilk on dokuzuncu yüzyılın sonunda Paul Langerhans (Langerhans hücreleri) tarafından tanımlanmıştır. DH'ler periferik kanda ve (Langerhans hücrelerinin olarak mevcut) kaplama olarak ve etkinleştirme burun, akciğer, mide ve bağırsaklar astarları dış ortama maruz kalan dokularda özellikle bol miktarda vücut pek çok dokusunda bulunan onları dışsal antijenler karşılaşmaya. Olgunlaşmamış DC'ler T hücrelerini 3 uyarmak için endositik kapasitesine sahip, ancak nispeten düşük kapasiteye sahiptir. Olgunlaşmamış DC'ler çeşitli örüntü tanıma reseptörleri (PRR) yakalayan patojen ilişkili moleküler şekilleri (PAMPS) veya hasar ilişkili moleküler şekilleri (Damps) 4 ifade eder. Kendi kendine moleküller T hücresi unresponsivene neden olurlar aktive tehlike sinyalleri imünojenik DCler doğru olgunlaşmasını sürücüss ve apoptoz 5. Immünojenik DH'ler MHC molekülleri ve yardımcı uyarıcı yüzey molekülleri ve tecrübesiz T hücreleri 6,7 kabiliyetleri upregülasyonu ile karakterize edilir.

Olgunlaşmamış DC'ler ayrıca D3 vitamini metaboliti 1a, 25 (O) 2 D3 ve bazı bağışıklık bastırıcı maddeler Interleukin-10 (IL-10) gibi, deksametazon ve 8-9 rapamisin karşılık olarak bir regülatör T oluşturan ya da tolerojenik durumuna doğru olgunlaşmış edilebilir. Tolerojenik DH'ler yüzey reseptörleri ve ligandları ihtiva eden immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifleri (ITIMs) kendi ekspresyonu ile karakterize edilir. Tolerojenik DC'lerde ILT aile üyeleri, ILT3 ve ILT4 içeren ITIMs sinyal iletim alloproliferation inhibe ve Foxp3 + Treg genişleme 10,11 sürücü. Tolerojenik DC'lerin Bu benzersiz özellikleri in vivo olarak derin potens, nakledilen allojenik greft ve SUPPR dayanıklı tolerans yaratacak yani yetenek yolotoimmün hastalıkların gelişiminin ESS. Tolerojenik DH'ler immün aktivasyon inhibisyonu işlev olgun polarize DClerin bir alt tipi, bu nedenle görülebilir.

Plasmasitoid DC'ler ve miyeloid DC'lerin 12: Şu anda, insan periferik kan dendritik hücrelerin iki genel alt kümeleri vardır. Sirkülasyon DH'ler insan kanında lökositlerin% 2'den daha az nadir Oluşturulması ve bu da bağışıklık işlevlerini çalışma DH'lerin uygun sayıda izole edilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, monosit farklılaşmış DCler dendritik hücre fonksiyonlarının araştırılmasında bir in vitro modeli olarak kullanılır. Bunlar in vitro DC'ler in vivo DC'lere karşılaştırıldığında benzer reseptörleri ve işlevlere sahiptir. In vivo DClerin ve in vitro oluşturulan monosit türevli DC'lerin (MoDC'ler) Ayrıntılı karşılaştırma diğer laboratuvarlar 13, 14, 15 ile incelenmiştir. Aynı zamanda, bu MoDC'ler ve CD bildirilmektedir1c + DC'ler antijen sunan ve T hücre fonksiyonunu 15 indükleyici eşdeğer idi.

Bu yazıda, periferik kan monositlerinden olgunlaşmamış MoDC'ler üreten ve daha sonra bağışıklık ve tolerojenik DC'lere içine ayırt bir yöntem açıklanmaktadır. Bu monosit türevli dendritik hücreler (MoDC'ler) yüzey belirteçleri, sitokin profili, immün düzenleyici ve metabolik Devletler ile karakterize edilir. Immünojenik ve tolerojenik dendritik hücreler allojenik T hücreleri veya düzenleyici T hücrelerinin, ya genişlemesi sonucu farklı sitokinler üretirler. Bu yazıda, sitokin profil multipleks teknolojisi kullanan sistemler ile yapılır. hücrelerin büyüme ortamına antikorun hareketsizleştirildiği renk kodlu boncuklar ile inkübe edildi ve kompakt bir analizör okunur. DH'lerin metabolik durumları glikolitik yansıtan oksijen tüketim hızı, hücresel solunum bir göstergesi ve hücre dışı asitlenme hızı ölçmek dışı akı analizörleri kullanılarak analiz edilmektedirdendritik hücreler akı. Bu biyoenerjetiğin oranlarının ölçümü dendritik hücre gelişimi ve işlevi hayati olan hücresel metabolizma değişiklikleri izlemek için bir araç sağlar.

Protocol

Bu araştırma Kurumsal Değerlendirme Kurulu (NUS-IRB 10-250) tarafından onaylandı.

Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin 1. izolasyonu (PBMC)

  1. Ayıracın hazırlanması
    1. fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile ek PBS / EDTA hazırlayın. 0.2 um'lik bir filtre içinden süzme ile, bu çözelti sterilize edin. 4 ° C'de PBS / EDTA depolamak için not edin ve kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirin.
    2. % 2 fetal sığır serumu (FBS) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), ek, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) boyama tamponu hazırlayın. 0.2 um'lik bir filtre içinden süzme ile, bu çözelti sterilize edin.
  2. Kan Koni gelen Blood toplayın
    Not: Kan koni plakası sonra toplanan beyaz kan hücresi bileşenleri içerirHastaneden letpheresis. 1 oranını ve 1.3 adıma geçin;: Kan heparin veya EDTA tüplerinde toplanması halinde, 1 PBS ile kan sulandırmak buffy coat alınırsa, 1 PBS ile buffy coat sulandırmak: 2 oranında ve 1.3 adıma geçin.
    1. Kan, 50 ml'lik bir tüp içine akmasına izin vermek için koni iki ucu kesilir. Koni, genellikle 10 ml kan içeren dikkat edin.
    2. 50 ml'lik bir tüp içinde koni yıkama ve toplamak için PBS / EDTA 30 ml ihtiva eden bir kör uç şırınga kullanın.
    3. 80 ml'lik bir son hacme sahip olacak şekilde, PBS / EDTA ile kan seyreltilir.
  3. Yoğunluk santrifüj 16 ile PBMC'lerin izolasyonu
    1. Kısım 15 ml 4 taze 50 ml tüpler için Ficoll her.
    2. Ficoll tabakası üzerine seyreltilmiş 20 ml kan ilave bir 25 ml serolojik pipet kullanın. 45 açıyla 50 ml tüp tutun ve interfaz rahatsız değil dikkat çekmek için not alın.
    3. 30 dakika, 20 ° C için fren olmayan 805 x g'de santrifüjleyin tüpler.
    4. Kaldırplazma tabakası ve sadece Pastör pipet ile plazma katmanı altında yatan PBMC'lerin halka toplamak. iki adet 50 ml'lik tüplere PBMC'ler Dört tüpün birleştirin. PBMC altında şeffaf tabaka toplama önlemek için dikkat edin.
    5. 10 dakikada, 20 ° C, frenli 548 xg'de PBMC'lerin tüp ve santrifüj 50 ml'lik bir son hacme kadar PBS / EDTA.
    6. lekeleme tampon maddesi 25 ml ile herbir tübe aspire supernatant ve tekrar süspansiyon topak, bir 50 ml tüp içine birleştirir.
    7. 5 dakika, 4 ° C için frenli 367 xg'de santrifüj.
    8. Süpernatant aspire ve lekeleme tampon maddesi 10 ml tekrar süspansiyon pelet.

Manyetik Ayırma 17 ile 2. Monosit Zenginleştirme

  1. Hücre sayısı belirleme
    1. PBMC hücre süspansiyonu 20 ul alın ve sitometresi kullanılarak canlı hücrelerin sayısını saymak için tripan mavisi 20 ul ile karıştırın.
    2. frenli 367 xg'de Santrifüj hücre süspansiyonu10 dakika, 4 ° C.
    3. Lekeleme tampon maddesi 80 ul başına 10 7 hücre konsantrasyonuna aspire tam süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre topağı.
  2. manyetik Etiketleme
    1. 10 7 hücre başına CD14 mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 2 de 15 dakika inkübe - 8 ° C.
    2. 10 dakika, 4 ° C, fren 367 xg'de boyama 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml ekleyerek hücreleri yıkanır.
    3. Lekeleme tampon maddesi 50 ul başına 10 7 hücre konsantrasyonunda aspire tam süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre topağı.
  3. manyetik Ayırma
    1. 2 x 10 8 toplam hücrelerin en fazla orta boy sütunu kullanın.
      Toplam hücre sayısı ve veri sayfası tavsiye CD14 + hücrelerinin sayısı göre uygun bir sütun ve ayırıcı seçin: edin.
    2. manyetik alan o sütunu yerleştirinfa uygun ayırıcı ve boyama tamponu 500 ul ile durulama sütun hazırlar.
    3. Pipet hücre sütunu üzerine süspansiyon ve 15 ml tüp ile kolon üzerinden geçmesi etiketlenmemiş hücreleri toplamak.
    4. sütununun altında yeni bir 15 ml tüp değiştirin ve boyama tamponu 500 ul sütun 3 kez yıkayın. Kolon rezervuar yıkar arasında yeni boyama tampon eklemeden önce boş olduğundan emin olun.
    5. ayırıcıdan sütun çıkarmak ve yeni bir 15 ml'lik bir tüp üzerine yerleştirin.
    6. Pipet kolonuna lekeleme tampon maddesi içinde 1 mi. Hemen sıkıca sütuna (kitin içinde verilmiştir) pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın.
    7. Yineleyin CD14 + hücrelerinin saflığını artırmak için yeni bir sütun üzerinde yıkandı fraksiyonu kullanarak 2.3.6 için 2.3.2 adımları. boncuk adım 3.2 sırasında kültür içinde otomatik hücrelerden çıkacak unutmayın.

Farklı Etkinleştirme S için dendritik hücreler 3. Farklılaşmatates

  1. Reaktif Hazırlanması (Endotoksin Seviye bütün Ayıraçlarında az 0.1 EU / ml olmak zorunda)
    1. Hücre kültürü ortamı hazırlayın: RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 temel olmayan amino asitler (NEAA) ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol (2Me) ile takviye edilmiştir. 0.2 um'lik bir filtre içinden süzme ile, bu çözelti sterilize edin.
    2. sitokinler hazırlayın: 0.25 mg, bir konsantrasyona kadar hücre kültürü dereceli su içinde IL-4 ve GM-CSF tekrar oluşturmak / sırasıyla aseptik koşullar altında ml. Kısım 200 ul mikrosantrifüj tüpleri içine sitokinler ve mağaza -80 ° C'de ilave edildi.
    3. D3 vitamini stok hazırlayın: aseptik koşullar altında 100 mM bir konsantrasyona kadar hücre kültürü dereceli su içinde D3 vitamininin sulandırın. -20 ° C'de kısım vitamini 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine D3 ve saklayın.
    4. deksametazon stok hazırlayın: aseptik koşullar altında 10 mM'lik bir konsantrasyona kadar hücre kültürü dereceli suda deksametazon sulandırın. Kısım dexamet-20 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine hasone saklayın.
    5. LPS hazırlayın: aseptik koşullar altında, 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar hücre kültürü dereceli su içinde lipopolisakkaritler (LPS) sulandırın. Kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine LPS ve mağaza -20 ° C'de ilave edildi.
  2. Farklı MoDC'ler oluşturuluyor
    1. Tohum 0.3 konsantrasyonunda CD14 + monositleri 4 set - GM-CSF, 200 ng / ml ve 6 yuvalı plakalar içinde IL-4 200 ng / ml ile takviye edilmiş hücre kültür ortamı, 0.5 x 10 6 / ml olmuştur. Bu gün 0 ve her 6 kuyudaki ortam hacmidir 2 mi olduğuna dikkat edin.
    2. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de, doku kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri.
    3. 5 dakika, 4 ° C, 300 x g'de 4. günde ve santrifüj de kültürden ortamın 850 ul çıkarın. Süpernatant aspire ve (GM-CSF, 200 ng / ml IL-4, 200 ng / ml) 2 x ihtiva eden hücre kültür ortamı, 1 ml içinde süspanse pelet. geri bu hücre karışımı ekleyinkültüre. ortam 1 ml kültüre geri ilave edildiğinde 1x olur GM-CSF ve IL-4 için eklenen 2x konsantrasyonu dikkat edin.
    4. tolerojenik MoDC'ler üretmek için 5 günde setleri iki D3 vitamini stok ve orta ml başına deksametazon stokunun 1ul 1 ul ekleyin. D3 vitamini nihai konsantrasyonu, 100 nM ve 10 nM deksametason olduğuna dikkat ediniz; GM-CSF ve IL-4'ün bir ek 5 günde, gerekli değildir.
    5. 6. günde tüm kümeler GM-CSF, 200 ng / ml IL-4, 200 ng / ml ilave edilir.
    6. Olgun MoDC'ler oluşturmak için 6 gün sadece GM-CSF ve IL-4 ile tedavi edilen her bir durum için LPS 1 ug / ml ilave edilir.
    7. LPS tolerojenik MoDC'ler oluşturmak için 6. günde tolerojenik MoDC'ler kümesi LPS 1 ug / ml ilave edilir.
    8. flow sitometri veya diğer çalışmalar için PBS, EDTA ile kültür çanak kızarma ile Gün 7 de MoDC'ler farklı hasat. Sadece yapışmayan hücreler hasat edildiğini kaydetmişlerdir. CD14 + monoc gelen yüzde verimini dikkatinizi çekerizOlgunlaşmamış MoDC'ler olgun MoDC'ler, tolerojenik MoDC'ler ve LPS ile tolerojenik DC'ler için ytes yaklaşık% 90,% 50,% 60 ve% 60, sırasıyla kan donör ve FBS çok arasında değişmektedir.

4. Akım Sitometri

  1. MoDC'ler Hücre Yüzey Etiket Karakterizasyonu
    1. pipetleme kültürü çanak hücreleri ayırın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde lekeleme tampon maddesi 50 ul başına 5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda bir kez PBS / EDTA ve tekrar süspansiyon hücreleri hücreleri yıkayın.
    2. PerCP konjüge HLA DR (1: 100), 0.5 x 10 6 hücre alikotları inkübe, PE-konjuge CD80 (1:50), PE-konjuge CD83 (1:25), PE-konjuge CD86 (1:50), APC- konjüge CD11c (1:50), PE-konjuge CD14 (1:50) ve PE-konjuge BDCA3 (1:50) ve 4 ° C'de 30 dakika süre ile karanlıkta, APC-konjuge ILT3 (01:25). Eş izotipli PerCP konjüge Mab (1:20), PE-konjuge Mab (01:11), APC-konjuge Mab (01:11) negatif kontroller olarak hizmet edecektir.
    3. 18 bir akış sitometrisi kullanılarak yüzey markerlerinin ekspresyon seviyelerini algılar.
  2. MoDC'ler ve Mitokondri Membran Potansiyeli Analizi
    1. Liyofilize Kırmızı CMXRos 50 ug başına dimetil sülfoksit (DMSO) 94.1 ul ekleyerek 1mM Red Klorometil-X-rosamine (CMXRos) stok çözelti hazırlayın.
    2. 15ml tüp içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 1 ml 100 nM Kırmızı CMXRos 2 x 10 5 MoDC'ler inkübe edin.
    3. 5 dakika oda sıcaklığında 300 xg'de hücreleri ve santrifüj PBS / EDTA 2 ml ilave edilir. 2 kez tekrarlayın. Süpernatant aspire ve akış sitometresi analizi için PBS, EDTA,% 2 FCS, 300 ul içinde süspanse hücre topağı. Kırmızı CMXRos sinyali analiz etmek için PE kanalını kullanmak için not alın.
  3. T-hücrelerinin Marker Karakterizasyonu
    1. 1.2 50 ul inkübe x 10 6 (elde edilen CD4 + T-hücreleri allo CFSE etiketli200), PE / Cy7-konjuge CD4 (1: 400) ve APC / Cy7-konjuge CD25 (1: 4 ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta 100) PerCP konjüge CD3 (1) 5.6 dur. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta Foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) ile ticari bir kit kullanılarak Leke T hücreleri.

5. Alloreaction Çalışmaları

  1. üreticinin protokolüne uygun olarak, CFSE liyofilize DMSO 18 ul ekleyerek carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) 5 mM stok çözelti hazırlayın.
  2. PBMC'lerden CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması
    1. PBMC hücre süspansiyonu 20 ul alarak hücre sayısını belirlemek ve bir Sitometreyi kullanılarak canlı hücrelerin sayısını saymak için tripan mavisi 20 ul ile karıştırın.
    2. 10 dakika, 4 ° C, fren 367 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu.
    3. 5 ml'lik bir polistiro boyama 1 ml tampon başına 5 x 10 7 hücre konsantrasyonunda aspire tam supernatant ve tekrar süspansiyon hücre topağırene tüp.
    4. 50 ul / ml hücre insan CD4 + T hücre Zenginleştirme Kokteyl ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe - 10 dakika boyunca (15 ila 25 ° C).
    5. Girdap manyetik parçacıklar 30 saniye boyunca 100 ul / ml hücre manyetik parçacıkların ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. 2.5 ml 'lik bir toplam hacme hücre süspansiyonu lekeleme tampon maddesi ekleyin. 3 kez - hafifçe aşağı 2 yukarı ve aşağı pipetleme tüp hücreleri karıştırın. mıknatıs içine tüp yerleştirin ve 5 dakika inkübe.
    7. tüp ile mıknatıs ters çevirin ve yeni bir 5 ml polistiren tüp içine süspansiyon (T hücrelerini içerir) süzün.
  3. Hücre sayısını belirler ve ışıktan korunan, 37 ° C'de 20 dakika boyunca 1 ml PBS içinde 5 uM CFSE ile 1.2 x 10 6 CD4 + T-hücreleri inkübe edin.
  4. hücrelere (basamak 3.1.1 göre hazırlandı) hücre kültür ortamının beş kat, orijinal boyanma hacmi ilave edin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Santrifüj75 ul başına 2 x 10 5 arasında bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamı içinde 5 dakika, 4 ° C ve tekrar süspansiyon pelet 300 xg'de Uge.
  6. 0 ile hücre kültür ortamında 75 ul ihtiva eden her bir MoDC kültürüne 2 x 10 5 CFSE etiketli CD4 + T-hücreleri 75 ul ekle, 2.5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 ve 96 oyuklu U tabanlı levhalarda 40 x 10 3 MoDC'ler. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde 6 gün boyunca kültürü.
  7. 5 dakika, 4 ° C, 300 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj içine CD4 + T hücreleri pipetleme Hasat. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 2 PBS / EDTA ve santrifüj sitokin analizi ve tekrar süspansiyon hücre peleti için supernatant toplamak.

6. Sitokin Analizleri 19

  1. Aşama 5.5'te tarif edildiği gibi alloreaction çalışmalarından süpernatantlar toplayın.
  2. Insan sitokin / kemokin reaktifi hazırlanmasıE Manyetik Panel Analizi
    1. tanelerin tek tek şişeler için Antikor-hareketsizleştirilmiş boncuk şişe karışım hazırlanması için, 1 dakika süre ile girdap (kitte dahil). (Kit içerisinde bulunan) karıştırma şişeye her antikor kordon şişesinden 60 ul ekle ve boncuk Seyreltici 3 ml lik bir son hacme getirmek (Resim).
    2. kalite kontrolleri hazırlanması için, Kalite Kontrol 1 ve Kalite Kontrol 2 deiyonize su 250 ul (kitine dahil) sulandırmak.
    3. Yıkama tamponu hazırlanması için, deiyonize su, 270 ml (kit içerisinde bulunan) 10x yıkama tamponu 30 mi seyreltilir.
    4. insan sitokin Standard hazırlanması için, 10,000 ug / ml konsantrasyonunu vermek için deiyonize su, 250 ul (kiti içinde bulunur), insan sitokin standart sulandırın.
      1. 2,000 pg / ml çalışma standart hale getirmek için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (kitte sağlanan), deney tamponu 200 ul 10,000 pg / ml insan sitokin standart 50 ul ekle. Transfer bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (kitte sağlanan), deney tamponu 200 ul 2.000 ug / ml insan sitokin standart 50 ul, 400 ug / ml çalışma standart hale getirmek için.
      2. Transfer bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (kitte sağlanan), deney tamponu 200 ul 400 ug / ml insan sitokin standart 50 ul 80 ug / ml çalışma standart hale getirmek için. Transfer bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (kitte sağlanan), deney tamponu 200 ul 80 ug / ml insan sitokin standart 50 ul 16 ug / ml çalışma standart hale getirmek için.
      3. Aktarım 3.2 ug / ml çalışma standart hale getirmek için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (kitte sağlanan), deney tamponu 200 ul 16 ug / ml insan sitokin standart 50 ul. 0 ug / ml çalışma standardı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde deney tamponu 200 ul bulunmaktadır.
  3. Filtreleri her oyuğuna deney tamponu (Resim) 200 ul pipetleme (kit içerisinde bulunan) ön Islak filtre plakasıplaka. Seal ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile, bir plaka karıştırıcısı üzerinde filtre plaka yerleştirin.
  4. Aspire deney tamponu ve uygun kuyulara Her standart veya kalite kontrolü 25 ul ekle.
  5. Hücre kültürü ortamı, 25 ul ekle plan, standartlar ve kontrol oyuklarına (basamak 3.1.1 göre hazırlanmıştır).
  6. Örnek oyuklara tahlil tamponunda 25 ul ilave edin ve uygun bir örnek kuyu içine örnek 25 ul ilave edin.
  7. Girdaplı karıştırma Antikor-hareketsizleştirilmiş boncuklar içeren şişe ve her bir karışım boncuklar 25 ul ekle. plakası kapatılır ve 4 ° C'de bir gece boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayarak kuluçkalayın.
  8. Aspire sıvı Plakayı tampon 200 ul / oyuk Yıkama eklenmesi ve sıvı aspire 2 kez.
  9. her bir kuyunun içine (sağlanan) algılama antikorların 25 ul ekleyin. Seal ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayarak kuluçkalayın.
  10. (Prov streptavidin Fikoeritrin 25 ul ekleyinde tespit antikorlarının 25 ul ihtiva eden her bir) IDED. Kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayarak kuluçkalayın.
  11. Adım 6.8 açıklandığı gibi aspire sıvı ve yıkama plakası.
  12. 5 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde tüm oyuklara ve tekrar süspansiyon boncuklara 150 ul / oyuk Kılıf sıvı ekleyin.
  13. 3D sistemi 20 kullanarak boncuk floresan yoğunluğu algılar. Örneklerinde 21 sitokin / kemokinler konsantrasyonlarının hesaplanması için beş parametreli log-lojistik eğri yöntemi kullanılarak medyan floresan yoğunluğu verileri analiz edin.

7. Gerçek zamanlı Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ve Ekstrasellüler Asitlenme Oranı (ECAR) Ölçümleri

  1. Reaktif Hazırlanması / Malzeme
    1. OCR orta hazırlayın: 25 mM glikoz ve 1 mM sodyum piruvat (pH 7.35) ile takviye edilmiş deney ortamı. 0.2 um'lik bir filtre içinden süzme ile, bu çözelti sterilize edin. pr Bu orta olduğunu dikkate alınFBS bileşenler karmaşık ve anter sürü bir sürü değişir çünkü FBS olmadan epared.
    2. ECAR orta hazırlayın: Orta 2 mM L-glutamin (pH 7.35) ile takviye konumlandırılmıştır. 0.2 um'lik bir filtre içinden süzme ile, bu çözelti sterilize edin. Bu orta bikarbonat, glukoz, piruvat ve FBS olmadan hazırlanan olduğunu not alın. FBS tamponlama kapasitesine sahiptir ve ECAR okuma engel olacak unutmayın.
    3. OCR ölçümleri için bileşiklerin hazırlanması: 100 mcM stok solüsyonu yapmak ve konsantrasyon çalışan 16 mcM OCR orta sulandırmak için OCR orta 630 ul oligomycin süspanse edin. OCR orta 720 ul yeniden süspanse karbonil siyanür 4- (trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) 100 mcM stok solüsyonu yapmak ve konsantrasyon çalışma 4.5 mcM OCR orta sulandırmak için. Süspanse rotenone / OCR orta 540 ul antimisin 50 uM stok solüsyonu yapmak ve konsantrasyon çalışan 10 uM OCR orta sulandırmak için.
    4. hazırlamakECAR ölçümleri için bileşikler: süspanse Glikoz ECAR ortamının 3 ml 100 mM stok çözelti yapmak ve konsantrasyonu çalışan 80 mM'ye seyreltin. 100 uM stok solüsyonu yapmak ve konsantrasyon çalışan 18 mM sulandırmak için ECAR orta 720 ul oligomycin süspanse edin. ECAR ortamın 1.5 ml yeniden süspanse 2-deoksi-D-glukoz 1.000 mM stok çözelti yapmak için.
    5. Pipet ölçümleri yapılmadan önce herhangi bir CO2 bir gün 37 ° C 'de kartuş ve mağaza her kuyuya kalibran 200 ul.
  2. Gerçek zamanlı OCR Ölçümleri
    1. Hasat MoDC'ler ve OCR ortamı 150 ul başına 60 x 10 3 konsantrasyonda OCR ortam içinde MoDC'ler her tür tekrar süspansiyon.
    2. Tohum 60 x 10 3 hücre / göz, bir poli-D-lizin kaplı 96 oyuklu düz tabanlı plaka içinde ve 37 ° C 'de 1 saat boyunca olmayan bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. 1 saat süre ile kaplamak için poli-D-lisin, 50 ng / ml plaka 50 ul kullanımı ile yıkama çekerizsteril su. Kullanmadan önce oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka kuru tutun.
    3. tüm kuyuları için enjeksiyon portu A içine Pipet 25 ul OCR orta; tüm kuyuları için enjeksiyon portu B oligomycin 16 mcM içeren 25 ul OCR orta; 4.5 Tüm kuyuları için enjeksiyon portu C (FCCP) içinde mcM ve 25 10 mM rotenone / tüm kuyuları için enjeksiyon portu D antimisin içeren ul OCR ortamı içeren 25 ul OCR orta. oligomycin için nihai oyuk konsantrasyonu 2 uM olduğunu unutmayın, FCCP 0.5 mcM ve rotenone olduğunu / antimisin 1 uM'dir.
    4. hücre dışı akı Analizöre plaka koyun ve üst üste dört aşamada aynı anda tüm MoDC'ler tam bir OCR çalışması çalıştırın: bazal solunum, (liman B ilaç enjeksiyonundan sonra) mitokondriyal kompleks V inhibisyonu, maksimal solunum indüksiyon (port A orta enjeksiyondan sonra) (sonra liman C ilaç enjeksiyonu) ve liman D ilacın) 22 sonra elektron taşıma zinciri engellenmesi (. 3 c olduğunu unutmayın alınenjeksiyonlar ve ölçümler arasındaki 6 dakika arayla arasında ycles.
  3. Gerçek zamanlı ECAR Ölçümleri
    1. Hasat MoDC'ler ve ECAR ortamının 60 x 10 3 150 her ul'lik bir konsantrasyonda ECAR ortam içinde MoDC'ler her tür tekrar süspansiyon.
    2. Tohum 6 x 10 4 hücre / göz, bir poli-D-lizin kaplı 96 oyuklu düz tabanlı plaka içinde ve 37 ° C 'de 1 saat boyunca olmayan bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.
    3. tüm kuyuları için enjeksiyon portu A içine Pipet 25 ul ECAR orta; tüm oyuklara enjeksiyon noktası B glikoz 10 mM ihtiva eden 25 ul ECAR ortam; 18 tüm oyuklara enjeksiyon noktası C oligomycin uM ve 25 tüm oyuklara enjeksiyon noktası D 1000 mM 2-deoksi-D-glukoz içeren uL OCR ortamı ihtiva eden 25 ul ECAR ortamı. Not glikoz için son konsantrasyonda 10 uM olduğu, oligomycin 2 uM ve 2-deoksi-D-glukoz, 100 mm'dir.
    4. hücre dışı akı Analizöre plaka koyun ve çalıştırınAynı anda dört ardışık aşamada tüm MoDC'ler ile komple ECAR çalışması: (port A orta enjeksiyonu sonrası) bazal solunum, (liman B ilaç enjeksiyonundan sonra) glikoliz indüksiyon ve glikoliz inhibisyonu (port C ilaç enjeksiyonundan sonra) maksimal glikoliz indüksiyon (sonra liman D) 22 ilaç.
    5. Tukey çoklu karşılaştırma sonrası testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak istatistiksel farklılıkları analiz edin.

Representative Results

Monosit Arıtma ve Dendritik Hücre Farklılaşması

Monositler CD14 + olgun olmayan dendritik hücreleri elde etmek için, GM-CSF ve IL-4 varlığında tam ortam içinde pozitif seçim manyetik ayırma (Şekil 1 b) ve kültürlenmiş (ardından, periferal kan (Şekil 1A) yoğunluk santrifüj ile PBMC'lerden saflaştırılmıştır Şekil 2A). Vitamin D3 ve deksametazon sonrası, GM-CSF ve IL-4 ilavesi tolerojenik MoDC'ler (Şekil 2B), immatür MoDC'ler farklılaşması ile sonuçlanmıştır. LPS olgunlaşması (Şekil 2D) direnç doğrulamak için LPS ile stimüle edildi MoDC'ler (Şekil 2C) ve tolerojenik MoDC'ler olgun olgunlaşmamış MoDC'ler olgunlaşmasını indüklediği ilave edildi. Bu çalışmada kullanılan kan numuneleri mi Sağlıklı vericilerden elde edilenrazı olmak.

MoDC Karakterizasyon

Akış Sitometrisi ile Marker Karakterizasyonu Yüzey

DC yüzey markerlerinin analizi, olgun MoDC'ler LPS ile muamele tolerojenik MoDC'ler, tolerojenik MoDC'ler ve olgunlaşmamış MoDC'ler (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında matürasyon belirteçleri HLA-DR, CD83 ve CD86 arasında, en yüksek seviyelerini ifade olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, LPS uyarımı şu olgunlaşmamış MoDC'ler karşılaştırıldığında tolerojenik MoDC'ler olgunlaşma dirençli olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, bir tolerogenik MoDC'ler LPS ile muamele edilmiş ve tolerojenik MoDC'ler olgun ve olgun MoDC'ler karşılaştırıldığında CD14, BDCA3 (CD141) ve immunoglobulin benzeri transkript (ILT) 3 artan ifadesi sergilemiştir. Burada üretilen tolerojenik MoDC'ler önceki raporlarda 23 ile uyumludur.

MoDC'ler fonksiyonel karakterizasyonu

olgunlaşması için uyarılan MoDC'ler immünojenik olur ve CD4 + T-hücrelerinin çoğalmasını teşvik sitokinler bırakın. Bu eş-kültürlenen T-hücrelerinin çoğalmasının ölçülmesi ile, farklı MoDC alt tiplerinin immünojenikliğini değerlendirildi. CD4 + T hücreleri, düşük alloproliferation (Şekil 4A) ile gösterildiği gibi tolerojenik MoDC'ler olgun MoDC'ler karşılaştırıldığında zayıf imünojenik idi. Tolerojenik MoDC'ler düşük IFN-y, CD4 + T-hücreleri (Şekil 4B) ile birlikte alloreaction ko-kültürlerde, düşük bir IL-12p40 ve yüksek IL-10 sitokin üretimi ile karakterize edilmektedir. Bundan başka, olgun MoDC'ler arasında tolerojenik MoDC'ler sayısının artırılması ko-kültürler neden allospesifik CD4 + T hücreleri, CD25, yüksek Foxp3 + regülatör T hücreleri (Şekil 4C) sıklığını artmıştır.

Mitokondriyal Aktivite Analizi

Kırmızı CMXRos MoDC'ler mitokondriyal membran potansiyeli seviyelerini analiz etmek için mitokondriyal aktiviteyi yansıtmak için kullanılır. Tolerojenik MoDC'ler Diğer MoDC farklılaşmış alt tipi (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir mitokondriyal etkinliğe sahip olduğu gözlenmiştir. Daha sonra, mitokondriyal oksijen tüketim hızı (OCR) bir Bioanalyzer kullanarak farklı MoDC alt tipleri için değerlendirilir. OCR ölçümleri de dahil olmak üzere, ancak bazal solunum, yedek solunum kapasitesi, proton kaçak sigara mitokondriyal solunum bunlarla sınırlı olmamak bilgi veren, metabolik profile yüksek çözünürlüklü anlayışlar sağlar. OCR ölçümü strese cevap hücreleri yeteneğinin tayin edilmesi için bir araç sağlar. Hücreler metabolik arkaya üç farklı bileşiklerin ilave edilmesi ile altüst. İlk enjeksiyon Ol olanATP sentezini inhibe, elektron taşıma zinciri (ETC) karmaşık V inhibe igomycin (ATP çoğaltıcı). Bu adım ATP sentezi için tüketilen oksijen yüzdesini ve iç mitokondrial membran boyunca proton sızıntısı üstesinden gelmek için tüketilen oksijen yüzdesini ayırır. ikinci enjeksiyon olmadan, mitokondriyal zarından yerine mitokondriyal membran potansiyeli çöküşü enerji ve oksijen hızlı tüketimine yol açar Kompleksi V. proton kanalından hidrojen iyonları taşıyan ATP sentezini bozar FCCP (ETC hızlandırıcı) 'dir ATP'nin nesil. FCCP tedavisi hücrelerinin fazlalık solunum kapasitesinin hesaplanması için de kullanılabilir. stres koşulları altında yedek solunum kapasitesinin korunması, hücre hayatta kalması için kritik önem taşır. Bu kapasite ETC katılan enzimlerin substrat kullanılabilirliği ve fonksiyonel kapasite gibi çeşitli faktörlere göre belirlenir Üçüncü enjeksiyon Rotenone bir YAPIM bir kombinasyonudurex I inhibitörü ve antimisin, Kompleks III inhibitörü. Bu kombinasyon mitokondriyal solunum kapanır ve OCR engelli mitokondriyal fonksiyon (Şekil 5C) bir sonucu olarak azalma görülmektedir. Tolerojenik MoDC'ler olgun MoDC'ler (Şekil 5D) daha yüksek bazal OCR düzeyleri görüntülenir. Buna ek olarak, tolerojenik, LPS tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC'ler olgun MoDC'ler (Şekil 5E) ile karşılaştırıldığında yedek solunum kapasitesi artış gösterdi.

MoDC'ler metabolik Karakterizasyonu

Laktik asit ve protonların glikoliz sırasında hücrelerden salınan aldığından, hücre dışı asidifikasyon (ECAR) (Şekil 6B) hızının gerçek zamanlı analizini gerçekleştirerek MoDC'ler glikolitik aktivitesi analiz edilmiştir. glükoz bulunan, tüm MoDC'ler glikolitik oranı ile bazal aşamaya nazaran artmışOlgunlaşmamış MoDC'ler (Şekil 6D) daha yüksek glikolitik oranı sergileyen olgun MoDC'ler. Tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC'ler LPS ile muamele MoDC'ler (Şekil 6B) ile karşılaştırıldığında (glikoz mevcudiyetinde oligomycin neden olduğu) daha yüksek bir maksimum glikolizi sergilemiştir. Tolerojenik ve olgunlaşmamış MoDC'ler glikolitik kapasite olgun MoDC'ler (Şekil 6E) daha yüksek bulunmuştur. Yüksek glikolitik oranda aksine, glikolitik rezerv olgun MoDC'ler (Şekil 6F) en düşük oldu.

Şekil 1
Şekil 1:. Periferik kan monosit saflaştırma (A) kan 25 mi dikkatle santrifüj işleminden önce 50 mi tüp başına Ficoll 15 ml üzerine katmanlı. PBMC yoğunluk santrifüj sonrası plazma altındaki bir katmanın altında konsantre edilir. (B) PBMC conj olan mikro boncuklar ile inkübe edilir insan CD14 antikorları (izotipi: fare IgG2a) monoklonal ugated. CD14 + monositler izole etmek için bir Ayırıcı manyetik alan içine yerleştirilen bir kolona yüklendi ve daha sonra bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: MoDC'ler Morfolojik Karakterizasyonu. (A), GM-CSF ve IL-4, 200 ng / ml olgun MoDC'ler oluşturmak için Gün 0, 4 ve 6 üzerinde saflaştırılmıştır CD14 + monositleri eklenir; ve (B), 100 nM D3 vitamini ve 5 günde, 10 nM deksametason ile uyarılmaya ek bir adım tolerojenik MoDC'ler oluşturur. Olgunlaşmamış MoDC'ler ve tolerojenik MoDC'ler (C) elde MoDC'ler olgun ve (D) LPS tolerojenik MoDC'ler için 6. günde 1 ug / ml LPS ile stimüle edilir.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Akım Sitometrisi tolerojenik yüzey belirteçleri HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 ve LT3 salgılanma düzeyleri (yeşil), LPS tolerojenik (siyah), olgunlaşmamış (kırmızı) ile yüzey İşaretleyici karakterizasyonu olgun (mavi) MoDC'ler. Izotip kontrolleri gri renkle gösterilir. her hücre tipi için ayrı histogram fluorofor yoğunluğu ve üst üste X ekseni günlük karşı Y ekseni hücre sayısı ile işaretlenmiştir. Tüm histogramlar dört bağımsız deneyi temsil etmektedir. 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve telif hakkı izni ile yayınlanamaz. Copyright 2015 Amerikan DerneğiBağışıklık, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: MoDC'ler fonksiyonel karakterizasyonu. (A), bir tolerogenik artan sayıları ile birlikte kültür ile uyarılan CD4 + T-hücrelerinin alloproliferation frekans ölçümü (TOS, yeşil), LPS ile tolerojenik (L-tol, siyah), olgunlaşmamış (IMM; kırmızı) ve olgun (MAT ; mavi) MoDC'ler. dört bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir olgun MoDC'ler karşı tüm MoDC'ler arasında + SEM İstatistiksel farklılıklar anlamına gelir. IFN-y (sol panel), IL-12p40 (orta panel) ve IL (B) Sitokin analizi 10 (sağ bölmesindeHer iki tolerojenik (yeşil), olgunlaşmamış (kırmızı) veya olgun (mavi) MoDC'ler sayısındaki artış ile birlikte kültürlenmiş, CD4 + T-hücreleri arasında alloreactions süpernatanların l). Veriler altı bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; ± SEM (C), CD4 + T-hücresi alloproliferation ve tolerojenik MoDC'ler sayısının artması varlığında, olgun MoDC'ler sahip ortak-kültür tarafından uyarılan düzenleyici T hücrelerinin genişlemesini anlamına gelir. Sol Y ekseninde, CD4 + T-hücresi çoğalmasının sıklığı. Sağ Y ekseninde, CD25, yüksek Foxp3 + proliferatif CD4 + T-hücreleri üzerinde geçirilen hücreler sıklığı. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; ± SEM Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir tolerojenik MoDC'ler yokluğu karşısında varlığı arasındaki istatistiksel farklılıkları anlamına gelir. (D) CD4 + T hücre alloproliferation (Sol) ve CD25highFoxP3 + hücrelerinin frekansı (Sağ) ko- tarafından uyarılan tolerojenik MoDC'ler kültürOlgun MoDC'ler artan sayıları varlığında gerçekleştirilebilir. Veriler iki, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; olgun MoDC'ler yokluğu Dunnett çoklu karşılaştırma sonrası testi ile iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir karşı ± SEM varlığı arasında istatistiksel farklılıklar anlamına gelir. 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: MoDC'ler mitokondrial faaliyeti analizi. (A) MoDC'ler mitokondriyal membran potansiyeli seviyeleri (Kırmızı CMXRos) f ile elde edilmiştirDüşük sitometrik analizi. Dört bağımsız deneyin verileri toplandı. ± SEM (B), gerçek zamanlı bir mitokondriyal solunumun şematik gösterimi ortalama. bazal solunum gelen ve oligomycin ilave (kompleks V inhibisyonu), FCCP (maksimal solunum indüksiyon) ve rotenone / A karışımı antimycin (elektron taşıma zinciri [ETC] önleme) sonra başlayan OCR analizi. Mitokondriyal SRC (maksimum solunum çıkarılır maksimal bazal) OCR eğriden elde edilir. (C), bir tolerogenik mitokondri OCR (pmol / dakika) (yeşil TOL) içinde Örnek kinetik çalışma, LPS tolerojenik (L-tol, siyah) , olgunlaşmamış (İBB, kırmızı) ve olgun (MAT, mavi) oligomycin sıralı ilavesini (OLIG) MoDC'ler ve bazal solunum, FCCP ve rotenone / A (Rot-AA) antimycin. (D) OCR miktar kullanarak MoDC'ler ( E) MoDC'ler solunum kapasitesini yedek. Veriler beş bağımsız deneyden toplandı. Ortalama ± SE10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Haziran 2015): M. Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI gelen modifiye edilmiştir. Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: MoDC'ler metabolik Karakterizasyonu. (A) gerçek zamanlı glikoliz şematik gösterimi. ECAR analizi (maksimum hücre glikoliz ve kompleks V inhibisyonuna neden olan) oligomycin hücreler glükoz (glikoliz indüksiyonu) ilave edilir glukoz içermeyen ortam içinde inkübe edildiği taban ECAR arasında değişir, ve son olarak da 2-deoksi-D- glikoz(Glikoliz inhibisyon). Glikolitik oranı (bazal ECAR için çıkarılır glikoliz indüksiyon), glikolitik kapasitesi (bazal ECAR için çıkarılır maksimal glikoliz), ve glikolitik rezerv (maksimal glikoliz glikoliz indüksiyon için çıkarılır) ECAR eğrisi elde edilir. (B) Temsilcisi kinetik çalışma glikoliz bağımlı tolerojenik içinde ECAR (mph / dk) (yeşil TOL), LPS tolerojenik (siyah L-TOL), olgunlaşmamış (kırmızı İBB), ve olgun (MAT, mavi) glikoz (glukozit) sıralı ekleme kullanarak MoDC'ler, oligomycin (OLIG), ve 2-DG. (C) Barlar bazal ECAR seviyeleri (D) glikolitik hızı (E) glikolitik kapasite ve (F) MoDC'ler glikolitik rezerv göstermektedir. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen edilmiştir; 6 SEM. İstatistiksel farklılıklar Tukey çoklu karşılaştırma son test tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. 10,4049 / jimmunol: Bu rakam J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI modifiye edilmiş.1303316 (1 Haziran 2015). Çoğaltılabilir ve immünolojistler bir telif hakkı izni. Copyright 2015 The American Association ile yayınlanamaz, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu çalışma, monositler olgunlaşmamış MoDC'ler, tolerojenik MoDC'ler ve olgun MoDC'ler arasından oluşturmak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol önemli adımlar aşağıdaki paragraflarda ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. İnsan periferal kan ve bu protokol uygulanmalıdır insan kanı kullanım için genel önlemleri bir başlangıç ​​malzemesi olarak kullanılır dikkat etmek önemlidir. Insanlarda 24, kemik iliğinden DH'leri elde etmek teknik olarak mümkün olmakla birlikte, periferal kanında bulunan hücrelerden in vitro DC farklılaşma nedeniyle kemik iliği ile karşılaştırıldığında periferal kan mevcudiyeti tercih edilir. Periferik kanda bulunan hücreler, hematopoietik CD34 + kök hücreleri ve monositler yaygın DH'ler in vitro üretimi için kullanılır. Hematopoetik CD34 + hücreleri daha sonra Langerhans ayrılırlar CD1a + ve CD14 + alt elde etmek için, GM-CSF ve TNF-a ile birlikte kültürlenir kökhücreler ve dendritik hücreler gibi. Bunun aksine, monositlerin olgunlaşmamış MoDC'ler oluşturmak için, GM-CSF ve IL-4 ile kültürlendi. Çeşitli protokoller periferik kandan monositler zenginleştirilmesi için kullanılır; örneğin, plastik tabaklar, ayırımı ve izolasyon kiti 25, 26 bağlılık, yapışma protokol avantajları hücreleri en az zarar ve nispeten Ancak saflık tehlikeye olabilir hücre maliyetli.; ve fazladan bir adım daha ileri deneyler için hücreleri ayırmak için gereklidir. Elutriasyon büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre hücreleri ayıran bir tekniktir. ayırımı avantajları, hücre canlılığı ve monositler hali hazırda başka deneyler için kullanılabilir; Bununla birlikte bu teknik, bir elutriatörü kullanılabilirliği ve benzeri sedimentasyon parametreleri farklı hücre (T hücreleri ve monositler) ayırmak için yetersizlik ile sınırlıdır. Ticari olarak mevcut izolasyon kitleri ya olumlu seçmek için manyetik mikrobilyeleri kullanmak veyaolumsuz monositik nüfus seçin. İzole monositler (belirteçler ya da mikro-bağlı değildir) "el değmemiş" kalır gibi bazı protokoller negatif seçim kullanarak monosit izolasyon karşı önyargılı olan. Bu protokolde, CD14 boncuk PBMC'lerden pozitif seçkin insan monositleri için kullanıldı. CD14 sitoplazmik alam ve CD14 antikorun bağlanma sinyal iletimini tetiklemez. Ayrıca, mikroboncuklarının farklılaşma sürecini aksatmayacak dolayısıyla kültürden sonra monositler ayırmak ve olacaktır. Buna ek olarak, CD14 En güçlü monositlerde ve zayıf nötrofil ve bazı miyeloid dendritik hücreler, diğer yöntemlerle 17 daha yüksek hücre saflıkta yalıtım sonuçları bu nedenle bu yöntem üzerinde ifade edilir.

Kan monositler DC'lere veya makrofajlar içine ayırt edilebilir ve monositlerin kaderi büyük ölçüde sitokin ortamına bağlıdır. Bu yazıda, MoDC'ler (GM granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü eklenerek oluşturulan-CSF) Ve insan periferik kan monositleri İnterlökin 4 (IL-4). GM-CSF, monosit hayatta kalma ve IL-4 makrofaj farklılaşması üzerinde bir inhibisyon aktivitesi uyguladığı için gereklidir; ve monositler GM-SCSF ve IL-4 kombinatoryal ilaveli bağımsız sitokin 27 göre olgunlaşmamış MoDC'ler daha yüksek bir yüzde verim. Periferal kan monositleri, 28, 29, 30, tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) ve interlökin 13 (IL-13) eklenerek MoDC'ler üreten diğer protokoller vardır. GM-CSF ve IL-4 birleşmesiyle immünojenik veya tolerojenik MoDC'ler ayrışmıştır ve Th1, Th2 veya Th17 teşvik MoDC'ler olarak polarize plastik olgun olmayan DH'ler oluşturur kabul edilen bir protokole 1990'larda optimize edildi ve.

Olgunlaşmamış MoDC'ler vitamin D3 ve deksametazon ilavesiyle tolerojenik MoDC'ler ayrılır. Örneğin tolerojenik DC'ler oluşturmak için birkaç protokoller aracılığıyla vardırnükleer faktör-kappa B (NF-kB) önlenmesi, β-katenin aktivasyonu, D3 vitamini, Deksametason ve rapamisin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Tek başına vitamin D3 ve deksametazon hem DH'ler, tek tek ilaç kullanıldığında daha alloproliferation daha büyük bir bastırma vitamin D3 ve deksametazon sonucu kombinasyonu üzerinde tolerojenik etkisini sağlamak için rapor edilmiştir, ancak. Bu nedenle, bir tolerogenik DC'lerin üretimi için, mevcut protokolü vitamin D3 ve deksametazon bir kombinasyonu için değiştirildi. Bu yöntem şu anda tedavi programı ile insan tolerojenik DC'ler için bir model olarak kabul ediliyor. Yeniden D3 vitamini ve deksametazon kısa bir raf ömrüne sahip olduğunu not etmek de önemlidir.

Bu protokol, lipopolisakkaritlerin (LPS) bir DH olgunlaşma teşvik edici olarak ilave edildi. Olgunlaşmamış MoDC'ler pro-enflamatuar bir kokteyl ile olgunlaştırma indüklenebilir:(TNF-α), interlökin 1 p (IL-1β), interlökin 6 (IL-6) ve prostaglandin E2) veya pro-enflamatuar sitokinleri (TNF-α ve interferon y (IFN-Γ)). Pro-iltihabik bir kokteyl, yüksek ko-stimülatör ve gezici fonksiyonları olgun MoDC'ler oluşturur fakat, IL-12, 38, nispeten düşük seviyelerde üretir. TNF-α ya da IFN-Γ başına sabit bir dendritik fenotipi 39 uyarabildiği değildir. LPS, Toll-benzeri reseptör 4 (TLR4) uyaran DH olgunlaşmasını indükleme, NF-kB ve mitojen ile aktive edilmiş protein kinazın (MAPK'lar) aktivasyonunu aracılık eder. LPS ile indüklenen DH olgunlaşma DH olgunlaşma belirteçleri (CD83, CD86, HLA-DR), bir yukarı-regülasyonu gösterir ve aynı zamanda, IL-12p70 üretimi yol açtı. Buna ek olarak, bu adım daha ileri klinik kanser aşıları için olgun DC'ler üretmek için TLR3 agonistleri ile LPS eşleştirmek için modifiye edilebilir. Bu yazıda, tolerojenik DCler LPS tedavisi üzerine olgunlaşma dirençli olduğu gösterilmiştir. Bu DC'ler immünojenik değildir ve relea yok gibi yarı-olgunse pro-inflamatuar sitokinler 40.

Bu protokolün sınırlamalar farklılaşma sürecinde yalan. süreç yüksek verimlilik analizleri içine adapte edilecek bir zorluk teşkil Gün 7 Gün 0 8 gün sürer. protokolde bir değişiklik farklılaşma sürecini kısaltmak henüz farklı devletler yaşayabilir DC'lere yüksek sayıda elde etmek için gereklidir. İkincisi, DH'ler bu protokol sitokinlerin ilave edilerek üretilen ve bu sitokinler uzun süre DC nüfus sürdürmek değil. Ayrıca, sitokinler konsantrasyonlarda in vivo çok daha yüksek kullanıldığı ve in vitro DC'ler fizyolojik özdeş olmayan yolların yanlı gelişimine neden olabilir. DC öncüleri in vitro kültürler, örneğin in vivo 41 normal DC farklılaşması için çok önemli bir sitokin değildir GM-CSF, yanıt gösterilmiştir. Bununla birlikte, sitokin stimülasyonu geni için yararlı bir yöntem olabilirdeney için in vitro DC yüksek sayıda oranı. Gibi immünofloresan boyama gibi diğer analizlere bu protokol oluşturulan bu hücrelerin tabi akım sitometri yeteneği, allo reaksiyon çalışmaları ve metabolik çalışmalar bu yöntemin yararını artırır. Bunlar in vitro DC'ler in vivo DC'lere nadir numaraları ile yapmak daha önce zor DC geliştirme, olgunlaşma ve antijen sunum bilgisini geliştirmek için iyi bir model olarak hizmet vermektedir.

Tolerans karşı immünolojik bağışıklık düzenleyen DCler yeteneği olanağına kanser ve otoimmün hastalıklar 42, 43, 44, 45 karşı terapötik çekici adaylar yapar. Bu protokol oluşturulan immünojenik DC'ler bulaşıcı hastalıklara ve tümörlere karşı aşı etkinliğini arttırmak için kullanılabilir; tolerojenik DC'ler istenmeyen T hücre yanıtları kontrol ve transplantasyon sonrası ret önlemek için kullanılabilir iken. karışıkdokunulmazlık ve hoşgörü arasındaki denge DC farklılaşma durumuna ilişkin son derece bağlıdır. DC farklılaşma çoklu sinyal yollar ve metabolik kader tarafından yönetilir koordineli bir hücresel bir programdır. DC Farklı farklılaşma durumları biyoenerjitik ve biyosentez ihtiyaçları farklıdır; dinlenme durumunda DCler ile karşılaştırıldığında, örneğin, aktive edilmiş DCler hayatta kalma ve taşıma için önemli bir daha enerjik metabolik uyarlamaları gerektirmektedir. O D3 vitamini, deksametason ve rapamisin tolerojenik DCler uyarabilme özellikleri için bilinen dikkat etmek önemlidir, DC metabolizmasını etkileme tarif edilmiştir. Bu yazıda, farklı farklılaşma devletler MoDC'ler enerjik metabolizma dışı akı analizörleri kullanılarak karakterize edilmiştir ve tolerojenik MoDC'ler yüksek metabolik plastisite ve LPS olgunlaşma bu plastisite azalma sergiledi. Katabolik metabolizmasını etkiler tolerojenik DC 46 işlevleriyle Anabolik metabolizması DC'ler olgunlaşmasını destekler. DC'lerBu protokol oluşturulan terapötik bağışıklık ve hoşgörüyü değiştirerek tuşunu basılı tutun DH'lerin metabolik durumunu değiştirerek olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, DCS 'immun fonksiyonları çalışmak için çok önemli olgunlaşmamış, tolerojenik ve olgun MoDC'ler nesil için bir protokol sundu.

Acknowledgments

Bu çalışma Bilim, Teknoloji ve (KEK için) Araştırmaları Çekirdek Finansman Ajansı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 ml centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 ml falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 ml falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline		 Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab		 BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel		 Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 ml Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

Tags

İmmünoloji Sayı 112 tolerojenik MoDC'ler Olgun MoDC'ler Olgunlaşmamış MoDC'ler Bağışıklık Tolerans Metabolizma
Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sim, W. J., Malinarich, F.,… More

Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. M., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter