Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av umoden, moden og tolerogene dendrittiske celler med ulik Metabolsk fenotyper

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54128

Abstract

Immunrespons resultater fra et komplekst samspill mellom antigen ikke-spesifikk medfødte immunsystemet og antigenet spesifikt adaptive immunsystemet. Immunsystemet er en konstant balanse opprettholde toleranse til selv-molekyler og reagere raskt til patogener. Dendrittiske celler (DCS) er kraftige profesjonelle antigenpresenterende celler som lenker det medfødte immunsystemet til det adaptive immunsystemet og balansere adaptive respons mellom selv og ikke-selv. Avhengig av modnings signaler, kan umodne dendrittiske celler selektivt bli stimulert til å differensiere til immunogene eller tolerogene DC. Immunogene dendrittceller tilveiebringe spredningssignaler til antigen-spesifikke T-celler for klonal ekspansjon; mens tolerogene dendrittceller regulere toleranse av antigen-spesifikke T-celle-delesjon eller klonal ekspansjon av regulatoriske T-celler. På grunn av denne unike eiendommen, er dendrittiske celler svært ettertraktet som terapeutiske midler for kreft og autoimmune diseAses. Dendrittiske celler kan lastes med spesifikke antigener in vitro og injisert inn i menneskekroppen for å montere en spesifikk immunrespons både immunogen og tolerogene. Dette arbeidet presenterer et middel til å generere in vitro fra monocytter, umoden monocytter avledet dendrittiske celler (moDCs), tolerogene og modne moDCs som skiller i overflate markør uttrykk, funksjon og metabolske fenotyper.

Introduction

DC ble først beskrevet av Paul Langerhans (Langerhans-celler) i slutten av forrige århundre som refereres av Jolles en og preget av Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som kjente dem som profesjonelle antigenpresenterende celler 2. DC finnes i perifert blod og i de fleste vev i kroppen, spesielt rik på vev som er utsatt for det ytre miljø, slik som huden (tilstede som Langerhans-celler) og i beleggene i nese, lunger, mage og tarmer som muliggjør dem til å møte ytre antigener. Umodne DC har endocytic evne, men relativt lav kapasitet til å stimulere T-celler 3. Umodne DCs uttrykke ulike mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) som fengsler patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs) eller skade-forbundet molekylære mønstre (demper) 4. Aktivering faresignalene kjøre modning mot immunogene DCs mens selv molekyler resultere i T-celle unresponsiveness og apoptose 5. Immunogene DC er preget av oppregulering av MHC molekyler og co-stimulerende overflatemolekyler og deres evne til å prime naive T-celler 6,7.

Umodne DC også kan modnes til en treg-induserende eller tolerogene tilstand som reaksjon på vitamin D3 metabolitt 1a, 25 (O) 2-D3 og visse immunosuppressive midler som interleukin-10 (IL-10), deksametason og rapamycin 8-9. Tolerogene DC er preget av deres uttrykk for immunoreceptor tyrosin-baserte hemmende motiver (ITIMs) som inneholder overflatereseptorer og ligander. Signaltransduksjon av ITIMs inneholder ILT familiemedlemmer, ILT3 og ILT4 i tolerogene DC hemme alloproliferation og kjøre foxp3 + treg utvidelse 10,11. Disse unike egenskaper av tolerogene DC føre til at de dype potens in vivo, nemlig evnen til å indusere toleranse til holdbar transplanterte allogene transplantater og supprESS utviklingen av autoimmune sykdommer. Tolerogene DC kan betraktes derfor som en subtype av modne polarisert DC som virker ved inhibering av aktivering av immunsystemet.

For tiden er det to generelle undergrupper av dendrittiske celler i humant perifert blod: plasmacytoid DC og myeloide DC 12. Sirkulerende DC er sjeldne, som utgjør mindre enn 2% av leukocytter i menneskeblod, og dette utgjør en vanskelighet til isolering av et passende antall DC for å studere deres immunregulerende funksjoner. For å overvinne dette problemet, er monocytt differensiert DC brukt som en in vitro modell for studiet av dendrittiske cellefunksjon. Disse in vitro DC har lignende reseptorer og funksjoner i forhold til in vivo DC. Detaljert sammenligning av in vivo DC og in vitro generert stammer fra monocytter DC (moDCs) er undersøkt ved andre laboratorier 13, 14, 15. Det er også rapportert at moDCs og CD1c + DC var tilsvarende på antigenpresenterende og indusere T-celle funksjon 15.

I denne artikkelen beskriver vi en metode for generering av umodne moDCs fra perifert blod monocytter og deretter skille dem inn immunogene og tolerogene DC. Disse stammer fra monocytter dendrittiske celler (moDCs) kjennetegnes ved sine overflatemarkører, cytokin profilen, immunfunksjoner og metabolske tilstander. Immunogene og tolerogene dendrittiske celler produserer forskjellige cytokiner som resulterer i ekspansjon av enten allogene T-celler eller regulatoriske T-celler. I denne utredningen, er cytokin profilering utføres med systemer som bruker multiplex-teknologi. Vekstmedium av celler ble inkubert med antistoff immobilisert fargekodet perler og lest i en kompakt analysator. Metabolske tilstander av DC er analysert ved hjelp av ekstracellulære flux analysatorer som måler oksygenforbruk rente, en indikator på mobilnettet åndedrett, og ekstracellulære forsuring hastighet som gjenspeiler glycolyticflux i dendrittiske celler. Måling av disse bioenergi prisene gir et middel for å spore endringer i cellenes stoffskifte som er avgjørende i dendrittiske cellen utvikling og funksjon.

Protocol

Denne forskningen ble godkjent av Institutional Review Board (NUS-IRB 10-250).

1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC)

  1. Fremstilling av Reagens
    1. Forbered PBS / EDTA: fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS) og supplere med 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Steriliseres oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 um filter. Legg merke til å lagre PBS / EDTA ved 4 ° C og varmes opp til romtemperatur før bruk.
    2. Forbered beising buffer: fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS) supplement med 2% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Steriliseres oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 um filter.
  2. Samle Blod fra Blood Cone
    Merk: Blodet kjegle inneholder hvite blodcellekomponenter samles etter plateletpheresis fra sykehuset. Dersom blod blir oppsamlet i heparin eller EDTA-rør, fortynnet blod med PBS i forholdet 1: 1 og gå videre til trinn 1.3; hvis Buffy Coat er mottatt, fortynne Buffy Coat med PBS i 1: 2 ratio og fortsett til trinn 1.3.
    1. Kutt de to ender av konusen for å tillate blod å strømme ut i et 50 ml rør. Legg merke til at membranen inneholder vanligvis 10 ml blod.
    2. Bruke en butt ende sprøyte inneholdende 30 ml PBS / EDTA for å vaske membranen og oppsamles i et 50 ml rør.
    3. Fortynn blod ytterligere med PBS / EDTA til et sluttvolum på 80 ml.
  3. Isolering av PBMC ved densitetssentrifugering 16
    1. Delmengde 15 ml Ficoll hver 4 friske 50 ml rør.
    2. Bruke en 25 ml serologisk pipette for å legge til 20 ml fortynnet blod over Ficoll lag. Ta oppmerksom på å holde 50 ml tube i 45 graders vinkel, og ta vare å ikke forstyrre inter.
    3. Sentrifuger rørene på 805 xg uten bremser i 30 min, 20 ° C.
    4. Fjernplasmalaget og samle ring av PBMC som ligger like under plasmalaget med en Pasteur-pipette. Kombiner fire rør av PBMC i to 50 ml-rør. Merk for å unngå å samle det gjennomsiktige laget under PBMC.
    5. Legg PBS / EDTA til et sluttvolum på 50 ml per rør av PBMC og sentrifuger ved 548 xg ved bremser i 10 min, 20 ° C.
    6. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i hvert rør med 25 ml buffer flekker og kombinere i en 50 ml tube.
    7. Sentrifuger ved 367 xg med bremser for 5 min, 4 ° C.
    8. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten med 10 ml buffer flekker.

2. Monocyte berikelse av magnetisk separasjon 17

  1. Bestem celle nummer
    1. Ta 20 ul av PBMC cellesuspensjon og bland med 20 ul av trypan blått for å telle antallet levende celler ved hjelp av cytometer.
    2. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 367 xg med bremseri 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten helt og resuspender cellepelleten til en konsentrasjon av 10 7 celler pr 80 ul av flekker buffer.
  2. magnetisk Merking
    1. Tilsett 20 ul av CD14-mikroperler pr 10 7 celler, bland godt og inkuber i 15 min ved 2 - 8 ° C.
    2. Vask cellene ved tilsetning av 1 ml av fargingen buffer per 10 7 celler og sentrifuger ved 367 xg ved bremser for 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten helt og resuspender cellepelleten i en konsentrasjon av 10 7 celler pr 50 ul buffer flekker.
  3. magnetisk separasjon
    1. Bruk middels størrelse kolonne for maksimalt 2 x 10 8 totalt celler.
      Merk: Velg et passende kolonne og separator i henhold til det totale antallet celler og antall CD14 + celler anbefalte i databladet.
    2. Plasser kolonne i det magnetiske felt ofa passende separator og forberede kolonne ved å skylle med 500 mL av flekker buffer.
    3. Pipetter cellesuspensjon på kolonne og samle umerkede celler som passerer gjennom kolonnen med en 15 ml tube.
    4. Bytt ut en ny 15 ml rør under kolonnen og vaske kolonne 3 ganger med 500 mL av flekker buffer. Kontroller at kolonnen reservoaret er tomt før du legger ny farging buffer mellom hver vask.
    5. Fjern kolonne fra separatoren og plassere den på en frisk 15 ml tube.
    6. Pipetter 1 ml flekker buffer på kolonnen. Skyll umiddelbart ut magnetisk merkede celler ved å ta godt skyve stempelet (i settet) inn i kolonnen.
    7. Gjenta trinn 2.3.2 til 2.3.6 ved hjelp av den eluerte fraksjon på en ny kolonne for å øke renheten av CD14 + -celler. Merk at perlene vil bli utgitt fra cellene automatisk i kultur under trinn 3.2.

3. Differensiering av dendrittiske celler til annen aktiverings STates

  1. Fremstilling av Reagens (Endotoksin nivå må være mindre enn 0,1 EU / ml i alle reagenser)
    1. Fremstille cellekulturmedium: RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) og 0,05 mM 2-merkaptoetanol (2ME). Steriliseres oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 um filter.
    2. Forbered cytokiner: rekonstituere IL-4 og GM-CSF i cellekulturkvalitet vann til en konsentrasjon på 0,25 mg / ml under aseptiske betingelser. Delmengde cytokiner i 200 mL Mikrosentrifugerør og oppbevares ved -80 ° C.
    3. Fremstille vitamin D3 lager: rekonstituere vitamin D3 i cellekulturkvalitet vann til en konsentrasjon på 100 mM under aseptiske betingelser. Delmengde vitamin D3 i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C.
    4. Forbered deksametason lager: rekonstituere deksametason i cellekulturkvalitet vann til en konsentrasjon på 10 mM under aseptiske betingelser. delmengde dexamethasone i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C.
    5. Forbered LPS: rekonstituere lipopolysakkarider (LPS) i cellekulturkvalitet vann til en konsentrasjon på 1 mg / ml under aseptiske betingelser. Delmengde LPS i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C.
  2. Generere ulike moDCs
    1. Seed 4 sett av CD14 + monocytter i konsentrasjon på 0,3 til 0,5 x 10 6 / ml cellekulturmedium supplert med 200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4 i 6 brønners plater. Merk at dette er dag 0 og volumet av mediet i hver brønn er 6 2 ml.
    2. Inkuber cellene i vevskultur-inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Fjerne 850 pl av mediet fra kulturen ved dag 4 og sentrifuger ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml cellekulturmedium inneholdende 2 x av (200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4). Legg denne cellen blandingen tilbaketil kulturen. Legg merke til at 2x konsentrasjon tilsatt for GM-CSF og IL-4 vil bli 1x når 1 ml medium ble tilsatt tilbake i kulturen.
    4. Tilsett 1 pl av vitamin D3 lager og 1 ul av deksametason lager per ml av medium til to av settene på dag 5 for å generere tolerogene moDCs. Legg merke til at den endelige konsentrasjonen av vitamin D3 er 100 nM deksametason og er 10 nM; Tilsetningen av GM-CSF og IL-4 er ikke nødvendig på dag 5.
    5. Legg 200 ng / ml GM-CSF og 200 ng / ml IL-4 til alle settene på dag seks.
    6. Tilsett 1 ug / ml LPS til ett av settene som ble behandlet med bare GM-CSF og IL-4 på dag 6 for å generere modne moDCs.
    7. Tilsett 1 ug / ml LPS til ett sett av tolerogene moDCs på dag 6 for å generere LPS-tolerogene moDCs.
    8. Høste forskjellige typer moDCs ved dag 7 ved å spyle kulturskål med PBS, EDTA for flowcytometri eller andre undersøkelser. Legg merke til at bare ikke-adherente celler blir høstet. Ta oppmerksom på at prosentvis avkastning fra CD14 + monocytes for umodne moDCs, modne moDCs, tolerogene moDCs og LPS-tolerogene DC er henholdsvis ca 90%, 50%, 60% og 60% og varierer mellom blodgivere og FBS mye.

4. flowcytometrisystemer

  1. Celle overflaten markør Karakterisering på moDCs
    1. Ta celler fra kultur fatet ved pipettering. Vask cellene en gang med PBS / EDTA og resuspender cellene i en konsentrasjon på 5 x 10 5 celler pr 50 ul flekker buffer i 1,5 ml mikrosentrifuge-rør.
    2. Inkuber 0,5 x 10 6 celler porsjoner med PerCP-konjugert HLADR (1: 100), PE-konjugert CD80 (01:50), PE-konjugert CD83 (01:25), PE-konjugert CD86 (01:50), APC- konjugerte CD11c (01:50), PE-konjugert CD14 (01:50) og PE-konjugert BDCA3 (01:50) og APC-konjugert ILT3 (01:25) i mørket i 30 minutter ved 4 ° C. Isotype-matchet PerCP-konjugert MAb (01:20), PE-konjugert MAb (01:11), APC-konjugert MAb (01:11) vil tjene som negative kontroller.
    3. Påvise ekspresjon nivåer av overflatemarkører ved hjelp av et strømningscytometer 18.
  2. Analyse av Mitokondrier membranpotensialet av moDCs
    1. Fremstille stamløsning av 1 mM Red klormetyl-X-rosamine (CMXRos) ved å tilsette 94.1 ul dimetylsulfoksid (DMSO) per 50 ug lyofilisert Red CMXRos.
    2. Inkuber 2 x 10 5 moDCs med 100 nM Red CMXRos i 1 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS) i 30 minutter ved 37 ° C i 15 ml rør.
    3. Tilsett 2 ml PBS / EDTA til celler og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter, romtemperatur. Gjenta 2 ganger. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 300 ul PBS, EDTA, 2% FCS for strømningscytometri-analyse. Ta oppmerksom på å bruke PE-kanal til å analysere Red CMXRos signal.
  3. Marker Karakterisering av T-celler
    1. Inkuber 50 pl 1,2 x 10 6 CFSE-merket allo CD4 + T-celler (som genereres fratrinn 5.6) med PerCP-konjugert CD3 (1: 200), PE / Cy7-konjugert CD4 (1: 400) og APC / Cy7-konjugert CD25 (1: 100) i mørket i 30 minutter ved 4 ° C. Flekk-T-celler ved anvendelse av et kommersielt sett med foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) i mørke i 1 time ved romtemperatur.

5. Alloreaction Studier

  1. Fremstille 5 mM stamløsning av karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) ved å tilsette 18 ul DMSO til lyofiliseres CFSE, i henhold til produsentens protokoll.
  2. Rens CD4 + T-celler fra PBMC
    1. Bestemme celle nummer ved å ta 20 ul av PBMC cellesuspensjon og bland med 20 ul av trypan blått for å telle antallet levende celler ved hjelp av en cytometer.
    2. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 367 xg med bremser til 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirer supernatanten helt og resuspender cellepelleten i en konsentrasjon på 5 x 10 7 celler per 1 ml av flekker buffer i en 5 ml polystyrerene tube.
    4. Legg human CD4 + T-celle Enrichment Cocktail på 50 ul / ml celler. Bland godt og inkuber ved værelsetemperatur (15 - 25 ° C) i 10 minutter.
    5. Vortex magnetiske partikler i 30 sek, og legge til magnetiske partikler ved 100 ul / ml celler. Bland godt og inkuber ved værelsestemperatur i 5 min.
    6. Legg farging buffer til cellesuspensjonen til et totalt volum på 2,5 ml. Bland cellene i røret ved forsiktig pipettering opp og ned til 2 - 3 ganger. Plasser slangen i magneten og inkuberes i 5 min.
    7. Inverter magnet med rør og dekanter suspensjon (inneholder T-celler) inn i en ny 5 ml polystyrenrør.
  3. Bestemme celleantallet og inkuberes 1,2 x 10 6 CD4 + T-celler med 5 uM CFSE i 1 ml PBS i 20 minutter ved 37 ° C, beskyttet mot lys.
  4. Legge til fem ganger den opprinnelige farging volumet av cellekulturmedium (fremstilt i henhold til trinn 3.1.1) til cellene og inkuberes i 5 min.
  5. sentrifugeuge ved 300 xg i 5 min, 4 ° C og resuspender pelleten i cellekulturmediet ved en konsentrasjon på 2 x 10 5 per 75 ul.
  6. Legg 75 ul av 2 x 10 5 CFSE-merkede CD4 + T-celler til hver moDC kultur inneholdende 75 ul av cellekulturmedium med 0, 2,5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 og 40 x 10 3 moDCs i 96 vel U-bunnplater. Kultur for 6 dager i vevsdyrkningsinkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
  7. Avling ved pipettering av CD4 + T-celler i 15 ml rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 min, 4 ° C. Samle supernatanten for cytokinanalyse og resuspender cellepelleten i 2 ml PBS / EDTA og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.

6. cytokinanalyse 19

  1. Samle supernatanter fra alloreaction studier som beskrevet i trinn 5.5.
  2. Fremstilling av Reagens for menneskelig cytokin / Chemokine Magnetic Panel Analysis
    1. For utarbeidelse av blande flaske antistoff-immobilisert perler for individuelle ampuller med perler (følger med i pakken), vortex i 1 min. Legg 60 mL av hver antistoff perle hetteglass til blandeflaske (inkludert i pakken) og få til et sluttvolum på 3 ml med Perlene fortynningsmiddel (følger med).
    2. For utarbeidelse av kvalitetskontroller, rekonstituere Kvalitetskontroll en og Quality Control 2 (følger med i pakken) med 250 mL deionisert vann.
    3. For fremstilling av vaskebuffer, fortynne 30 ml 10 x vaskebuffer (inkludert i settet) med 270 ml avionisert vann.
    4. For utarbeidelse av menneskelig cytokin Standard, rekonstituere den menneskelige cytokin standard (følger med i pakken) med 250 mL deionisert vann for å gi en 10 000 pg / ml konsentrasjon.
      1. Tilsett 50 mL av 10 000 pg / ml humant cytokin standard til 200 ul assaybuffer (følger med i pakken) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør å gjøre 2000 pg / ml arbeids standard. Overfør 50 mL av 2000 pg / ml humant cytokin standard til 200 ul assaybuffer (følger med i pakken) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør å gjøre 400 pg / ml arbeids standard.
      2. Overfør 50 mL av 400 pg / ml humant cytokin standard til 200 ul assaybuffer (følger med i pakken) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør å gjøre 80 pg / ml arbeids standard. Overfør 50 mL av 80 pg / ml humant cytokin standard til 200 ul assaybuffer (følger med i pakken) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør å gjøre 16 pg / ml arbeids standard.
      3. Overfør 50 mL av 16 pg / ml humant cytokin standard til 200 ul assaybuffer (følger med i pakken) i en 1,5 ml mikrosentrifugerør å gjøre 3,2 pg / ml arbeids standard. 0 pg / ml standard arbeids har bare 200 pl av analysebuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  3. Pre våt filterplate (inkludert i settet) ved pipettering av 200 ul assaybuffer (forutsatt) til hver brønn av filtertallerken. Forsegl og plassere filterplaten på en platerister i 10 minutter ved romtemperatur.
  4. Aspirer analysebuffer og legge til 25 mL av hver Standard eller Kvalitetskontroll i de aktuelle brønnene.
  5. Legg 25 ul av cellekulturmedium (fremstilt i henhold til trinn 3.1.1) til bakgrunnen, standarder og kontrollbrønnene.
  6. Tilsett 25 ul assaybuffer til prøvebrønnene og tilsett 25 ul av prøven i de aktuelle prøvebrønner.
  7. Vortex blandeflasken inneholdende antistoff-immobiliserte perler og tilsett 25 ul av de blandede perlene til hver brønn. Tetningsplaten og inkuber med risting på en plate rister over natten ved 4 ° C.
  8. Aspirer væske og vask plate 2 ganger ved tilsetning av 200 ul / brønn vaskebuffer og aspirering av fluidet.
  9. Legg 25 mL av deteksjons antistoffer (følger med) i hver brønn. Forsegl og inkuber med risting på en platerister i 1 time ved romtemperatur.
  10. Legg 25 mL av streptavidin Phycoerythrin (provIDed) til hver brønn inneholdende 25 ul av deteksjons antistoffer. Forsegl og inkuber med risting på en platerister i 30 minutter ved romtemperatur.
  11. Aspirer væske og vask plate som beskrevet i trinn 6.8.
  12. Tilsett 150 ul / brønn av skjermfluid til alle brønner og resuspender perler på en platerister i 5 minutter.
  13. Detect fluorescens intensitet av perler ved hjelp av en 3D-system 20. Analyser median fluorescerende intensitet data ved hjelp av en fem parameter log-logiskurvetilpasning metode for beregning av cytokin / kjemokiner konsentrasjoner i prøver 21.

7. Sanntidsoksygenforbruk Rate (OCR) og ekstracellulære Forsuring Rate (ECAR) Målinger

  1. Forberedelse av Reagens / Materialer
    1. Forbered OCR medium: Analyse medium supplert med 25 mM glukose og 1 mM natrium pyruvat (pH 7,35). Steriliseres oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 um filter. Ta oppmerksom på at dette mediet er prepared uten FBS fordi komponentene i FBS er sammensatte og varierer fra ett lodd til anther mye.
    2. Forbered ECAR medium: Base medium supplert med 2 mM L-glutamin (pH 7,35). Steriliseres oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,2 um filter. Ta oppmerksom på at dette mediet er forberedt uten bikarbonat, glukose, pyruvat og FBS. Merk at FBS har bufferkapasitet og vil forstyrre ECAR lesing.
    3. Forbered forbindelser for OCR målinger: Susp oligomycin med 630 mL av OCR medium for å gjøre 100 mikrometer stamløsning og fortynnes med OCR medium til 16 mikrometer arbeider konsentrasjon. Resuspender karbonyl cyanid 4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) med 720 mL av OCR medium for å gjøre 100 mikrometer stamløsning og fortynnes med OCR medium til 4,5 mikrometer arbeider konsentrasjon. Resuspender rotenon / antimycin med 540 mL av OCR medium for å gjøre 50 M stamløsning og fortynnes med OCR medium til 10 mikrometer arbeider konsentrasjon.
    4. Forberedeforbindelser for ECAR målinger: Resuspender Glukose med 3 ml ECAR medium for å gjøre 100 mM stamløsning og fortynnet i 80 mM arbeidskonsentrasjon. Suspender oligomycin med 720 mL av ECAR medium for å gjøre 100 mikrometer stamløsning og fortynne til 18 mm Arbeids konsentrasjon. Gjensuspender 2-deoksy-D-glukose med 1,5 ml av ECAR medium for å lage 1000 mM stamløsning.
    5. Pipet 200 ul kalibrerings i hver brønn av kassetten og oppbevar ved 37 ° C uten CO 2 en dag før målinger.
  2. Sanntids OCR Målinger
    1. Høste moDCs og resuspender hver type moDCs i OCR-medium ved en konsentrasjon på 60 x 10 3 per 150 ul OCR medium.
    2. Seed 60 x 10 3 celler / brønn i et poly-D-lysin-belagte 96-brønns flatbunnet plate og inkuberes i et ikke-CO 2 inkubator i 1 time ved 37 ° C. Ta oppmerksom på å bruke 50 ul 50 ng / ml poly-D-lysin å belegge plate for en time og vask medsterilt vann. Holde platen tørke i 2 timer ved romtemperatur før bruk.
    3. Pipetter 25 mL OCR medium inn i injeksjonsporten A for alle brønner; 25 ul OCR-medium inneholdende 16 uM av oligomycin i injeksjonsport B for alle brønner; 25 ul OCR-medium inneholdende 4,5 uM av (FCCP) i injeksjonsporten C for alle brønner og 25 ul OCR-medium inneholdende 10 mM rotenon / antimycin A i injeksjonsporten D til alle brønner. Vær oppmerksom på at den endelige godt konsentrasjon for oligomycin er 2 mikrometer, er FCCP 0,5 mikrometer og rotenon / antimycin er en mikrometer.
    4. Sett platen inn i ekstracellulære flux analysator og kjøre en fullstendig OCR studie med alle moDCs samtidig i fire påfølgende stadier: basal respirasjon (etter medium injeksjon fra port A), mitokondrielle kompleks V hemming (etter sprøyte fra port B), maksimal respirasjon induksjon (etter sprøyte fra port C) og elektrontransportkjeden hemming (etter narkotika fra port D) 22. Ta oppmerksom på at det er 3 cycles i mellom injeksjonene og 6 min intervallet mellom målingene.
  3. Sanntids ECAR Målinger
    1. Høste moDCs og resuspender hver type moDCs i ECAR medium ved en konsentrasjon på 60 x 10 3 pr 150 ul av ECAR medium.
    2. Seed 6 x 10 4 celler / brønn i et poly-D-lysin-belagte 96-brønns flatbunnet plate og inkuberes i et ikke-CO 2 inkubator i 1 time ved 37 ° C.
    3. Pipetter 25 mL ECAR medium inn i injeksjonsporten A for alle brønner; 25 ul ECAR medium inneholdende 10 mM glukose i injeksjonsport B for alle brønner; 25 ul ECAR medium inneholdende 18 uM av oligomycin i injeksjonsport C for alle brønner og 25 ul OCR-medium inneholdende 1000 mM 2-deoksy-D-glukose i injeksjonsporten D til alle brønner. Legg merke til at den siste brønnen konsentrasjonen for glukose er 10 uM, er oligomycin 2 uM og 2-deoksy-D-glukose er 100 mm.
    4. Sett platen inn i ekstracellulære flux analysator og kjøre enkomplett ECAR studie med alle moDCs samtidig i fire påfølgende stadier: basal respirasjon (etter medium injeksjon fra port A), glykolyse induksjon (etter sprøyte fra port B), maksimal glykolyse induksjon (etter sprøyte fra port C) og glykolyse hemming (etter stoffet fra port D) 22.
    5. Analyser statistiske forskjeller ved hjelp av enveis ANOVA med en Tukey multippel sammenligning post-test.

Representative Results

Monocyte Rensing og Dendritic celledifferensiering

Monocytter ble renset fra PBMC ved tetthetssentrifugering fra perifert blod (figur 1A), etterfulgt av CD14 + positiv seleksjon magnetisk separasjon (figur 1B) og dyrket i fullstendig medium i nærvær av GM-CSF og IL-4 for å oppnå umodne dendrittiske celler ( Figur 2A). Tilsetning av vitamin D3 og dexametason etter GM-CSF og IL-4 resulterte i differensieringen av umodne moDCs til tolerogene moDCs (figur 2B). LPS ble lagt for å indusere modning av umodne moDCs å modne moDCs (Figur 2C) og tolerogene moDCs ble stimulert med LPS å verifisere motstand mot modning (figur 2D). Blodprøvene som brukes i dette arbeidet ble erholdt fra friske donorer med tidligere informerttillatelse.

moDC Karakterisering

Surface Marker Karakterisering ved flowcytometri

Analyse av DC overflatemarkører viste at modne moDCs uttrykte de høyeste nivåene av modning markører HLA-DR, CD83 og CD86 sammenlignet med LPS-behandlede tolerogene moDCs, tolerogene moDCs og umodne moDCs (figur 3). Disse resultatene viste at tolerogene moDCs var resistente til modning i forhold til umodne moDCs etter LPS-stimulering. I tillegg LPS-behandlede tolerogene moDCs og tolerogene moDCs vises økt uttrykk av CD14, BDCA3 (CD141) og Immunoglobulin-lignende transkripsjon (ILT) 3 sammenlignet med umodne og modne moDCs. De tolerogene moDCs at vi genererte her er i samsvar med tidligere rapporter 23.

Funksjonell karakterisering av moDCs

moDCs indusert for modning blir immunogent og slipper cytokiner som fremmer proliferasjon av CD4 + T-celler. Vi vurderte immunogenisitet av de ulike moDC subtyper ved å måle spredning av co-kultivert T-celler. Tolerogene moDCs var dårlig immunogene sammenlignet med modne moDCs, som vist ved lav alloproliferation av CD4 + T-celler (figur 4A). Tolerogene moDCs er karakterisert ved sin lave IFN-Γ, lav IL-12p40, og høy IL-10-cytokin produksjon i alloreaction ko-kulturer med CD4 + T-celler (Figur 4B). Videre øker antallet tolerogene moDCs i ko-kulturer av modne moDCs indusert allospesifikk CD4 + T-celler økte hyppighet av CD25 høy foxp3 + regulatoriske T-celler (Figur 4C).

Analyse av mitokondrie aktivitet

Rød CMXRos blir brukt til å gjenspeile den mitokondrielle aktivitet for å analysere mitokondrie membranpotensialnivåer i moDCs. Tolerogene moDCs ble observert å ha høyere mitokondriell aktivitet sammenlignet med de andre moDC differensierte undertyper (figur 5A). Neste, er satsen av mitokondriell oksygenforbruk (OCR) vurderes for de ulike moDC subtyper ved hjelp av en Bioanalyzer. OCR-målinger tillate høy oppløsning innsikt i metabolsk profil, som gir informasjon, inkludert men ikke begrenset til basal åndedrett, åndedretts ledig kapasitet, proton lekkasje og ikke-mitokondriell respirasjon. Målingen av OCR tilveiebringer et middel for å vurdere evnen til celler til å svare på stress. Cellene metabolsk perturbert ved tilsetning av tre forskjellige forbindelser i rekkefølge. Den første injeksjonen er Oligomycin (ATP Coupler) som inhiberer kompleks V i elektrontransportkjeden (ETC), inhibering av ATP syntese. Dette trinnet skiller prosentandelen av oksygen forbrukt for ATP syntese og prosentandelen av oksygen som forbrukes for å overvinne proton lekkasje over den indre mitokondrie-membran. Den andre injeksjonen er FCCP (ETC akselerator) som forstyrrer ATP-syntese ved å transportere hydrogenioner på tvers av mitokondriemembranen i stedet for gjennom proton kanal av komplekset V. Sammenbruddet av mitokondriemembranen potensialet fører til et hurtig forbruk av energi og oksygen, uten generering av ATP. FCCP behandling kan brukes til å beregne luft ledig kapasitet av celler. Vedlikehold av reserveluftkapasitet under stress forhold er avgjørende for celle overlevelse. Denne kapasiteten er bestemt av flere faktorer, inkludert tilgjengeligheten av substratet og funksjonell kapasitet som er involvert i den ETC. enzymer Den tredje injeksjon er en kombinasjon av rotenon, et Komplex-I-inhibitor, og antimycin A, en kompleks III inhibitor. Denne kombinasjonen avsluttes mitokondriell respirasjon og OCR er observert å avta som følge av nedsatt mitokondriefunksjon (figur 5C). Tolerogene moDCs vises høyere basal OCR nivåer enn modne moDCs (Figur 5D). I tillegg tolerogene, LPS-tolerogene og umodne moDCs viste økt reserveluftkapasitet sammenlignet med modne moDCs (figur 5E).

Metabolsk Karakterisering av moDCs

Fordi melkesyre og protoner frigjøres fra celler i løpet av glykolyse, analyserte vi glycolytic aktiviteten moDCs ved å utføre en sanntidsanalyse av frekvensen av ekstracellulære forsuring (ECAR) (Figur 6B). I nærvær av glukose, økte den glykolytiske frekvensen av alle moDCs sammenlignet med basaltrinnet, medmodne moDCs stiller høyere glycolytic rente enn umodne moDCs (Figur 6D). Tolerogene og umodne moDCs viste høyere maksimal glykolyse (indusert av oligomycin i nærvær av glukose) sammenlignet med LPS-behandlede moDCs (Figur 6b). Den glycolytic kapasitet på tolerogene og umodne moDCs var høyere enn modne moDCs (Figur 6E). I motsetning til sin høye glycolytic rente, glycolytic reserve var lavest i modne moDCs (Figur 6F).

Figur 1
Fig. 1: Monocytt Rensing fra perifert blod (A) 25 ml blod ble forsiktig lagt oppå 15 ml Ficoll per 50 ml røret før sentrifugering. PBMC-er konsentrert i et lag under plasma etter densitetssentrifugering. (B) PBMC ble inkubert med mikroperler som er konj ugated til monoklonale humane CD14 antistoffer (isotype: mus IgG2a). og deretter lastet på en kolonne som er plassert i det magnetiske felt av en separator for å isolere CD14 + monocytter Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Morfologiske Karakterisering av moDCs. (A) 200 ng / ml GM-CSF og IL-4 ble tilsatt til rensede CD14 + monocytter på dag 0, 4 og 6 for å generere umodne moDCs; og (B) et ytterligere trinn av stimulering med 100 nM vitamin D3 og 10 nM deksametason på dag 5 genererer tolerogene moDCs. Umodne moDCs og tolerogene moDCs blir stimulert med 1 ug / ml LPS på dag 6 for å generere (C) modne moDCs og (D) LPS-tolerogene moDCs.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Surface Marker Karakterisering ved flowcytometri Expression nivåer av overflatemarkører HLA-DR, CD80-, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 og LT3 i tolerogene (grønn), LPS-tolerogene (svart), umodne (rød), moden (blå) moDCs. Isotype kontroller er vist i grått. Individuell histogram for hver celletype er plottet med Y-aksen legemer mot X-aksen logg av fluorophore intensitet og kledde. Alle histogrammer er representative for fire uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt forandret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gjengitt og publiseres med copyright tillatelse. Copyright 2015. The American Association ofImmunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Funksjonell Karakterisering av moDCs. (A) Kvantifisering av alloproliferation frekvens av CD4 + T-celler indusert ved ko-kultur med økende antall tolerogene (TOL, grønn), LPS-tolerogene (L-TOL, svart), umodne (IMM, rød) og moden (MAT ; blå) moDCs. Dataene ble samlet fra fire uavhengige forsøk; mener + SEM statistiske forskjeller mellom alle moDCs versus modne moDCs ble analysert ved toveis ANOVA med Dunnett multippel sammenligning post-test. (B) cytokin analyse av IFN-Γ (venstre panel), IL-12p40 (midtre panelet) og IL- 10 (høyre rutel) i supernatanter fra alloreactions mellom CD4 + T-celler co-dyrket med økende antall av enten tolerogene (grønn), umodne (rød) eller eldre (blå) moDCs. Data ble samlet fra seks uavhengige forsøk; gjennomsnitt ± SEM (C) CD4 + T-celle alloproliferation og regulatoriske T-celler utvidelse indusert av co-kultur med modne moDCs i nærvær av økende antall tolerogene moDCs. Venstre Y-aksen, hyppighet av CD4 + T-celle-proliferasjon. Høyre Y-aksen, frekvens av CD25 høy foxp3 + celler gating på proliferativ CD4 + T-celler. Dataene ble samlet fra tre uavhengige eksperimenter; gjennomsnitt ± SEM Statistiske forskjeller mellom nærvær versus fravær av tolerogene moDCs ble analysert ved en-veis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test. (D) CD4 + T-celle alloproliferation (venstre) og hyppigheten av CD25highFoxP3 + celler (høyre) indusert ved sam- kultur med tolerogene moDCsi nærvær av økende antall modne moDCs. Dataene ble samlet fra to til tre uavhengige eksperimenter; gjennomsnitt ± SEM Statistiske forskjeller mellom nærværet versus fravær av modne moDCs ble analysert ved to-veis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test. Dette tallet har blitt forandret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gjengitt og publiseres med copyright tillatelse. Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Analyse av mitokondrielle aktivitet moDCs. (A) Nivåer av mitokondriemembranen potensial (Red CMXRos) i moDCs ble oppnådd ved flav cytometri analyse. Dataene i fire uavhengige eksperimenter ble slått sammen. Gjennomsnitt ± SEM (B) Skjematisk fremstilling av en real-time mitokondrie respirasjon. OCR-analyse fra basal respirasjon og etter tilsetning av oligomycin (kompleks V-inhibering), FCCP (maksimal åndedrett induksjon), og rotenon / antimycin blanding (elektrontransportkjeden [etc] inhibering). Den mitokondrielle SRC (maksimal basal subtrahert fra maksimal respirasjon) er avledet fra OCR-kurven. (C) Representative kinetisk studie av mitokondrier OCR (pmol / min) i tolerogene (TOL, grønn), LPS-tolerogene (L-TOL, sort) , umoden (IMM, rød) og moden (MAT, blå) moDCs ved hjelp av sekvensiell tilsetning av oligomycin (OLIG), FCCP, og rotenon / antimycin (Rot-AA). (D) OCR kvantifisering av basal respirasjon av moDCs og ( E) overs luftkapasitet på moDCs. Dataene ble samlet fra fem uavhengige eksperimenter. Gjennomsnitt ± SEM. Dette tallet har blitt forandret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gjengitt og publiseres med copyright tillatelse. Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Metabolsk Karakterisering av moDCs. (A) Skjematisk fremstilling av sanntids glykolyse. ECAR analyse starter fra basal ECAR, i hvilket cellene ble inkubert i glukosefritt medium, fulgt av tilsetning av glukose (glykolyse induksjon), oligomycin (som induserer maksimal celle glykolyse og kompleks V-inhibering), og til slutt 2-deoksy-D- glukose(Glykolyse hemming). Glycolytic rate (glykolyse induksjon trekkes for basal ECAR), glycolytic kapasitet (maksimal glykolyse trekkes for basal ECAR), og glycolytic reserve (maksimal glykolyse trekkes for glykolyse induksjon) er utledet fra ECAR kurven. (B) Representant kinetisk studie av glykolyse-avhengige ECAR (mph / min) i tolerogene (TOL, grønn), LPS-tolerogene (L-TOL, svart), umodne (IMM, rød), og modne (MAT, blå) moDCs ved hjelp av sekvensiell tilsetning av glukose (Gluc), oligomycin (OLIG), og to-DG. (C) Barer vise basal ECAR nivåer (D) glycolytic rate (E) glycolytic kapasitet, og (F) glycolytic reservatet moDCs. Dataene ble samlet fra tre uavhengige eksperimenter; bety seks SEM. Statistiske forskjeller ble analysert ved en-veis ANOVA med en Tukey multiple sammenlignings post-test. Dette tallet har blitt forandret fra J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gjengitt og publiseres med copyright tillatelse. Copyright 2015. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette notatet beskriver en metode for å generere fra monocytter umodne moDCs, tolerogene moDCs og modne moDCs. De viktigste trinnene i denne protokollen er diskutert i detalj i de følgende avsnittene. Det er viktig å merke seg at humant perifert blod blir brukt som et utgangsmateriale i denne protokollen, og universelle retningslinjer for behandling av humant blod skal praktiseres. Selv om det er teknisk mulig å utlede DC fra benmarg hos mennesker 24, er in vitro DC differensiering av celler som finnes i perifert blod foretrukket på grunn av tilgjengeligheten av perifert blod sammenlignet med benmargen. Blant de celler som finnes i perifert blod, er hematopoetiske CD34 + stamceller og monocytter som vanligvis brukes for in vitro produksjon av DC. Hematopoetisk CD34 + stamceller blir dyrket sammen med GM-CSF og TNF-α for å utlede CD1a + og CD14 + undergrupper som deretter videre differensiert til Langerhansliknende celler og dendrittiske celler. Omvendt, monocytter dyrket i GM-CSF og IL-4 for å generere umodne moDCs. Flere protokoller brukes for anriking av monocytter fra perifert blod; for eksempel ved tilslutning til plastskåler, oppslemming og isoleringssett 25, 26 Fordelene ved den tilslutning protokollen er minimal skade på celler og forholdsvis kostnadseffektiv imidlertid celle renhet kan være kompromittert.; og et ekstra trinn er nødvendig for å løsne cellene for ytterligere eksperimenter. Oppslemming er en teknikk som skiller celler basert på deres størrelse og tetthet. Fordelene med oppslemming er celleviabilitet og monocytter, kan lett anvendes for videre eksperimenter; men denne teknikken er begrenset av tilgjengeligheten av en elutriator og manglende evne til å skille mellom forskjellige populasjoner av celler (T-celler og monocytter) med tilsvarende sedimenteringsparametere. Kommersielt tilgjengelige isolasjon kits bruke magnetiske mikro å enten velge positivt ellernegativt velge monocytic befolkningen. Noen protokoller er forutinntatt mot monocytter isolert med negativ seleksjon som de isolerte monocytter forbli "urørt" (ikke bundet av markører eller mikroperler). I denne protokollen, ble CD14 perler brukes til positive velger humane monocytter fra PBMC. CD14 mangler et cytoplasmatisk domene og binding av antistoffet til CD14 ikke utløser signaloverføring. Videre vil mikroperlene løsne fra monocytter etter kultur og således ikke hindrer differensieringsprosessen. I tillegg er CD14 sterkt uttrykt på de fleste monocytter og svakt på nøytrofile celler og noen myeloid dendrittiske celler, derav denne metoden for isolasjon resulterer i høyere cellerenhet enn de andre metodene 17.

Blodmonocytter kan differensieres til DCS eller makrofager og skjebnen til monocytter i stor grad avhenger av cytokin miljø. I denne utredningen, er moDCs genereres ved å legge granulocytt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) Og interleukin 4 (IL-4) til humane perifere blodmonocytter. GM-CSF er nødvendig for monocytt overlevelse og IL-4 utøver en inhibitorisk aktivitet på makrofag differensiering; og kombinatoriske tillegg av GM-SCSF og IL-4 til monocytter gi en høyere prosentandel av umodne moDCs forhold til individuell cytokin 27. Det finnes andre protokoller som genererer moDCs ved tilsetning av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) og interleukin 13 (IL-13) for å perifere blodmonocytter 28, 29, 30. Kombinasjonen av GM-CSF og IL-4 ble optimalisert på 1990-tallet og nå en akseptert protokoll som genererer plast umodne DC differensierte inn immunogene eller tolerogene moDCs og polariserte i Th1, Th2 eller Th17 fremme moDCs.

Umodne moDCs blir differensiert i tolerogene moDCs ved tilsetning av vitamin D3 og dexametason. Det finnes flere protokoller for å generere tolerogene DC for eksempel vianukleær faktor kappa B-(NF-kB) inhibering, β-catenin aktivering, vitamin D3, deksametason og Rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Selv om både vitamin D3 og dexametason alene har blitt rapportert å indusere en tolerogene effekt på DC, kombinasjonen av vitamin D3 og dexametason resultat i en større undertrykkelse av alloproliferation enn når de enkelte stoffer er anvendt. Derfor ble den eksisterende protokoll for generering av tolerogene DC modifisert til en kombinasjon av vitamin D3 og dexametason. Denne metoden er i ferd med å bli akseptert som en modell for menneske tolerogene DCs med et terapeutisk verktøy. Det er også viktig å merke seg at det rekonstituerte vitamin D3 og dexametason har kort holdbarhet.

I denne protokollen, ble lipopolysakkarider (LPS) lagt til som en DC modning induser. Umodne moDCs kan også bli overtalt til modning ved hjelp av pro-inflammatoriske cocktail:(TNF-α), Interleukin 1 beta (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) og prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-a og interferon gamma (IFN-Γ)). Pro-inflammatorisk cocktail genererer modne moDCs med høy ko-stimulerende og trekkende funksjoner, men de frembringer forholdsvis lave nivåer av IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ alene er ikke i stand til å indusere en stabil dendrittisk fenotype 39. LPS stimulerer Toll-like receptor 4 (TLR4), medierer aktivering av NF-kB og mitogen aktivert protein kinaser (MAPK) for å indusere DC modning. DC modning indusert av LPS viser en oppregulering av DC modnings markører (CD83, CD86, HLA-DR) og også førte til produksjon av IL-12p70. I tillegg kan dette trinnet endres ytterligere å pare LPS med TLR3-agonister å produsere modne DC for kliniske kreftvaksiner. I denne utredningen, er tolerogene DCs vist seg å være resistente mot modning på LPS behandling. Disse halv modne som DC er ikke immunogene og ikke releaSE proinflammatoriske cytokiner 40.

Begrensningene i denne protokollen ligge i differensiering prosessen. Prosessen tar 8 dager fra dag 0 til dag 7 som utgjør en vanskelighet for å tilpasses til høy gjennomstrømning analyser. En modifikasjon av protokollen som kreves for å forkorte den differensieringsprosessen likevel gi et høyt antall levedyktige DC i ulike tilstander. For det andre, blir DCS generert ved tilsetning av cytokiner i denne protokollen, og disse cytokinene ikke opprettholde DC befolkning over lengre tid. Videre er cytokiner som brukes i konsentrasjoner mye høyere enn in vivo og kan resultere i forspent utvikling av banene som ikke er fysiologisk identiske med in vivo DC. For eksempel in vitro kulturer av DC-forløpere har vist seg å svare på GM-CSF, som ikke er en viktig cytokin for normal DC differensiering in vivo 41. Likevel kan cytokin stimulering være en nyttig metode for å genrangere høyt antall DC in vitro for eksperimentering. Evnen til å underkaste disse cellene som genereres fra denne protokollen til andre analyser som immunofluorescens flekker, strømningscytometri, allo reaksjonsstudier og metaboliske studier øker nytten av denne fremgangsmåte. Disse in vitro DC tjene som en god modell for å forbedre kunnskapen til DC-utvikling, modning og antigen presentasjon som er tidligere vanskelig å gjøre med de sjeldne antall in vivo DC.

DCs 'evne til å regulere immunologisk immunitet mot toleranse gjør dem attraktive kandidater i terapi mot kreft og autoimmune sykdommer 42, 43, 44, 45. Immunogene DC generert på denne protokollen kan brukes til å forbedre vaksinasjon effekt mot infeksjonssykdommer og tumorer; mens tolerogene DC kan brukes til å kontrollere uønskede T-celle responser og forhindre avvisning etter transplantasjon. intrikatebalanse mellom immunitet og toleranse avhenger umåtelig på DC differensiering status. DC differensiering er en koordinert cellular program som er styrt av flere signalveier og metabolske skjebne. Ulike differensierings statene DC varierer i bioenergetisk og biosyntese behov; for eksempel aktiverte DC krever mer energiske metabolske tilpasninger viktige for overlevelse og migrasjon i forhold til DC på hviletilstand. Det er viktig å merke seg at vitamin D3, deksametason og rapamycin er kjent for sin evne til å indusere tolerogene DC, har blitt beskrevet å påvirke DC metabolisme. I denne utredningen, ble den energiske metabolismen av moDCs fra ulike differensierings tilstander preget hjelp ekstracellulære fluks analysatorer og tolerogene moDCs utstilt høyeste metabolske plastisitet og LPS-indusert modning redusert dette plastisitet. Anabole metabolisme støtter DCs modning mens katabole metabolisme påvirkninger tolerogene DC fungerer 46. DCSgenerert fra denne protokollen kan brukes til å vurdere om å endre den metabolske tilstand av DC holder nøkkelen til å endre immunitet og toleranse i terapi. I konklusjonen, presenterte vi en protokoll for generering av umodne, tolerogene og modne moDCs avgjørende for å studere DCs 'immunfunksjoner.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Direktoratet for Science, Technology and Reasearch kjernefinansiering (til JEC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 ml centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 ml falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 ml falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline
Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab
BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab
Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab
Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel
Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 ml Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

Tags

Immunologi tolerogene moDCs Eldre moDCs Umodne moDCs Immunity Toleranse Metabolism
Generering av umoden, moden og tolerogene dendrittiske celler med ulik Metabolsk fenotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sim, W. J., Malinarich, F.,More

Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. M., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter