Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler

Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54135
Automatic Translation
*1, *1,3, 1,2
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS
* These authors contributed equally

Summary

Förster resonans (FRET) imaging er et kraftfuldt værktøj til realtid cellebiologiske undersøgelser. Her en fremgangsmåde til FRET billeddannelse celler i fysiologiske tredimensionale (3D) hydrogel mikromiljøer anvendelse af traditionel epifluorescensmikroskopi præsenteres. En analyse for ratiometriske FRET sonder, der giver lineære nøgletal over aktiveringen sortiment er beskrevet.

Abstract

Imaging af Förster resonans (FRET) er et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellebiologi i real-tid. Forsøg med FRET almindeligt ansætte todimensional (2D) kultur, som ikke efterligner den tredimensionale (3D) cellulære mikromiljø. En metode til at udføre standset emission FRET billeddannelse under anvendelse af konventionel Vidvinklet epifluorescensmikroskopi af celler i en 3D hydrogel miljø præsenteres. Her beskrives en analysemetode til ratiometriske FRET sonder, der giver lineære nøgletal over sonden aktivering rækkevidde. Måling af intracellulær cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) niveauer er påvist i chondrocytter under forskolin-stimulering under anvendelse af en probe for EPAC1 aktivering (ICUE1) og evnen til at detektere forskelle i cAMP signaling afhængige af hydrogelmateriale type, heri en fototværbinding hydrogel (PC-gel, polyethylenglycoldimethacrylat) og en termoresponsiv hydrogel (TR-gel). Sammenlignet med 2D FRET metoder,denne metode kræver lidt ekstra arbejde. Laboratorier allerede udnytter FRET billeddannelse i 2D kan nemt vedtage denne metode til at udføre cellulære studier i en 3D mikromiljø. Det kan endvidere anvendes til high throughput lægemiddel-screening i manipuleret 3D microtissues. Desuden er det kompatibelt med andre former for FRET billeddannelse, såsom anisotropi måling og fluorescens levetid imaging (FLIM), og med avancerede mikroskopi platforme ved hjælp af konfokal, pulserende eller moduleret belysning.

Introduction

Cellulær signalering er både komplekse og følgeskader for mange områder, herunder farmakologi, tissue engineering, og regenerativ medicin. Nyttige testpræparater værktøjer er nødvendige for at fremme vores forståelse af cellebiologi og udvikle optimale materialer til væv regenerering. Förster resonans (FRET) billeddannelse er et vigtigt redskab, hvormed analyse af receptor-aktivering, molekylær kropsbygning, og supramolekylære interaktioner (f.eks., Protein / DNA kompleksdannelse) i levende celler. FRET er en form for ikke-radiative energioverførsel mellem fluoroforer 1. Det har en effektivitet, der er omvendt proportional med den sjette potens af afstanden mellem en donorfluorofor og acceptor fluorophor. Således kan det give oplysninger om den rumlige afstand mellem to forskellige molekyler eller på tværs regioner af et molekyle på nanometer skala (typisk 1 - 10 nm) 2. Donor- og acceptor-fluoroforer kan være forskellige molecule typer (hetero-FRET), hvor donor har højere energi emission (kortere bølgelængde) eller af samme type (homo-FRET). FRET billeddannelse kan udføres på faste eller levende celler, men generelt anvendes faste celler til billeddannelse af molekylære interaktioner med høj rumlig opløsning, når høj hastighed konfokale systemer er ikke tilgængelige. Levende celler anvendes til at studere interaktioner og processer, der inhiberes eller ændret af fiksering, såsom realtids intracellulære signalering respons 3.

Levende celle undersøgelser, der beskæftiger FRET imaging brug todimensionale (2D) cellekulturer dels på grund af enkelhed og lavere baggrund (ingen emission fra ud af plane celler). Men 2D kulturer også ændre talrige cellulære processer i forhold til den fysiologiske mikromiljø og tredimensionale (3D) kultur 4,5. For eksempel er nativ celle til celle og celle til ekstracellulære matrix-interaktioner drastisk ændret i 2D kultur førte til de easily observerede ændringer i cellemorfologi og polaritet 6. Membran mikrodomæner (f.eks., Caveolae og lipidklumper) og receptor signalering er stærkt reguleret af kultur miljø, delvis fordi de binder cytoskeletale komponenter 7,8 og cellens form og cytoskelet struktur er stærkt reguleret af den rumlige kultur miljø 9. Mechanotransduction er ikke kun påvirket af 3D matrix, men af de mere komplekse sekundære belastningsforhold affødt i 3D-miljøer i forhold til 2D kulturer 10. Endelig permeabiliteten af ​​3D matricer er mindre end dyrkningsmediet, generelt med nedsat diffusion og forøget binding af celle signalering molekyler sammenlignet med 2D kulturer. Med 3D kulturer man er i stand til at skabe og observere en mikromiljø mere ligner den fysiologiske med hensyn til lim, kemiske og mekaniske signaler. Celle til celle-interaktioner kan fremmes og de klæbende egenskaber kan styres wed struktur, sammensætning og arkitektur (mønsterdannelse) af 3D materiale 11-13. De mekaniske egenskaber af materialet kan ligeledes skræddersys ved sammensætning og struktur 14,15. Dyrkning af celler i hydrogeler derfor tillader FRET undersøgelser af primære celler, der ellers ville de-differentiere eller ændring i fænotype ved anvendelse af traditionelle teknikker, f.eks., Celler fra ledbrusk. Således er der behov for en metode til at aktivere FRET assays i levende 3D kulturer.

Hydrogel stilladser er ideelle til 3D FRET-baserede eksempler, fordi de kan gøres optisk transparent og tilpasset til at styre mikromiljø og tilvejebringe cellulære signaler. Hydrogeler fremstillet af naturlige polymerer er blevet anvendt i cellekultur i årtier, herunder gelatine og fibrin 16. Kan opnås større kontrol over det cellulære mikromiljø med kemisk modifikation af disse polymerer og med anvendelse af syntetiske polymerer 17,18. Hydrogel mekanisk stivhed og permeabilitet kan styres ved at ændre deres polymere sammensætning og maskestørrelse (polymer og tværbindingsdensitet) 19,20. Endvidere kan hydrogeler gøres bioaktivt ved inkorporering af vækstfaktorer og cellulære ligander. På grund af disse muligheder, udvikling af hydrogeler til biosensorer, drug delivery, og vævsdyrkningsapplikationer er en meget aktiv forskningsområde 21. 3D-print af hydrogeler er også under udvikling til fremstilling af mikro-væv og -organs 15. Således FRET billeddannelse af celler i hydrogeler er ikke kun nyttig som et middel til at tilnærme fysiologiske cellulære adfærd, men også som et værktøj til at studere og optimere manipuleret vævsvækst.

Binære ratiometriske FRET-prober er meget nyttige i at studere cellulær signalering og kan anvendes i hydrogel kulturer. For en delvis liste over offentliggjorte fluorescerende og FRET sonder, se Cell Migration Consortium hjemmeside (fx., Binding af en ion eller et molekyle, enzymatisk spaltning af område), som ændrer afstanden mellem fluorophorer og derfor FRET størrelsesorden (enten højere eller lavere) 23. En mindre almindelig alligevel nyttige probe typen er afhængig af en analyt følsom ændring i spektral overlapning af de to fluorophorer, som ændrer FRET størrelsesorden. "Single-chain" ratiometriske prober udnytte en fluorofor par forbundet på et enkelt molekyle. "Dual-kæden" prober udnytte fluoroforen par på separate molekyler, men deres ekspression kan kobles under samme ekspressionskassette 24. I modsætning til undersøgelser med enkelt fluorophor udtryk (f.eks., Fluorescerende fusion proteiner), undersøgelser med ratiometriskFRET prober kræver ikke dobbelt transfektion til kontrol for transfektionseffektivitet eller cellelevedygtighed. Ratiometrisk FRET sonder er relativt ufølsomme over for transfektion effektivitet, når udtrykkes over en minimumstærskel (koncentration ufølsom) 23,25. De er ufølsomme over for excitation source svingninger og andre intracellulære miljø faktorer (f.eks., PH, ioner) så længe begge fluoroforer er ligeledes reagerer. Desuden deres svar er ikke underlagt transkriptionel forsinkelse, i modsætning til fluorescerende og selvlysende promotor-reporter konstruerer 26,27.

Ratiometrisk FRET prober let og hyppigt anvendt i konventionelle Vidvinklet epifluorescensmikroskop systemer. Vidvinklet mikroskoper er foretrukket frem for linje scanning konfokale systemer til levende celler på grund af bekymringer over systemets omkostninger, fluorophor blegning, og erobringen af ​​signal ændringer med tilstrækkelig tidsmæssig opløsning. Derudover enkelt celle analysis over en stor population af celler er muligt med et motoriseret trin og billedoptagelse over flere synsfelter. Vidvinklet mikroskopi kræver intensitet baseret analyse af hetero-FRET probesignaler. Selvom intensitet analyse ikke kræver kompliceret hardware som andre FRET metoder, er mere post-erhvervelse arbejde for at korrigere for virkningerne af fluoroforen adfærd og mikroskop / imaging systemkonfigurationer 28. Det optagne emissionsintensitet en fluorofor er en funktion af excitationsenergi, fluorophor kvanteudbytte, og det kombinerede filter og kamera / detektor spektral følsomhed og linearitet 2. Disse kan være forskellig for donoren og acceptor og vil kræve kalibrering for kvantitativ analyse. Desuden er billeddannelse af acceptor emission påvirket af spektral overlapning af de fluoroforer (excitation af acceptoren ved donor excitationslys og gennemblødning af donor emission til acceptor emissionsspektrene) 2.4, Single-kæden "sonder er internt normaliseret, fordi deres fluoroforer er ækvimolær på nanoskala, mens fluoroforer af" dual-kæden "prober kan eksistere på forskellige støkiometrier hele en celle 25,28 Hvis fluoroforer af." Single-chain " prober er af tilsvarende lysstyrke (funktion af ekstinktionskoefficienten og kvantumudbytte), virkningerne af ikke-lineære detektor følsomhed er lille og kun korrektion for baggrundsfluorescens og det koblede kvanteudbytte / detektor følsomhed er behov 23. således "single-chain" ratiometrisk FRET sonder lettest implementeret i Vidvinklet mikroskopi 24.

Dette papir beskriver en enkel teknik til at udføre FRET billeddannelse af levende celler i 3D-hydrogel kulturer ved hjælp af en konventionel Vidvinklet epifluorescensmikroskop. Det kan let vedtaget af laboratorier allerede udfører FRET eksperimenter i 2D, samt laboratorier interesseret i intercellulær signalering i microtissues. Her demonstrerer vi metoden med FRET billeddannelse baseret måling af cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) niveauer i levende chondrocytter inden fotokrydsbinding (PC-gel, polyethylenglycol-dimethacrylat) og termoresponsiv (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En ratiometrisk FRET probe anvendes baseret på EPAC1 (ICUE1) for at detektere cAMP-niveauer som respons på forskolin, en kemisk agonist til adenylylcyclase, der katalyserer omdannelsen af ​​ATP til cAMP. cAMP er en af ​​de vigtigste sekundære budbringere medierer G-protein-koblet receptor signalering og det aktiverer forskellige faktorer, herunder downstream exchange proteiner direkte aktiveres af cAMP (EPACs). Fluoroforerne sig fra hinanden ved cAMP-binding til EPAC domæne resulterer i et fald i FRET. Beskrevet her er fremstillingen af ​​hydrogelmaterialer, celletransfektion med ICUE1 probe og indlejring af cellerne i 3D hydrogeler. eksperiment procedure 3D FRET og billedet analyse nødvendigat evaluere probe aktivitet per celle er forklaret. Vi diskuterer også de iboende begrænsninger FRET analyse i 2D og 3D ved hjælp Widefield mikroskopi. Teknikken præsenteres her, er en forbedring i forhold til eksisterende 2D metoder, da det gør det muligt analyse i et mere fysiologisk kontekst og kræver mindre billedkorrektion og kalibrering. Stor anvendelighed ligger i det faktum, at mange transparente materialer kan bruges, mens celle- og transfektion præferencer kan opretholdes.

Protocol

1. Materialer Fremstilling

  1. Forbered polyethylenglycoldimethacrylat (PEGDM, 4.000 MW) ved methacrylating polyethylenglycol ifølge fremgangsmåder beskrevet af Lin-Gibson et al. 29. Alternativt kan PEGDM købes.
  2. Syntetisere fotoinitiator, lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), gennem en to-trins proces, hvor første dimethyl phenylphosphonite omsættes med 2,4,6-trimethylbenzoyl choride via en Michaelis-Arbuzov-reaktion og derefter lithiumsaltet skabt ved tilsætning af lithiumbromid i 2-butanon, i overensstemmelse med Majima et al. 30..
    Bemærk: Alternativt kan andre fotoinitiatorer købes men LAP viser bedre biokompatibilitet og tværbindende effektivitet 31.
  3. Funktionalisere de dækglas for at muliggøre binding af hydrogelen til glasset og derved forhindre bevægelse under billedbehandling.
    1. I en kemisk hætte med rette personlige værnemidler, brug3- (trimethoxysilyl) propylmethacrylat ifølge fabrikantens protokol til PC-geler og epoxy silaner (3-glycidoxypropyltrimethoxysilan) for TR-geler 31. Bemærk: Alternativt kan præcoatede slides købes. Bemærk, at dækglasset skal være større end den brønd i PDMS skålen i trin 3.8.

2. Cell Transfektion

  1. I en vævskultur hætte og med sterile teknikker, tø og plade de ønskede celler ved sub-konfluens (50 - 70%), heri bovine chondrocytter i 15.000 celler / cm2 i 6-brønds ikke-behandlede dyrkningsskåle. Bemærk: Enhver relevant celletype kan anvendes, herunder forankringsuafhængig celler.
    1. Tillad celler til at komme sig én dag i en inkubator ved 37 ° C. Før efterfølgende trin, fjern medium, skylles med PBS, og der tilsættes 2 ml phenol- og serum-frit medium per brønd.
  2. Den næste dag for hver brønd, tilsættes 100 pi phenol- og serum-frit medium samt 3pi transfektionsreagens til en autoklaveret reagensglas. At blande, ryst røret let. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Begræns enhver udsættelse for lys.
  3. Tilsæt 1 ug FRET probe DNA og ryst let. Inkuber blandingen ved stuetemperatur og væk fra lys i 30 minutter.
    Bemærk: I dette eksperiment ICUE1 plasmid (høflighed af Dr. Jin Zhang 33) blev anvendt. De fluoroforer i ICUE1 er cyan fluorescerende protein (CFP, donor) og gult fluorescerende protein (YFP, acceptor). Forholdet mellem transfektionsreagens til plasmid DNA vil skulle justeres for optimal transfektion af forskellige celletyper.
  4. Fordel fremstillede blanding (~ 104 pi) dråbevis til hver af de 6 brønde indeholdende celler plus 2 ml phenol- og serum-frit medium. Må ikke pipetteres op og ned. Vend forsigtigt pladen for at blande.
  5. Der inkuberes ved 37 ° C i 48 timer. Bemærk: konfluens inhiberer transfektionseffektivitet og ændrer endogen ekspression af receptorer.

3. Fremstilling afPDMS forme til Hydrogel Støbning og Kultur

  1. For at forberede et stort glas slide at kaste polydimethylsiloxan (PDMS) på, rengøre glasset først med sæbe, skyl med rigeligt vand, og tør efter med isopropanol efterfulgt af luft.
    1. Behandl glas med en silikonebehandling reagens som pr fabrikantens protokol, så at PDMS let kan skrælles af efter hærdning. Skyl resterende reagens ud af overfladen med toluen over en opland container. Skal overfladen lufttørre helt, før eller bruge varme ved 100 ° C for at forkorte ventetiden.
  2. Vælg en hydrogel højde (f.eks 1 mm) og beregne 1,2 gange volumenet af PDMS nødvendig for at dække objektglasset med PDMS af denne tykkelse ved hjælp af dimensionerne af objektglas og hydrogel højde. Bemærk: PDMS ikke krymper.
    1. Bland PDMS kitkomponenter ved et 10: 1 forhold efter vægt i et bæger. Når det er blandet godt, placere bægeret under huset vakuum til afgasse. relieve vakuum, hvis bobler begynder at flyde over beholderen og gentage.
      Bemærk: Andre hydrogel tykkelser kan anvendes, men på bekostning af forøget baggrund og forøget opacitet hvis centrifugering (trin 6.2) ikke anvendes.
  3. Wrap aluminiumfolie omkring basen og sider af glasset for at indeholde PDMS. Hæld forsigtigt den ønskede mængde afgasset PDMS på dette glas omgivet af folie. Mål PDMS højde. Husk, at højden af ​​PDMS vil være den maksimale højde af hydrogelen. Hvis der oprettet nogen bobler, når der hældes, afgasses igen eller pop dem med en spatel eller nål.
  4. Placer de uhærdede PDMS på en plan overflade i en ovn ved 100 ° C i 2 timer, eller lad ved stuetemperatur i 24 timer.
  5. Fjern forsigtigt PDMS fra overfladen, når den er hærdet. Punch ud den ønskede form (f.eks cylindrisk punch af 3 mm) til hydrogelerne.
    Bemærk: fototværbinding vil give lidt smallere PC-gel cylindre end formen diameter på grundtil quenching af reaktionen ved molekylært oxygen i PDMS.
  6. Sterilisere udstansede PDMS. For kort sigt eksperimenter, nedsænkes PDMS i 70% ethanol i 1 time.
  7. Saml formen ved at montere bunden af ​​de steriliserede PDMS med en steril dækglas af tykkelse tilpasset mikroskopobjektivet korrektion. Braklægning til brug i trin 6.
  8. Fabrikere et større PDMS skål ved anvendelse af fremgangsmåderne ovenfor (med et godt bredere og højere end hydrogelen) til at indeholde hydrogelen og medium. Rumme en medium volumen mindst 10x mere end hydrogelen at nedsænke hydrogelen og for at minimere fortynding af analyt.

4. Fremstilling af Hydrogel precursor-opløsningerne

  1. I en vævskultur hætte og under anvendelse af sterile teknikker, forberede hydrogel precursor-opløsningerne hensigtsmæssigt for studiet umiddelbart før tilsætning celler. Forbered PC-gel fra polymerpræcursoren som følger.
    1. Bland PEGDM pulver i phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,2) ved 10% (vægt / volumen).
    2. Tilsæt fotoinitiator (f.eks LAP) ved en slutkoncentration på 0,005 - 0,01% (vægt / volumen) og blandes ved pipettering. Dæk opløsningen med aluminiumsfolie eller skjold fra lys som LAP er lysfølsomt.
      Bemærk: Her TR-gel reducerede vækstfaktor ekstracellulære matrix anvendes som leveret af producenten.

5. cellesuspension i Hydrogel Solutions

  1. I en vævskultur hætte og under anvendelse af sterile teknikker, aspireres mediet fra brøndene.
  2. Tilføj PBS til brøndene og derefter fjerne til grundigt skylles vedhæftede cellemonolag.
  3. Dissociere cellerne fra kulturen underlaget med 2 til 3 ml pr 25 cm 2 i celledissocieringsopløsningen. Rock blidt, derefter inkuberet ved 37 ° C i 10 - 20 minutter eller indtil dissocieret. Fast tryk skål, hvis nødvendigt for at fjerne celler.
    Bemærk: Alternative celle dissociation løsninger er tilgængelige med valg begrænset til dem, der ikke iIRKNING signalvejen under analyse ved spaltning receptorer af interesse.
  4. Efter at cellerne er fritliggende, tilsættes 2 ml phenol- og serum-frit medium, suspendere cellerne, og tælle cellerne med et hæmocytometer. Bemærk: Kemisk definerede serumfrit medium (f.eks suppleret med insulin, transferrin og selen), kan også anvendes.
  5. Alikvot det ønskede antal celler baseret på celletypen i sterile hætteglas og pellet (f.eks 2,0 x 10 6 celler per hætteglas).
  6. Fjern supernatanten, tilsættes den ønskede mængde hydrogel forløber og suspendere cellerne ved pipettering. Brug et volumen på prækursor, som vil give 2 x 10 5 celler / cm2 i xy planet når visualisere z-aksen af hydrogelen som kollapsede (f.eks 1,0 ml pr hætteglas for en 1 mm tyk hydrogel indeholdende 2 x 10 6 celler / ml). Pas på ikke at producere bobler.
    1. Hurtigt gå videre til det næste trin for at begrænse negative virkninger på cellernes levedygtighed 34 </ Sup>.

6. Hydrogel Forberedelse

  1. I en vævskultur hætte og under anvendelse af sterile teknikker, tilsæt celleholdige hydrogel forløber for støbeformene fremstillet i trin 3 (f.eks, 7,1 pi per 3 mm i diameter x 1 mm høj mug). Skabe ekstra hydrogel, efter samme fremgangsmåder beskrevet, der skal bruges til mikroskop imaging system kalibrering og sonde kalibrering (hvis den iboende probe effektivitet er ukendt).
  2. Centrifuger den fremstillede celle-hydrogel precursor før gelering / tværbinding at optimere billeddannelse ved at begrænse celler til en enkelt fokalplan og minimering af plane signal (figur 1). Juster centrifugeringstid og kraft til celletypen og viskositeten af ​​forstadiet (400 g i 4 minutter).
  3. Gel eller tværbinde opløsning
    1. Til PC-gel hydrogel, bestråle celleholdige precursor med en UV-A lyskilde (λ = 365 nm) i en tid eksponering lig med3,2 J / cm2 pr millimeter tykkelse til photocrosslink.
      Bemærk: Brug en 1 mm minimumstykkelse i beregningen. Engagementer skulle falde i 1-5 min interval. Brug den minimale eksponeringstid. Undgå over-bestråle celler som dette vil falde levedygtighed og blege donor fælles fiskeripolitik. Imidlertid er eksponeringstider mindre end 60 s anbefales ikke, da høj intensitet bestråling fører til radikal selv-quenching og dårlig cellelevedygtighed.
    2. For TR-gel hydrogel, placere fyldte form i en petriskål og flytte til en inkubator til termisk gelat. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Efter geldannende eller krydsbinding af hydrogel, fjerne PDMS hydrogel støbeform og erstatte det med den forberedte større PDMS fad (fra trin 3.5). Tryk på PDMS ned på glasset med en steril spatel til at overholde den.
    1. Placer dette PDMS skål med dækglas i en steril beholder, såsom en petriskål. Tilføj phenol-free serum-frit medium eller kemisk defineret migDIUM (serumfrit medium suppleret med insulin, transferrin og selen (trin 5.4)) til brønden oprettet med PDMS skålen og dækglas for at holde hydrogelen nedsænket. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
      Bemærk: Hvis du bruger en specialiseret fad med et dækglas, og derefter placere dækglasset i det, og på samme måde tilføje medium.
    2. Alternativt udføre dette trin dagen før FRET billedbehandling for at tillade sonderne at inddrive så ioniserende stråling bølgelængder overlapper den fælles fiskeripolitik donor excitation spektrum.

7. 3D FRET Imaging

  1. Fjern PDMS skål med hydrogelen fra petriskålen, fremstillet i trin 6.4, og fastgør den på en indstillelig prøveholder XY mikroskopbordet (figur 2). Placer præparatholderen på mikroskopet scenen. Påfør olie til målet, hvis det kræves. Brug en målsætning om mindst 40X og af høj numerisk apertur (NA) (dvs. 1,3 NA) til at fange den relativt svage fluorophorene emissioner.
  2. Konfigurer synsfelter (FOVs) for erhvervelse billede: Vælg celler til billeddannelse ved hjælp transmitteret lys billeddannelse og kontrollere transfektion med fluorescens billeddannelse. Vælge mindst 15 forskellige celler.
    1. Vælg celler, der hverken er for lyse eller for dim (som ellers kunne føre til sonde over-mætning eller lav følsomhed), og med FRET forholdet mellem 0,0 og 1,0 (som ellers er beskadigede eller henfald af den binære sonde). Derefter slukke lyset for at begrænse eksponeringen.
    2. Vælg FOVs tæt på centrum af hydrogelen og med cellerne af interesse inden for relativt flade feltbelysning (se figur 3B og Trin 9.2 nedenfor).
  3. Konfigurere kameraindstillingerne for FRET billedkanaler. Vælg mellem et par celler nær centrum af FOV at optimere de "optiske konfigurationer" (dvs.., Eksponering og forstærkning pr billede kanal).
    Bemærk: Nomenklaturen nedenfor varierer depending af den software der anvendes til at betjene mikroskop og kamera. Mikroskopet software, NIS-Elements, anvendes her til billedoptagelse og analyse.
    1. For FRET analyse af enkelte kæde sonder, vælge to billedfiler kanaler pr FOV: Standset emission (QE), som er donor emission under donor excitation og acceptor emission under acceptor excitation (AEM).
      Bemærk: For ICUE1 CFP-YFP sonde, et fælles fiskeripolitik excitation og emission filter par til QE (418-442 ex, 458-482 em) og en YFP excitation og emission par til AEM (490-510 ex, 520-550 em) er brugt.
    2. Indstil eksponeringen for QE og AEM til at erhverve den maksimale signal intensitet uden mætning (og hvis du bruger en CCD, med den minimale mulige gevinst) for at minimere baggrundsstøj. Hold de optiske konfigurationer den samme for begge fluorophorer og gennem hele forsøget, samt blandt eksperimentelle grupper for at undgå forspænding af resultater (dvs. excitation magt, iris størrelse, eksponering og kamera gain) (Figure 3A).
    3. Erhverve yderligere billedkanaler at give mulighed for flere analysemuligheder efter erhvervelsen (f.eks korrigeret sensibiliseret emission (CSE) imaging (se Diskussion)). For ICUE1 CFP-YFP sonde, erhverve magnetisering (Ex) og emission (Em) kanaler af Ex donor - Em donor (QE, vælg FFP-FFP i mikroskopet software), Ex donor - Em acceptor (SE, skal du vælge CFP- YFP), Ex acceptor - Em acceptor (AEM, vælg YFP-YFP), og Ex acceptor - Em donor (YFP-CFP) konfigurationer (se figur 3A).
  4. Konfigurer capture sats for time-lapse billede erhvervelse.
    1. Sænk capture sats, hvis begrænset af hardwaren. For kort sigt assays (fx 30-60 min), betegner omkring 12 opkøb i minuttet for hver FOV (5 sek samplingfrekvens) at fange signalering kinetik. Brug den mindste samplingfrekvens nødvendig for at undgå signideligt fotoblegning sonden.
    2. Indstil erhvervelse sats ved at skrive hyppigheden af ​​fangst i mikroskopet software. For langsigtede assays (f.eks., 24 timer), begynder med det høje optagelseshastighed at fange den første puls respons og derefter skifte til en lav optagelseshastighed, fx hver 5 til 10 minutter.
  5. Vælg "Kør nu" i mikroskop software til at indlede opkøb og capture billede billeder i 5 min til at etablere et grundlag for sonde reaktion på de udpegede FOVs.
  6. Efter 5 min af billedoptagelsen, pipette i den ønskede agonist eller antagonist analyt (fx forskolin ved 100 nM), blandes ved pipettering, og fortsætte billeddannelse.

8. FRET kalibrering

  1. System Kalibrering: Brug ekstra kalibrering hydrogel, fremstillet som beskrevet i trin 6, til at erhverve AEM billeder af mindst 6 repræsentative celler med de samme FOV kriterier, optiske konfigurationer, og kamera sætlinger anvendt til FRET billeddannelse ovenfor (trin 7.1, 7.2 og 7.3).
    Bemærk: Der er behov for Kvantificering af kvante udbytte og spektral følsomhed (QS) for den kombinerede sonde og mikroskop imaging system for "absolut" FRET analyse, men ikke for "relativ" FRET.
    1. Photobleach acceptorfluoroforen ved at vælge en 5 min lang udsættelse for excitationslyset med fuld intensitet (excitation på AEM kanal). Brug en smal åbning at blege kun cellerne af interesse. Kontroller, at AEM signalet er mindst 10% lavere end det oprindelige signal ved at sammenligne signalintensiteten histogram ( "LUT" vindue) før og efter fotoblegning. Fortsæt fotoblegning hvis signal tab er mindre end 90%.
      Bemærk: Sørg for donorfluoroforen ikke bleget under denne procedure ved hjælp AEM excitation filtre, der ikke overlapper med donor excitation spektrum.
    2. Anskaf donor emission under donor excitation med den nu bleget acceptor fluorophor (Dem) osing samme optiske konfiguration som for QE i trin 7.3.
    3. Beregn QS per pixel som Dem divideret med AEM efter baggrund korrektion, som i afsnit 9 nedenfor. QS = Dem / AEM
    4. Beregn den gennemsnitlige QS blandt cellerne fra de cellulære gennemsnit.
  2. Estimere iboende FRET effektiviteten af ​​proben (Ei) under anvendelse af kalibreringsprøve. Fremkald maksimal FRET af sonden og beregne Ei = 1 - QE / (AEM x QS) som i afsnit 9 nedenfor. Alternativt bruge Ei = CSE / AEM eller Ei beregnes ved hjælp af en konventionel endpoint assay for FRET effektivitet med Ei = 1 - (QE / DEM).
    Bemærk: Ei er nødvendig for at kvantificere den absolutte fraktion af aktiverede prober (FAP, dvs., fraktion af prober bindende analyt), men ikke nødvendigt for "relative" FRET analyse.
    1. Mætte probe respons ved at stimulere kulturen med en agonist af analyt produktion / aktivering for prober, der øges i FRET ved interaktion med analyt.
    2. Hæmmer sonde interaction med analytten under anvendelse af en antagonist af signalering for sonder Dette fald i FRET efter binding analytten. Bemærk: I tilfælde af ICUE1 probe, undertrykke cAMP-niveauer med en adenylcyclase inhibitorer, såsom 2 ', 5'-dideoxyadenosin (specifik) eller 3-isobutyl-methyl-xanthin (ikke-specifik).

9. FRET Ratio Beregning

  1. Tegn og udpege en region af interesse (ROI) pr FOV nær cellerne for at definere baggrundsniveauet (figur 3B) i hver FOV over tid, men begrænser ROI til området med relativt homogen belysning over midten af billedet (figur 4A ). Se diskussionen for en forklaring af korrektion baggrund indstillinger.
    1. Med mikroskop software: Vælg pilen på "Background ROI Ikon" og vælg "Tegn Elliptical Background ROI" (andre former vil arbejde). Sørg for, at "Keep Opdatering Baggrund Offset" er valgt. Aktiver viefløj af baggrunden ROI ved at klikke på ikonet Background investeringsafkast. Alternativt bruge "ROI Ikon" og egenskaberne ROI indstillet som "Anvend som baggrund ROI" og "ROI'er er forskellige i de enkelte multipoint".
    2. Med ImageJ: Brug værktøjslinjen til at vælge den cirkulære tegneværktøj. Tilsæt derefter form til ROI leder via menuen "Analyze → Værktøjer → ROI Manager". Sæt en anden farve til baggrunden ROI i ROI Manager, hvis det ønskes.
    3. For hvert FOV og billede kanal (f.eks QE og AEM), trække den gennemsnitlige værdi i baggrunden ROI pr time-point for at oprette et korrigeret billede pr kanal, f.eks SQE t, p = QE t, p - BQE t, p hvor t er erhvervelsen tid, p er den FOV (dvs. xy position), og BQE og bAem er de skalære værdier af signalet i baggrunden ROI. Brug billedet aritmetiske funktioner tilgængelige i softwaren.
      1. Wed mikroskop software, bruge "ROI Background Ikon" og vælg "Fratræk Background Brug ROI". I pop-up vindue, skal du vælge "Hver Image" under "Fratræk baggrund ROI på", og vælg "Alle Frames" under "Anvend på".
        Bemærk: En baggrund ROI skal defineres i hvert FOV for denne funktion til at fungere korrekt (f.eks funktionen ikke korrekt trække baggrunde for FOV med baggrund ROI'er hvis nogle FOV har udefinerede baggrund ROI'er.).
      2. Med ImageJ, bruge "BG Subtraktion fra ROI" makro skrevet af Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Gem den korrigerede tidsserier af billeder ved at vælge "Gem som" for de følgende analyse trin.
  2. Definer en ROI omkring cellen under anvendelse af en binær maske for hver celle under analyse i hver FOV (figur 4B). Brug AEM kanal til tærsklen billedet pr FOV i starten of eksperimentet, identificere celle grænser, og defineret ROI'er. Gem ROI'er.
    1. Med mikroskop software: For hver ramme (dvs. FOV), først bruge menuen "Binary → Definer Threshold" og vælg "gælder for aktuelle ramme". Juster nedre tærskelværdi for at vælge cellerne. Brug derefter "Binary → Luk" funktion til at udfylde huller i den binære maske, hvis nødvendigt. Næste bruge ikonet ROI for at vælge "Copy Binary til ROI"; den binære lag slettes automatisk.
      1. Append ROI'er for efterfølgende rammer til den eksisterende pulje af ROI'er. Slet nogen uægte ROI'er. Næste "højreklikke" på ROI'er og sørge for at deres egenskaber er "Anvend som standard ROI" og "ROI'er er forskellige i de enkelte multipoint".
      2. Med ImageJ: For hver FOV, først bruge menuen "Image → Juster → Threshold". Brug derefter "Analyze → Analyser Partikler" med Vis konturer og Føj til manager valgt. Brug"Binary → Luk" for at udfylde "huller" i den binære maske, hvis nødvendigt. Slet falsk ROIs. Gratis plugins er tilgængelige til at automatisere denne proces.
  3. Beregn QE baseret FRET ratio på hver pixel, SQE / SAEM for relativ analyse (Se trin 10) og E QE = SQE / (QS x SAEM) for absolutte analyse (se trin 10) med QS opnået i trin 8.1. Brug kommatalsdivisioner af billederne. Se afsnittet diskussion for en forklaring af ratio afledning.
    1. Med mikroskop software: Brug menuen "Billede → Billede Operations" og vælg "Floating Point".
    2. Med ImageJ: Brug enten "Process → Billede Lommeregner" funktionen eller "Calculator_Plus.java" plugin. Bemærk: Alternativt til makroen "pH_ratioMacro" .txt "kan tilpasses beregne FRET nøgletal beskæftiger korrektionen baggrund makro beskrevet ovenfor, og er tilgængelig på.
  4. Eksporter gennemsnitlige forhold per celle (dvs. pr ROI) ind i et regneark og graftegning software.
    1. Med mikroskop software: Brug enten eksport knappen ND i "ROI Statistics" analyse kontrol eller knappen "regneark Export" i "Time Analysis" analyse kontrol.
    2. Med ImageJ: Vælg først menuen "Analyze → Indstil Målinger", og sørg for at "Mean værdi" og "Standard afvigelse" er valgt. Brug derefter ROI Manager og vælge knappen "Measure". Gem den genererede resultater vinduet.

10. FRET Ratio Analysis

  1. Beregn den gennemsnitlige cellulære FRET forholdet over tid fra de gennemsnitlige nøgletal per celle (eksporteret i trin 9.4). Overvej baseline FRET nøgletal (forholdet før administration analysanden) i denne beregning.
    Bemærk: Regneark og graftegning software bruges her for at plotte baseline-subtrhandlet gennemsnitlige FRET forhold og deres standardfejl på middelværdien (SEM) under anvendelse af en lineær regression på grundlinjen som i trin 10.1.2 og 10.1.3 nedenfor (figur 5 og 6).
    1. Relativ Analyse (omfanget af respons): Normalisér hver kurve til en fælles reference prøve (fx ubehandlet prøve.).
    2. Absolute Analysis (tidsforløbet af respons): Skift kurverne til et fælles startpunkt ved at normalisere hver kurve med sin hidtidige FRET ratio.
      1. I regnearket og graftegning software, interleave data (kolonner af gennemsnitlige nøgletal per celle) med nye kolonner, således at hver af de oprindelige kolonne er parret med en ny kolonne, der kun indeholder forholdet data for basisperioden (nøgletal før analyt tilføjet). Vælg "Indsæt kolonne" for at indsætte en tom kolonne efter hver kolonne med data. kopiere Så de grundlæggende data i de parrede tomme kolonner.
      2. I regnearket og graftegning software, skal du vælge "Indsæt → Ny Analyse → Transform Fjern baseline ", og derefter indstille" Selected kolonnen "til" hver anden ", vælg" antage basislinien er lineær ", og vælg" Difference "under" Beregning ".
      3. Beregn den gennemsnitlige cellulære ratio og beskrivende statistik. I regnearket og graftegning software, skal du vælge "Indsæt → Ny Analyse → XY Analyser → række midler med SD- eller SEM" og vælg derefter "Row betyder med SEM" i pop-up vindue.

Representative Results

Alle hydrogelmaterialer forstadier, celler og støbeforme blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Cellen lastet precursor-opløsningerne blev støbt i PDMS forme og derefter centrifugeret før gelering / fototværbinding at immobilisere celler nær dækglasset og lette FRET billeddannelse analyse (figur 1). Hydrogelerne med vedhæftede dækglas blev anbragt inden forberedte PDMS billeddannende brønde til mikroskopisk billeddannelse (figur 2). De optiske konfigurationer og billedoptagelse parametre blev derefter indstillet som vist i figur 3A. Capture af alle fire FRET relateret billede kanaler for FFP-YFP fluoroforen par demonstreres (se under "Optisk Conf." I figur 3), som er nødvendig for ikke-binære sonder. Men i dette arbejde kræves kun to billeder for enkelt kæde binære ICUE1 sonde, QE = "FFP FFP" og AEM = "YFP YFP" (excitation emission). Multiple FOVs (xy positions) blev udvalgt, hvor flere celler boede i den homogene belysning område (figur 3B). Efter tid bortfalder erhvervelse, blev signalet data for sonden eksporteres. ROI'er til baggrund korrektion af kanalsignaler og for celleanalyse blev betegnet under anvendelse tærsklingsbehandlede AEM billeder fra starten af eksperimenterne (figur 4). Celler blev udvalgt blandt cellen puljen som dem, der udtrykker tilstrækkelig (ikke for dim), men ikke for høj (overdrevent lyst) probe (figur 4B). QE og SE FRET nøgletal per pixel på hver købet blev beregnet ved hjælp af floating-point opdeling af baggrunden trækkes billedkanaler. Det gennemsnitlige FRET forholdet per celle (dvs. pr ROI) blev beregnet, normaliseret til baseline signal forud for stimulation (dvs. en regression på basislinien trækkes fra alle tidspunkter), og plottet med fejlsøjler som standard fejl af mean (SEM). Både QE og CSE baseret FRET nøgletal detect den øgede cAMP aktivitet i chondrocytter under forskolin-stimulering (100 nM, Figur 5). QE FRET forholdet var mere følsom over for baggrund korrektion end CSE FRET-forholdet, fordi QE signalet var lavere på grund af det lave basale niveau af cAMP aktivitet i chondrocytter indlejret i hydrogelerne. Begge hydrogel typer (TR-gel og PC-gel) viste en stigning i FRET-forhold over tid (figur 6), hvilket indikerer en forøget cAMP signalering respons på tilsætningen af forskolin. Som angivet af QE FRET ratio, chondrocytter i PC-gel hydrogeler udviser en større ændring i cAMP (vist) og en højere basalt niveau af cAMP (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist i baseline fratrukket figur).

figur 1
Figur 1: Cell Distribution i fotokrydsbundet Hydrogel (PC-gel) A: Cellen lastet hydrogel precursor blev centrifugeret for at maksimere antallet af celler ved en fokalplan nær dækglasset. B: Dette forøger antallet af celler i FOV og minimerer baggrundssignal fra ud af plane celler. (Scale bar = 200 um) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Hydrogel i PDMS Dish
Hydrogelen blev anbragt indvendigt i et tall PDMS brønd (10x volumen af ​​hydrogel) med et dækglas base for mikroskopisk billeddannelse og analyt stimulation. De PC-gel hydrogeler er gennemsigtige og bundet til dækglasset, så de forbliver på plads i hele analysen. PDMS godt kan gøres større for at indeholde 10x mere medium end hydrogel volumen under anvendelse af en bredere biopsitang foruden påhicker PDMS ark. (Skala bar = 2 mm) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Køb konfiguration for FRET Imaging
A: Købet blev konfigureret til billedoptagelse hver 7 sek på flere steder. For QE FRET-forholdet beregning, er der behov for kun to billedkanaler for den anvendte her ICUE1 sonde (binær enkelt kæde probe), QE = "FFP FFP" og AEM = "YFP YFP" (excitation emission) under "Optisk Conf." kolonne i fanen λ af mikroskopet software. B: FOVs ( "XY" positioner) blev udvalgt, hvor flere celler boede inden for det homogene belysning område. Plottet under billedet viser belysningen intensitet langs blå pile linjeder krydser gennem midten af den FOV. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Valg af ROI'er for FRET Imaging Analysis
A: En region af interesse (ROI) fri af celler blev udvalgt til at korrigere for baggrundssignal på hver kanal. Et billede af en cellefri hydrogel kan i stedet bruges til baggrund subtraktion hvis celletæthed eller migration er høj, eller hvis en skygge maske ikke bruges, når cellerne ikke ligger inden for et homogent feltbelysning. B: Cellen ROI'er blev udvalgt under anvendelse billede tærskling og binær maskering af AEM kanal. Valg af en ROI større end cellerne vil påvirke beregningen af ​​den gennemsnitlige FRET forholdet per celle på grund af inddragelse af ekstracellulære nøgletal genereret fra baggrunden nOise. Beregning af den cellulære FRET forholdet ved hjælp af gennemsnittet for hver kanal per celle anbefales ikke, da dette undervurderer forholdet. (Scale bar = 50 um) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Sammenligning af FRET nøgletal i termoresponsiv Hydrogel (TR-gel)
Både QE og SE baserede FRET nøgletal detektere den forøgede cAMP aktivitet i chondrocytter under forskolin-stimulering. Forskolin er en adenylcyclase agonist, der inducerer cAMP-produktion. FRET falder, når ICUE1 proben binder cAMP, og dermed QE FRET ratio (E QE = SQE / (SAEM x QS)) stiger. Omvendt falder SE FRET-forholdet og er derfor afbildet som E SE = 1 - CSE / SAEM. I hydrogel indlejret chondrocytter, QE FRET-forholdet er mere følsomme over for baggrund korrektion end SE FRET-forholdet, fordi QE signal er lav på grund af den lave basale cAMP-aktivitet. Fejl barer = SEM, n = 25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Sammenligning af FRET Ratio i forskellige Hydrogeler
Chondrocytterne i begge hydrogel typer reagerede på forskolin stimulering med en stigning i cAMP-aktivitet som demonstreret ved den øgede QE FRET-forhold over tid. Hydrogelen typen påvirker cellulære respons gennem flere effekter, herunder forskelle i permeabilitet for forskolin og i basal cellulær cAMP-aktivitet (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist). Fejllinjer = SEM, n for TR-gel= 25, n til PC-gel = 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette arbejde viser, hvordan FRET billeddannelse kan bruges til at analysere cellulær signalering i 3D hydrogeler. Mens tidligere undersøgelser har vist FRET billeddannelse af celler podet på hydrogel substrater 35-37, af ekstracellulære interaktioner med hydrogeler 38, og af molekyler fanget i hydrogeler 39-41, dette er den første offentliggørelse at beskrive FRET billeddannelse baseret intracellulær analyse af celler indlejret i 3D hydrogeler. Arbejdet løser flere problemer med gennemførelsen ved oversættelse FRET billeddannelse fra 2D til 3D. Først er brug for store numeriske apertur mål for FRET billeddannelse at samle tilstrækkelig emission signal, men de begrænser dybdeskarphed. Cellerne her får lov til let afvikle via centrifugering for at øge antallet af celler i en fokalplan nær glasset for at kompensere for dette. For det andet kan 3D hydrogel scaffolds glide hen over synsfeltet under billedbehandling hvilket komplicerer analysen. Hydrogelerne her er bundet til coverslip så de ligger fast i hele forsøget. Tredje, udvælgelse af passende hydrogel præparater til 3D FRET er afgørende, fordi hydrogeler kan hindre visualisering af cellerne. Her transparente hydrogeler af PC-gel og TR-gel anvendes. Imidlertid kan samle cellerne med centrifugering til et fokalplan nær dækglasset anvendes til at afbilde celler i hydrogeler med højere diffraction.The valg af hydrogel afhænger mikromiljøet betingelser, der skal simuleres som kan findes i en bedømmelse på hydrogeler 42 . For det fjerde er en alternativ beregning ansat her for FRET forholdet mellem enkelt kæde ICUE1 sonde (dvs. E QE = QE / cAem) for at minimere antallet af billedkanaler kræves til analyse og dermed minimere fotoblegning. Det gennemsnitlige FRET forholdet per celle er beregnet som gennemsnittet af de nøgletal per pixel i en celle for at minimere undervurdering af den faktiske FRET forholdet. Endelig en lineær ratiometrisk analyse og midlerat beregne den aktiverede del af enkeltkædede binære prober er beskrevet.

Der er flere kritiske aspekter af udførelsen vellykkede FRET eksperimenter ved hjælp vidvinklede mikroskopi. Med hensyn til hardware, skal kameraet være følsomme nok til at løse små signal ændringer, efterlader nyere videnskabelige CMOS kameraer og elektron multiplicere CCD'er passer bedre end konventionelle CCD'er. For bedst at analysere den rumlige fordeling af FRET-forholdet, skal kameraet på minimum besidder to gange den rumlige opløsning af punktspredningsfunktionen af ​​formålet (Nyquist kriteriet). Dette gør dual-view-systemer mindre egnet til opgaven. Mere afgørende er at vælge en passende eksponering og image erhvervelse sats for den givne FRET parret for at minimere fotoblegning af fluoroforer. En nedsat erhvervelse sats anbefales som eksperiment varighed øges. Anvendelsen af ​​filterhurtigskifterens hjul øger erhvervelse og antallet af FOVs til analyse mens undgåing registreringskravene billede problemer med dual-view og tårn filter kuber. Den inhomogene belysning felt komplicerer korrektion for baggrund fluorescens, der opstår fra prøve autofluorescens og kamera system støj. Nogle hydrogeler, især sådanne indeholdende kollagenproteiner er yderst autofluorescerende 43,44. FRET nøgletal er undervurderet uden baggrund korrektion. Her anvender vi en enkel baggrund korrektion metode, der bygger på den relativt flade feltbelysning som ofte kan konfigureres med epi-fluorescens belysning over midten af billedet (figur 3B, trin 7.2). Denne fremgangsmåde begrænser derfor celler af interesse for dem inden dette feltbelysning. Baggrunden korrektion beskrevet her tager ikke højde for cellulær autofluorescens i bølgelængder læses for den binære probe. I et sådant tilfælde bør umærkede celler (ingen sonde transfektion) afbildes på samme vilkår og baggrunden trækkes. En mix af mærkede og umærkede celler kan anvendes, og de umærkede celler udvalgt til baggrunden ROI. Alternative metoder, som tilvejebringer celle analyse over hele billedfeltet omfatter brug af en skygge maske, flere baggrund ROIs eller identiske prøver uden celler og en protokol er til rådighed efter anmodning.

Specifikt til 3D FRET billeddannelse, probe reaktion er meget følsom over hydrogelen permeabilitet for analysanden (figur 6). de samme hydrogel regioner er derfor sammenlignes på tværs eksperimentelle behandlinger, fortrinsvis ved et punkt af geometri symmetri såsom nær stilladset center som anvendt her. Alternativt mikrofluide kamre / bioreaktorer kan anvendes til hurtigt og ensartet perfuse hydrogelen med analytopløsningen 45. muligvis ikke fundet et FRET-signal (signal til støj-forholdet er for lav), når hydrogelens autofluorescens er for høj; bør der anvendes en tyndere hydrogel eller forskellige probe (forskellige fluoroforer).Med hensyn til 3D FRET billeddannelse i fotokrydsbundet hydrogeler, anbefales brug af minimal bestråling eksponering og bølgelængder uden for excitation spektre af sonden fluoroforer. LAP kan anvendes med en synlig lyskilde ved 405 nm til yderligere at minimere potentiel celleskade 31,46. hjælp LAP med 365 nm bestråling anbefales dog, da dette minimerer sonde blegning. 365 nm ligger for enden af ​​den fælles fiskeripolitik donor excitation spektrum, mens 405 nm ligger på toppen excitation. Alternativt kan proben ekspression lov til at komme i en dag. Anvendelse af binære sonder minimerer spørgsmål af følsomhed over for forskelle i ekspressionsniveauerne og i molekylær diffusion af donor- og acceptor fluoroforer. Ikke-binære prober kan anvendes, men med SE stedet for QE billeddannelse og yderligere korrektion for spektral gennemblødning af excitations- og emissionsspektre (se nedenfor). Desuden den lave kommercielle tilgængelighed og kompleksiteten i at designe FRET sonderkan være en hindring. Den mest kritiske faktor for succesfulde eksperimenter forbliver ordentlig korrektion og analyse af fluorescens-signaler.

En alternativ beregning af FRET forholdet udnyttes til flere andre grunde udover minimering af fotoblegning. For binære single-kæde sonder, den almindeligt rapporterede forholdet er acceptor emission under donor excitation (sensibiliserede emission, SE) til donor emission under donor excitation (slukket emission, QE), dvs FRET ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE er ikke-lineær i forhold til ændringer i FRET effektivitet 21,22,47. Nemlig forholdet har en eksponentielt ikke-lineær sammenhæng til iboende FRET effektivitet af proben (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM udgivet værk. (2015)), idet forholdet mest lineære for Ei mindre end ca. 15%. SE / QE vil også undervurdere den del af aktiverede prober (FAP, dvs, fraktion af sonder bindende analyt). therefore, analyse af SE / QE kræver en besværlig ligevægt dosis respons studie og kurve pasform. Heldigvis forholdene mellem SE eller QE til acceptor emission under acceptor excitation (AEM) er lineær med hensyn til Ei og FAP, dvs FRET nøgletal SE / AEM og QE / AEM. SE / AEM bruges ofte til binære sonder og kræver kun endepunkt kalibrering (uden sonde aktivitet og fuld sonde aktivitet), men basal cellulær signalering gør det vanskeligt. For at eliminere behovet for endpoint kalibrering, kan SE korrigeres (CSE) for spektral overlapning af donor- og acceptor excitations- og emissions- spektre (spektral gennemblødning) og for kvanteudbytte og spektral følsomhed (QS) af de kombinerede probe fluoroforer og mikroskop billeddannelsessystem. Den korrigerede SE FRET forhold baseret på CSE definerer den observerede FRET effektiviteten af sonderne inden for hver pixel i et billede, dvs E SE = CSE / AEM. Kommerciel og fri software er tilgængelig til at korrigere SE for disse effekter oglæseren henvises til arbejdet i Chen og Periasamy 2006 for en detaljeret forklaring af de metoder, 50. Men beregning E SE kræver indfangning af tre billedfiler kanaler pr time-point (SE, QE, AEM),. Derfor, i dette arbejde beskæftiger vi også en alternativ FRET forholdet E QE = 1 - QE / cAem, som kræver indfangning af kun to billedkanaler (QE og AEM). Beregning E QE fra disse kanaler kræver kun korrigere AEM for QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM let estimeres ved hjælp af to billeder fra den ene kalibrering prøve, hvor Dem er donor emission under donor excitation med acceptor bleget. FAP på ethvert øjeblik kan beregnes ved at sammenligne E SE eller E QE til Ei af sonden.

I sidste ende bør FRET-forholdet valg (E SE = CSE / AEM vs E QE = QE / cAem) træffes på baggrund af sonden type og kanalerne med bedst signal. både enpproaches omfatter baggrundsstøj korrektion af billeder pr ramme som beskrevet ovenfor til grund for ændringer i autofluorescens over tid. De antager ingen overlapning af AEM excitation lys ind i Dem ekscitationsspektret, som det ofte er tilfældet som følge af sonde design og mikroskop filter konfiguration. Single-kæde sonder kan bruge enten og udvælgelse er baseret på bedste sonde signal (lysstyrke) til kamera støj og til baggrunden signal på SE og QE kanaler. For ICUE1 sonde og eksperimentelle her anvendte betingelser (celle- og hydrogel typer), SE har et stærkere signal end QE. Dual-kæde-prober kræver brug af E SE grund af ikke-ækvimolær fordeling af donor- og acceptor-fluoroforer. For sonder, der sænker i FRET efter binding analyt såsom ICUE1, ærgre effektivitet kan "omvendt" til at præsentere en positiv signalering ændring ved binding analysanden, som vi gør her, med E SE = 1 - CSE / AEM eller E QE = QE / (AEM x QS).

Analyse af the FAP er følsom over for korrekt korrektion af FRET nøgletal samt til skøn over Ei. Det kan vurderes med samme kalibrering anvendte prøve til QS og en konventionel endpoint FRET effektivitet assay som Ei = 1- (QE / DEM) (QE billede efterfulgt af acceptor fotoblegning og et Dem billede) 28, men man skal være opmærksom på at minimere utilsigtet blegning af donoren. Vi beskriver en modificeret version, hvor estimatet af Dem baseret på AEM korrigeret for QS substitueres, dvs Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / AEM anvendes. Estimering af Ei i levende celler kræver, at alle sonder blive drevet til fuld FRET. Dette er vanskeligt at opnå i praksis for sonder, såsom ICUE1 Dette fald i FRET efter binding analytten. En in vitro baseret beregning af Ei hjælp cellelysater og oprenset analyt er bedst, men uden for rammerne af dette arbejde. Her anbefaler vi at bruge 2 ', 5'-dideoxyadenosin at mindske cAMP i cellerne. Dog kan en relativ FAP be beregnet med en Ei estimat stammer fra baseline niveau af signalering. Af disse årsager undersøgelser rapporterer oftest FRET ratio (som gjort her) eller en slægtning FAP baseret på endpoint kalibrering, hvor signalering baseline før tilsætning agonist er den nedre grænse og signalet efter tilsætning af en anden agonist, der mætter signalering er den øvre bundet. Forskolin bruges ofte som en kontrol agonist til at mætte cAMP signal. Alternativt kan et cAMP-analog anvendes, såsom 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cyklisk monophosphat. Positive kontroller bruges ved afslutningen af ​​undersøgelser for at identificere potentielle ændringer i signalvejen blandt eksperimentelle behandlinger anbefales.

Beregning af den gennemsnitlige signalering respons per celle kræver overvejelse af flere faktorer. Først bør det gennemsnitlige FRET-forholdet beregnes som gennemsnittet af forholdene for hver pixel inden for en celle, dvs. (Σ (QE/cAem)) / (antal pixel), i stedet for ratio af gennemsnittet QE og AEM i en celle, dvs. (ΣQE) / (ΣcAem). Om sidstnævnte ikke kræver omhyggelig maskering som baggrundsstøjen er lav, er det alvorligt undervurderer den sande gennemsnitlige FRET ratio. Imidlertid pixelforhold kræver floating-point beregning og omhyggelig binær maskering af celleområdet at definere ROI'er og undgå indbefatningen af ​​uægte nøgletal genereret fra baggrundsstøj uden for cellen. Hele celle område skal kvantificeres for at undgå forspændingsorgan resultater på celle form. Den maskering skal måske omdefineres over tid afhængig af ændringer i celle form og migration. Alternativt kan ROIs større end cellen anvendes, hvis udelukkelseskriterier er defineret til at fjerne pixel nøgletal fra QE og AEM signaler, der falder langt under cellulære niveauer og er nær baggrundsniveauer. Den beskrevne analysemetoder detaljer de grundlæggende trin, der anvendes i dette arbejde for FRET analyse uden specialiserede software / plugins. Mikroskop fabrikanter og andre leverandører sælger tillægsmoduls for deres mikroskop software, der understøtter automatiseret ratiometrisk og FRET-analyse. Ligeledes det offentlige rum ImageJ software har flere plugins til rådighed for partikel og FRET analyse, såsom RiFRET. Sekund, pixel-baserede gennemsnitlige FRET forholdet undervurderer den sande gennemsnitlige forhold af 3D cellestruktur fordi et 2D billede bruges. 2D signaler repræsenterer og gennemsnitlige langs z-aksen. Beregning af 3D rumlige fordeling af FRET-forhold i levende celler er ikke muligt uden højhastigheds 3D imaging (f.eks. Ved hjælp af roterende skive konfokal mikroskopi). Dette er et problem for både 2D og 3D-kulturer, men har en større effekt i 3D som mere af den cellulære struktur eksisterer ud af flyet. Dette er af stor bekymring for prober, der lokaliserer til cellulære strukturer, såsom plasmamembranen EPAC1 probe PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 til forslag til at korrigere for tykkelse celle virkninger på forholdet beregninger 24. Analyse af fordelingen af ​​AEM kan anvendes tilopdage, hvis sonde akkumuleres i områder af cellen og billedplanet justeret. Dette vil også bidrage til at fortolke den rumlige fordeling af FRET nøgletal og fjerne falske resultater, f.eks., Identificere sonde mætning (dvs. vil en lav AEM regionen har koncentrationen lav sonde og kan udvise sonde mætning og høj FRET forhold). Det tredje forskellige FRET baselineniveauer kan indikere en forskel i transfektionseffektiviteten, sonde udtryk, eller basal signalering mellem forsøgsgrupper. "Relativ Analysis" (trin 10.1.1) hjælper med at fjerne afdrift i FRET forholdet over tid, hvis til stede. Det letter sammenligning af den relative størrelse af svarene mellem prøver, men hæmmer sammenligning med tidsforløbet for respons for referenceprøven (kontrol plot er en flad linje). "Absolute Analysis" (trin 10.1.2) letter sammenligning af hastigheden af ​​respons på tværs prøver, men hindrer sammenligning af størrelsen af ​​respons, fordi hver linje skaleres ved en dissimnende konstant. Undersøgelser bruger ofte en lineær regression på grundlinjen for at korrigere for afdrift i FRET-forholdet med tiden.

Den beskrevne 3D FRET metode er en nyttig og praktisk måde at fremstille og udføre time-lapse billeddannelse af celle- lastet 3D hydrogeler, som kan anvendes til andre sonder og billeddannende modaliteter. Andre FRET-systemet udover enkeltkædede binære prober vil kræve mere komplekse korrektion af intensitet baseret signaler, som beskrevet ovenfor. Alternativt kan fluorescenslevetid billeddannelse af FRET (FLIM-FRET) anvendes til at beregne FRET effektivitet via en ændring i emission levetid af sonden donor. I modsætning til intensitet baseret FRET, FLIM-FRET er ufølsom over for baggrundsstøj, spektral gennemblødning, kvante effektivitet, og detektor spektrale følsomhed 2. Men flim systemer er dyre, komplekse og ualmindelige, og fungerer bedst med fluoroforer med enkelt eksponent henfald og ingen FLIM afstrømning 49. Den beskrevne fremgangsmåde kan også anvendes med more avancerede mikroskop platforme (f.eks., FRET-TIRF, fluorescens anisotropi, og spektral korrelation FRET). Anvendelsen af ​​denne metode til 3D-billeder med høj hastighed konfokal og multifoton mikroskopi vil lette analyse af sub-cellulære fordeling af signalering respons og øge nøjagtigheden af ​​signalering analyse. Denne 3D FRET metode vil muliggøre avancerede cellebiologiske studier i simulerede 3D cellulære mikromiljøer. Som sådan kan det let påføres farmakologi og regenerativ medicin behov, herunder studere intercellulær signalering og screening lægemiddelrespons i manipulerede hydrogel-baserede microtissues.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender den økonomiske støtte i School of Dental Medicine ved University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, og tilskud P30 DE030740. Forfatterne også takke Dr. Jin Zhang for ICUE1 plasmidet, Wayne Rasband for at udvikle ImageJ og Michael Cammer for ImageJ makro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

Molecular Biology Mikrofluid microtissue fluorescens Förster stillads polyethylenglycol hydrogel FRET intracellulær signalering chondrocytter
FRET Imaging i Tre-dimensionelle Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V.,… More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter