Summary
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。
Abstract
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の画像化は、リアルタイムで細胞生物学を調査するための強力なツールです。 FRETを利用した研究は、一般的に、三次元（3D）細胞の微小環境を模倣していない二次元（2D）培養物を用います。 3Dヒドロゲル環境内のセルの従来の広視野落射蛍光顕微鏡を用いてクエンチ発光FRETイメージングを実行するための方法が提供されます。ここで、プローブの活性化範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析方法について説明します。細胞内の環状アデノシン一リン酸（cAMP）のレベルの測定は、EPAC1活性化（ICUE1）及びヒドロゲル材料の種類は、本明細書に光架橋ヒドロゲル（PC-ゲル依存シグナリングcAMPの相違を検出する能力のためにプローブを使用して、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で実証されていますポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）。 2D FRET法と比較して、この方法は少し追加の作業が必要です。すでに2DでFRETイメージングを利用した研究所は、簡単に3D微小環境における細胞の研究を実行するには、この方法を採用することができます。さらに、操作された3D微細組織における高スループット薬物スクリーニングに適用することができます。さらに、このような異方性の測定と蛍光寿命イメージング（FLIM）としてFRETイメージングの他の形態では、共焦点、パルス、または変調された照明を使用して、高度な顕微鏡プラットフォームと互換性があります。
Introduction
細胞シグナリングは複雑で、薬理学、組織工学、再生医療などの多くの分野のための必然でもあります。有用な治験ツールは、細胞生物学の理解を促進し、組織再生のための最適な材料を開発するために必要とされます。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングは受容体の活性化、分子のコンホメーション、および生細胞中で超分子相互作用を（ 例えば 、タンパク質/ DNA複合体形成）の分析を可能に不可欠なツールです。 FRETは、蛍光色素分子1との間の非放射エネルギー転送のタイプです。これは、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォア間の距離の6乗に反比例する効率を有します。 （ - 10ナノメートル、典型的には1）2このように、ナノメートルスケールでの2つの異なる分子間または1つの分子の領域にわたって空間的な距離情報を提供することができます。ドナーとアクセプターフルオロフォアは異なるメートルとすることができますolecule型ドナーは、より高いエネルギー放出（より短い波長）を有する、（ヘテロFRET）、または同じタイプの（ホモFRET）。 FRET画像化は、固定または生細胞に対して行うことができるが、高速共焦点システムが利用できない場合、一般的に固定された細胞は、高い空間分解能での分子相互作用のイメージングのために使用されます。生細胞は、このような応答3シグナリングリアルタイム細胞内などの阻害または固定することによって変更される相互作用およびプロセスを研究するために使用されます。
なぜなら、シンプルさとより低いバックグラウンド（平面セルのうちから無発光）の一部でFRETイメージング用2次元（2D）の細胞培養液を使用し、生細胞の研究。しかし、2D培養物はまた、生理学的微小環境と3次元（3D）培養4,5に比べて非常に多くの細胞プロセスを変化させます。例えば、細胞外マトリックス相互作用のセルとセルの天然の細胞が大幅にEASをもたらす2D培養で変更されますILY細胞形態と極性6の変化を観察しました。それらは、細胞骨格成分7,8及び細胞形状および細胞骨格構造が強く空間培養環境9によって調節される結合ので、膜マイクロドメイン（ 例えば 、カベオラおよび脂質ラフト）と受容体シグナル伝達が強く部分的に、培養環境によって調節されます。メカノだけ3Dマトリックスの影響を受けますが、より複雑な二次負荷条件によって2D培養10と比較して、3D環境で生み出されていません。最後に、3Dマトリックスの透過性は拡散を減少し、2D培養物と比較してシグナル伝達分子の細胞への結合の増加とともに一般に、培地未満です。 3D培養物と一つの接着剤、化学的、及び機械的な合図に対して生理学的により類似微小環境を作成して観察することができます。細胞相互作用の細胞を促進することができ、接着性がwを制御することができます3D素材11-13の構造、組成、およびアーキテクチャ（パターニング）は、i番目。材料の機械的性質は、同様の組成および構造14,15によって調整することができます。ヒドロゲル中の細胞を培養することは、したがって、許可は、他の脱分化になる初代細胞、または従来の技術を使用して表現型の変化、 例えば、上で検討をFRET、関節軟骨からの細胞。したがって、この方法は、ライブ3D培養におけるFRETアッセイを可能にするために必要とされます。
彼らは、光学的に透明と微小環境を制御し、携帯手がかりを提供するように調整することができるので、ヒドロゲル足場は、3D FRETベースの研究に最適です。天然ポリマーから作られるヒドロゲルは、ゼラチンおよびフィブリン16などの数十年のための細胞培養に使用されてきました。携帯の微小環境をより細かく制御は、これらのポリマーの化学修飾とし、合成ポリマー17,18の使用によって達成することができます。 Hydr機械的剛性をogel透磁率は、そのポリマー組成物を変えることによって制御することができ、サイズ（ポリマーと架橋密度）19,20メッシュ 。さらに、ヒドロゲルは、増殖因子および細胞リガンドを組み込むことによって、生物活性にすることができます。なぜならこれらの可能性、バイオセンシング、薬物送達、および組織工学用途のためのヒドロゲルの開発は、研究21の非常に活発な領域です。ヒドロゲルの3Dプリントはまた、微細組織の製造のための開発を受けて、15を -organsされます。したがって、ヒドロゲル中の細胞のFRETイメージングは、生理的な細胞挙動を近似するための手段として有用であるだけでなく、勉強や工学的組織の成長を最適化するためのツールとしてだけではありません。
バイナリレシオメトリックFRETプローブは、細胞のシグナル伝達を研究するのに非常に有用であり、ヒドロゲル培養物中で利用することができます。公開された蛍光及びFRETプローブの部分的なリストについては、細胞遊走コンソーシアムのWebサイトを参照してください
レシオメトリックFRETプローブは、容易にかつ頻繁に、従来の広視野落射蛍光顕微鏡システムで使用されます。広視野顕微鏡はため、システムコスト、フルオロフォアの漂白、および十分な時間分解能で信号変化の捕獲に対する懸念の生細胞イメージングのためのライン走査型共焦点システムよりも好ましいです。また、単一細胞肛門細胞の大集団を超えるysisは、複数の視野を超える電動ステージと画像キャプチャで可能です。広視野顕微鏡は、ヘテロFRETプローブ信号の強度に基づいた分析が必要です。強度解析は、他のFRETの方法のような複雑なハードウェアを必要としませんが、より多くの取得後の作業は、フルオロフォアの行動や顕微鏡/イメージング・システム構成28の影響を補正するために必要とされます。フルオロフォアの捕捉発光強度は、励起エネルギー、フルオロフォア、量子収率、および合成フィルタ及びカメラ/検出器スペクトル感度と直線2の関数です。これらは、ドナーとアクセプターのために異なることがあり、定量的な分析のためのキャリブレーションを必要とします。また、アクセプター発光の画像化は蛍光体のスペクトルの重複によって影響される（ドナー励起光によって受容体の励起およびアクセプターの発光スペクトルにドナー発光のスルーブリード）2。4;単鎖二重鎖」プローブセル25,28を通じて異なる化学量論で存在してもよい場合の蛍光団。 ""プローブは、フルオロフォアは、一方で、それらの蛍光団がナノスケールで等モルであるため、内部的に正規化されている「単鎖」プローブは、同様の明るさ（吸光係数および量子収量の機能）、非線形検出器感度の効果は、バックグラウンド蛍光と23を必要とされる結合量子収量/検出器感度のために小さいだけ補正されているのである。従って、「単鎖」レシオメトリックFRETプローブは、最も容易に広視野顕微鏡24に実装されています。
本稿では、従来の広視野落射蛍光顕微鏡を使用して3Dハイドロゲル培養における生細胞のFRETイメージングを実行するための簡単な技術が記載されています。これは、簡単に相互に興味がよく研究室のように、すでに2DでFRET実験を行う研究室によって採用することができます微細組織における細胞シグナリング。ここでは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）光架橋内生軟骨細胞におけるレベル（PC-ゲル、ポリエチレングリコールジメタクリレート）および熱応答性（TR-ゲル、マトリゲル）ヒドロゲルのFRETイメージングベースの測定と方法を示しています。レシオメトリックFRETプローブは、フォルスコリンに応答したcAMPへのATPの変換を触媒するアデニル酸シクラーゼのための化学的アゴニストcAMPレベルを検出するためのEPAC1（ICUE1）に基づいて利用されています。 cAMPは、Gタンパク質共役受容体のシグナル伝達を媒介する主要なセカンドメッセンジャーの一つであり、それは、直接のcAMP（EPACs）によって活性化される下流の交換タンパク質を含む種々の因子を活性化します。フルオロフォアは、cAMPは、FRETが低下EPACドメインに結合すると離れて移動します。ここに記載のヒドロゲル材料の製造、ICUE1プローブを用いた細胞のトランスフェクション、および3Dヒドロゲル中の細胞の埋め込みです。 3D FRET実験手順および必要な画像解析細胞あたりのプローブの活性を評価するために説明されています。また、広視野顕微鏡を用いて、2Dと3DでのFRET分析の固有の限界を議論します。それは、より生理的な文脈で分析を可能にし、より少ない画像補正および較正を必要とするので、ここで提示された技術は、既存の2次元方法に対する改善です。大きな有用性は、細胞トランスフェクションの好みを維持することができるが、多くの透明な材料を使用することができるという事実にあります。
Protocol
1.材料の準備
- 林・ギブソンら 29によって記載された方法に従って、ポリエチレングリコールをmethacrylatingことにより、ポリエチレングリコールジメタクリレート（PEGDM、4,000 MW）を準備します。あるいは、PEGDMを購入することができます。
- 第ジメチルphenylphosphoniteは、ミカエリス - アルブゾフ反応を介して2,4,6-トリメチルchorideと反応させて、二段階のプロセスを介して、次いで、リチウム塩、光開始剤を合成し、リチウムフェニル-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP）真島ら30に従って、2-ブタノン中で臭化リチウムを添加することによって作成されました。
注：あるいは、他の光開始剤を購入することができるが、LAPは、より良い生体適合性と架橋効率31を示しています。 - ガラスにヒドロゲルの接着を可能にし、それにより、撮像中の動きを防ぐために、カバーガラスを官能。
- 適切な個人用保護具と化学フードでは、使用TR-ゲル31のためのPC-ゲルおよびエポキシシラン（3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン）のために、製造業者のプロトコルに従って、3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート。注：または、プレコートスライドを購入することができます。カバースリップは、ステップ3.8でPDMS皿の井戸よりも大きくなければならないことに注意してください。
2.細胞トランスフェクション
- 組織培養フード中で、滅菌技術を使用して、解凍サブ密集度で所望の細胞プレート（50 - 70％）を、6ウェルの非処理培養皿中で15,000細胞/ cm 2で、本明細書にウシ軟骨細胞。注意：任意の関連する細胞型を使用することができる、足場非依存性細胞を含みます。
- 細胞を37℃のインキュベーター中で一日のために回復することを可能にします。その後の工程の前に、培地を除去し、PBSですすぎ、そしてウェル当たり2ミリリットルフェノールおよび無血清培地を追加します。
- 各ウェルのための次の日、100フェノールおよび無血清培地μlのと同様に3を追加オートクレーブのガラス試験管にμlのトランスフェクション試薬。混合するために、軽くチューブを振ります。室温で5分間インキュベートします。光への曝露を制限します。
- 1μgの追加のDNAをプローブし、軽く振るFRET。室温で混合物をインキュベートし、光を避けて30分間。
注：この実験ではICUE1プラスミド（博士ジン張33の礼儀）を使用しました。 ICUE1中のフルオロフォアは、シアン蛍光タンパク質（CFP、ドナー）と黄色蛍光タンパク質（YFP、アクセプター）です。プラスミドDNAにトランスフェクション試薬の比は、異なる細胞型の最適なトランスフェクションのために調整が必要になります。 - 調製された混合物（〜104μl）を細胞に加えて、フェノールおよび無血清培地の2ミリリットルを含む6ウェルのそれぞれに滴下して配布します。アップピペットとダウンしないでください。穏やかに混合するためにプレートを渦巻きます。
- 48時間37℃でインキュベートします。注：コンフルエンシーは、トランスフェクション効率を阻害し、受容体の内因性の発現を変化させます。
3.製作ハイドロゲル鋳造および文化のためのPDMS金型
- 上にポリジメチルシロキサン（PDMS）を鋳造するために大きなガラススライドを準備石鹸で第一のガラスを清掃し、多量の水で洗い流し、そして空気が続くイソプロパノールで、その後乾燥してください。
- PDMSは容易に硬化後に剥離することができるように、製造業者のプロトコルに従ってシリ試薬とガラスを扱います。流域コンテナの上にトルエンで表面から残留試薬を洗い流します。空気の表面が完全に乾燥する前に、または待機時間を短縮するために100℃の熱を使用可能にします。
- ヒドロゲルの高さ（ 例えば 、1ミリメートル）を選択し、PDMSの1.2倍の体積を計算ガラススライドおよびヒドロゲルの高さの寸法を使用して、この厚さのPDMSとガラススライドをカバーするのに必要な。注：PDMSは収縮しません。
- ビーカー内の1の重量比：10でPDMSのキット成分を混ぜます。それは十分に混合された後、脱ガスにハウス真空下でビーカーを置きます。 REL気泡がコンテナをオーバーフローさせ、繰り返しを開始する場合は、真空をieve。
注：他のヒドロゲルの厚さは使用されるが、増加したバックグラウンドを犠牲にし、遠心分離（ステップ6.2）が使用されていない場合は、不透明度を増加させることができます。
- ビーカー内の1の重量比：10でPDMSのキット成分を混ぜます。それは十分に混合された後、脱ガスにハウス真空下でビーカーを置きます。 REL気泡がコンテナをオーバーフローさせ、繰り返しを開始する場合は、真空をieve。
- PDMSを含むようにベースガラスの側面の周りにアルミ箔を包みます。慎重に箔に囲まれたこのガラス上に脱気したPDMSの所望の量を注ぎます。 PDMSの高さを測定します。 PDMSの高さは、ヒドロゲルの最大の高さになることに留意してください。注ぐときに気泡が作成された場合は、再度脱ガスやへらや針でそれらを開きます。
- 2時間100℃のオーブンでレベルの表面に未硬化PDMSを置き、または24時間、室温で残します。
- それが硬化した後に慎重に表面からPDMSを削除します。ヒドロゲルのための所望の形状（3ミリメートルの例えば 、円筒形のパンチ）をパンチアウト。
注：光架橋が原因モールド径よりも若干狭くPC-ゲルシリンダーを得られますPDMS中の分子状酸素による反応の消光します。 - パンチPDMSを滅菌します。短期間の実験のために、1時間、70％エタノールでPDMSを水没。
- 顕微鏡対物補正に合わせた厚さの滅菌ガラスカバースリップで滅菌PDMSのベースを嵌合することにより、金型を組み立てます。ステップ6での使用のために取っておかれます。
- ヒドロゲルおよび培地を含むように（ヒドロゲルよりも広く、背が高いと）上記の方法を用いて、より大きなPDMS皿を製作。ハイドロゲルを浸漬すると、検体の希釈を最小限にするためにヒドロゲルより少なくとも10倍以上の媒体ボリュームを収容します。
ヒドロゲル前駆体溶液の4準備
- 組織培養フード内で、滅菌技術を用いて、直ちに細胞を添加する前に、研究のためのヒドロゲル前駆体溶液を適切に準備します。次のようにポリマー前駆体からPC-ゲルを準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBにPEGDM粉末を混合10％のS、pHは7.2）（w / vで）。
- 0.005の最終濃度で光開始剤（ 例えば、LAP）を追加- 0.01％（w / v）で、ピペッティングにより混合します。 LAPは、光に敏感であるように、光からアルミ箔またはシールドで溶液をカバーしています。
注：製造業者によって供給される。ここでTR-ゲル減少成長因子、細胞外マトリックスが使用されます。
ヒドロゲルソリューション5.細胞懸濁液
- 組織培養フード内で、滅菌技術を用いて、ウェルから培地を吸引します。
- ウェルにPBSを追加し、徹底的に取り付けられた細胞単層を洗浄するために削除します。
- 細胞解離溶液25 1cm 2当たり2〜3ミリリットルを用いて培養基質から細胞を解離します。 20分または解離するまで - 10、37℃でインキュベートした後、静かに揺らし。細胞を取り除くために、必要に応じて、しっかりと料理をタップします。
注：代替細胞解離ソリューションは、私はそうでないものに限られた選択肢を用意してい関心の受容体を切断することによって、分析中のシグナル伝達経路をMPACT。 - 細胞が分離された後、フェノールおよび無血清培地の2ミリリットルを追加し細胞を懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。注：化学的に規定された無血清培地（ 例えば 、インスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充した）を使用してもよいです。
- 滅菌バイアル、ペレット（ 例えば、2.0×10 6細胞1バイアルあたり）への細胞の種類に基づいて、所望の細胞数を等分。
- 上清を除去し、ヒドロゲル前駆体の所望のボリュームを追加し、ピペッティングにより細胞を懸濁。崩壊としてヒドロゲルのz軸を可視化する際にxy平面に2×10 5細胞/ cm 2が得られる前駆体の体積を使用します（ 例えば 、2×10 6細胞を含有する1ミリメートルの厚さのヒドロゲルのための1バイアルあたり1.0ミリリットル/ mlで）。気泡を発生させないように注意してください。
- 素早く<細胞生存率34に負の影響を制限するために、次のステップに進みます/ SUP>。
6.ハイドロゲルの調製
- 組織培養フード内や無菌技術を使用して、ステップ3で調製した鋳型に細胞含有ヒドロゲル前駆体を追加する（ 例えば 、直径3mmのx高さ1mmの金型当たり7.1μl）を。 （固有のプローブ効率が不明である場合）、顕微鏡イメージング・システム較正およびプローブ較正のために使用することが、記載された同じ方法に従って、余分なヒドロゲルを作り出します。
- 遠心分離前の単一の焦点面に細胞を閉じ込め平面信号（ 図1）のうち、最小にすることによって画像化を最適化するためのゲル化/架橋に調製した細胞を含むヒドロゲル前駆体。前駆体の細胞型および粘度（4分間400グラム）に遠心時間と力を調整します。
- ゲルまたは溶液を架橋
- PC-ゲルヒドロゲルについては、に等しい露光時間のためのUV光源（λ= 365 nm）を持つ細胞含有前駆体を照射光架橋するミリメートル厚さ当たり3.2 J / cm 2です。
注意：計算で1ミリメートルの最小厚さを使用してください。エクスポージャーは1-5分の範囲に入る必要があります。最小露光時間を使用してください。過剰照射の生存率を減少させ、CFPドナーを漂白します。このような細胞を避けてください。高強度の照射がラジカル自己消光および乏しい細胞生存率につながるしかし、露光時間未満60秒が推奨されていません。 - TR-ゲルハイドロゲルの場合は、シャーレ内に充填された金型を配置し、熱ゲル化へのインキュベーターに移動します。 37℃で30分間インキュベートします。
- PC-ゲルヒドロゲルについては、に等しい露光時間のためのUV光源（λ= 365 nm）を持つ細胞含有前駆体を照射光架橋するミリメートル厚さ当たり3.2 J / cm 2です。
- ゲル化またはヒドロゲルを架橋した後、PDMSヒドロゲル鋳型を除去し、（ステップ3.5から）を用意し、より大きなPDMS皿と交換してください。それを接着するための無菌のスパチュラでガラス上にダウンPDMSを押してください。
- これは、シャーレなどの無菌容器内へのカバースリップで皿をPDMS置きます。フェノールフリー無血清培地を追加するか、または化学的に私に定義されましたよく浸しヒドロゲルを保つために、PDMS皿とカバーガラスを使用して作成するdium（インスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充した無血清培地（ステップ5.4））。 37℃で30分間インキュベートします。
注意：カバーガラスで特殊な皿を使用している場合は、その中にカバースリップを配置し、同様にメディアを追加します。 - 代わりに、照射波長がCFPドナー励起スペクトルと重なるように、プローブが回復することを可能にするためにFRETイメージング前日、この手順を実行します。
- これは、シャーレなどの無菌容器内へのカバースリップで皿をPDMS置きます。フェノールフリー無血清培地を追加するか、または化学的に私に定義されましたよく浸しヒドロゲルを保つために、PDMS皿とカバーガラスを使用して作成するdium（インスリン、トランスフェリンおよびセレンを補充した無血清培地（ステップ5.4））。 37℃で30分間インキュベートします。
7. 3D FRETイメージング
- ステップ6.4で調製したペトリ皿からヒドロゲルとPDMS皿を外し、XYの顕微鏡ステージ（ 図2）のための調整可能な試料ホルダーに固定します。顕微鏡ステージ上の試料ホルダーを置きます。必要に応じて、客観的にオイルを適用します。比較的弱い蛍光体を捕捉するために、少なくとも40Xと高開口数（NA）の（ すなわち 、1.3 NA）の対物レンズを使用します電子放出。
- 画像取得のためのビュー（のFOV）のフィールドを設定します。透過光イメージングを用いたイメージング用の細胞を選択し、蛍光イメージングでのトランスフェクションを確認します。少なくとも15の異なるセルを選択してください。
- どちらも明るすぎず暗すぎ（そうでなければ過飽和または低感度プローブするためにつながる可能性がある）と、（そうでなければ、バイナリプローブの損傷や崩壊を示す）0.0と1.0の間のFRET比であるセルを選択します。その後、露出を制限するために、光をオフにします。
- （ 図3Bおよびステップ以下の9.2を参照）ヒドロゲルの中心に、比較的フラットな照明フィールド内の目的の細胞と密接のFOVを選択します。
- FRETの画像チャネル用のカメラ設定を構成します。 「光学的構成」（ すなわち 、露出、画像チャネルあたりの利得）を最適化するために、FOVの中心付近の少数の細胞の間で選択してください。
注：下記の命名法はdependin異なります顕微鏡とカメラを操作するために使用されるソフトウェアにグラム。顕微鏡ソフトウェア、NIS-要素は、画像キャプチャおよび分析のためにここで使用されます。- アクセプター励起（AEM）の下で、ドナーの励起とアクセプター発光の下でドナー発光で急冷放出（QE）、：一本鎖プローブのFRET分析のために、FOVごとに2つの画像チャネルを選択します。
注：ICUE1 CFP-YFPプローブ、QEのためのCFPの励起および発光フィルターペアについては（418から442元、458から482 EM）とAEMのためのYFPの励起および発光ペア（490から510元、520から550 EM）使用されています。 - バックグラウンドノイズを最小限に抑えるために（最小限の可能利得で、CCDを使用している場合）、飽和せずに最大の信号強度を取得するためにQEとAEMのための露出を設定します。 図 （結果（ すなわち、励起パワー、アイリスの大きさ、露出、カメラゲイン）を付勢回避するために、両方のフルオロフォアのために同じ光の設定を維持し、実験を通して、ならびに実験群の間でUREの3A）。
- 買収後のより多くの分析オプション（ 例えば、補正後の増感発光（CSE）イメージング（説明を参照））を可能にするために追加の画像チャネルを取得します。エムドナー （QE、顕微鏡ソフトウェアで選択CFP-CFP）、例のドナー - -エムアクセプター （SE、選択CFP- ICUE1 CFP-YFPプローブの場合は、励起（例）と例のドナーの放射（エム）チャネルを取得YFP）、例アクセプタ -エムアクセプター （AEM、YFP-YFPを選択）、および実施例アクセプタ -エムドナー （YFP-CFP）の構成（ 図3Aを参照してください）。
- アクセプター励起（AEM）の下で、ドナーの励起とアクセプター発光の下でドナー発光で急冷放出（QE）、：一本鎖プローブのFRET分析のために、FOVごとに2つの画像チャネルを選択します。
- タイムラプス画像取得のための捕捉率を設定します。
- ハードウェアによって制限される場合捕捉率を低下させます。短期アッセイのために（ 例えば、30 - 60分）、シグナル動態を捕捉するために、各FOV（5秒のサンプリングレート）毎分約12の取得を示します。 signiを回避するために必要な最小のサンプリングレートを使用しますficantlyプローブを光退色。
- 顕微鏡ソフトウェアでキャプチャの周期を入力して取得レートを設定します。長期的なアッセイ（ 例えば 、24時間）のために、すべての5〜10分、例えば 、初期パルス応答をキャプチャし、低取得速度に切り替えるには、高い取得速度で始まります。
- 選択画像の取得を開始し、指定のFOVにおけるプローブ応答のベースラインを確立するために、5分間の画像をキャプチャするために、顕微鏡ソフトウェアの「現在実行」。
- 希望のアゴニストまたはアンタゴニスト検体中の画像取得、ピペットの5分（ 例えば、100 nmでのフォルスコリン）した後、ピペッティングにより混和し、撮影を続けます。
8. FRETキャリブレーション
- システムのキャリブレーション：同じFOV条件、光学的構成、およびカメラセットを使用して少なくとも6代表的な細胞のAEMの画像を取得するために、ステップ6で説明したように作製し、さらなる較正ヒドロゲルを使用リントは（ステップ7.1、7.2、および7.3）上記のFRETイメージングのために使用されます。
注：組み合わせられたプローブと顕微鏡イメージングシステムのための量子収率および分光感度（QS）の定量は、「絶対」FRET分析ではなく、「相対」FRETのために必要とされます。- フル強度（AEMチャネル上で励起）で励起光に5分長時間露光を選択することにより、アクセプターフルオロフォアを光退色。興味のある細胞のみを漂白する狭い開口部を使用してください。 AEM信号は前と光退色後の信号強度ヒストグラム（「LUT」ウィンドウ）を比較することにより、元の信号よりも少なくとも10％低いことを確認します。信号損失が90％未満である場合、光退色続けます。
注：ドナーフルオロフォアがドナーの励起スペクトルと重複しないAEM励起フィルターを使用して、この手順の間に漂白されていないことを確認。 - 今漂白アクセプターフルオロフォアとドナー励起下で私たちを（DEM）をドナー発光を買収ステップ7.3でのQEと同じ光学構成をる。
- 以下のセクション9のように、バックグラウンド補正後AEMで割っデムような画素あたりのQSを計算します。 QS =デム/ AEM
- 携帯平均値からのセル間の平均QSを計算します。
- フル強度（AEMチャネル上で励起）で励起光に5分長時間露光を選択することにより、アクセプターフルオロフォアを光退色。興味のある細胞のみを漂白する狭い開口部を使用してください。 AEM信号は前と光退色後の信号強度ヒストグラム（「LUT」ウィンドウ）を比較することにより、元の信号よりも少なくとも10％低いことを確認します。信号損失が90％未満である場合、光退色続けます。
- キャリブレーションサンプルを用いたプローブ（EI）の固有のFRET効率を推定します。プローブの最大FRETを誘発し、Eiは= 1を計算 - QE /下のセクション9のように（AEMは、QSをX）。 （QE / DEM） - 代わりに、Eiは= CSE / AEM、またはEiはEiの= 1とFRET効率のための従来のエンドポイントアッセイを用いて計算します。
注：Eiは活性化プローブ（FAP、 すなわち 、検体を結合プローブの割合）の絶対割合を定量化するために必要ですが、FRET「相対的」分析のために必要されていません。- 検体と相互作用するとFRETの増加プローブの分析物の生産/活性化のアゴニストと文化を刺激することによって、プローブ応答を飽和。
- プローブを阻害interactio分析物に結合するとFRETの減少のプローブのためのシグナリングの拮抗薬を使用して、検体を有するn。注：ICUE1プローブの場合には、「このような2などアデニルシクラーゼ阻害剤でcAMPレベルを抑制し、5'-ジデオキシアデノシン（特異的）または3-イソブチル - メチルキサンチン（非特異的）。
9. FRET比算出
- 時間をかけて各FOVでバックグラウンドレベル（ 図3B）を定義しますが、画像（ 図4Aの中心にわたって比較的均質な照明の領域にROIを制限するために、細胞の近くにFOVごとに関心のある領域（ROI）を描画し、指定）。バックグラウンド補正オプションの説明のための議論を参照してください。
- 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：「背景ROIアイコン」の矢印を選択し、（他の形状も動作します）「楕円背景ROIを描画」を選択します。 「オフセット背景を更新し続ける」ことを確認してください選択されています。争うアクティブ化背景ROIのアイコンをクリックして、背景ROIの翼。代わりに、「ROIのアイコン」と「背景ROIとして使用する」に設定したROIのプロパティを使用し、「ROIが各マルチポイントで異なっています」。
- ImageJのでは：円形の描画ツールを選択するには、ツールバーを使用してください。次に、 "→ツール→ROIマネージャーの分析」メニューからROIマネージャーに図形を追加します。必要であれば、ROI Managerで背景ROIのための別の色を設定します。
- 各FOVと画像チャネル（ 例えば、QEとAEM）の場合は、チャンネルごとに補正画像を作成するために、時点ごとに背景ROI内の平均値を減算、 例えば、SQE のT、P = QEのT、P - BQE T、P tは取得時間であり、pは FOV（ すなわち、XY位置）であり、BQEとbAemは、背景ROI内の信号のスカラー値です。ソフトウェアで利用可能な画像の算術関数を使用します。
- W顕微鏡ソフトウェアi番目、「ROIの背景アイコン」を使用し、「減算背景ROIを使用」を選択します。ポップアップウィンドウで、「上減算背景ROI」の「すべてのイメージ」を選択し、「適用先」の下の「すべてのフレーム」を選択します。
注：背景ROIが正しく動作するために、この機能のために、すべてのFOVで定義する必要があります（ 例えば 、いくつかのFOVは未定義のバックグラウンドのROIを持っている場合、機能が正常にバックグラウンドのROIとFOVのためのバックグラウンドを減算しません。）。 - ImageJのでは、マイケル・カメロ（http://microscopynotes.com/imagej/macros/）によって書かれた「BG減算ROIから「マクロを使用しています。
- W顕微鏡ソフトウェアi番目、「ROIの背景アイコン」を使用し、「減算背景ROIを使用」を選択します。ポップアップウィンドウで、「上減算背景ROI」の「すべてのイメージ」を選択し、「適用先」の下の「すべてのフレーム」を選択します。
- 以下の分析手順については、「名前を付けて保存」を選択することで、画像の補正された時系列を保存します。
- 各FOV（ 図4B）で分析中の各セルのバイナリマスクを用いて細胞の周りにROIを定義します。スタートOにおけるしきい値にFOVあたりの画像をAEMチャネルを使用実験F、セル境界を識別し、関心領域を定義しました。 ROIを保存します。
- 顕微鏡ソフトウェアで：各フレーム（ すなわち 、FOV）、最初の「バイナリ→は、しきい値の定義」メニューを使用し、「現在のフレームに適用」を選択します。セルを選択するために、下限しきい値を調整します。その後、必要に応じてバイナリマスクの穴を埋めるために「バイナリ→閉じる」関数を使用します。次に「ROIにコピーバイナリ」を選択するために、ROIのアイコンを使用します。バイナリ層は自動的に削除されます。
- ROIの既存のプールに後続フレームのためのROIを追加します。任意のスプリアスのROIを削除します。次のROIの「右クリック」とそのプロパティが「標準ROIとして使用する」され、「関心領域は、各マルチポイントで異なっている」ことを確認してください。
- ImageJのでは：各FOVについて、最初の "→しきい値を調整して画像→「メニューを使用します。そして、ショーアウトラインで「粒子の分析→分析」を使用し、選択したマネージャに追加します。つかいます「バイナリ→閉じる」を必要に応じてバイナリマスクで「穴」を埋めるために。スプリアスのROIを削除します。無料のプラグインは、このプロセスを自動化するために利用可能です。
- 顕微鏡ソフトウェアで：各フレーム（ すなわち 、FOV）、最初の「バイナリ→は、しきい値の定義」メニューを使用し、「現在のフレームに適用」を選択します。セルを選択するために、下限しきい値を調整します。その後、必要に応じてバイナリマスクの穴を埋めるために「バイナリ→閉じる」関数を使用します。次に「ROIにコピーバイナリ」を選択するために、ROIのアイコンを使用します。バイナリ層は自動的に削除されます。
- 各ピクセルのQEベースのFRET比を計算し、SQE / SAEMは、相対的な分析のために（ステップ10を参照）およびE QE = SQE /ステップ8.1で得られたQSとの絶対的な分析（ステップ10を参照）（QSは、SAEMをX）。画像の浮動小数点除算を使用してください。比の導出を説明するための議論のセクションを参照してください。
- 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：メニュー「イメージ→画像の操作」を使用し、「浮動小数点」を選択します。
- ImageJのでは：「プロセス→画像電卓」機能や「Calculator_Plus.java」プラグインのいずれかを使用してください。注：代わりに、マクロ」に適合させることができるの.txt "pH_ratioMacroは「FRET比を計算するためには、上記のバックグラウンド補正のマクロを使用し、で入手可能です。
- 表計算やグラフ作成ソフトに（ROIごとに、すなわち ）細胞当たりの平均比率をエクスポートします。
- 顕微鏡のソフトウェアを使用すると：「ROI統計」解析制御または「時間分析」分析制御における「スプレッドシートのエクスポート」ボタンでNDのエクスポート]ボタンのいずれかを使用します。
- ImageJのでは：まず "→設定測定値を分析する」メニューを選択し、「平均値」と「標準偏差」が選択されていることを確認します。そして、ROI Managerを使用し、ボタン「測定」を選択します。生成された結果ウィンドウを保存します。
10. FRET比分析
- セル当たりの平均比からの時間にわたる平均セルラーFRET比を計算する（ステップ9.4でエクスポート）。この計算では、ベースラインFRET比（分析物を投与する前比）を検討してください。
注：スプレッドシートとグラフ作成ソフトウェアは、ベースラインsubtrをプロットするために使用されていますステップ10.1.2と（ 図5および6）下記の10.1.3のように、ベースライン上の線形回帰を使用して、平均FRET比および平均のそれらの標準誤差（SEM）を務めました。- 相対的解析（応答の大きさ）：共通の基準サンプル（ 例えば 、未処理試料）に各曲線を正規化。
- 絶対的な分析（応答の時間経過）：そのベースラインFRET比で各曲線を正規化することによって、共通の開始点に曲線をシフトします。
- 表計算やグラフソフトウェアでは、新しい列を持つデータ（セル当たりの平均比の列）をインターリーブ、それぞれ元の列がベースライン期間（分析対象物を追加する前比）のためにのみ比データを含む新しい列とペアになっているように。データのすべての列の後に空の列を挿入するには、「列の挿入」を選択します。その後、対になった空の列にベースラインデータをコピーします。
- 表計算やグラフソフトウェアでは、「挿入→新しい分析→Transfoを選択RMベースラインを削除」した後、設定された「他のすべての "に"選択した列を「選択」ベースラインが直線的であると仮定」、および選択 ""計算 "の下に"違いを。
- 平均の細胞比と記述統計を計算します。表計算やグラフソフトウェアでは、「SDまたはSEMで行手段→挿入→新しい分析]→[XY分析」を選択し、ポップアップウィンドウで「行をSEMと意味」を選択します。
Representative Results
すべてのヒドロゲル前駆体細胞、及び鋳型は、上記のように調製しました。セルを含んだ前駆体溶液は、PDMSの型にキャストした後、カバーガラスの近くに細胞を固定化し、FRETイメージング解析（ 図1）を容易にするために、ゲル化/光架橋前に遠心分離しました。添付のカバーガラスを有するヒドロゲルは、（ 図2）顕微鏡イメージングのために準備されたPDMS撮像ウェル内に置きました。 図3Aに示すように、光学的構成及び画像取得パラメータは、設定されました。非バイナリのプローブのために必要とされるようにCFP-YFPの蛍光団のペアのための4つのすべてのFRET関連画像チャネルのキャプチャは、（下参照「光学研究会。「 図3に）示されています。しかし、この作品で唯一の2つの画像が一本鎖バイナリICUE1プローブ、QE = "CFP CFP」とAEM =" YFP YFP」（励起発光）のために必要とされます。複数のFOV（XY位置単数または複数）は、いくつかのセルが均一照明領域（ 図3B）内に居住する選択しました。時間経過の取得後、プローブ用の信号データはエクスポートされました。チャネル信号のバックグラウンド補正のために、細胞分析のためのROIは、実験の開始（ 図4）から閾値処理AEM画像を用いて命名しました。細胞は、（あまりにも暗くない）十分ではなく、高すぎる（明るすぎる）プローブ（ 図4B）を発現するもののような細胞プールの中から選択しました。各取得の画素ごとのQEとSE FRET比は、背景減算画像チャネルの浮動小数点除算を用いて計算しました。セル当たりの平均FRET比（ すなわち、ROIあたり）、算出した刺激の前にベースライン信号に正規化（ すなわち、すべての時点から減算ベースライン上の回帰）、および標準エラーとしてエラーバーでプロット（SEM）を意味します。 QEとCSEベースのFRET比ドの両方フォルスコリン刺激（100 nMで、 図5）の下で軟骨細胞における増加したcAMP活性をTECT。 QE信号が原因でハイドロゲル内に埋め込まれた軟骨細胞におけるcAMP活性の低い基底レベルに低下したため、QE FRET比は、CSE FRET比よりもバックグラウンド補正に敏感でした。どちらのハイドロゲルタイプ（TR-ゲルおよびPC-ゲル）フォルスコリンの添加に増加したcAMPシグナル伝達応答を示す経時FRET比の増加（ 図6）を示しました。 QE FRET比で示すように、PC-ゲル、ヒドロゲル中の軟骨細胞は、cAMPの大きな変化（図示）およびcAMP（E QEの高い基礎レベルを示し= E QE = TR-ゲルで0.09 対 PC-ゲルで0.19、 ）は、ベースラインを差し引い図には示されていません。
図1： 光架橋ヒドロゲル内のセル・ディストリビューション（PC-ゲル） A：細胞を含んだヒドロゲル前駆体は、カバースリップ周辺焦点面での細胞の数を最大にするために遠心分離しました。 B：これは、FOV内の細胞の数を増加させ、平面セルのうちからバックグラウンド信号を最小限に抑えることができます。 （スケールバー= 200μm）は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PDMS皿にヒドロゲル
ヒドロゲルは、顕微鏡イメージングと検体刺激のためのカバーガラスをベースとよく背の高いPDMS（ヒドロゲルの10倍容量）の内側に配置しました。それらは、アッセイを通して所定の位置に残るようにPCゲルヒドロゲルは透明でカバースリップに接着されています。 PDMSは十分にに加えて、より広い生検パンチを使用して、ヒドロゲルの体積よりも10倍多くの媒体を含むように大きくすることができますhicker PDMSシート。 （スケールバー= 2ミリメートル） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：FRET イメージングのための取得の設定
：買収は、複数の場所での画像取り込みごとに7秒を設定しました。 QE FRET比計算のために、2つだけの画像チャネルは、QE = "CFP CFP」とAEM =" YFP YFP」（励起発光は）の下で、ここで使用ICUE1プローブ（バイナリ単鎖プローブ）のために必要とされる「光学研究会。 "顕微鏡ソフトウェアのλ]タブ内の列。 B：のFOV（「XY」の位置）は、いくつかの細胞が均一照明領域内に居住する選択しました。画像の下のプロットは青色に沿って照明強度がラインを矢印付き示していますそれは、FOVの中心を通って横断する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：FRETイメージング解析のためのROIの選択
A：細胞を含まない関心領域（ROI）は、各チャネルのバックグラウンド信号を補正するために選択しました。細胞密度または遊走が高い場合、または細胞が均一な照明フィールド内にないときに遮光マスクを使用しない場合、無細胞ヒドロゲルの画像ではなく、バックグラウンド減算のために使用することができます。 B：細胞のROIを画像しきい値とAEMチャネルのバイナリマスクを用いて選択しました。バックグラウンドnから生成された細胞外の比率の包含に悪影響セルあたりの平均FRET比の算出に影響を与える細胞よりも大きなROIを選択オワーズ。この比率を過小評価として細胞あたりの各チャンネルの平均を用いた携帯FRET比の算出は推奨されません。 （スケールバー= 50μm）は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：熱応答性ハイドロゲル（TR-ゲル）でFRET比の比較
QEとSEベースのFRET比の両方が、フォルスコリン刺激下の軟骨細胞で増加しcAMP活性を検出します。フォルスコリンは、cAMPの産生を誘導するアデニルシクラーゼアゴニストです。 ICUE1プローブがキャンプを結合する場合にFRETが減少し、したがって、QE FRET比（E QE = SQE /（SAEM X QS））が増加します。 CSE / SAEM -逆に、SE FRET比が減少し、従って= 1 E SEとしてプロットされています。ヒドロゲル埋め込まれた軟骨細胞では、QE FRET比率が低い基礎cAMP活性にSE FRET比よりもバックグラウンド補正QE信号が低いために、より敏感です。エラーバー= SEM、N = 25 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 異なるヒドロゲルでFRET比の比較
両方のハイドロゲルタイプで軟骨細胞を経時的に増加QE FRET比によって示されるように、cAMP活性の増加に伴って、フォルスコリン刺激に応答しました。ヒドロゲル型の影響フォルスコリンに、基底細胞cAMP活性の透過性の違いなど、いくつかの効果を介して、細胞応答（E QE = E QE 対 PC-ゲル中0.19 = 0.09 TR-ゲルで、図示していません）。エラーバー= SEM、nはTR-ゲル用= 25、nはPC-ゲル= 15のため、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
この作業は、FRET画像が3Dヒドロゲルで細胞シグナルを分析するために使用することができる方法を示しています。以前の研究は、ハイドロゲル基材35から37に播種した細胞の、ヒドロゲル38を有する細胞外相互作用のため、およびヒドロゲル39-41で捕獲された分子のFRETイメージングを実証しているが、これは内部に埋め込 まれた細胞のFRETイメージングベースの細胞内分析を記述するための最初の出版物であります3Dヒドロゲル。 2Dから3DへのFRETイメージングを変換するときの作業には、いくつかの実装上の問題を解決します。まず、高開口数の対物レンズは、十分な発光信号を収集するために、FRETのイメージングのために必要な、しかし、それらは、フィールドの深さを制限しています。ここで、細胞はわずかにこれを補償するために、ガラス周辺焦点面内のセルの数を増加させるために遠心分離を介して沈降させました。第二に、3次元ヒドロゲル足場は、分析を複雑に撮像中の視野を横切ってドリフトすることがあります。ヒドロゲルは、ここでCOVに接着されていますerslip彼らは実験を通して固定されたままとなるよう。ヒドロゲルは、細胞の視覚化を妨げる可能性があるため、第三の、3D FRETに適したヒドロゲル組成物の選択は必須です。ここではPC-ゲルとTR-ゲルの透明ヒドロゲルが使用されています。しかし、カバーガラスに近い焦点面に遠心分離で細胞を収集し、ヒドロゲルのdiffraction.The選択は、ヒドロゲル42のレビューで見つけることができますシミュレートしなければならない微小環境条件に依存するより高いとヒドロゲルに画像セルに使用することができます。第四に、代替の計算は、一本鎖ICUE1プローブのFRET比（ すなわち 、E QE = QE / cAem）が解析に必要な画像チャネルの数を最小限にし、それによって光退色を最小限にするためにここで使用されています。細胞当たりの平均FRET比は、実際のFRET比の過小評価を最小限にするために、セル内の画素当たりの比の平均として算出されます。最後に、線形レシオメトリック分析手段単鎖二元プローブの活性画分を算出することが記載されています。
広視野顕微鏡を用いて成功したFRET実験を実施するいくつかの重要な側面があります。ハードウェアに関しては、カメラは、従来のCCDよりも適して新しい科学的なCMOSカメラや電子増倍CCDを残し、小信号変化を解決するのに十分な感度でなければなりません。最高のFRET比の空間分布を分析するために、カメラは、少なくとも二度客観（ナイキスト基準）の点広がり関数の空間分解能を有していなければなりません。これは、タスクへのデュアルビューシステムはあまり適しています。より重要なフルオロフォアの光退色を最小にするように指定されたFRETペアのための適切な露出と画像取得レートを選択することです。減少し、取得率は、実験期間が増加すると推奨されています。避けながら急速フィルタホイールを使用することは、獲得速度および分析のためのFOVの数を増加させますデュアルビューとタレットフィルターキューブで画像レジストレーションの問題がる。不均一な照明フィールドは、サンプル自己蛍光およびカメラシステムノイズから生じるバックグラウンド蛍光の補正を複雑にします。いくつかのヒドロゲルは、特にコラーゲンタンパク質を含むものが43,44の高い自己蛍光です。 FRET比は、バックグラウンド補正なしで過小評価されています。ここでは、多くの場合、画像（ 図3B、ステップ7.2）の中心上落射照明で構成することができ、比較的平坦な照明分野に依存しているシンプルなバックグラウンド補正方式を採用します。したがって、この方法は、この照明フィールド内のものに目的の細胞を制限します。ここで説明するバックグラウンド補正は、バイナリプローブに読ん波長における細胞の自己蛍光を考慮していません。このような場合には、非標識細胞（無プローブトランスフェクション）が差し引か同じ条件と背景の下で画像化されるべきです。メートル標識及び非標識細胞のIXを用いてもよいし、非標識細胞は、バックグラウンドのROIのために選択されました。イメージフィールド全体細胞分析を提供する別の方法は、細胞を含まない遮光マスクの使用、複数のバックグラウンドのROI、または同一のサンプルを含む、プロトコルは、リクエストに応じて利用可能です。
3D FRETイメージングに特有の、プローブ応答は、検体（ 図6）へのヒドロゲルの透過性に非常に敏感です。したがって、同一のヒドロゲル領域は、好ましくは、ここで使用されるような足場中央付近などの幾何対称の点において、実験的処置間で比較されます。代替的に、マイクロ流体チャンバ/バイオリアクターを迅速かつ均一にアナライト溶液45でヒドロゲルを灌流するために使用することができます。 FRETシグナルは、ヒドロゲルの自己蛍光が高すぎる場合（信号対雑音比が低すぎる）を検出しなくてもよいです。シンナーヒドロゲルまたは異なるプローブ（異なる蛍光体）を使用する必要があります。光架橋ヒドロゲル内の3D FRETイメージングに関しては、最小照射露光およびプローブ蛍光体の励起スペクトル外の波長の使用が推奨されます。 LAPはさらに、潜在的な細胞損傷31,46を最小限に抑えるために、405nmでの可視光源を使用することができます。これは、プローブ漂白を最小限に抑えるため、しかし、365 nmの照射で使用してLAPをお勧めします。 405nmのピーク励起であるのに対し、365nmのは、CFP、ドナーの励起スペクトルの末尾にあります。代替的に、プローブの発現は一日回復させてもよいです。バイナリープローブの使用は、発現レベルのドナーおよびアクセプターフルオロフォアの分子拡散の差に対する感度の問題を最小限に抑えます。非バイナリプローブ（下記参照）が、励起および発光スペクトルのスペクトルブリードスルーのためのSEの代わりQE画像と追加の修正で使用することができます。さらに、低商業可用性とFRETプローブを設計する際の複雑さ障害であってもよいです。成功した実験のための最も重要な要因は、蛍光信号の適切な補正と分析まま。
FRET比の代替の計算は、光退色の最小化に加えて、いくつかの付加的な理由のために利用されます。バイナリ単鎖プローブの場合、一般的に報告された割合は、すなわち 、ドナー励起（急冷放出、QE）の下でドナー発光にドナー励起（増感発光、SE）の下で、アクセプター放出である、比= SE / QE 25,47,48を FRET。 SE / QEは、FRET効率21,22,47の変化に非線形の相対的なものです。すなわち、比率が少なく、約15％未満Eiのための比が最も線形を有するプローブの固有のFRET効率（EI）（Donius、AE、Taboas、JM 未発表の作品。（2015））に指数関数的に非直線的な関係を持っています。 SE / QEはまた、活性化プローブ（FAP、 すなわち、検体を結合プローブの割合）の割合を過小評価します。 Therefo再、SE / QEの分析は、面倒な平衡用量応答研究とカーブフィットが必要です。幸いなことに、アクセプター励起下でアクセプター発光に対するSEまたはQEの比率（AEM）は、すなわち EiをおよびFAP、に対して線形であり、FRETの比率SE / AEMおよびQE / AEM。 SE / AEMは、多くの場合、バイナリのプローブのために使用され、のみ（プローブの活動と完全なプローブの活動で）エンドポイントのキャリブレーションが必要ですが、基底細胞シグナリングは、これが困難にされます。エンドポイントキャリブレーションの必要性を排除するために、SEは、ドナーとアクセプターの励起および発光スペクトルのスペクトルの重なり（スペクトルブリードスルー）は、合わせたプローブのフルオロフォアと顕微鏡の量子収率及び分光感度（QS）は（CSE）を補正することができますイメージングシステム。 CSEに基づいて補正SE FRET比は、画像の各画素内に、すなわち、E SE = CSE / AEMをプローブの観察されたFRET効率を定義します。商用とフリーソフトウェアはこれらの影響をSEを修正するために利用可能であり、読者は、方法50の詳細な説明のためにチェンとPeriasamy 2006年の仕事に呼ばれています。しかし、E SEを計算する時点（SE、QE、AEM）ごとに3つの画像チャネルの捕捉を必要とします。 QE / cAem、2つだけの画像チャネル（QEとAEM）の捕獲を必要とする-そのため、本研究で我々はまた、代替のFRET比E QE = 1を採用します。これらのチャネルからE QEを計算するだけ（cAem = AEMはQSをX）QSのためAEMを修正する必要があります。 QS =デム/ AEMは簡単デムがアクセプター漂白とドナー励起下でドナー発光である1つの較正サンプルから2つの画像を用いて推定されます。任意の瞬間にFAPは、プローブのEiのにE SEまたはE QEを比較することによって計算することができます。
最終的に、FRET比選択（E QE = QE / cAem 対 E SE = CSE / AEM）は、プローブの種類を考慮し、最良の信号を有するチャネルに基づくべきです。両方時間をかけて自家蛍光の変化を考慮するために、上述したようpproachesは、フレームごとの画像の背景ノイズ補正を含みます。彼らはしばしばデザインと顕微鏡のフィルタ設定をプローブに起因する場合であるデム励起スペクトル、にAEMの励起光の重なりを負いません。単鎖プローブは、どちらかを使用することができ、選択は、カメラノイズにとSEとQEのチャネル上の背景信号に最良のプローブ信号（明るさ）に基づいています。 ICUE1プローブと、ここで使用される実験条件（電池およびハイドロゲルタイプ）の場合、SEはQEよりも強いシグナルを有します。二重鎖プローブによりドナーとアクセプターフルオロフォアの非等モル分布E SEの使用を必要とします。 、このようなICUE1として、分析物に結合するとFRETの減少我々はE SE = 1で、ここではそうであるように効率は、分析物と結合すると、正のシグナル伝達の変化を提示するために「反転」させることができるFRETプローブのため- CSE / AEMまたはE QE = QE / （AEMはQSをX）。
目の分析電子FAPは、FRET比を適切に補正するとEiのの推定値に敏感です。これは、28（QEイメージがアクセプター光退色とデム画像が続く）Eiを= 1-（QE / DEM）として効率アッセイをFRET QSに使用したのと同じキャリブレーションサンプルと従来のエンドポイントと推定することができますが、注意を最小限に抑えるように注意しなければなりませんドナーの偶発漂白。 （QE /（AEMはQSをX）） -私たちは、QSのために調整AEMに基づいデムの推定値が置換されている修正されたバージョン、 すなわち 、Eiは= 1を記述します。代わりに、Eiは= CSE / AEMを使用することができます。生きた細胞内Eiの量の推定は、すべてのプローブが完全なFRETに駆動されている必要があります。これは、分析物に結合するとFRETの減少などICUE1プローブとして、ために実際に達成するのは困難です。細胞溶解物および精製された検体を用いて、Eiはのin vitroベースの計算が最良であるが、この仕事の範囲外。ここでは、細胞中のcAMPを減少させるために2 '、5'-ジデオキシアデノシンを使用することをお勧めします。しかし、相対的なFAPは、bはありEは、信号のベースラインレベルから導出さEiの推定値を用いて算出します。これらの理由から（ここで行ったように）、研究は、ほとんどの場合、FRET比を報告したり、エンドポイント・キャリブレーションに基づいて相対的FAP、アゴニストを添加する前に、シグナリングベースラインがシグナル伝達が上位である飽和二アゴニストを追加した後、下限と信号でありますバウンド。フォルスコリンは、しばしば、cAMPシグナルを飽和する制御アゴニストとして使用されています。あるいは、cAMP類似体を使用することができるような8-ブロモアデノシン3 '、5'-環状一リン酸など。実験的処理間のシグナル伝達経路の潜在的な変化を識別するために、研究の終了時に使用されるポジティブコントロールが推奨されています。
セルあたりの平均シグナル伝達応答の計算は、いくつかの要因を考慮しなければなりません。まず、平均FRET比は、セル内の各ピクセルの比率の平均値として計算されるべきである、 すなわち 、（Σ（QE/cAem））/（画素数）の代わりに、RA細胞、 すなわち 、（ΣQE）/（ΣcAem）の平均QEとAEMのョ。バックグラウンドノイズが低いとして、後者は慎重にマスキングを必要としませんが、それは深刻な真の平均FRET比を過小評価します。しかし、画素比は、浮動小数点演算及び関心領域を定義し、細胞外背景ノイズから発生するスプリアス比の混入を避けるために、セル領域の注意深いバイナリマスキングを必要とします。セル全体の面積は、セル形状での結果にバイアスをかける避けるために定量化されなければなりません。マスキングは、細胞の形状および移動の変化に応じて時間をかけて再定義する必要があるかもしれません。除外基準は、QEウェル細胞レベルを下回ると、周辺のバックグラウンドレベルであるAEM信号から画素比率を除去するために定義されている場合、あるいは、セルより大きいのROIを使用することができます。記載の分析方法の詳細特殊なソフトウェア/プラグインなしでFRET分析のためにこの作品で使用される基本的な手順。顕微鏡メーカーや他のベンダーは、アドオンモジュール販売しますレシオメトリックおよびFRET分析を自動サポート彼らの顕微鏡ソフトウェア、のための。同様に、パブリックドメインのImageJソフトウェアは、RiFRETなどの粒子およびFRET分析のために利用可能ないくつかのプラグインを持っています。 2D画像を使用しているため、2番目、ピクセルベースの平均FRET比は、3D細胞構造の真の平均比を過小評価します。 2D信号表し、z軸に沿った平均。生細胞内のFRET比の三次元空間分布の計算は、（ 例えば 、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて）高速3Dイメージングなしでは不可能です。これは、2Dと3Dの両方の文化のための問題であるが、細胞構造の複数が平面の外に存在するように3Dでより大きな効果があります。これは、原形質膜EPAC1プローブPM-ICUEなどの細胞構造、に局在するプローブにとって大きな関心事です。スピアリングらを参照してください。比率の計算24上のセル厚の影響を補正するための提案のための2013年。 AEMの分布の分析をするために使用することができますプローブが調整セルと、撮像面の領域内に蓄積するかどうかを検出。これはまた、FRET比の空間分布を解釈すると、誤った結果を排除するために役立つ例えば 、（ 低 AEM領域は、低プローブ濃度を有し、プローブの飽和および高いFRET比を示すことができるIE）プローブ飽和を識別する。第三に、異なるFRETベースラインレベルは、トランスフェクション効率の違いを示す実験群間の発現、または基底シグナリングプローブができます。 「相対的分析」（ステップ10.1.1）が存在する場合時間をかけてFRET比のドリフトを除去するのに役立ちます。これは、サンプル間の応答の相対的な大きさの比較を容易にするが、基準サンプルに対する応答（対照区が平らな線である）の時間経過との比較を妨げます。 「絶対分析」（ステップ10.1.2）は、サンプル全体の応答速度の比較を容易にするが、各ラインはdissimによってスケーリングされるので、応答の大きさの比較を妨げますILAR定数。研究は、多くの場合、時間をかけてFRET比のドリフトを補正するために、ベースライン上の線形回帰を使用します。
説明3D FRET法は、他のプローブと撮像モダリティにも適用することができる細胞を含んだ3Dヒドロゲル、のタイムラプスイメージングを作製し、実行するための有用かつ実用的な方法です。上述したように、一本鎖のバイナリプローブ以外の他のFRETシステムは、強度ベースの信号のより複雑な補正が必要になります。あるいは、FRET（FLIM-FRET）の蛍光寿命イメージングプローブのドナーの発光寿命の変化を介してFRET効率を計算するために使用されてもよいです。強度ベースのFRETとは異なり、FLIM-FRETは、バックグラウンドノイズ、スペクトルブリードスルー、量子効率、および検出器の分光感度2に鈍感です。しかし、FLIMシステムは、高価な複雑で、まれであり、単一指数減衰とフルオロフォアおよび無FLIM 49ランオフで最適に動作します。記載の方法はまた、MOで使用することができます高度な顕微鏡プラットフォーム再（ 例えば 、FRET-TIRF、蛍光異方性、およびスペクトル相関FRET）。高速共焦点および多光子顕微鏡で3D撮影にこの方法を適用すると、応答シグナル伝達のサブ細胞分布の解析を容易にし、シグナル伝達解析の精度が向上します。この3D FRET法は、シミュレートされた3Dの細胞微小環境に高度な細胞生物学の研究を可能にします。このように、容易に薬理学および細胞間のシグナル伝達を研究し、操作されたヒドロゲルに基づく微細組織における薬物応答のスクリーニングを含む再生医療のニーズに適用することができます。
Acknowledgments
著者らは、ピッツバーグ、健康賞K01 AR062598の国立研究所、および助成金P30のDE030740の大学歯科医学部の財政支援を認めます。著者らはまた、ImageJのマクロのためのImageJとマイケル・カメロを開発するためのICUE1プラスミド、ウェインRasband博士ジンチャンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
| Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
| 2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
| 2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
| Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
| Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
| Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
| FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
| Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
| Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
| Pipette Tips (10,200,1,000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
| Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
| Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
| Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
| Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
| Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
| Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
| Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
| 60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
| CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
| CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
| Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
| NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
| Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
| OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
| Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |
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