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Biology

तीन आयामी hydrogels में इमेजिंग झल्लाहट

Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54135
Automatic Translation
*1, *1,3, 1,2
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS
* These authors contributed equally

Summary

Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग वास्तविक समय कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां शारीरिक तीन आयामी (3 डी) हाइड्रोजेल पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग microenvironments में झल्लाहट इमेजिंग कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। कि सक्रियण सीमा से अधिक रैखिक अनुपात की पैदावार ratiometric झल्लाहट जांच के लिए एक विश्लेषण में वर्णित है।

Abstract

Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) की इमेजिंग वास्तविक समय में कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। झल्लाहट का उपयोग अध्ययन में आमतौर पर दो आयामी (2 डी) संस्कृति है, जो तीन आयामी (3 डी) सेलुलर microenvironment की नकल नहीं है रोजगार। बुझती उत्सर्जन झल्लाहट इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक 3 डी हाइड्रोजेल पर्यावरण के भीतर कोशिकाओं की पारंपरिक widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक विधि प्रस्तुत किया है। यहाँ है कि जांच के सक्रियण सीमा से अधिक रैखिक अनुपात की पैदावार ratiometric झल्लाहट जांच के लिए एक विश्लेषण विधि वर्णित है। intracellular चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के स्तर का मापन, EPAC1 सक्रियण (ICUE1) और हाइड्रोजेल सामग्री के प्रकार, इस के साथ साथ एक photocrosslinking हाइड्रोजेल (पीसी-जेल पर निर्भर संकेत शिविर में अंतर का पता लगाने की क्षमता के लिए forskolin उत्तेजना के तहत chondrocytes एक जांच का उपयोग में प्रदर्शन किया है पॉलीथीन ग्लाइकोल dimethacrylate) और एक thermoresponsive हाइड्रोजेल (TR-जेल)। 2 डी झल्लाहट के तरीकों के साथ तुलना में,इस विधि थोड़ा अतिरिक्त काम की आवश्यकता है। प्रयोगशालाओं पहले से ही 2 डी में झल्लाहट इमेजिंग का उपयोग आसानी से एक 3 डी microenvironment में सेलुलर अध्ययन करने के लिए इस विधि को अपनाने कर सकते हैं। यह आगे इंजीनियर 3 डी microtissues में उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह इस तरह के anisotropy माप और प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim), के रूप में और उन्नत माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों confocal का उपयोग कर, स्पंदित, या संग्राहक रोशनी के साथ झल्लाहट इमेजिंग के अन्य रूपों के साथ संगत है।

Introduction

सेलुलर संकेत दोनों जटिल और औषध विज्ञान, ऊतक इंजीनियरिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा सहित कई क्षेत्रों के लिए परिणामी है। उपयोगी अनुसंधानात्मक उपकरण कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए और ऊतक उत्थान के लिए इष्टतम सामग्री को विकसित करने की जरूरत है। Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग रिसेप्टर सक्रियण, आणविक रचना, और supramolecular बातचीत (जैसे।, प्रोटीन / डीएनए complexation) जीवित कोशिकाओं में के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। झल्लाहट fluorophores 1 के बीच गैर विकिरणवाला ऊर्जा हस्तांतरण का एक प्रकार है। यह एक दक्षता कि व्युत्क्रमानुपाती एक दाता fluorophore और स्वीकर्ता fluorophore के बीच की दूरी के छठे सत्ता में आनुपातिक है। (- 10 एनएम आम तौर पर 1) 2 प्रकार, यह दो अलग अलग अणुओं के बीच या nanometer पैमाने पर एक अणु के क्षेत्रों में स्थानिक दूरी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। दाता और स्वीकर्ता fluorophores अलग मीटर हो सकता हैolecule प्रकार (असमलैंगिक झल्लाहट), जिसमें दाता उच्च ऊर्जा उत्सर्जन (छोटी तरंग दैर्ध्य) है, या एक ही प्रकार के (होमो-झल्लाहट)। झल्लाहट इमेजिंग निश्चित या जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता है, लेकिन सामान्य तौर पर तय कोशिकाओं जब उच्च गति confocal सिस्टम उपलब्ध नहीं हैं उच्च स्थानिक संकल्प पर आणविक बातचीत की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जीवित कोशिकाओं में इस तरह की प्रतिक्रिया 3 संकेत वास्तविक समय intracellular के रूप में बातचीत और प्रक्रियाओं है कि हिचकते हैं या निर्धारण से बदल रहे हैं, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

लाइव सेल अध्ययन बताते हैं कि रोजगार सादगी और कम पृष्ठभूमि (विमान कोशिकाओं के बाहर से कोई उत्सर्जन) की वजह से भाग में इमेजिंग का उपयोग दो आयामी (2 डी) सेलुलर संस्कृतियों झल्लाहट। हालांकि, 2 डी संस्कृतियों भी शारीरिक microenvironment और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति 4,5 की तुलना में कई सेलुलर प्रक्रियाओं में परिवर्तन। उदाहरण के लिए, सेल और बाह्य मैट्रिक्स बातचीत करने के लिए सेल का निवासी सेल काफी ईएएस के लिए अग्रणी 2 डी संस्कृति में बदल रहे हैंily सेल आकृति विज्ञान और polarity 6 में परिवर्तन मनाया। झिल्ली microdomains (जैसे।, Caveolae और लिपिड राफ्ट) और रिसेप्टर संकेतन जोरदार संस्कृति के माहौल में भाग द्वारा विनियमित रहे हैं, क्योंकि वे बाँध cytoskeletal घटकों 7,8 और सेल आकार और cytoskeletal संरचना जोरदार स्थानिक संस्कृति पर्यावरण 9 द्वारा विनियमित रहे हैं। Mechanotransduction केवल 3 डी मैट्रिक्स से प्रभावित नहीं है, लेकिन और अधिक जटिल माध्यमिक लदान की स्थिति से 2 डी संस्कृतियों 10 की तुलना में 3 डी वातावरण में engendered। अंत में, 3 डी matrices के पारगम्यता प्रसार में कमी आई है और 2 डी संस्कृतियों की तुलना में संकेतन अणुओं सेल के बंधन में वृद्धि हुई है के साथ सामान्य में संस्कृति के माध्यम से भी कम है। 3 डी संस्कृतियों के साथ एक बना सकते हैं और चिपकने वाला, रासायनिक और यांत्रिक संकेतों के संबंध में शारीरिक करने के लिए और अधिक समान एक microenvironment निरीक्षण करने के लिए सक्षम है। सेल बातचीत करने के लिए सेल को बढ़ावा दिया जा सकता है और चिपकने वाला गुण डब्ल्यू नियंत्रित किया जा सकताith संरचना, संरचना, और 3 डी सामग्री 11-13 की वास्तुकला (patterning)। सामग्री के यांत्रिक गुणों इसी तरह की संरचना और संरचना 14,15 द्वारा अनुरूप किया जा सकता है। हाइड्रोजेल में संवर्धन कोशिकाओं इसलिए परमिट प्राथमिक कोशिकाओं है कि अन्यथा डे के अंतर होगा या पारंपरिक तकनीक का उपयोग कर phenotype में परिवर्तन, जैसे पर अध्ययन झल्लाहट।, जोड़ कार्टिलेज से कोशिकाओं। इस प्रकार, एक विधि जीना 3 डी संस्कृतियों में झल्लाहट assays सक्षम करने के लिए की जरूरत है।

क्योंकि वे ऑप्टिकली पारदर्शी बनाया जा सकता है और microenvironment को नियंत्रित करने और सेलुलर संकेतों प्रदान करने के लिए रुझान हाइड्रोजेल scaffolds 3 डी झल्लाहट आधारित अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं। प्राकृतिक पॉलिमर से बने हाइड्रोजेल दशकों, जिलेटिन और आतंच 16 सहित के लिए सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया गया है। सेलुलर microenvironment पर अधिक नियंत्रण इन पॉलिमर की रासायनिक संशोधन के साथ और सिंथेटिक पॉलिमर 17,18 के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। hydrयांत्रिक कठोरता ogel और पारगम्यता उनकी बहुलक संरचना को बदलने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और आकार (पॉलिमर और Crosslink घनत्व) 19,20 जाल। इसके अलावा, हाइड्रोजेल वृद्धि कारक है और सेलुलर ligands के समावेश के माध्यम से बायोएक्टिव बनाया जा सकता है। क्योंकि इन संभावनाओं की, biosensing, दवा वितरण, और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल के विकास अनुसंधान 21 साल की एक बहुत सक्रिय क्षेत्र है। हाइड्रोजेल की 3 डी प्रिंटिंग भी सूक्ष्म ऊतकों के निर्माण के लिए विकास के दौर से गुजर रहा है और -organs 15 है। इस प्रकार, हाइड्रोजेल में कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग शारीरिक सेलुलर व्यवहार लगभग करने के लिए एक साधन के रूप में न केवल उपयोगी है, लेकिन यह भी अध्ययन और इंजीनियर ऊतक विकास अनुकूलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में है।

बाइनरी ratiometric झल्लाहट जांच सेलुलर संकेत का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी होते हैं और हाइड्रोजेल संस्कृतियों में उपयोग किया जा सकता है। प्रकाशित फ्लोरोसेंट की एक आंशिक सूची के लिए और जांच झल्लाहट, सेल प्रवास कंसोर्टियम वेबसाइट देखें (जैसे।, एक आयन या अणु है, इस क्षेत्र के enzymatic दरार के बंधन) कि fluorophores और इसलिए झल्लाहट परिमाण (या तो अधिक या कम) के बीच की दूरी को बदल 23। एक कम आम अभी तक उपयोगी जांच प्रकार दो fluorophores के वर्णक्रम ओवरलैप करते हैं, जो झल्लाहट परिमाण बदल में एक analyte संवेदनशील परिवर्तन पर निर्भर करता है। "एकल श्रृंखला" ratiometric जांच एक fluorophore जोड़ी एक अणु पर लिंक का उपयोग। "दोहरे श्रृंखला" जांच अलग अणुओं पर fluorophore जोड़े का उपयोग, लेकिन उनकी अभिव्यक्ति ही अभिव्यक्ति कैसेट 24 के तहत मिलकर किया जा सकता है। एकल fluorophore अभिव्यक्ति के साथ अध्ययन (उदा।, फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन), पढ़ाई के साथ विपरीत ratiometricझल्लाहट जांच अभिकर्मक दक्षता या सेल व्यवहार्यता के लिए नियंत्रित करने के लिए दोहरी अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है। Ratiometric झल्लाहट जांच अपेक्षाकृत अभिकर्मक दक्षता के प्रति असंवेदनशील है जब एक न्यूनतम सीमा (एकाग्रता असंवेदनशील) 23,25 ऊपर व्यक्त कर रहे हैं। वे उत्तेजना स्रोत उतार चढ़ाव और अन्य intracellular पर्यावरण कारकों (जैसे।, पीएच, आयनों) इतने लंबे समय के रूप में दोनों fluorophores इसी तरह से जिम्मेदार हैं असंवेदनशील हैं। इसके अलावा, उनकी प्रतिक्रिया नहीं ट्रांसक्रिप्शनल देरी के अधीन, के विपरीत फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रमोटर संवाददाता constructs 26,27 है।

Ratiometric झल्लाहट जांच आसानी से और अक्सर पारंपरिक widefield epifluorescence खुर्दबीन सिस्टम में कार्यरत हैं। विदेफीएल्ड सूक्ष्मदर्शी क्योंकि प्रणाली लागत, fluorophore विरंजन, और पर्याप्त अस्थायी समाधान के साथ संकेत परिवर्तन का कब्जा को लेकर चिंता का जीना सेल इमेजिंग के लिए लाइन स्कैनिंग confocal प्रणालियों से अधिक पसंद कर रहे हैं। इसके अलावा, एकल कोशिका गुदाकोशिकाओं की एक बड़ी आबादी पर विश्लेषण देखने के कई क्षेत्रों से अधिक एक मोटर चालित मंच और छवि पर कब्जा के साथ संभव है। विदेफीएल्ड माइक्रोस्कोपी असमलैंगिक झल्लाहट जांच संकेतों की तीव्रता के आधार पर विश्लेषण की आवश्यकता है। हालांकि तीव्रता विश्लेषण अन्य झल्लाहट के तरीकों की तरह जटिल हार्डवेयर की आवश्यकता नहीं है, और अधिक अधिग्रहण के बाद काम fluorophore व्यवहार और माइक्रोस्कोप / इमेजिंग सिस्टम विन्यास 28 के प्रभाव के लिए सही करने के लिए की जरूरत है। एक fluorophore का कब्जा कर लिया उत्सर्जन तीव्रता उत्तेजना ऊर्जा के एक समारोह में, fluorophore क्वांटम उपज, और संयुक्त फिल्टर और कैमरा / डिटेक्टर वर्णक्रमीय संवेदनशीलता और linearity 2 है। ये दाता और स्वीकर्ता के लिए भिन्न हो सकता है और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अंशांकन की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, स्वीकर्ता उत्सर्जन की इमेजिंग (दाता उत्तेजना प्रकाश द्वारा स्वीकर्ता की उत्तेजना और खून के माध्यम से दाता उत्सर्जन की स्वीकर्ता उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में) fluorophores के वर्णक्रमीय ओवरलैप से प्रभावित है 2।4; एकल श्रृंखला "जांच के आंतरिक रूप से सामान्यीकृत क्योंकि उनके fluorophores nanoscale पर equimolar हो रहे हैं, जबकि fluorophores" दोहरे श्रृंखला "जांच के लिए एक सेल 25,28 भर में विभिन्न stoichiometries में मौजूद हो सकता है यदि fluorophores।" एकल श्रृंखला " जांच के समान चमक (विलुप्त होने के गुणांक और क्वांटम उपज का समारोह), गैर रेखीय डिटेक्टर संवेदनशीलता के प्रभाव पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और मिलकर क्वांटम उपज / डिटेक्टर संवेदनशीलता 23 की जरूरत है के लिए छोटे और केवल सुधार कर रहे हैं की कर रहे हैं। इस प्रकार "एकल श्रृंखला" ratiometric झल्लाहट जांच सबसे आसानी से widefield माइक्रोस्कोपी 24 में लागू कर रहे हैं।

यह पत्र एक पारंपरिक widefield epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों में जीवित कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन है। यह आसानी से पहले से ही 2 डी में झल्लाहट प्रयोगों, साथ ही इंटर में रुचि प्रयोगशालाओं से बाहर ले जाने प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया जा सकता हैmicrotissues में सेलुलर संकेत। यहाँ हम चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) photocrosslinking भीतर लाइव chondrocytes में स्तरों (पीसी-जेल, पॉलीथीन ग्लाइकोल dimethacrylate) और thermoresponsive (TR-जेल, Matrigel) हाइड्रोजेल की झल्लाहट इमेजिंग आधारित माप के साथ विधि का प्रदर्शन। एक ratiometric झल्लाहट जांच EPAC1 (ICUE1) पर आधारित forskolin, जो शिविर में एटीपी के रूपांतरण उत्प्रेरित adenylyl साइक्लेज के लिए एक रासायनिक एगोनिस्ट के जवाब में शिविर स्तर का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। शिविर प्रिंसिपल दूसरा दूत मध्यस्थता जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर संकेतन में से एक है और यह नीचे की ओर विनिमय प्रोटीन सीधे शिविर (EPACs) द्वारा सक्रिय सहित विभिन्न कारकों को सक्रिय करता है। fluorophores शिविर EPAC डोमेन झल्लाहट में कमी के परिणामस्वरूप के लिए बाध्य पर अलग चाल। यहाँ वर्णित हाइड्रोजेल सामग्री की तैयारी, ICUE1 जांच के साथ सेल अभिकर्मक, और 3 डी हाइड्रोजेल में कोशिकाओं के embedding है। 3 डी झल्लाहट प्रयोग प्रक्रिया और छवि विश्लेषण आवश्यकमूल्यांकन करने के लिए सेल प्रति जांच गतिविधि समझाया जाता है। हम यह भी 2 डी और 3 डी में झल्लाहट विश्लेषण के निहित सीमाओं widefield माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर चर्चा की। यहाँ प्रस्तुत तकनीक मौजूदा 2 डी के तरीकों पर एक सुधार के बाद से यह एक और अधिक शारीरिक संदर्भ में विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है और कम छवि सुधार और अंशांकन की आवश्यकता है। महान उपयोगिता तथ्य यह है कि कई पारदर्शी सामग्री, जबकि सेल और अभिकर्मक वरीयताओं को बनाए रखा जा सकता का इस्तेमाल किया जा सकता है में निहित है।

Protocol

1. माल की तैयारी

  1. । लिन-गिब्सन एट अल 29 द्वारा वर्णित विधि के अनुसार पॉलीथीन ग्लाइकोल methacrylating द्वारा पॉलीथीन ग्लाइकोल dimethacrylate (PEGDM, 4000 मेगावाट) तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, PEGDM खरीदा जा सकता है।
  2. एक दो कदम प्रक्रिया है, जहां पहले डाइमिथाइल phenylphosphonite एक Michaelis-Arbuzov प्रतिक्रिया और फिर लिथियम नमक के माध्यम से 2,4,6-trimethylbenzoyl choride साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है के माध्यम से, photoinitiator, लिथियम फिनाइल-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (एलएपी) synthesize Majima एट अल। 30 के अनुसार, 2-butanone में लिथियम ब्रोमाइड जोड़कर बनाया।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अन्य photoinitiators खरीदा जा सकता है, लेकिन एलएपी बेहतर biocompatibility और दक्षता 31 crosslinking पता चलता है।
  3. कांच के हाइड्रोजेल के संबंध में सक्षम है और जिससे इमेजिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए कांच coverslips functionalize।
    1. उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, उपयोग के साथ एक रासायनिक हुड में3- (Trimethoxysilyl) propyl methacrylate पीसी-जैल और टी.आर. जैल 31 के लिए epoxy silanes (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane) के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार। नोट: वैकल्पिक रूप से, precoated स्लाइड खरीदा जा सकता है। ध्यान दें कि कवर पर्ची 3.8 चरण में PDMS पकवान की अच्छी तरह से बड़ा होना चाहिए।

2. सेल अभिकर्मक

  1. एक टिशू कल्चर हुड में और बाँझ तकनीक, पिघलना का उपयोग कर और उप confluency पर वांछित कोशिकाओं प्लेट - 15,000 कोशिकाओं / 2 सेमी 6 में अच्छी तरह से गैर इलाज संस्कृति बर्तन में (50 से 70%), के साथ साथ गोजातीय chondrocytes। नोट: किसी भी प्रासंगिक सेल प्रकार इस्तेमाल किया जा सकता है, लंगर स्वतंत्र कोशिकाओं सहित।
    1. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एक दिन के लिए ठीक करने की अनुमति दें। बाद के चरणों से पहले, मध्यम हटाने पीबीएस के साथ कुल्ला, और अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर phenol- और सीरम मुक्त माध्यम जोड़ें।
  2. प्रत्येक के लिए अगले दिन खैर, 3 100 phenol- और सीरम मुक्त माध्यम से μl के साथ-साथ जोड़नेएक autoclaved कांच टेस्ट ट्यूब को μl अभिकर्मक अभिकर्मक। , मिश्रण को हल्के ट्यूब हिला। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। प्रकाश के लिए किसी भी निवेश की सीमा।
  3. 1 माइक्रोग्राम प्रति झल्लाहट डीएनए जांच और हल्के से हिला जोड़ें। आरटी पर मिश्रण सेते हैं और प्रकाश से दूर 30 मिनट के लिए।
    नोट: इस प्रयोग ICUE1 प्लाज्मिड में (डॉ जिन झांग 33 के सौजन्य से) का इस्तेमाल किया गया था। ICUE1 में fluorophores सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी, दाता) और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP, स्वीकर्ता) कर रहे हैं। अभिकर्मक अभिकर्मक के अनुपात से डीएनए प्लाज्मिड करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का इष्टतम अभिकर्मक के लिए समायोजन की आवश्यकता होगी।
  4. तैयार मिश्रण (~ 104 μl) कोशिकाओं प्लस phenol- और सीरम मुक्त मध्यम 2 मिलीलीटर युक्त 6 कुओं में से प्रत्येक के लिए बुद्धिमान ड्रॉप बांटो। pipet और नीचे मत करो। धीरे थाली मिश्रण करने के लिए ज़ुल्फ़।
  5. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। नोट: confluency अभिकर्मक दक्षता को रोकता है और रिसेप्टर्स की अंतर्जात अभिव्यक्ति बदल।

3. का निर्माणहाइड्रोजेल कास्टिंग और संस्कृति के लिए PDMS Molds

  1. पर polydimethylsiloxane (PDMS) कास्ट करने के लिए, साबुन से पहले कांच साफ, पानी की एक प्रचुर मात्रा में है, और फिर हवा के द्वारा पीछा isopropanol के साथ सूखी से कुल्ला एक बड़ा गिलास स्लाइड तैयार करने के लिए।
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक siliconizing अभिकर्मक के साथ कांच के इलाज के लिए इतना है कि PDMS आसानी से इलाज के बाद से खुली किया जा सकता है। जलग्रहण कंटेनर पर टोल्यूनि के साथ सतह के बंद अवशिष्ट अभिकर्मक कुल्ला। हवा के लिए सतह से पहले पूरी तरह से सूखे या समय के इंतजार छोटा करने के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी का उपयोग करने की अनुमति दें।
  2. एक हाइड्रोजेल ऊंचाई (जैसे, 1 मिमी) का चयन करें और 1.2 गुना PDMS की मात्रा की गणना इस मोटाई गिलास स्लाइड और हाइड्रोजेल ऊंचाई के आयाम का उपयोग करने का PDMS के साथ कांच स्लाइड को कवर करने की जरूरत है। नोट: PDMS हटना नहीं करता।
    1. एक बीकर में वजन द्वारा: 1 के अनुपात में एक 10 पर PDMS किट घटकों का मिश्रण। यह अच्छी तरह से मिलाया जाता है एक बार, देगास के लिए घर वैक्यूम के अंतर्गत बीकर जगह है। रिलायंसवैक्यूम ieve यदि बुलबुले कंटेनर अतिप्रवाह और दोहराने के लिए शुरू करते हैं।
      नोट: अन्य हाइड्रोजेल मोटाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वृद्धि की पृष्ठभूमि की कीमत पर और वृद्धि की अस्पष्टता यदि centrifugation (कदम 6.2) नहीं किया जाता है।
  3. आधार पर चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी लपेटें और कांच के पक्ष PDMS को रोकने के लिए। ध्यान से पन्नी से घिरे इस कांच पर degassed PDMS के वांछित राशि डालना। PDMS ऊंचाई मापने। ध्यान रखें कि PDMS की ऊंचाई हाइड्रोजेल की अधिकतम ऊंचाई हो जाएगा। अगर किसी भी बुलबुले बनाई गई हैं जब घनघोर, फिर देगास या उन्हें एक रंग या सुई के साथ पॉप।
  4. 2 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में एक स्तर की सतह पर uncured PDMS प्लेस, या 24 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  5. एक बार यह ठीक हो गया है ध्यान से सतह से PDMS को हटा दें। हाइड्रोजेल लिए वांछित आकार (जैसे, 3 मिमी बेलनाकार पंच) बाहर पंच।
    नोट: Photocrosslinking कारण ढालना व्यास की तुलना में थोड़ा संकरा पीसी जेल सिलेंडरों निकलेगाPDMS में आणविक ऑक्सीजन से प्रतिक्रिया का शमन करने के लिए।
  6. छिद्रित PDMS जीवाणुरहित। लघु अवधि के प्रयोगों के लिए, 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में PDMS डूब।
  7. एक मोटाई माइक्रोस्कोप उद्देश्य सुधार करने के लिए मिलान की एक बाँझ गिलास coverslip के साथ निष्फल PDMS के आधार फिटिंग द्वारा ढालना इकट्ठा करो। चरण 6 में उपयोग के लिए अलग निर्धारित करें।
  8. (एक अच्छी तरह से व्यापक और हाइड्रोजेल से लम्बे) के साथ उपरोक्त तरीकों का उपयोग कर हाइड्रोजेल और मध्यम को रोकने के लिए एक बड़ा PDMS पकवान बनाना। एक मध्यम मात्रा हाइड्रोजेल हाइड्रोजेल विसर्जित करने के लिए और analyte के कमजोर पड़ने से कम करने के लिए कम से कम 10x अधिक ठहरें।

4. हाइड्रोजेल अग्रदूत साबित समाधान की तैयारी

  1. एक टिशू कल्चर हुड में और बाँझ तकनीक का उपयोग कर, तुरंत कोशिकाओं को जोड़ने से पहले अध्ययन के लिए हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान उचित तैयार करते हैं। इस प्रकार के रूप बहुलक अग्रदूत से पीसी-जेल तैयार करें।
    1. फॉस्फेट बफर खारा में PEGDM पाउडर मिक्स (पीबीएस, पीएच 7.2) 10% से कम (डब्ल्यू / वी)।
    2. 0,005 के एक अंतिम एकाग्रता में photoinitiator (जैसे, एलएपी) जोड़ें - 0.01% (w / v) और pipetting द्वारा मिश्रण। प्रकाश से एल्यूमीनियम पन्नी या ढाल के साथ समाधान कवर गोद के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील है।
      नोट: यहाँ TR-जेल कम वृद्धि कारक बाह्य मैट्रिक्स के रूप में निर्माता द्वारा आपूर्ति किया जाता है।

5. हाइड्रोजेल समाधान में सेल निलंबन

  1. एक टिशू कल्चर हुड और बाँझ तकनीक का उपयोग कर में, कुओं से मध्यम aspirate।
  2. कुओं के लिए पीबीएस जोड़ें और फिर अच्छी तरह जुड़ी सेल monolayers कुल्ला करने के लिए हटा दें।
  3. प्रति सेल हदबंदी समाधान के 25 सेमी 2 2 से 3 मिलीलीटर का उपयोग करते हुए संस्कृति सब्सट्रेट से कोशिकाओं को अलग कर देना। धीरे रॉक, तो 10 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते - 20 मिनट या जब तक अलग। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए मजबूती से पकवान नल।
    नोट: वैकल्पिक सेल हदबंदी समाधान चयन उन है कि मैं ऐसा नहीं करने के लिए सीमित के साथ उपलब्ध हैंब्याज की रिसेप्टर्स cleaving द्वारा विश्लेषण के तहत संकेतन मार्ग mpact।
  4. बाद कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, phenol- और सीरम मुक्त मध्यम 2 मिलीलीटर, एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं को जोड़ने कोशिकाओं को निलंबित, और गिनती। नोट: रासायनिक परिभाषित सीरम मुक्त माध्यम (जैसे, इंसुलिन, transferrin और सेलेनियम के साथ पूरक) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. बाँझ शीशियों और गोली (जैसे, प्रति शीशी 2.0 x 10 6 कोशिकाओं) में सेल प्रकार के आधार पर कोशिकाओं की वांछित संख्या विभाज्य।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें, हाइड्रोजेल अग्रदूत के वांछित मात्रा जोड़ने और pipetting द्वारा कोशिकाओं को निलंबित। जब हाइड्रोजेल की जेड अक्ष visualizing के रूप में ध्वस्त हो गई है कि XY विमान में 2 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी निकलेगा अग्रदूत का एक मात्रा का प्रयोग करें (जैसे, एक 1 मिमी मोटी हाइड्रोजेल 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं से युक्त के लिए शीशी प्रति 1.0 मिलीलीटर / एमएल)। बुलबुले का उत्पादन करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    1. जल्दी सेल व्यवहार्यता 34 पर नकारात्मक प्रभाव को सीमित करने के लिए अगले चरण पर जाने </ Sup>।

6. हाइड्रोजेल तैयारी

  1. एक टिशू कल्चर हुड में और बाँझ तकनीक का उपयोग कर, चरण 3 में तैयार कास्टिंग molds करने के लिए सेल युक्त हाइड्रोजेल अग्रदूत जोड़ने (जैसे, प्रति 3 मिमी व्यास x 1 मिमी उच्च ढालना 7.1 μl)। एक अतिरिक्त हाइड्रोजेल बनाएँ, एक ही तरीके वर्णित के अनुसार, माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रणाली जांच के लिए उपयोग करें और अंशांकन जांच (यदि निहित जांच दक्षता अज्ञात है) करने के लिए।
  2. सेंट्रीफ्यूज तैयार सेल युक्त / हाइड्रोजेल अग्रदूत जमाना करने से पहले एक भी फोकल हवाई जहाज़ के लिए कोशिकाओं सीमित और विमान संकेत से बाहर कम करके इमेजिंग अनुकूलन करने के लिए crosslinking (चित्रा 1)। सेल प्रकार और अग्रदूत (4 मिनट के लिए 400 ग्राम) की चिपचिपाहट को centrifugation समय और बल को समायोजित करें।
  3. जेल या समाधान crosslink
    1. पीसी-जेल हाइड्रोजेल लिए, एक जोखिम समय के बराबर के लिए एक यूवी एक प्रकाश स्रोत (λ = 365 एनएम) के साथ सेल युक्त अग्रदूत चमकाना3.2 जम्मू / मिलीमीटर मोटाई 2 सेमी प्रति photocrosslink करने के लिए।
      नोट: गणना में 1 मिमी न्यूनतम मोटाई का प्रयोग करें। निवेश जोखिम 1-5 मिनट रेंज में गिर चाहिए। कम से कम जोखिम के समय का उपयोग करें। ओवर-irradiating इस रूप में कोशिकाओं व्यवहार्यता कम होती है और सीएफपी दाता ब्लीच जाएगा से बचें। हालांकि, जोखिम बार कम से कम 60 एस की सिफारिश नहीं है क्योंकि उच्च तीव्रता के विकिरण के कट्टरपंथी आत्म-शमन और गरीब सेल व्यवहार्यता की ओर जाता है कर रहे हैं।
    2. TR-जेल हाइड्रोजेल लिए, एक पेट्री डिश में भरा ढालना जगह है और thermally gelate करने के लिए एक मशीन के लिए कदम। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. बीच बढ़िया तालमेल या हाइड्रोजेल crosslinking के बाद, PDMS हाइड्रोजेल कास्टिंग मोल्ड हटाने और (3.5 कदम से) तैयार बड़ा PDMS पकवान के साथ बदलें। एक बाँझ रंग यह पालन करने के साथ कांच पर नीचे PDMS दबाएँ।
    1. जगह इस एक बाँझ कंटेनर में coverslip के साथ पकवान PDMS इस तरह के एक पेट्री डिश के रूप में। फिनोल मुक्त सीरम मुक्त मध्यम जोड़ें या रासायनिक मेरे परिभाषितdium करने के लिए अच्छी तरह से PDMS पकवान और coverslip हाइड्रोजेल डूबे रखने के लिए के साथ बनाया (सीरम मुक्त माध्यम इंसुलिन, transferrin और सेलेनियम (कदम 5.4) के साथ पूरक)। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: एक coverslip के साथ एक विशेष पकवान का उपयोग करते हैं, तो उस में coverslip जगह और इसी के माध्यम जोड़ें।
    2. वैकल्पिक रूप से, के रूप में विकिरण तरंग दैर्ध्य सीएफपी दाता उत्तेजना स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप जांच ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए झल्लाहट इमेजिंग एक दिन पहले यह कदम प्रदर्शन करते हैं।

7. 3 डी इमेजिंग झल्लाहट

  1. पेट्री डिश से हाइड्रोजेल, कदम 6.4 में तैयार पकवान के साथ PDMS निकालें, और XY खुर्दबीन मंच (चित्रा 2) के लिए एक समायोज्य नमूना धारक में सुरक्षित। खुर्दबीन मंच पर नमूना धारक स्थिति। उद्देश्य के लिए तेल लागू अगर जरूरी है। (यानी, 1.3 एनए) अपेक्षाकृत कमजोर fluorophor पर कब्जा करने के लिए कम से कम 40X की और उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) का एक उद्देश्य का प्रयोग करेंई उत्सर्जन।
  2. प्रेषित प्रकाश इमेजिंग का उपयोग इमेजिंग के लिए कक्षों का चयन करें और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ अभिकर्मक सत्यापित करें: छवि अधिग्रहण के लिए देखने के क्षेत्रों (FOVs) विन्यस्त करें। कम से कम 15 विभिन्न कोशिकाओं को चुनें।
    1. कक्षों का चयन करें कि न तो बहुत उज्ज्वल और न ही बहुत कम हैं (जो अन्यथा जांच के लिए ले जा सकता अधिक संतृप्ति या कम संवेदनशीलता) और 0.0 और 1.0 के बीच झल्लाहट अनुपात (जो अन्यथा नुकसान या बाइनरी जांच के क्षय को इंगित करता है) के साथ। तब निवेश की सीमा प्रकाश बंद।
    2. हाइड्रोजेल के केंद्र के लिए और अपेक्षाकृत सपाट रोशनी क्षेत्र के भीतर ब्याज की कोशिकाओं के साथ बंद करें FOVs (चित्रा 3 बी देखें और नीचे 9.2 चरण)।
  3. झल्लाहट छवि चैनलों के लिए कैमरा सेटिंग विन्यस्त करें। FOV के केंद्र के पास कुछ कोशिकाओं के बीच चुनें "ऑप्टिकल विन्यास" (यानी।, जोखिम और छवि चैनल के अनुसार लाभ) अनुकूलन करने के लिए।
    नोट: नीचे नामकरण dependin बदलता हैमाइक्रोस्कोप और कैमरा संचालित करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर जी। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर, एनआईएस-तत्वों, छवि पर कब्जा और विश्लेषण के लिए यहां इस्तेमाल किया जाता है।
    1. बुझती उत्सर्जन (क्यूई) है, जो दाता उत्तेजना और स्वीकर्ता उत्तेजना (AEM) के तहत अपनाने उत्सर्जन के तहत दाता उत्सर्जन है: एकल श्रृंखला जांच की झल्लाहट विश्लेषण के लिए, प्रति FOV दो छवि चैनलों का चयन करें।
      नोट: ICUE1 CFP-YFP जांच, QE के लिए एक सीएफपी उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर जोड़ी के लिए (418 - 442 पूर्व, 458 - 482 ईएम) और AEM के लिए एक YFP उत्तेजना और उत्सर्जन जोड़ी (490 - 510 पूर्व, 520 - 550 ईएम) उपयोग किया जाता है।
    2. क्यूई और AEM संतृप्ति के बिना अधिकतम संकेत तीव्रता का अधिग्रहण करने के लिए जोखिम सेट (और एक सीसीडी का उपयोग करते हुए, कम से कम संभव लाभ के साथ हो तो) पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए। प्रयोगात्मक समूहों परिणाम (यानी, उत्तेजना शक्ति, आईरिस आकार, जोखिम, और कैमरे के लाभ) biasing से बचने के लिए बीच में (छवि दोनों fluorophores के लिए और प्रयोग भर में एक ही है, साथ ही ऑप्टिकल विन्यास रखेंUre 3 ए)।
    3. अतिरिक्त छवि चैनलों के अधिग्रहण अधिग्रहण के बाद और अधिक विश्लेषण विकल्प (जैसे, सुधारा अवगत उत्सर्जन (सीएसई) इमेजिंग (चर्चा देखने के लिए)) के लिए अनुमति देने के लिए। एम दाता (क्यूई, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में CFP-सीएफपी का चयन), पूर्व दाता - - एम स्वीकर्ता (एसई, का चयन CFP- ICUE1 CFP-YFP जांच के लिए, उत्तेजना (पूर्व) और उत्सर्जन (ईएम) पूर्व दाता के चैनलों का अधिग्रहण YFP), पूर्व स्वीकर्ता - एम स्वीकर्ता (AEM, YFP-YFP चयन), और पूर्व स्वीकर्ता - एम दाता (YFP-सीएफपी) विन्यास (चित्रा 3A देखें)।
  4. समय चूक छवि अधिग्रहण के लिए कब्जा दर विन्यस्त करें।
    1. कब्जा दर घटाएँ अगर हार्डवेयर द्वारा सीमित। लघु अवधि के assays के लिए (जैसे, 30 - 60 मिनट), संकेत कैनेटीक्स पर कब्जा करने के लिए प्रत्येक FOV (5 सेकंड नमूना दर) के लिए प्रति मिनट लगभग 12 अधिग्रहण निरूपित। न्यूनतम दर नमूना लेने के लिए आवश्यक का उपयोग signi से बचने के लिएficantly जांच photobleaching।
    2. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में कब्जा की अवधि टाइप करके अधिग्रहण की दर निर्धारित करें। लंबी अवधि के assays के लिए (जैसे।, 24 घंटे), उच्च अधिग्रहण की दर के साथ प्रारंभिक पल्स प्रतिक्रिया पर कब्जा करने के लिए शुरू और फिर, एक कम दर अधिग्रहण, जैसे करने के लिए स्विच हर 5 से 10 मिनट के लिए।
  5. 5 मिनट के लिए छवि अधिग्रहण और छवियों पर कब्जा आरंभ करने के लिए नामित FOVs पर जांच की प्रतिक्रिया के लिए एक आधारभूत स्थापित करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में "अब भागो" का चयन करें।
  6. वांछित एगोनिस्ट या प्रतिपक्षी analyte में छवि अधिग्रहण, pipet के 5 मिनट (जैसे, 100 एनएम पर Forskolin) के बाद, pipetting द्वारा मिश्रण है, और इमेजिंग जारी है।

8. झल्लाहट कैलिब्रेशन

  1. प्रणाली कैलिब्रेशन: अतिरिक्त अंशांकन हाइड्रोजेल, गढ़े चरण 6 में वर्णित के रूप में एक ही FOV मानदंड, ऑप्टिकल विन्यास, और कैमरा सेट का उपयोग कम से कम 6 प्रतिनिधि कोशिकाओं के AEM छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग करें,सी चीज़ें (कदम 7.1, 7.2, और 7.3) के ऊपर झल्लाहट इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया।
    नोट: क्वांटम उपज और वर्णक्रमीय संवेदनशीलता (क्यूएस) संयुक्त जांच और माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रणाली के लिए की मात्रा का ठहराव के लिए "पूर्ण" झल्लाहट विश्लेषण लेकिन नहीं "रिश्तेदार" झल्लाहट की जरूरत है।
    1. पूर्ण तीव्रता (AEM चैनल पर उत्तेजना) में उत्तेजना प्रकाश के लिए एक 5 मिनट लंबे समय जोखिम का चयन करके स्वीकर्ता fluorophore photobleach। ब्याज की ही कोशिकाओं को ब्लीच करने के लिए एक संकीर्ण एपर्चर का प्रयोग करें। सत्यापित करें कि AEM संकेत कम से कम 10% से पहले और बाद photobleaching संकेत तीव्रता हिस्टोग्राम ( "LUT" विंडो) की तुलना द्वारा मूल संकेत से कम है। photobleaching यदि संकेत हानि कम से कम 90% है जारी रखें।
      नोट: AEM उत्तेजना फिल्टर है कि दाता उत्तेजना स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप नहीं है का उपयोग करके यह सुनिश्चित दाता fluorophore इस प्रक्रिया के दौरान प्रक्षालित नहीं है।
    2. अब प्रक्षालित स्वीकर्ता fluorophore साथ दाता उत्तेजना के तहत दाता उत्सर्जन मोल (डीईएम) हमेंकदम 7.3 में QE के लिए के रूप में एक ही ऑप्टिकल विन्यास हैैं।
    3. डेम पृष्ठभूमि सुधार के बाद AEM से विभाजित के रूप में पिक्सेल प्रति क्यु की गणना करें, नीचे धारा 9 के रूप में। क्यूएस = डेम / AEM
    4. सेलुलर औसत से कोशिकाओं के बीच औसत क्यु की गणना।
  2. जांच (ईआई) अंशांकन नमूना का उपयोग कर के निहित झल्लाहट दक्षता का अनुमान है। जांच की अधिकतम झल्लाहट प्रेरित और ईआइ = 1 की गणना - नीचे धारा 9 के रूप में क्यूई / (AEM x क्यूएस)। (क्यूई / डीईएम) - वैकल्पिक रूप से, ईआइ = सीएसई / AEM, या Ei ईआइ = 1 के साथ झल्लाहट दक्षता के लिए एक पारंपरिक समापन बिंदु परख उपयोग कर की गणना का उपयोग करें।
    नोट: ईआइ सक्रिय जांच (FAP, यानी, बाध्यकारी analyte जांच के अंश) के पूर्ण अंश यों की जरूरत है, लेकिन के लिए "रिश्तेदार" झल्लाहट विश्लेषण आवश्यक नहीं।
    1. जांच जो analyte के साथ बातचीत पर झल्लाहट में वृद्धि के लिए analyte उत्पादन / सक्रियण के एक agonist के साथ संस्कृति उत्तेजक द्वारा जांच प्रतिक्रिया तर।
    2. जांच interactio बाधितanalyte जांच जो analyte बाध्यकारी पर झल्लाहट में कमी के लिए संकेत के एक विरोधी का उपयोग के साथ एन। नोट: ICUE1 जांच के मामले में, इस तरह के 2 के रूप में एक adenyl साइक्लेज अवरोधकों 'के साथ शिविर स्तरों को दबाने, 5'-Dideoxyadenosine (विशिष्ट) या 3-isobutyl मिथाइल-xanthine (गैर विशिष्ट)।

9. झल्लाहट अनुपात की गणना

  1. ड्रा और ब्याज (आरओआई) FOV प्रति कोशिकाओं समय के साथ प्रत्येक FOV में पृष्ठभूमि स्तर (चित्रा 3 बी) को परिभाषित करने के लिए पास के एक क्षेत्र को नामित, लेकिन (चित्रा -4 ए छवि के केंद्र में अपेक्षाकृत समरूप रोशनी के क्षेत्र के लिए रॉय को प्रतिबंधित )। पृष्ठभूमि सुधार विकल्पों में से एक स्पष्टीकरण के लिए चर्चा देखें।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ: "पृष्ठभूमि रॉय चिह्न" पर तीर का चयन करें और "अण्डाकार पृष्ठभूमि रॉय ड्रा" (अन्य आकृतियों काम करेंगे) का चयन करें। सुनिश्चित करें कि "ऑफसेट पृष्ठभूमि को अद्यतन रखने के" चुना है। सक्रिय करें होड़पृष्ठभूमि रॉय आइकन पर क्लिक करके पृष्ठभूमि रॉय के पंख। वैकल्पिक रूप से, "रॉय चिह्न" और रॉय गुण "पृष्ठभूमि रॉय के रूप में प्रयोग करें" और "ROIs प्रत्येक बहु में अलग हैं" के रूप में सेट का उपयोग करें।
    2. ImageJ के साथ: परिपत्र ड्राइंग उपकरण का चयन करने के लिए उपकरण पट्टी का प्रयोग करें। फिर मेनू के माध्यम रॉय प्रबंधक को आकार जोड़ने "विश्लेषण → उपकरण → रॉय प्रबंधक"। रॉय प्रबंधक में पृष्ठभूमि रॉय के लिए एक अलग रंग सेट अगर वांछित।
    3. प्रत्येक FOV और छवि चैनल (जैसे, क्यूई और AEM) के लिए, प्रति समय बिंदु पृष्ठभूमि रॉय के भीतर औसत मूल्य घटाना चैनल के अनुसार एक सही छवि बनाने के लिए, जैसे, sQE टी, पी = QE टी, पी - bQE टी, पी जहां टी अधिग्रहण समय है, पी FOV (यानी, XY स्थिति) है, और bQE और bAem पृष्ठभूमि रॉय के भीतर संकेत के अदिश मान रहे हैं। छवि के गणित कार्यों सॉफ्टवेयर में उपलब्ध प्रयोग करें।
      1. डब्ल्यूमाइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर ith, "रॉय पृष्ठभूमि चिह्न" का उपयोग करें और चुनें "घटाना पृष्ठभूमि रॉय का प्रयोग"। पॉप-अप विंडो में, "पर घटाना पृष्ठभूमि रॉय" "हर छवि 'के तहत चयन करें और" पर लागू करें "के अंतर्गत चुनें" सभी फ्रेम "।
        नोट: एक पृष्ठभूमि रॉय ठीक से काम करने के लिए इस समारोह के लिए हर FOV में परिभाषित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, कार्य ठीक पृष्ठभूमि ROIs के साथ FOV के लिए पृष्ठभूमि घटाना नहीं करता है तो कुछ FOV अपरिभाषित पृष्ठभूमि ROIs है।)।
      2. ImageJ के साथ, माइकल Cammer द्वारा लिखित मैक्रो (http://microscopynotes.com/imagej/macros/) "रॉय से बीजी घटाव" का उपयोग करें।
    4. निम्नलिखित विश्लेषण चरणों के लिए "के रूप में सहेजें" का चयन करके छवियों के सुधारा समय श्रृंखला को बचाओ।
  2. प्रत्येक FOV (चित्रा 4 बी) में विश्लेषण के तहत प्रत्येक कक्ष के लिए एक द्विआधारी मुखौटा का उपयोग सेल के चारों ओर एक रॉय को परिभाषित करें। प्रारंभ ओ पर FOV प्रति छवि दहलीज को AEM चैनल का उपयोग करेंप्रयोग एफ, सेल सीमाओं की पहचान है, और ROIs परिभाषित किया। ROIs बचाओ।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ: प्रत्येक फ्रेम के लिए (यानी, FOV), पहली मेनू का उपयोग करें "बाइनरी → परिभाषित सीमा" और "वर्तमान फ्रेम करने के लिए लागू करें" का चयन करें। कक्षों का चयन करने के लिए कम मूल्य सीमा को समायोजित करें। फिर "बाइनरी → बंद" समारोह का उपयोग यदि आवश्यक हो तो बाइनरी नकाब में छेद में भरने के लिए। अगला का चयन करने के लिए "कॉपी रॉय को बाइनरी" रॉय आइकन का उपयोग करें; द्विआधारी परत स्वचालित रूप से हटा दिया है।
      1. ROIs के मौजूदा पूल करने के बाद फ्रेम के लिए ROIs जोड़ें। किसी भी नकली ROIs हटाएँ। अगली ROIs पर "राइट क्लिक करें" और यकीन है कि उनके गुण "मानक रॉय के रूप में प्रयोग कर रहे हैं" और "ROIs प्रत्येक बहु में अलग हैं" बनाते हैं।
      2. ImageJ के साथ: प्रत्येक FOV के लिए, पहली मेनू का उपयोग करें "छवि → → दहलीज समायोजित"। तब उपयोग "विश्लेषण → विश्लेषण कण" रूपरेखा शो के साथ और चयनित प्रबंधक को जोड़ें। उपयोग"बाइनरी → नजदीक" यदि आवश्यक हो तो बाइनरी नकाब में "छेद" में भरने के लिए। मिटायें नकली ROIs। मुफ्त plugins इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए उपलब्ध हैं।
  3. प्रत्येक पिक्सेल पर त्वरित अनुमानों के आधार झल्लाहट अनुपात की गणना, sQE / Saem रिश्तेदार के विश्लेषण के लिए (चरण 10 देखें) और ई QE = sQE / (क्यु x Saem) पूर्ण विश्लेषण (चरण 10 देखें) क्यु साथ कदम 8.1 में प्राप्त करने के लिए। छवियों की चल बिन्दु विभाजन का प्रयोग करें। अनुपात derivations की एक विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ: मेनू "छवि → छवि के संचालन" का प्रयोग करें और चुनें "फ्लोटिंग प्वाइंट"।
    2. ImageJ के साथ: उपयोग या तो "प्रक्रिया → छवि कैलक्यूलेटर" समारोह या "Calculator_Plus.java" प्लगइन। नोट: वैकल्पिक रूप से, मैक्रो "pH_ratioMacro" .txt "अनुकूलित किया जा सकता है झल्लाहट अनुपात की गणना करने के लिए यह पृष्ठभूमि सुधार ऊपर वर्णित मैक्रो को रोजगार और पर उपलब्ध है।
  4. एक स्प्रेडशीट और रेखांकन सॉफ्टवेयर में सेल प्रति औसत अनुपात में निर्यात (यानी, रॉय के अनुसार)।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ: "रॉय सांख्यिकी" विश्लेषण नियंत्रण या "समय विश्लेषण" विश्लेषण नियंत्रण में "स्प्रेडशीट निर्यात" बटन में या तो एन डी निर्यात बटन का प्रयोग करें।
    2. ImageJ के साथ: पहले मेनू "विश्लेषण → माप निर्धारित" और यकीन है कि "मतलब मूल्य" और "मानक विचलन" चयनित हैं का चयन करें। तब रॉय प्रबंधक का उपयोग करें और बटन "उपाय" का चयन करें। उत्पन्न परिणाम विंडो को बचाओ।

10 झल्लाहट अनुपात विश्लेषण

  1. सेल के प्रति औसत अनुपात के समय में औसत सेलुलर झल्लाहट अनुपात की गणना (चरण 9.4 में निर्यात)। आधारभूत इस गणना में (analyte प्रशासन से पहले अनुपात) झल्लाहट अनुपातों पर विचार करें।
    नोट: स्प्रेडशीट और रेखांकन सॉफ्टवेयर आधारभूत-subtr साजिश करने के लिए यहां इस्तेमाल किया जाता हैअभिनय किया औसत झल्लाहट अनुपात और चरण 10.1.2 में के रूप में मतलब (SEM) आधारभूत पर एक रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर के अपने मानक त्रुटि और 10.1.3 नीचे (आंकड़े 5 और 6)।
    1. सापेक्ष विश्लेषण (प्रतिक्रिया की भयावहता): एक आम संदर्भ नमूना करने के लिए प्रत्येक वक्र मानक के अनुसार (जैसे, अनुपचारित नमूना।)।
    2. निरपेक्ष विश्लेषण (प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम): एक आम प्रारंभ बिंदु के लिए घटता शिफ्ट अपनी आधारभूत साथ प्रत्येक वक्र सामान्य से अनुपात झल्लाहट।
      1. स्प्रेडशीट और रेखांकन सॉफ्टवेयर में, डेटा नए कॉलम के साथ, ऐसा है कि प्रत्येक स्तंभ मूल आधारभूत अवधि के लिए ही अनुपात डेटा युक्त एक नया स्तंभ के साथ रखा जाता है (सेल प्रति औसत अनुपात के कॉलम) बिछा (अनुपातों से पहले analyte जोड़ा)। डेटा के हर स्तंभ के बाद एक खाली कॉलम डालने के लिए "डालें कॉलम" का चयन करें। तब बनती खाली कॉलम में आधारभूत डेटा कॉपी।
      2. स्प्रेडशीट और रेखांकन सॉफ्टवेयर में, "का चयन सम्मिलित → नई विश्लेषण → Transfoआरएम आधारभूत निकालें "और फिर सेट" चयनित स्तंभ "के लिए" हर दूसरे ", चुनें" मान आधारभूत रैखिक है ", और" अंतर गणना "के तहत" "।
      3. औसत सेलुलर अनुपात और वर्णनात्मक आँकड़े गणना। स्प्रेडशीट और रेखांकन सॉफ्टवेयर में, "के साथ एसडी या SEM सम्मिलित → नई विश्लेषण → XY विश्लेषण → पंक्ति का मतलब है" का चयन करें और फिर चुनें पॉप-अप विंडो में "पंक्ति SEM के साथ अर्थ है"।

Representative Results

सभी हाइड्रोजेल व्यापारियों, कोशिकाओं, और कास्टिंग molds के रूप में ऊपर वर्णित तैयार थे। सेल लादेन अग्रदूत समाधान PDMS नए नए साँचे में डाल दिया जाए और उसके बाद / जमाना पहले centrifuged coverslip के पास कोशिकाओं को स्थिर और झल्लाहट इमेजिंग विश्लेषण (चित्रा 1) की सुविधा के लिए photocrosslinking। संलग्न coverslips के साथ हाइड्रोजेल सूक्ष्म इमेजिंग (चित्रा 2) के लिए तैयार PDMS इमेजिंग कुओं के भीतर रखा गया था। ऑप्टिकल विन्यास और छवि अधिग्रहण मापदंडों तो के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया है निर्धारित किया गया। CFP-YFP fluorophore जोड़े के लिए सभी चार झल्लाहट संबंधित छवि चैनलों की कैद प्रदर्शन किया है (चित्रा 3 में नीचे देखना "ऑप्टिकल सम्मेलन।"), के रूप में गैर द्विआधारी जांच के लिए आवश्यक है। हालांकि इस काम में केवल दो छवियों एकल श्रृंखला बाइनरी ICUE1 जांच, QE = "सीएफपी सीएफपी" और AEM = "YFP YFP" (उत्तेजना उत्सर्जन) के लिए आवश्यक हैं। एकाधिक FOVs (XY स्थितिओं) का चयन किया गया, जिसमें कई कोशिकाओं समरूप रोशनी क्षेत्र (चित्रा 3 बी) के भीतर बसता है। समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण के बाद, जांच के लिए संकेत डेटा निर्यात किया गया था। चैनल संकेतों की पृष्ठभूमि सुधार के लिए ROIs और सेल के विश्लेषण के लिए प्रयोगों (चित्रा 4) के शुरू होने से thresholded AEM छवियों का उपयोग नामित किया गया। कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले के रूप में सेल पूल के बीच में से चयन किया गया था पर्याप्त (भी मंद नहीं) है, लेकिन बहुत अधिक नहीं (जरूरत से ज्यादा चमकदार) जांच (चित्रा 4 बी)। प्रत्येक अधिग्रहण पर पिक्सेल प्रति QE और एसई झल्लाहट अनुपात की पृष्ठभूमि घटाया छवि चैनलों के चल बिन्दु विभाजन का उपयोग कर की गणना की गई। सेल के प्रति औसत झल्लाहट अनुपात (यानी, प्रति आरओआई) की गणना की गई, आधारभूत संकेत उत्तेजना से पहले सामान्यीकृत (यानी, आधारभूत सभी समय अंक से घटाया पर एक प्रतिगमन), और की मानक त्रुटि के रूप में त्रुटि सलाखों के साथ साजिश रची मतलब (SEM)। दोनों क्यूई और सीएसई आधारित झल्लाहट अनुपातों deforskolin उत्तेजना (100 एनएम, चित्रा 5) के तहत chondrocytes में वृद्धि की गतिविधि शिविर tect। क्योंकि QE संकेत हाइड्रोजेल भीतर एम्बेडेड chondrocytes में शिविर गतिविधि के कम बेसल स्तर के कारण कम थी QE झल्लाहट अनुपात सीएसई झल्लाहट अनुपात की तुलना पृष्ठभूमि सुधार के लिए अधिक संवेदनशील था। दोनों हाइड्रोजेल प्रकार (TR-जेल और पीसी-जेल) (चित्रा 6) समय पर झल्लाहट अनुपात में वृद्धि हुई है, Forskolin के अलावा के लिए एक वृद्धि शिविर सिगनल प्रतिक्रिया का संकेत दिखाया। क्यूई झल्लाहट अनुपात से संकेत के रूप में, पीसी जेल हाइड्रोजेल में chondrocytes एक बड़ा शिविर में परिवर्तन (दिखाया गया है) और शिविर (ई QE के एक उच्च बेसल स्तर दिखा = पीसी जेल बनाम ई QE = TR-जेल में 0.09 में 0.19, आधारभूत घटाया आकृति में नहीं दिखाया गया है)।

आकृति 1
चित्रा 1: Photocrosslinked हाइड्रोजेल (पीसी-जेल) में सेल वितरण एक: सेल लादेन हाइड्रोजेल अग्रदूत coverslip के पास एक फोकल हवाई जहाज़ पर कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए centrifuged था। बी: यह FOV में कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है और विमान की कोशिकाओं के बाहर से पृष्ठभूमि संकेत को कम करता है। (स्केल बार = 200 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: PDMS डिश में हाइड्रोजेल
हाइड्रोजेल सूक्ष्म इमेजिंग और analyte उत्तेजना के लिए एक coverslip आधार के साथ एक लंबा PDMS अच्छी तरह से (10x हाइड्रोजेल की मात्रा) के अंदर रखा गया था। ताकि वे परख भर में जगह में रहने के पीसी-जेल हाइड्रोजेल पारदर्शी और coverslip को बंधुआ रहे हैं। PDMS अच्छी तरह से करने के अलावा एक व्यापक बायोप्सी पंच का उपयोग हाइड्रोजेल मात्रा की तुलना में 10x अधिक मध्यम रोकने के लिए बड़ा बनाया जा सकता हैhicker PDMS चादर। (स्केल बार = 2 मिमी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: झल्लाहट इमेजिंग के लिए अधिग्रहण विन्यास
एक: अधिग्रहण के कई स्थानों पर छवि पर कब्जा करने के लिए विन्यस्त किया गया था हर 7 सेकंड। क्यूई झल्लाहट अनुपात की गणना के लिए, केवल दो छवि चैनलों ICUE1 जांच का यहां इस्तेमाल किया (बाइनरी एकल श्रृंखला जांच) के तहत, QE = "सीएफपी सीएफपी" और AEM = "YFP YFP" (उत्तेजना उत्सर्जन) के लिए आवश्यक हैं "ऑप्टिकल सम्मेलन।" माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर की λ टैब में कॉलम। बी: FOVs ( "XY" पदों) का चयन किया गया, जिसमें कई कोशिकाओं समरूप रोशनी क्षेत्र के भीतर रहते थे। छवि के नीचे साजिश से पता चलता नीले रंग के साथ रोशनी की तीव्रता लाइन arrowedकि FOV के केंद्र से होकर बहती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: झल्लाहट इमेजिंग विश्लेषण के लिए ROIs का चयन
एक: ब्याज (आरओआई) कोशिकाओं की मुफ्त की एक क्षेत्र हर चैनल पर पृष्ठभूमि संकेत के लिए सही करने के लिए चुना गया था। एक सेल मुक्त हाइड्रोजेल की एक छवि के बजाय पृष्ठभूमि घटाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो सेल घनत्व या प्रवास उच्च है, या जब कोशिकाओं को एक सजातीय रोशनी क्षेत्र के भीतर झूठ नहीं है एक छायांकन मुखौटा इस्तेमाल नहीं किया है। बी: सेल ROIs की छवि thresholding और AEM चैनल के द्विआधारी मास्किंग का उपयोग कर चयन किया गया था। पृष्ठभूमि n से उत्पन्न बाह्य अनुपातों के शामिल किए जाने के कारण एक रॉय कोशिकाओं की तुलना में बड़ा प्रतिकूल सेल के प्रति औसत झल्लाहट अनुपात की गणना को प्रभावित करेगा का चयनOise। सेल प्रति प्रत्येक चैनल के औसत का उपयोग सेलुलर झल्लाहट अनुपात की गणना नहीं की सिफारिश के रूप में इस अनुपात underestimates है। (स्केल बार = 50 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Thermoresponsive हाइड्रोजेल (TR-जेल) में झल्लाहट अनुपात की तुलना
दोनों क्यूई और एसई आधारित झल्लाहट अनुपात के forskolin उत्तेजना के तहत chondrocytes में वृद्धि शिविर गतिविधि का पता लगाने। Forskolin एक adenyl साइक्लेज एगोनिस्ट जो शिविर उत्पादन को प्रेरित करता है। झल्लाहट कम हो जाती है जब ICUE1 जांच बांधता शिविर, और इस तरह QE झल्लाहट अनुपात (ई QE = sQE / (Saem x क्यूएस)) बढ़ जाती है। इसके विपरीत, एसई झल्लाहट अनुपात कम हो जाती है और इस प्रकार के ई एसई = 1 के रूप में साजिश रची है - सीएसई / Saem। हाइड्रोजेल एम्बेडेड chondrocytes में, QE एफरेत अनुपात कम बेसल शिविर गतिविधि के कारण एसई झल्लाहट अनुपात की तुलना पृष्ठभूमि सुधार क्योंकि QE संकेत कम है के प्रति संवेदनशील है। त्रुटि सलाखों = SEM, N = 25 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: विभिन्न hydrogels में झल्लाहट अनुपात की तुलना
दोनों हाइड्रोजेल प्रकार में chondrocytes शिविर की गतिविधियों में वृद्धि के रूप में समय से अधिक वृद्धि हुई QE झल्लाहट अनुपात द्वारा प्रदर्शन के साथ forskolin उत्तेजना को जवाब दिया। हाइड्रोजेल प्रकार से प्रभाव डालता है forskolin करने और बेसल सेलुलर शिविर गतिविधि में पारगम्यता में मतभेद सहित कई प्रभाव, के माध्यम से सेलुलर प्रतिक्रिया (ई QE = पीसी जेल बनाम ई QE में 0.19 = TR-जेल में 0.09, नहीं दिखाया गया है)। त्रुटि सलाखों = SEM, एन के लिए TR-जेल= 25, एन पीसी-जेल के लिए = 15 यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

इस काम दर्शाता है कि कैसे झल्लाहट इमेजिंग 3 डी हाइड्रोजेल में सेलुलर संकेत विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्व के अध्ययन हाइड्रोजेल 38 के साथ कोशिकी बातचीत की, हाइड्रोजेल substrates 35-37 पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग का प्रदर्शन किया है, और हाइड्रोजेल 39-41 में फंस अणुओं की, वहीं इस के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग आधारित intracellular विश्लेषण वर्णन करने के लिए पहला प्रकाशन है 3 डी हाइड्रोजेल। काम जब 2 डी से 3 डी झल्लाहट इमेजिंग का अनुवाद करने के लिए कई कार्यान्वयन के मुद्दों को हल करती है। सबसे पहले, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के लिए पर्याप्त उत्सर्जन संकेत इकट्ठा करने के लिए झल्लाहट इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, लेकिन वे क्षेत्र की गहराई की सीमा। यहाँ कोशिकाओं थोड़ा इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कांच के पास एक फोकल हवाई जहाज़ में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए centrifuging के माध्यम से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है। दूसरा, 3 डी हाइड्रोजेल scaffolds इमेजिंग जो विश्लेषण पेचीदा दौरान देखने के क्षेत्र भर में बहाव हो सकता है। यहाँ हाइड्रोजेल cov को बंधुआ रहे हैंerslip वे प्रयोग भर में रहना तय है कि इतनी। तीसरा, 3 डी झल्लाहट के लिए उचित हाइड्रोजेल रचनाओं का चयन आवश्यक है क्योंकि हाइड्रोजेल कोशिकाओं के दृश्य में बाधा हो सकती है। पीसी-जेल और टी.आर. जेल के यहाँ पारदर्शी हाइड्रोजेल किया जाता है। हालांकि, coverslip के पास एक फोकल हवाई जहाज़ के centrifugation साथ कोशिकाओं को एकत्र करने के साथ उच्च हाइड्रोजेल की diffraction.The पसंद microenvironment की स्थिति है कि नकली जाना चाहिए, हाइड्रोजेल 42 पर एक समीक्षा में पाया जा सकता है पर निर्भर करता है हाइड्रोजेल में छवि कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता । चौथा, एक वैकल्पिक गणना यहाँ एकल श्रृंखला ICUE1 जांच की झल्लाहट अनुपात (यानी, ई QE = QE / cAem) छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक चैनलों की संख्या को कम करने के लिए और इस तरह photobleaching कम से कम के लिए कार्यरत है। सेल के प्रति औसत झल्लाहट अनुपात वास्तविक अनुपात झल्लाहट के मूल्यवान समझना कम करने के लिए एक कोशिका के भीतर पिक्सेल प्रति अनुपात की औसत के रूप में गणना की है। अंत में, एक रेखीय ratiometric विश्लेषण और साधनएकल श्रृंखला बाइनरी जांच के सक्रिय अंश गणना करने के लिए वर्णित है।

वहाँ widefield माइक्रोस्कोपी का प्रयोग सफल झल्लाहट प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए कई महत्वपूर्ण पहलू हैं। हार्डवेयर के लिए सम्मान के साथ, कैमरा छोटे संकेत परिवर्तनों को हल करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होना चाहिए, नए वैज्ञानिक CMOS कैमरों और इलेक्ट्रॉन गुणा CCDs बेहतर पारंपरिक CCDs से अनुकूल छोड़ने। सबसे अच्छा झल्लाहट अनुपात के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए, कैमरा कम से कम दो बार उद्देश्य (Nyquist कसौटी) की बात फैल समारोह के स्थानिक संकल्प में होने चाहिए। इस दोहरे विचार प्रणाली कम काम करने के अनुकूल बनाता है। अधिक महत्वपूर्ण के रूप में तो fluorophores के photobleaching कम से कम करने के लिए दिया झल्लाहट जोड़ी के लिए एक उचित जोखिम और छवि अधिग्रहण दर का चयन करने के लिए है। एक कम दर अधिग्रहण प्रयोग की अवधि बढ़ जाती है के रूप में सिफारिश की है। तेजी से फिल्टर पहियों के उपयोग के अधिग्रहण की दर और विश्लेषण करते हुए बचने के लिए FOVs की संख्या बढ़ जाती हैदोहरे देखें और बुर्ज फिल्टर घन के साथ छवि पंजीकरण मुद्दों हैैं। inhomogeneous रोशनी क्षेत्र पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कि नमूना autofluorescence और कैमरा प्रणाली शोर से उठता है के लिए सुधार पेचीदा हो। कुछ हाइड्रोजेल, विशेष रूप से श्लेषजनउत्पादी प्रोटीन युक्त उन अत्यधिक autofluorescent 43,44 हैं। झल्लाहट अनुपात की पृष्ठभूमि सुधार के बिना कम करके आंका जाता है। यहाँ हम एक साधारण पृष्ठभूमि सुधार तरीका है कि अपेक्षाकृत सपाट रोशनी क्षेत्र है जो अक्सर छवि (चित्रा 3 बी, चरण 7.2) के केंद्र पर महामारी प्रतिदीप्ति रोशनी के साथ विन्यस्त किया जा सकता है पर निर्भर करता है रोजगार। इस विधि इसलिए इस रोशनी के क्षेत्र के भीतर उन लोगों के लिए ब्याज की कोशिकाओं को प्रतिबंधित। पृष्ठभूमि यहाँ वर्णित सुधार तरंग दैर्ध्य बाइनरी जांच के लिए पढ़ें में सेलुलर autofluorescence के लिए खाते में नहीं है। ऐसे एक मामले में, लेबल हटाया गया कोशिकाओं (कोई जांच अभिकर्मक) एक ही स्थिति और पृष्ठभूमि घटाया तहत imaged किया जाना चाहिए। एक मीटरलेबल और लेबल हटाया गया कोशिकाओं की नौवीं इस्तेमाल किया जा सकता है और लेबल हटाया गया कोशिकाओं पृष्ठभूमि रॉय के लिए चयन किया। वैकल्पिक तरीकों जो पूरी छवि क्षेत्र से अधिक सेल विश्लेषण के लिए प्रदान कोशिकाओं के बिना समान नमूने एक छायांकन मुखौटा का उपयोग करते हैं, कई पृष्ठभूमि ROIs, या में शामिल हैं और एक प्रोटोकॉल अनुरोध पर उपलब्ध है।

3 डी इमेजिंग झल्लाहट के लिए विशिष्ट, जांच प्रतिक्रिया अत्यधिक analyte (चित्रा 6) को हाइड्रोजेल पारगम्यता के प्रति संवेदनशील है। इसलिए एक ही हाइड्रोजेल क्षेत्रों ऐसी पाड़ केंद्र के रूप में यहां इस्तेमाल किया निकट के रूप में अधिमानतः ज्यामिति समरूपता का एक बिंदु पर प्रयोगात्मक उपचार भर में तुलना कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, microfluidic कक्षों / बायोरिएक्टर तेजी से और समान रूप से analyte समाधान 45 के साथ हाइड्रोजेल छिड़कना लिए नियोजित किया जा सकता है। एक झल्लाहट संकेत नहीं पाया जा सकता है (शोर अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है) जब हाइड्रोजेल के autofluorescence बहुत अधिक है; एक पतली हाइड्रोजेल या अलग अलग जांच (विभिन्न fluorophores) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।photocrosslinked हाइड्रोजेल में 3 डी इमेजिंग झल्लाहट करने के लिए सम्मान के साथ, कम से कम विकिरण जोखिम और जांच fluorophores की उत्तेजना स्पेक्ट्रम के बाहर तरंग दैर्ध्य के उपयोग की सिफारिश की है। एलएपी 405 एनएम पर एक दृश्य प्रकाश स्रोत के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है आगे संभावित सेलुलर क्षति 31,46 कम से कम। हालांकि, 365 एनएम विकिरण के साथ एलएपी का उपयोग कर सिफारिश की है क्योंकि इस जांच विरंजन को कम करता है। जबकि 405 एनएम पीक उत्तेजना पर स्थित 365 एनएम, CFP दाता उत्तेजना स्पेक्ट्रम की पूंछ के अंत में निहित है। वैकल्पिक रूप से, जांच अभिव्यक्ति एक दिन के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी जा सकती है। बाइनरी जांच के उपयोग अभिव्यक्ति के स्तर में और दाता और स्वीकर्ता fluorophores की आणविक प्रसार में मतभेद के प्रति संवेदनशीलता के मुद्दों को कम करता है। गैर-बाइनरी जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इसके बजाय के एसई QE इमेजिंग और उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के वर्णक्रम खून के माध्यम से करने के लिए अतिरिक्त सुधार के साथ (नीचे देखें)। इसके अलावा, कम वाणिज्यिक उपलब्धता और झल्लाहट जांच को डिजाइन करने में जटिलताएक बाधा हो सकती है। सफल प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रतिदीप्ति संकेतों के समुचित सुधार और विश्लेषण बनी हुई है।

झल्लाहट अनुपात की गणना एक वैकल्पिक photobleaching के न्यूनतम इसके अलावा कई अतिरिक्त कारणों के लिए उपयोग किया जाता है। बाइनरी एकल श्रृंखला जांच के लिए, आमतौर पर सूचना दी अनुपात दाता उत्सर्जन करने के लिए दाता उत्तेजना (अवगत उत्सर्जन, एसई) दाता उत्तेजना (बुझती उत्सर्जन, क्यूई), यानी तहत स्वीकर्ता उत्सर्जन है, अनुपात = एसई / QE 25,47,48 झल्लाहट। एसई / QE गैर रेखीय झल्लाहट दक्षता 21,22,47 में परिवर्तन करने के रिश्तेदार है। अर्थात्, अनुपात लगभग 15% से भी कम समय के लिए Ei अनुपात सबसे रैखिक के साथ जांच (ईआई) के निहित झल्लाहट दक्षता के लिए एक तेजी से गैर रेखीय रिश्ता है (Donius, एई, Taboas, जेएम अप्रकाशित काम करते हैं। (2015))। एसई / QE भी सक्रिय जांच (FAP, यानी, बाध्यकारी analyte जांच के अंश) के अंश बहुत मूल्यवान समझना होगा। therefoफिर से, एसई / QE के विश्लेषण एक बोझिल संतुलन खुराक प्रतिक्रिया का अध्ययन करने और वक्र फिट की आवश्यकता है। सौभाग्य से, स्वीकर्ता उत्तेजना के तहत स्वीकर्ता उत्सर्जन करने के लिए एसई या त्वरित अनुमानों के अनुपात (AEM) Ei और FAP, यानी करने के लिए सम्मान के साथ रैखिक हैं, झल्लाहट अनुपात के एसई / AEM और QE / AEM। एसई / AEM अक्सर बाइनरी जांच के लिए प्रयोग किया जाता है और केवल (कोई जांच गतिविधि और पूर्ण जांच गतिविधि पर) अंत बिंदु अंशांकन आवश्यकता है, लेकिन बेसल सेलुलर संकेत यह कठिन बना देता है। समापन बिंदु जांच के लिए आवश्यकता को समाप्त करने के लिए, एसई दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के वर्णक्रमीय ओवरलैप (वर्णक्रम खून के माध्यम से) के लिए और संयुक्त जांच fluorophores और माइक्रोस्कोप के क्वांटम उपज और वर्णक्रमीय संवेदनशीलता (क्यूएस) के लिए सुधारा जा सकता है (सीएसई) इमेजिंग प्रणाली। सीएसई के आधार पर सुधारा एसई झल्लाहट अनुपात एक छवि है, यानी, ई एसई = सीएसई / AEM के प्रत्येक पिक्सेल के भीतर जांच का मनाया झल्लाहट दक्षता को परिभाषित करता है। वाणिज्यिक और मुफ्त सॉफ्टवेयर के इन प्रभावों के लिए एसई सही करने के लिए उपलब्ध है औरपाठक तरीकों 50 के विस्तृत विवरण के लिए चेन और Periasamy 2006 के काम करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, गणना ई एसई प्रति समय बिंदु (एसई, क्यूई, AEM) तीन छवि चैनलों का कब्जा की आवश्यकता है। क्यूई / cAem है, जो (क्यूई और AEM) केवल दो छवि चैनलों का कब्जा की आवश्यकता है - इसलिए, इस काम में हम भी एक वैकल्पिक झल्लाहट अनुपात ई QE = 1 रोजगार। इन चैनलों से ई QE की गणना केवल क्यु (cAem = AEM x क्यूएस) के लिए AEM को सही करने की आवश्यकता है। क्यूएस = डेम / AEM आसानी से एक अंशांकन नमूना है, जहां डेम स्वीकर्ता प्रक्षालित के साथ दाता उत्तेजना के तहत दाता उत्सर्जन से दो छवियों का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है। FAP किसी भी पल में जांच के Ei करने के लिए ई एसई या ई QE की तुलना द्वारा गणना की जा सकती है।

अंत में, झल्लाहट अनुपात चयन (ई एसई = सीएसई / AEM बनाम ई QE = QE / cAem) से जांच कराने प्रकार के विचार और सबसे अच्छा संकेत के साथ चैनलों पर आधारित होना चाहिए। दोनों एकpproaches फ्रेम प्रति छवियों की पृष्ठभूमि शोर सुधार के रूप में समय के साथ autofluorescence में परिवर्तन के लिए खाते में ऊपर वर्णित शामिल हैं। वे डेम उत्तेजना स्पेक्ट्रम है, जो अक्सर जांच के लिए डिजाइन और माइक्रोस्कोप फिल्टर विन्यास के कारण मामला है में AEM उत्तेजना प्रकाश की कोई ओवरलैप मान। एकल श्रृंखला जांच या तो उपयोग कर सकते हैं और चयन कैमरा शोर करने के लिए सबसे अच्छा जांच संकेत (चमक) पर और एसई और QE चैनलों पर पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए आधारित है। ICUE1 जांच और प्रयोगात्मक शर्तों यहां इस्तेमाल किया (सेल और हाइड्रोजेल प्रकार) के लिए, एसई QE तुलना में एक मजबूत संकेत है। दोहरे श्रृंखला जांच दाता और स्वीकर्ता fluorophores की गैर equimolar वितरण की वजह से ई एसई के उपयोग की आवश्यकता है। जांच है कि इस तरह के रूप में ICUE1 analyte बाध्यकारी पर झल्लाहट में कमी, झल्लाहट दक्षता "" उलटा किया जा सकता analyte बाध्यकारी पर एक सकारात्मक संकेत दे परिवर्तन को पेश करने के रूप में हम यहाँ ई एसई = 1 के साथ करते हैं, के लिए - सीएसई / AEM या ई QE = QE / (AEM x क्यूएस)।

वें का विश्लेषणई FAP झल्लाहट अनुपात की समुचित सुधार करने के लिए और ईआइ के अनुमान के प्रति संवेदनशील है। यह वही अंशांकन नमूना क्यु के लिए इस्तेमाल किया और एक पारंपरिक समापन बिंदु के साथ अनुमान लगाया जा सकता झल्लाहट दक्षता परख ईआइ = 1- (क्यूई / डीईएम) (क्यूई की छवि स्वीकर्ता photobleaching और एक डेम की छवि के बाद) 28 है, लेकिन ध्यान रखा जाना चाहिए कम से कम करने के रूप में दाता के आकस्मिक विरंजन। हम एक संशोधित संस्करण जहां AEM के आधार पर डेम का अनुमान क्यु के लिए समायोजित, प्रतिस्थापित है वर्णन यानी, ईआइ = 1 - (क्यूई / (AEM x क्यूएस))। वैकल्पिक रूप से, ईआइ = सीएसई / AEM इस्तेमाल किया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं में Ei का आकलन जरूरी है कि सारे जांच पूर्ण झल्लाहट करने के लिए प्रेरित किया। इस तरह के ICUE1 के रूप में जांच, कि analyte बाध्यकारी पर झल्लाहट में कमी के लिए व्यवहार में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। Ei की इन विट्रो आधारित गणना सेल lysates और शुद्ध analyte का उपयोग सबसे अच्छा है, लेकिन इस काम के दायरे से बाहर। यहाँ हम 2 ', 5'-Dideoxyadenosine का उपयोग कोशिकाओं में शिविर में कमी करने के लिए सलाह देते हैं। हालांकि, एक रिश्तेदार FAP ख सकता हैई एक Ei अनुमान संकेत के आधारभूत स्तर से निकाली गई उपयोग कर की गणना। इन कारणों के लिए, पढ़ाई सबसे अधिक बार झल्लाहट अनुपात (के रूप में यहाँ किया है) या एक रिश्तेदार FAP समापन बिंदु अंशांकन, जहां एगोनिस्ट जोड़ने से पहले संकेत आधारभूत एक दूसरे एगोनिस्ट कि सिगनल संतृप्त जोड़ने के बाद कम बाध्य और संकेत है के आधार पर रिपोर्ट ऊपरी है बंधे। Forskolin अक्सर शिविर संकेत तर करने के लिए एक नियंत्रण agonist के रूप में प्रयोग किया जाता है। जैसे कि 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-चक्रीय मोनोफास्फेट के रूप में वैकल्पिक रूप से, एक शिविर अनुरूप इस्तेमाल किया जा सकता है। पढ़ाई के प्रयोगात्मक उपचार के बीच संकेतन मार्ग में संभावित परिवर्तनों की पहचान करने के पूरा होने पर इस्तेमाल किया सकारात्मक नियंत्रण सिफारिश कर रहे हैं।

सेल के प्रति औसत सिगनल प्रतिक्रिया की गणना कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, औसत झल्लाहट अनुपात एक कोशिका के भीतर प्रत्येक पिक्सेल पर अनुपात की औसत के रूप में गणना की जानी चाहिए, यानी, (Σ (QE/cAem)) / (पिक्सेल की संख्या), के बजाय Raऔसत QE और AEM एक सेल में, यानी, (ΣQE) / (ΣcAem) की Tio। हालांकि बाद में सावधान मास्किंग की आवश्यकता नहीं है के रूप में पृष्ठभूमि शोर कम है, यह गंभीर रूप से सच औसत झल्लाहट अनुपात underestimates। हालांकि, पिक्सेल अनुपात में चल बिन्दु परिकलन और सेल क्षेत्र ROIs को परिभाषित करने और सेल के बाहर पृष्ठभूमि शोर से उत्पन्न नकली अनुपातों के शामिल किए जाने से बचने के लिए सावधान बाइनरी मास्किंग की आवश्यकता होती है। पूरे सेल क्षेत्र सेल आकार पर biasing परिणामों से बचने के लिए मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। मास्किंग सेल आकार और प्रवास में परिवर्तन के आधार पर समय के साथ नए सिरे से परिभाषित करने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, सेल से ROIs बड़ा बहिष्कार मानदंड QE और AEM का संकेत है कि अच्छी तरह से सेलुलर स्तर से नीचे गिर जाते हैं और निकट पृष्ठभूमि के स्तर से पिक्सेल अनुपात को दूर करने के लिए परिभाषित कर रहे हैं, तो इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्णित विश्लेषण के तरीकों को विस्तार विशेष सॉफ्टवेयर / plugins के बिना झल्लाहट विश्लेषण के लिए इस काम में इस्तेमाल बुनियादी कदम। माइक्रोस्कोप निर्माताओं और अन्य विक्रेताओं जोड़ने पर मॉड्यूल बेचनेउनकी माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर है, जो स्वचालित ratiometric का समर्थन और विश्लेषण झल्लाहट के लिए है। इसी तरह, सार्वजनिक डोमेन ImageJ सॉफ्टवेयर ऐसे RiFRET के रूप में कण और झल्लाहट विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई plugins, है। दूसरा, पिक्सेल आधारित औसत झल्लाहट अनुपात क्योंकि एक 2 डी छवि प्रयोग किया जाता है 3 डी सेलुलर संरचना का सच औसत अनुपात underestimates। 2 डी संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं और जेड अक्ष के साथ औसत। जीवित कोशिकाओं में झल्लाहट अनुपात की 3 डी स्थानिक वितरण की गणना के लिए उच्च गति 3 डी इमेजिंग के बिना संभव नहीं है (जैसे।, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग)। यह दोनों 2 डी और 3 डी संस्कृतियों के लिए एक समस्या है, लेकिन 3 डी में एक बड़ा प्रभाव सेलुलर संरचना के अधिक के रूप में हवाई जहाज से बाहर मौजूद है। यह जांच है कि इस तरह के प्लाज्मा झिल्ली EPAC1 जांच PM-ICUE के रूप में सेलुलर संरचनाओं, के लिए स्थानीय बनाना के लिए बड़ी चिंता का विषय है। Spiering एट अल देखें। 2013 के लिए सुझाव अनुपात की गणना 24 पर सेल मोटाई प्रभाव के लिए सही करने के लिए। AEM के वितरण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपता लगा कि अगर जांच सेल और इमेजिंग विमान समायोजित के क्षेत्रों में जम जाता है। यह भी झल्लाहट अनुपात की स्थानिक वितरण की व्याख्या करने और नकली परिणामों को खत्म करने में मदद करेगा, उदाहरण के लिए।, जांच संतृप्ति की पहचान (यानी, एक कम AEM क्षेत्र कम जांच एकाग्रता होगा और जांच संतृप्ति और उच्च झल्लाहट अनुपात प्रदर्शन कर सकते हैं)। तीसरा, विभिन्न झल्लाहट आधारभूत स्तर, अभिकर्मक दक्षता में एक अंतर का संकेत हो सकता प्रयोगात्मक समूहों के बीच अभिव्यक्ति, या बेसल सिगनल की जांच। "सापेक्ष विश्लेषण" (चरण 10.1.1) समय पर झल्लाहट अनुपात में बहाव को दूर उपस्थित अगर मदद मिलती है। यह नमूने के बीच प्रतिक्रियाओं के रिश्तेदार परिमाण की तुलना की सुविधा है, लेकिन संदर्भ नमूना के लिए प्रतिक्रिया (नियंत्रण साजिश एक फ्लैट लाइन है) के समय पाठ्यक्रम की तुलना में बाधा उत्पन्न करती। "निरपेक्ष विश्लेषण" (चरण 10.1.2) नमूने भर में प्रतिक्रिया की दर की तुलना की सुविधा है, लेकिन प्रतिक्रिया की भयावहता की तुलना बाधित क्योंकि प्रत्येक पंक्ति एक dissim द्वारा बढ़ाया हैilar निरंतर। अध्ययन अक्सर आधारभूत पर एक रेखीय प्रतिगमन का उपयोग समय पर झल्लाहट अनुपात में बहाव के लिए सही करने के लिए।

वर्णित 3 डी झल्लाहट विधि बनाना और प्रदर्शन सेल लादेन 3 डी हाइड्रोजेल है, जो अन्य जांच और इमेजिंग तौर तरीकों को लागू किया जा सकता है की समय चूक इमेजिंग के लिए एक उपयोगी और व्यावहारिक तरीका है। जैसा कि ऊपर चर्चा की एकल श्रृंखला बाइनरी जांच के अलावा अन्य झल्लाहट प्रणाली, तीव्रता आधारित संकेतों के और अधिक जटिल सुधार की आवश्यकता होगी। वैकल्पिक रूप से, झल्लाहट (flim-झल्लाहट) के प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग जांच दाता के उत्सर्जन को जीवन में एक परिवर्तन के माध्यम से झल्लाहट दक्षता गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विपरीत तीव्रता आधारित झल्लाहट, लिए flim झल्लाहट पृष्ठभूमि शोर, वर्णक्रमीय खून के माध्यम से, क्वांटम दक्षता, और डिटेक्टर वर्णक्रमीय संवेदनशीलता 2 के प्रति असंवेदनशील है। हालांकि, लिए flim प्रणाली, महंगी जटिल है, और असामान्य हैं, और एकल प्रतिपादक क्षय के साथ fluorophores और कोई लिए flim रन दूर 49 के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। वर्णित विधि भी मो के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैउन्नत माइक्रोस्कोप प्लेटफार्मों रे (उदा।, झल्लाहट TIRF, प्रतिदीप्ति anisotropy, और वर्णक्रमीय सह-संबंध झल्लाहट)। उच्च गति confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी के साथ 3 डी इमेजिंग के लिए इस पद्धति लागू संकेत प्रतिक्रिया के उप सेलुलर वितरण के विश्लेषण की सुविधा और विश्लेषण के संकेत की सटीकता में वृद्धि होगी। इस 3 डी झल्लाहट विधि नकली 3 डी सेलुलर microenvironments में उन्नत कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा। जैसे, यह आसानी से औषध विज्ञान और कहनेवाला संकेतन का अध्ययन और इंजीनियर हाइड्रोजेल आधारित microtissues में दवा प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग सहित पुनर्योजी दवा की जरूरत है, के लिए लागू किया जा सकता है।

Acknowledgments

लेखकों पिट्सबर्ग, स्वास्थ्य पुरस्कार K01 AR062598 के राष्ट्रीय संस्थानों, और अनुदान P30 DE030740 विश्वविद्यालय में दंत चिकित्सा के स्कूल ऑफ मेडिसिन की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं। लेखकों को भी ImageJ मैक्रो के लिए ImageJ और माइकल Cammer के विकास के लिए ICUE1 प्लाज्मिड के लिए डॉ जिन झांग, वेन Rasband धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

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References

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Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

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