Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54135
Automatic Translation
*1, *1,3, 1,2
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS
* These authors contributed equally

Summary

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

Abstract

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)의 영상은 실시간으로 세포 생물학을 검사하기위한 강력한 도구이다. FRET을 이용한 연구는 일반적으로 3 차원 (3D) 세포 미세 환경을 모방하지 않고 2 차원 배양을 사용한다. 차원 겔 환경 내 세포의 위드 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 켄칭 발광 FRET 이미징을 수행하는 방법이 제공된다. 여기서 프로브 활성화 범위 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석 방법을 설명한다. 세포 내 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준의 측정은 EPAC1 활성화 (ICUE1)과 하이드로 겔 재료의 종류, 본원 광 가교 하이드로 겔 (PC - 겔법에 따라 시그널링 된 cAMP의 차이를 검출 할 수있는 능력에 대한 프로브를 사용하여 포스 콜린 자극 하에서 연골 세포에서 증명되고 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive 하이드로 겔 (TR-GEL). 2D FRET 방법과 비교하여,이 방법은 약간의 추가 작업이 필요합니다. 이미 2d에 FRET 영상을 이용하여 실험실 쉽게 3 차원 미세 셀에 대한 연구를 수행하기 위해이 방법을 채택 할 수있다. 이것은 더 설계 차원 microtissues 높은 처리량 약품 스크리닝에 적용될 수있다. 또한, 이러한 이방성 측정 및 형광 수명 이미징 (FLIM)과 같은 고급 공 초점 현미경을 사용하여 플랫폼 펄스 또는 변조 된 조명 FRET 촬상 다른 형태와 호환 가능하다.

Introduction

셀룰러 신호는 복잡하고 약리학, 조직 공학, 재생 의학 등 다양한 분야에 대한 필연적 모두이다. 유용한 임상 도구는 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 촉진하고 조직 재생을위한 최적의 재료를 개발하기 위해 필요하다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 수용체 활성화 분자 형태 및 생균의 초분자 상호 작용 (예., 단백질 / DNA 착화)의 분석을 가능하게하는 중요한 도구이다. FRET는 형광 물질 (1) 사이 비 복사 에너지 전달의 유형이다. 이 도너 형광 물질 및 형광 수용체 사이의 거리의 여섯 번째 전력에 반비례 효율을 갖는다. (- 10 nm의 통상적 1) 2 따라서, 나노 미터 크기의 두 개의 다른 분자 사이 또는 한 분자의 영역에 걸쳐 공간적 거리 정보를 제공 할 수있다. 기증자 및 수용체 형광 다른 m 할 수있다olecule 타입 도너는 높은 에너지 방출 (단파장)가있는 (헤테로 FRET), 또는 같은 형태의 (호모 FRET). FRET 영상은 고정 또는 살아있는 세포에서 수행 할 수 있지만, 고속 촛점 시스템을 사용할 때 일반적으로 고정 된 세포는 높은 공간 해상도에서 분자 상호 작용의 영상화에 사용된다. 생균 등의 반응 3 시그널링 실시간 세포 등의 억제 나 고정에 의해 변경되는 상호 작용과 프로세스를 연구하기 위해 사용된다.

채용 생균 연구 때문에 간단하고 낮은 배경 (평면 세포 밖으로 방출에서 아니오)의 일부 촬상 사용을 2 차원 세포 배양 FRET. 그러나, 2 차원 배양은 생리적 및 미세 3 차원 배양 4,5- 비해 다양한 세포 과정을 변경. 예를 들어, 세포 외 기질 상호 작용에 셀과 셀 기본 셀은 크게 EAS에 이르는 2D 문화에 변경된다ILY는 세포 형태와 극성 (6)의 변화를 관찰했다. 그들은 골격 성분 7,8과 셀 형상 및 골격 구조가 강하게 공간 배양 환경 (9)에 의해 규제되는 결합 때문에 막 마이크로 도메인 (예., 카베 올래 지질 래프트) 및 수용체 신호 강하게 부분적 배양 환경에 의해 조절된다. Mechanotransduction은 3 차원 매트릭스에 의해 좌우되지만보다 복잡한 차 적재 상태로 2 차원 배양 물 (10)에 비해 3 차원 환경에서 생기게하지 않는다. 마지막으로, 3 차원 매트릭스의 투과​​성은 확산을 감소 차원 배양에 비해 신호 분자 세포의 결합을 증가와 함께, 일반적으로 배지 미만이다. 3D를 배양 한 접착제, 화학적 및 기계적 큐에 대한 생리적 더 유사한 미세 환경을 생성하고 관찰 할 수있다. 전지 셀 상호 작용을 촉진 할 수 있고, 접착 특성 w를 제어 할 수있다차원 재료 11-13의 구조 조성, 및 구조 (패터닝) 번째. 재료의 기계적 특성을 마찬가지로 조성 및 구조 (14, 15)에 의해 조정될 수있다. 하이드로 겔에서 세포를 배양 따라서 허가 그렇지 않으면 해제 차별화 것이 일차 전지 또는 기존 기술을 사용하여 표현형의 변화, 예에 대한 연구를 FRET., 관절 연골의 세포를. 따라서, 방법은 라이브 3D 배양에서 FRET 분석을 가능하게하는데 필요하다.

그들은 광학적으로 투명하게하고, 미세 제어하는​​ 셀룰러 신호를 제공하도록 맞추어 질 수 있으므로 하이드로 겔 지지체는 3D FRET 기초 연구에 적합하다. 천연 고분자로 만든 하이드로 겔은 젤라틴과 섬유소 (16)를 포함하여 수십 년을위한 세포 배양에 사용되어왔다. 세포 미세 환경을보다 컨트롤이 고분자의 화학적 변형과 합성 고분자 (17, 18)의 사용으로 달성 될 수있다. HYDR기계적 강성 ogel 투자율들은 폴리머 조성을 변화시킴으로써 제어 할 수 있고, 사이즈 (중합체 및 가교 밀도) 19, 20 메쉬. 또한, 하이드로 겔은 성장 인자 및 세포 리간드의 결합을 통해 생리 활성을 할 수있다. 때문에 이러한 가능성을, 바이오 센싱, 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 하이드로 겔의 개발 연구 (21)의 매우 활동적인 영역이다. 하이드로 겔의 3D 프린팅은 미세 조직의 제조를 위해 개발을 진행하고 15 -organs된다. 따라서, 하이드로 겔의 셀 FRET 촬상 생리적 셀룰러 동작을 근사화하는 수단으로서 유용하지만, 또한 연구 및 설계 조직 성장을 최적화하기위한 도구로써뿐만 아니라.

이진 비율 적 FRET 프로브는 셀룰러 신호를 연구하는데 유용하며, 하이드로 겔 배양에 활용 될 수있다. 게시 된 형광의 일부 목록 및 프로브를 FRET, 셀 마이그레이션 컨소시엄 웹 사이트를 참조하십시오 예). 분석 물질의 검출시에 형태 적 변화를 연결 또는 연결 해제를 거쳐 23. 덜 일반적인 아직 유용 프로브 유형은 FRET의 크기를 변경하는 두 형광의 스펙트럼 중첩의 분석 민감한 변화에 의존한다. "단일 쇄"비율 적 프로브는 단일 분자에 연결된 형광 쌍을 이용한다. "이중 쇄"프로브는 개별 분자에 형광 쌍을 이용하지만, 그 표현은 동일한 발현 카세트 (24) 아래에 연결될 수있다. 단일 형광 식 연구 (예., 형광 융합 단백질), 연구 비율 적으로 달리FRET 프로브는 형질 전환 효율 또는 세포 생존에 대한 제어 이중 형질 전환이 필요하지 않습니다. 최소 임계 값 (문자를 구분 농도) (23, 25) 위의 표현하면 비례 FRET 프로브는 형질 전환 효율이 상대적으로 문자를 구분하지 않는다. 그들은 여기 소스 변동 및 기타 세포 내 환경 요인 (예., 산도, 이온) 너무 오래 두 형광 유사하게 반응하는로에 민감하다. 형광체 및 발광 생물 프로모터 리포터 (26, 27)를 구성 달리 또한, 이들 반응은 전사 지연을받지 않는다.

비례 FRET 프로브는 쉽게 자주 위드 종래의 표면 형광 현미경 시스템에 사용된다. 위드 현미경 때문에 시스템 비용, 형광 표백, 충분한 시간 해상도와 신호 변경의 캡처에 대한 우려의 라이브 세포 이미징을위한 라인 스캔 공 촛점 시스템에 비해 바람직하다. 또한, 단일 세포 항문세포의 큰 인구 이상이 Analysis보기의 여러 분야에 걸쳐 전동 무대 및 이미지 캡처 가능합니다. 위드 현미경은 이종 FRET 프로브 신호의 강도를 기반으로 분석을 필요로한다. 강도의 분석은 FRET 다른 방법과 같은 복잡한 하드웨어를 필요로하지 않지만,보다 취득 후 작업은 형광 현미경 동작 및 / 영상 시스템 구성 (28)의 영향을 보정하기 위해 필요하다. 형광의 촬상 발광 강도의 여기 에너지의 함수, 형광 양자 수율 및 결합 필터 및 카메라 / 검출기 분광 감도 및 선형성이있다. 이러한 도너 및 수용체에 대한 이종 수 있고, 정량 분석​​을 위해 교정을 필요로한다. 또한, 억 셉터 발광 이미징 (도너 여기 광에 의해 수용체의 여기 및 블리드 스루 도너 발광을 수용체에 발광 스펙트럼)을 형광체의 스펙트럼 오버랩에 의해 영향이.4, 단일 체인 이중 체인 "프로브 셀 25, 28을 통해 다른 화학 양론에 존재할 수있는 경우의 형광." "프로브의 형광이있는 동안, 자신의 형광체는 나노 스케일에서 몰 있기 때문에 내부적으로 정규화"단일 체인 " 프로브는 유사한 밝기 (흡광 계수 및 양자 수율의 작용), 비선형 검출기 감도의 효과는 배경 형광 (23)을 필요로하는 접속의 양자 수율 / 검출기 감도 작은만을 보정이다의이다. 따라서, "단일 쇄" 비율 계량 FRET 프로브는 쉽게 위드 현미경 (24)에서 구현됩니다.

본 논문은 기존의 위드의 epifluorescent 현미경을 사용하여 3D 하이드로 겔 문화의 살아있는 세포의 FRET 이미징을 수행 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 쉽게 이미 2D에서 FRET 실험뿐만 아니라 간에 관심이 실험실을 수행하는 실험실에 의해 채택 될 수있다microtissues에서 세포 신호. 여기서 우리는 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 광 가교 내의 실제 연골 세포의 레벨 (PC 겔, 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive (TR-겔, 마트 리겔) 하이드로 겔의 FRET 촬상 계와 측정 방법을 보여준다. 율 비교 FRET 프로브는 포스 콜린, 캠프 ATP의 전환을 촉매 아데 닐 레이트 사이 클라 제에 대한 화학 작용제에 대한 응답의 cAMP 수준을 검출 EPAC1 (ICUE1)에 기초하여 이용된다. 캠프는 G 단백질 결합 수용체의 신호 전달을 매개하는 주요한 두 번째 메신저 중 하나이며 직접 캠프 (EPAC를)에 의해 활성화 하류 교환 단백질 등 다양한 요소를 활성화합니다. 형광 캠프는 FRET의 감소의 결과로 EPAC 도메인에 바인딩에 떨어져 이동합니다. 3D 하이드로 겔의 셀의 하이드로 겔 물질의 제조 상기 ICUE1 프로브가 세포 형질 전환 및 매립은 여기에서 설명한다. 차원 FRET 실험 절차 및 필요한 이미지 분석셀 당 프로브 활동이 설명되어 평가한다. 우리는 또한 위드 현미경을 사용하여 2D 및 3D에서 FRET 분석의 본질적인 한계에 대해 설명합니다. 그것보다 생리적 환경에서 분석을 가능하게 적은 화상 보정 및 교정을 필요로하기 때문에 여기에 제시된 기술은 기존의 2D 방식에 비해 개선 된 것이다. 그레이트 유틸리티 셀 형질 환경이 유지 될 수 있지만 많은 투명 재료가 이용 될 수 있다는 사실에있다.

Protocol

1. 재료 준비

  1. 린 - 깁슨 외. (29)에 의해 기재된 방법에 따라, 폴리에틸렌 글리콜 methacrylating하여 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트 (PEGDM, 4000 MW)을 준비한다. 또한, PEGDM는 구입하실 수 있습니다.
  2. 제 디메틸 phenylphosphonite는 다음 미카엘-Arbuzov 반응 및 리튬 염을 통해 2,4,6- 트리메틸 벤조일 choride과 반응시켜 두 단계의 과정을 통해, 광개시제, 리튬 페닐 -2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP)를 합성 마지마 동부 알. (30)에 따라, 2- 부타 논에 브롬화 리튬을 첨가하여 만들었다.
    참고 : 또는 다른 광개시제를 구입하지만, LAP 더 나은 생체 적합성과 효율성 31 가교을 표시 할 수있다.
  3. 유리로 하이드로 겔의 결합을 사용함으로써, 영상 중에 움직임을 방지하는 커버 글라스를 기능화.
    1. 적절한 개인 보호 장비 사용과 화학 후드TR-겔 (31) PC-겔 및 에폭시 실란, (3- 글리시 독시 프로필)를위한 제조자의 프로토콜에 따라 3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트를 포함한다. 참고 : 또는 도장 슬라이드를 구입하실 수 있습니다. 커버 슬립 단계 3.8에서 PDMS 접시의 잘보다 커야합니다.

2. 세포 형질

  1. 조직 배양 후드에서 멸균 기법 해동을 사용하여 서브 - 컨 플루 언시에 원하는 세포를 판 - 15,000 세포 / cm 2 내지 6 웰 무 처리 된 배양 접시에서 (50 내지 70 %), 본 명세서 소 연골한다. 주 : 모든 관련 세포 유형이 사용될 수 있고, 고정 독립 셀을 포함.
    1. 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에서 하루 동안 복구 할 수 있습니다. 다음 단계 전에, 매체를 제거 PBS로 씻어 잘 당 2 ㎖의 페놀 및 무 혈청 배지를 추가합니다.
  2. 각 다음날 웰 (100) 및 페놀 - 무 혈청 배지 μL뿐만 아니라 3 추가멸균 된 유리 시험관에 ㎕를 형질 전환 시약. , 혼합 가볍게 튜브를 흔들합니다. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. 빛에 대한 노출을 제한합니다.
  3. 1 μg의는 DNA 프로브 가볍게 흔들어 번민 추가합니다. 실온에서 혼합물을 품어 멀리 빛에서 30 분.
    참고 :이 실험 ICUE1 플라스미드에서 (닥터 진 장 (33)의 의례)을 사용 하였다. ICUE1의 형광은 시안 형광 단백질 (CFP, 기증자)과 노란색 형광 단백질 (YFP, 수용체)입니다. DNA 플라스미드 형질 전환 시약의 비율은 다른 세포 유형의 최적의 형질 전환에 대한 조정이 필요합니다.
  4. 준비된 혼합물 (~ 104 μL) 셀 플러스 페놀 및 무 혈청 배지 2 ㎖를 포함하는 6 웰 각각에 분배 적가. 최대 피펫 아래로하지 마십시오. 부드럽게 섞어 접시를 소용돌이 친다.
  5. 48 시간 동안 37 ° C에서 품어. 주 : 포화 상태가 형질 전환 효율을 억제 및 수용체의 내인성 발현을 변화시킨다.

3. 제작히드로 겔 주조 및 문화 PDMS 금형

  1. 풍부한 물의 양, 공기 다음 이소프로판올과 다음 건조로, 상 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 주조 비누로 먼저 유리를 청소, 세척 할 수있는 대형 유리 슬라이드를 준비합니다.
    1. PDMS의 용이 경화 후에 박리 될 수 있도록 제조사의 프로토콜에 따라 같은 siliconizing 시약으로 유리를 취급한다. 유역 컨테이너를 통해 톨루엔 표면의 오프 잔류 시약을 씻어. 공기가 표면이 완전히 건조되기 전에 혹은 대기 시간을 단축하기 위해 100 ℃에서 열을 사용할 수 있습니다.
  2. 하이드로 겔의 높이 (예를 들면, 1mm)으로 선택하고 PDMS의 1.2 배의 양을 계산하는 유리 슬라이드 및 하이드로 겔의 높이의 치수를 사용하여이 두께 PDMS와 유리 슬라이드를 포함 할 필요가 있었다. 참고 : PDMS는 축소되지 않습니다.
    1. 비커에 1 중량 비율 : 10에서 PDMS 키트 구성 요소를 섞는다. 그것이 잘 혼합되면, 가스 제거에 집 진공 비커를 놓습니다. REL기포가 컨테이너를 오버플로 반복하기 시작하면 진공을 ieve.
      주의 : 다른 겔 두께는 사용하지만, 증가 된 배경의 비용으로 원심 분리하고 (단계 6.2)를 사용하지 않는 경우 불투명도를 증가시킬 수있다.
  3. 기지 주변 알루미늄 호일 포장과 유리의 측면은 PDMS를 포함 할 수 있습니다. 조심스럽게 호일에 둘러싸인이 유리에 가스가 제거 된 PDMS의 원하는 양을 붓는다. PDMS의 높이를 측정한다. PDMS의의 높이가 하이드로 겔의 최대의 높이가 될 것이다 있음을 알아 두셔야합니다. 주입시 기포가 생성되는 경우, 다시 드가 또는 주걱이나 바늘로 팝.
  4. 2 시간 동안 100 ℃의 오븐에서 평평한면에 미 경화 PDMS를 놓고, 24 시간 동안 RT에서 떠난다.
  5. 이 치료되면 조심스럽게 표면에서 PDMS를 제거합니다. 하이드로 겔의 원하는 모양 (3mm의 예를 들면, 원통형 펀치를) 밖으로 펀치.
    주 : 광 가교 인해 몰드 직경보다 약간 좁은 PC 겔 실린더를 수득 할PDMS의 분자 산소에 의해 반응을 급냉한다.
  6. 펀칭 PDMS를 소독. 단기간의 실험에서, 1 시간 동안 70 % 에탄올에서 PDMS 잠수함.
  7. 현미경 목적 보정 일치 두께의 멸균 유리 커버 슬립으로 살균 PDMS의 기본 피팅에 의해 금형을 조립합니다. 6 단계에서 사용하기 위해 따로 설정합니다.
  8. 하이드로 겔 매체를 포함하는 (하이드로 겔보다 충분히 넓게하고 키와 함께) 상기 방법을 이용하여 더 큰 PDMS 접시를 제작. 하이드로 겔 몰입하고 분석의 희석을 최소화하기 위해 하이드로 겔보다 적어도 10 배 더 많은 매체 볼륨을 수용.

히드로 겔 전구체 솔루션 4. 준비

  1. 조직 배양 후드에서 무균 기술을 사용하여 즉시 세포를 추가하기 전에 연구 하이드로 겔 전구체 용액의 적절한 준비. 다음과 같이 고분자 전구체에서 PC-젤을 준비합니다.
    1. (인산염 완충 식염수로 PB를 PEGDM 분말 믹스10 % S, pH를 7.2) (W / V).
    2. 0.005 최종 농도 광개시제 (예를 들어, LAP)를 추가 - 0.01 % (w / v)로 피펫 팅하여 혼합한다. LAP은 빛에 민감로 빛 알루미늄 호일 또는 방패 솔루션을 커버.
      참고 : 제조업체가 제공하는 다음은 TR-젤 감소 성장 인자 세포 외 기질이 사용됩니다.

히드로 겔 솔루션 5. 세포 현탁액

  1. 조직 배양 후드 무균 기술을 사용하여, 각 웰로부터 배지를 흡인.
  2. 우물에 PBS를 추가하고 철저하게 부착 된 세포 단층을 씻어 제거합니다.
  3. 세포 해리 용액이 25cm 당 2 내지 3 ml의 사용 배양 용 기재로부터 세포를 해리. 20 분 또는 해리까지 - 다음 10, 37 ° C에서 품어 부드럽게 바위. 셀을 제거하기 위해 필요에 단단히 접시를 누릅니다.
    참고 : 다른 세포 분리 솔루션은 내가 그렇지 않은 제한 선택 사용할 수 있습니다관심의 수용체를 절단하여 분석중인 신호 전달 경로를 MPACT.
  4. 세포를 분리 한 후, 혈구와 세포를 페놀 및 무 혈청 배지 2를 가하여 세포를 일시 중단하고, 카운트. 주 : 화학적으로 무 혈청 배지 (예, 인슐린, 트랜스페린 셀레늄 보충)도 사용될 수있다.
  5. 멸균 된 튜브 및 펠릿 (예컨대, 2.0 × 106 세포 바이알 당)으로 셀 타입에 기초하여 세포의 수를 나누어지는.
  6. 상기 상등액을 제거 겔 전구체의 원하는 양을 추가하고 피펫 팅하여 세포를 정지. 붕괴로 하이드로 겔의 Z 축 시각화 경우 XY 평면에서 2 × 105 세포 / ㎠을 수득 할 전구체의 체적을 사용하여 (예를 들어, 2 × 106 세포를 함유하는 1mm 두께의 겔 용 바이알 당 1.0 ml의 / ㎖). 거품을 생성하기 위해주의 바랍니다.
    1. 신속하게 세포 생존율의 34에 부정적인 영향을 제한하는 다음 단계로 이동 </ SUP>.

6. 하이드로 겔 제조

  1. 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 이용하여, 3 단계에서 제조 된 주조 몰드로 셀 - 함유 하이드로 겔 전구체를 추가 (예컨대, 3 mm 직경 X 1mm 높은 금형 당 7.1 μL). 현미경 영상 시스템의 교정에 사용 (고유 프로브 효율을 알 수없는 경우) 교정 프로브를 위해 기술 된 것과 동일한 방법에 따라, 추가로 하이드로 겔을 생성한다.
  2. 원심 준비된 세포 함유 / 전 겔화 하이드로 겔 전구체를 단일 초점면에 셀을 한정 비행기 신호로부터 최소화하여 영상을 최적화하기 위해 가교 결합 (도 1). 전구체 (4 분 400g)의 세포 유형 및 점도 원심 분리 시간과 힘을 조절합니다.
  3. 겔 또는 용액을 가교
    1. PC의 하이드로 겔의 경우, 동일한 노광 시간 동안 UV-A 광원 (λ = 365 ㎚)을 갖는 셀 - 함유 전구체에 조사3.2 J / mm 두께 당 cm 2 photocrosslink합니다.
      참고 : 계산에 1mm의 최소 두께를 사​​용합니다. 노출은 1-5 분 범위에 빠지게한다. 최소 노출 시간을 사용합니다. 오버 조사 가능성을 감소하고, CFP 기증자를 표백 할 것이다이 같은 세포를 피하십시오. 강도 높은 조사가 급진적 인 자기 담금질 가난한 세포 생존에 이르게하기 때문에, 노출 시간보다 60 초는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
    2. TR-겔 하이드로 겔의 경우, 페트리 접시에 가득 금형을 배치하고 열 겔화에 인큐베이터로 이동합니다. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  4. 겔 또는 하이드로 겔 가교 후, PDMS 하이드로 겔 주형을 제거하고 (단계 3.5)에서 준비된 큰 PDMS 요리로 교체합니다. 를 준수하기 위해 멸균 주걱으로 유리에 아래로 PDMS를 누릅니다.
    1. 이 같은 배양 접시로 멸균 용기에 커버 슬립과 함께 요리를 PDMS 놓습니다. 페놀 무 혈청 배지를 추가 또는 화학적으로 나를 정의dium 잘 몰입 하이드로 겔을 유지하는 PDMS 요리와 커버 슬립으로 작성하는 (무 혈청 배지는 인슐린, 트랜스페린과 셀레늄 (단계 5.4)로 보충). 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
      주 : 커버 슬립과 전문 접시를 사용하는 경우, 그 다음에 커버 슬립을 배치하고 유사 매체를 추가합니다.
    2. 대안으로, 조사 파장이 CFP 도너 여기 스펙트럼과 중첩으로서 프로브가 복구 할 수 있도록 FRET 촬상 전날이 단계를 수행한다.

7. 3D FRET 영상

  1. 단계 6.4에서 제조 된 배양 접시에서 하이드로 겔, 함께 PDMS 접시를 제거하고 XY 현미경 단계 (그림 2)에 대한 조정 시편 홀더에 고정합니다. 현미경 무대에서 시편 홀더를 배치합니다. 필요한 경우 목적에 오일을 적용합니다. 적어도 40 배의 높은 개구 수 (NA)의 목표를 ​​사용하여 (즉, 1.3 NA)는 상대적으로 약한 형광체를 캡처전자 방출.
  2. 투과광 이미지를 사용하여 이미지를 선택 세포와 형광 이미징과 형질을 확인 : 이미지 획득을위한 뷰의 필드 (영상 범위)을 구성합니다. 적어도 15 개의 셀을 선택합니다.
    1. 도 너무 밝은도 너무 희미 선택 세포 (그렇지 않으면 프로브로 이어질 수있는 또는 낮은 감도 포화 오버) 및 (그렇지 않으면 손상 또는 이진 프로브의 감쇠를 나타냄) 0.0에서 1.0 사이의 FRET 비율. 그런 노출을 제한 할 수있는 빛을 전환 할 수 있습니다.
    2. 하이드로 겔의 중심과 상대적으로 평면 조명 분야 내에서 관심의 세포와의 긴밀한 선택 영상 범위 (그림 3B를 참조 아래 9.2 단계).
  3. 프렛 이미지 채널의 카메라 설정을 구성합니다. 은 "광학 구성"(즉., 노출 및 이미지 채널 당 이득)을 최적화하기 위해 FOV의 중심 근처에 몇 가지 세포 중 하나를 선택할 수 있습니다.
    참고 : 명칭 아래 dependin 변화현미경과 카메라를 작동하는 데 사용되는 소프트웨어에 대한 g. 현미경 소프트웨어 NIS 요소는 이미지 캡쳐 및 분석을 위해 여기에서 사용된다.
    1. 수용체 여기 (AEM)에서 기증자 여기 및 채택 방출에서 기증자 방출이다 담금질 방출 (QE) : 하나의 체인 프로브의 FRET 분석을 위해, FOV 당 두 개의 영상 채널을 선택합니다.
      참고 : ICUE1 CFP-YFP 프로브, QE에 대한 CFP의 여기 및 방출 필터 쌍을 위해 (418-442 전, 458-482 EM) 및 AEM에 대한 YFP 여기 및 방출 쌍 (490-510 전, 520-550 EM) 사용된다.
    2. 포화없이 최대 신호 강도를 획득하고 QE AEM에 대한 노출을 설정 (및 가능한 최소 이득과 더불어, CCD를 사용하는 경우) 배경 잡음을 최소화. 결과 (즉, 여기 전력, 홍채 크기, 노광, 카메라 게인) 편향 피하기 실험군 중 (양 형광체 및 실험 내내 동일한뿐만 아니라도 광학 구성을 유지우레의 3A).
    3. 인수 후 더 분석 옵션 (예를 들어, 수정 감응 형 발광 (CSE) 영상 (토론) 참조)을 허용하도록 추가 이미지 채널을 획득. 엠 기증자 (QE, 현미경 소프트웨어를 선택 CFP-CFP), 예 기증자 - - 엠 수용체 (SE를 선택 CFP- ICUE1 CFP-YFP 프로브를 들어, 여기 (예)와 예 기증자의 방출 (엠) 채널을 취득 YFP)는, 예 수용체 - 엠 수용체는 (AEM은) YFP-YFP를 선택하고 예 수용체 - 엠 기증자 (YFP-CFP) 구성 (도 3a 참조).
  4. 시간 경과 이미지 수집에 대한 캡처 속도를 구성합니다.
    1. 하드웨어에 의해 한정되는 경우 포착 속도를 감소시킨다. 단기 분석법 (예를 들어, 30-60 분), 시그널링 동력학을 포착하기 위해 각각의 FOV (5 초, 샘플링 레이트)에 대해 분당 약 12 인수를 나타낸다. 유의 방지하기 위해 필요한 최소한의 샘플링 레이트를 사용ficantly 프로브를 photobleaching에.
    2. 현미경 소프트웨어의 캡처의 주기성을 입력하여 수집 속도를 설정합니다. 장기 분석법 (예., 24 시간)는 초기 펄스 응답을 캡처 높은 수집 속도로 시작하고, 예를 들면 낮은 수집 속도로 5 분마다 10 스위치.
  5. 지정된 영상 범위에서 프로브 응답에 대한 기준을 설정하기 위해 5 분 동안 이미지 수집과 캡처 이미지를 시작하기 위해 현미경 소프트웨어에서 "지금 실행"을 선택합니다.
  6. 원하는 작용제 또는 길항제 분석에서 이미지 수집, 피펫의 5 분 (예를 들어, 100 nm에서의 포스 콜린) 후, 피펫 팅하여 혼합하고, 영상을 계속합니다.

8. FRET 교정

  1. 시스템 교정을 스텝 6과 동일한 FOV 기준 광학 구성 및 카메라 세트를 이용하여 적어도 6 대표적인 세포 AEM 이미지를 획득하기 위해 제조 된 부가적인 캘리브레이션 하이드로 겔을 사용하여십시는 (단계 7.1, 7.2, 7.3) 위의 FRET 영상에 사용됩니다.
    참고 : 결합 된 프로브와 현미경 이미징 시스템의 양자 수율 및 분광 감도 (QS)의 정량은 "절대"FRET 분석하지만 "상대"FRET에 대한 필요합니다.
    1. 풀 강도 (AEM 채널 음원)의 여기 광에 5 분 긴 노출을 선택하여 형광 수용체를 Photobleach. 관심의 세포를 표백하기 위해 좁은 조리개를 사용합니다. AEM 신호 전과 후에 photobleaching에 신호 세기 히스토그램 ( 'LUT'창)을 비교하여, 원래의 신호보다 적어도 10 % 낮은 것으로 확인한다. 신호 손실이 90 % 미만이면 photobleaching에 계속.
      주 : 도너 여기 스펙트럼과 중첩되지 않는 AEM 여기 용 필터를 사용하여 상기 도너 형광이 절차 동안 표백되지 확인.
    2. 지금 표백 수용체 형광와 기증자 여기에서 우리 (민주)을 기증자 방출 획득단계 7.3에서 QE와 동일한 광학 구성을 보내고.
    3. 아래 9 절에서와 같이, 배경 보정 후 AEM로 나눈 민주으로 픽셀 당 QS를 계산합니다. QS = 민주 / AEM
    4. 휴대 평균의 세포들 사이의 평균 QS를 계산합니다.
  2. 캘리브레이션 샘플을 사용하여 프로브 (EI)의 고유 FRET 효율성을 추정한다. 프로브의 최대 FRET을 유도하고 에이 = 1 계산 - 아래 섹션 9와 QE /을 (AEM은 QS를 X). (QE / 민주) - 또는, 에이 = CSE / AEM, 또는 에이가 에이 = 1 FRET 효율을 기존 엔드 포인트 분석을 사용하여 계산 사용합니다.
    참고 : 에이가 활성화 프로브 (FAP, 즉, 분석을 결합 프로브의 일부)의 절대 부분을 정량화하는 데 필요한,하지만 FRET "상대"분석을 위해 필요하지 않습니다.
    1. 분석과의 상호 작용에 FRET 증가 프로브에 대한 분석 생산 / 활성화의 효능과 문화를 자극하여 프로브 응답을 포화.
    2. 프로브 interactio을 억제분석 물을 결합에 감소 FRET 프로브 신호의 길항제를 사용하여 분석 물질과 N. (특정) 또는 3- 이소 부틸 메틸 크 산틴 (비 특정) 5'-Dideoxyadenosine를 상기 ICUE1 프로브의 경우 2-로 아데 닐 레이트 사이 클라 제 억제제 '으로의 cAMP 수준을 억제 참고.

9. FRET 비율 계산

  1. 그리는 시간에 따른 각각의 FOV 백그라운드 레벨 (도 3b)을 정의하는 셀 근처 FOV 당이자 (ROI)의 하나의 영역을 지정할 수 있지만, (이미지의 중심 위에도 4a를 비교적 균일 한 조도의 영역에 ROI를 제한 ). 배경 보정 옵션에 대한 설명은 설명을 참조하십시오.
    1. 현미경 소프트웨어를 다음 "배경 ROI 아이콘"의 화살표를 선택하고 (다른 형상이 작동) "타원형 배경 투자 수익 (ROI)을 그립니다"를 선택합니다. "오프셋 배경을 업데이트 유지"있는지 확인이 선택됩니다. 경쟁 활성화[배경 ROI 아이콘을 클릭하여 배경 투자 수익 (ROI)의 날개. 또는, "ROI 아이콘"와 "ROI를 각 지점에서 다른" "배경 ROI으로 사용"을로 설정 한 투자 수익 (ROI) 속성을 사용합니다.
    2. ImageJ에 함께 : 원형 그리기 도구를 선택하려면 도구 모음을 사용합니다. 그런 다음 "→ 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석"메뉴를 통해 투자 수익 (ROI) 관리자에 모양을 추가합니다. 원하는 경우 투자 수익 (ROI) 관리자에서 배경 투자 수익 (ROI)에 대해 다른 색을 설정합니다.
    3. 각각의 FOV 및 이미지 채널 (예를 들어, QE 및 AEM)의 경우, 채널 당 보정 된 이미지를 만드는 데 시간이 포인트 당 배경 투자 수익 (ROI) 내에서 평균 값을 뺍니다, 예를 들어, SQE의 t, P = QE의 t, P - BQE t, P t는 획득 시간이고, p는 FOV (즉, XY 위치)이고, BQE 및 bAem는 배경 ROI 내의 신호의 스칼라 값이다. 소프트웨어의 이미지 연산 기능을 사용할 수 있습니다.
      1. W현미경 소프트웨어 i 번째의 "ROI 배경 아이콘"을 사용하여 "빼기 배경 투자 수익 (ROI)을 사용"을 선택합니다. 팝업 창에서 "에 빼기 배경 투자 수익 (ROI)"에서 "모든 이미지"를 선택하고 "다음의 제품에 적용"에서 "모든 프레임"을 선택합니다.
        참고 : 배경 ROI가 제대로 작동하려면이 기능에 대한 모든 FOV에 정의되어야합니다 (예 : 일부 FOV가 정의되지 않은 배경 로아가있는 경우,이 기능이 제대로 배경 로아와 FOV에 대한 배경을 빼기하지 않습니다.).
      2. ImageJ에로, 마이클 대화방에 의해 작성된 매크로 (http://microscopynotes.com/imagej/macros/)은 "투자 수익 (ROI)에서 BG를 빼기"를 사용합니다.
    4. 다음 분석 단계 "로 저장"을 선택하여 이미지의 수정 시계열을 저장합니다.
  2. 각각의 FOV (도 4b)에서 분석중인 각 셀의 바이너리 마스크를 이용하여 상기 셀 주변에 ROI를 정의한다. 시작 O에서 임계 FOV 당 이미지를 AEM 채널을 사용실험 F를 세포 경계를 식별하고, ROI 영역을 정의 하였다. ROI 영역을 저장합니다.
    1. 현미경 소프트웨어를 각 프레임 (즉, FOV), 최초의 "이진 →이 임계 값을 정의"메뉴를 사용하여 "현재 프레임에 적용"을 선택합니다. 셀을 선택하기 위해 낮은 임계 값을 조정합니다. 그런 다음 필요한 경우 바이너리 마스크에 구멍을 작성하기 위해 "이진 → 닫기"기능을 사용합니다. 다음 "투자 수익 (ROI)에 복사 이진"를 선택합니다 ROI 아이콘을 사용; 이진 층은 자동으로 삭제됩니다.
      1. 로아의 기존 풀에 후속 프레임에 대한 ROI를 추가합니다. 어떤 의사의 ROI를 삭제합니다. 다음은 로아의 "마우스 오른쪽 버튼으로 클릭"그들의 속성 "표준 ROI으로 사용"하고 "ROI를 각 지점에서 다른"확인하십시오.
      2. ImageJ에 함께 각 FOV를 들어, 첫 번째 "→ 임계 값을 조정하여 이미지 →"메뉴를 사용합니다. 그런 다음 표시 개요와 함께 "입자를 분석 → 분석"을 사용하여 선택한 관리자에 추가합니다. 용도필요한 경우 "이진 → 닫기"바이너리 마스크에 "구멍"을 작성합니다. 의사의 ROI를 삭제합니다. 무료 플러그인은이 프로세스를 자동화 할 수 있습니다.
  3. 각 픽셀의 QE를 기반으로 FRET 비율을 계산, SQE / SAEM 상대 분석을 위해 (10 단계 참조) 및 E QE = SQE / 단계 8.1에서 얻어진 QS 절대 분석 (10 단계 참조) (QS는 SAEM을 X). 이미지의 부동 소수점 분할을 사용합니다. 비율 유도에 대한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.
    1. 현미경 소프트웨어 : 메뉴 "이미지 → 이미지 작업"을 사용하여 "부동 소수점"를 선택합니다.
    2. ImageJ에 함께 : "프로세스 → 이미지 계산기"기능 또는 "Calculator_Plus.java"플러그인 중 하나를 사용합니다. 참고 : 또는, 매크로 "에 적합 할 수있다 된 .txt"pH_ratioMacro "는 FRET 비율을 계산하는 데 그것은 위에서 설명한 배경 보정 매크로를 사용하고 이용하실 수 있습니다.
  4. 스프레드 시트 및 그래프 소프트웨어에 (ROI 당, 즉) 셀 당 평균 비율을 보냅니다.
    1. 현미경 소프트웨어를 다음 "투자 수익 (ROI) 통계"분석 제어 또는 "시간 분석"분석 제어에서 "스프레드 시트 내보내기 '버튼에서 ND 수출 버튼 중 하나를 사용합니다.
    2. ImageJ에로 : 첫 번째 메뉴 "→ 설정 측정 분석"및 확인 "평균 값"과 "표준 편차"가 선택되어 있는지 확인을 선택합니다. 그런 다음 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하고 버튼 "측정"을 선택합니다. 생성 된 결과 창을 저장합니다.

10 FRET 비율 분석

  1. 셀 당 평균 비율에서 시간이 지남에 따라 평균 휴대 FRET 비율을 계산한다 (단계 9.4에 수출). 기준이 계산 (분석 물질을 투여하기 전에 비) 비율을 고려 FRET.
    참고 : 스프레드 시트 및 그래프 소프트웨어는베이스 라인-subtr 음모 여기에 사용되는평균 FRET 비율 스텝 10.1.2 같이 기준선에 회귀를 사용하여 평균 (SEM)들의 표준 오차 아래 행동 10.1.3 (도 5 및도 6).
    1. 상대 분석 (응답의 크기) : 공통 기준 샘플 각 곡선을 정상화 (예를 들어, 처리되지 않은 샘플.).
    2. 절대 분석 (응답의 시간 과정) : 비를 FRET의 기준 각 곡선을 정상화하여 공통의 시작 지점에 곡선을 시프트.
      1. 스프레드 시트 및 그래프 소프트웨어, 데이터 각각의 원래 열이 기준 기간 동안 만 비가 데이터를 포함하는 새 열와 결합되도록 새로운 열 (셀 당 평균 비율의 열) 인터리브 (비율 분석을 추가하기 전에). 데이터의 모든 열 후 빈 열을 삽입하는 "열 삽입"을 선택합니다. 이어서 쌍 빈 열로 기준 데이터를 복사한다.
      2. 스프레드 시트 및 그래프 소프트웨어에서 "삽입 → 새로운 분석 → 변압기의를 선택RM은베이스 라인 제거 "를 설정 한 다음"다른 모든는 "선택"의 기준이 선형 가정 "으로"선택한 열을 "선택"계산 "에서"차이 "를.
      3. 평균 세포 비율과 기술 통계를 계산합니다. 스프레드 시트 및 그래프 소프트웨어에서 팝업 창에서 "행은 SEM과 의미"를 선택 후 "SD 또는 SEM과 행 수단 → 삽입 → 새로운 분석 →의 XY의 분석"을 선택합니다.

Representative Results

모든 하이드로 겔 전구체 세포, 주조 주형은 전술 된 바와 같이 제조 하였다. 셀 라덴 전구체 용액이 PDMS 몰드에 캐스팅 한 후 커버 슬립 근처 세포를 고정 및 FRET 분석을 촬상 (도 1)을 용이하게하기 위해 광 가교 / 겔화 전에 원심 분리 하였다. 부착 된 커버와 함께 하이드로 겔은 현미경 영상 (그림 2)에 대한 준비 PDMS 영상 우물 안에 넣었다. 도 3a에 도시 된 바와 같은 광학 구성 및 화상 획득 파라미터는 설정 하였다. 비 바이너리 프로브 필요로 CFP-YFP의 형광 쌍에 대한 네 FRET 관련 이미지 채널 캡처 (아래 참조 "광 컨퍼런스."그림 3) 증명된다. 그러나이 연구에서 두 이미지는 하나의 체인 진 ICUE1 프로브, QE = "CFP CFP"및 AEM = "YFP YFP"(여기 방출)이 필요합니다. 여러 영상 범위 (XY 위치들)은 여러 세포가 균일 한 조명 영역 (그림 3B) 내에 거주하는 선정되었다. 시간 경과 취득 후, 프로브에 대한 신호 데이터를 반출 하였다. 로아 채널 신호의 백그라운드 보정 및 세포 분석은 실험 (도 4)의 개시로부터 역치 AEM 이미지를 사용하여 지정 하였다. 세포를 발현하는 것과 셀 풀 중에서 선택되며 충분한 (너무 어둡되지 않음)하지만, 너무 높게하지 (지나치게 밝은) 프로브 (도 4b). 각각의 획득에서 화소 당 QE 및 SE FRET 비율은 배경 화상 감산 채널 부동 소수점 나눗셈을 이용하여 계산 하였다. 셀당 평균 FRET 비율 (즉, ROI마다) 계산 된 자극에 앞서 기준 신호에 대한 정규화 된 (즉, 모든 시간 포인트로부터 감산 기준선에 회귀)과의 표준 오차로서 오차 막대 플롯 의미 (SEM). 양적 완화와 CSE 기반의 FRET 비율 드 두포스 콜린 자극 (100 nm의, 그림 5)에서 연골 세포의 증가 캠프 활동을 TECT. QE 신호 때문에 하이드로 겔 내에 포함 된 연골 세포에서의 cAMP 활성의 낮은 기저 수준으로 낮았다 때문에 QE FRET 비율은 CSE FRET 비율보다 배경 보정에 더 민감했다. 두 유형의 하이드로 겔 (TR 겔 및 ​​PC-겔) 포스 콜린의 첨가로 증가 된 cAMP 신호 응답을 나타내는 시간 경과 FRET 비율의 증가 (도 6)를 보였다. 양적 완화 FRET 비율로 나타낸 바와 같이, PC-겔 히드로 겔의 연골 세포는 캠프에 큰 변화 (도시) 및 캠프 (E QE의 높은 기저 수준을 보여 = E QE = TR-젤 0.09 대 PC-젤 0.19, ) 기본 공제 도시하지 않음.

그림 1
그림 1 : 광 가교 하이드로 겔 (PC - 겔)에서 셀 배포 A : 셀 라덴 하이드로 겔 전구체는 커버 슬립에 가까운 초점면에서 세포의 수를 최대화하기 위해 원심 분리 하였다. B :이 FOV에서 세포의 수를 증가시키고 평면 세포 밖에서 배경 신호를 최소화한다. (스케일 바 = 200 μm의)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : PDMS 접시에 히드로 겔
하이드로 겔은 현미경 이미징 및 분석 자극에 대한 커버 슬립베이스와 높이 PDMS 잘 (하이드로 겔의 10 배 부피) 내부에 배치했다. 그들은 상기 분석 내내 그대로 유지되도록 PC 하이드로 겔은 투명 커버 슬립 결합된다. PDMS의 잘에서 외에 넓은 생검 펀치를 사용하여 하이드로 겔 부피보다 10 배 이상의 매체를 포함하고 크게 할 수있다hicker PDMS 시트. (스케일 바 = 2mm)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : FRET 이미지에 대한 수집 구성
A : 인수는 여러 위치에서 이미지 캡처 매 7 초 구성되었습니다. QE FRET 비율 계산, 두 영상 채널은 아래 여기서 사용 ICUE1 프로브 (이진 단일 쇄 프로브), QE는 = "CFP CFP"및 AEM = "YFP YFP"(여기 발광)에 필요한 "광 논문집." 현미경 소프트웨어의 λ 탭에서 열입니다. B : 영상 범위 ( "XY"위치는) 여러 세포가 균일 한 조명 영역 내에 거주하는 선정되었다. 이미지 아래 그래프는 청색 따라 조도 라인을가는 화살표 도시즉 FOV의 중심을 통과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : FRET 영상 분석을위한 로아의 선택
A : 셀의 자유 ROI (region of interest)를 각 채널에 대한 배경 신호를 수정하기 위해 선택되었다. 무 세포 겔의 이미지 대신에 세포 밀도 나 마이그레이션이 높은 경우, 또는 세포가 균일 한 조명 필드 내에 있지 않은 경우에 차광 마스크를 사용하지 않는 경우에 배경 차감을 위해 사용될 수있다. B : 셀 로아가 이미지 임계 값 및 AEM 채널의 이진 마스크​​를 사용하여 선택 하였다. 때문에 배경 N에서 생성 된 세포 외 비의 포함에 악영향 셀 당 평균 FRET 비율의 계산에 영향을 미칠 세포보다 큰 투자 수익 (ROI)을 선택OISE. 이 비율을 과소 평가로 셀 당 각 채널의 평균을 사용하여 휴대 FRET 비율의 계산은하지 않는 것이 좋습니다. (스케일 바 = 50 μm의)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : Thermoresponsive 히드로 겔 (TR-겔)에서 FRET 비율의 비교
QE 및 SE 기반의 FRET 비율 모두 포스 콜린 자극에서 연골 세포에서 증가 캠프 활동을 감지합니다. 포스 콜린 캠프 생산을 유도 아데 닐 레이트 사이 클라 제 작동 제이다. ICUE1 프로브는 캠프를 결합 할 때 FRET가 감소하고, 따라서 QE FRET 비율 (E QE = SQE / (SAEM은 QS를 X)) 증가한다. 반대로, SE FRET 비율은 감소하고, 따라서 E SE = 1로 플롯 - CSE / SAEM. 하이드로 겔 포함 된 연골 세포에서, QE FRET 비율이 낮기 때문에 기저 캠프 액티비티 SE FRET 비율보다 배경에 정사 QE 신호가 낮기 때문에 더 민감하다. 오류 바 = SEM, N = 25 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 다른 히드로 겔의 FRET 비율의 비교
모두 하이드로 겔 타입의 연골 세포는 시간이 지남에 따라 증가 된 QE FRET 비율에 의해 입증 된 바와 같이 cAMP를 활성의 증가 포스 콜린 자극에 반응. 하이드로 겔 형태의 영향 포스 콜린 및 기저 세포의 cAMP 활성 투과성의 차이 등 여러 가지 효과를 통해 세포 반응 (E QE = E QE 대 PC 겔 0.19 = 0.09 TR 겔에서 도시 생략). 오류 바 = SEM, n은 TR-젤= 25, n은 PC-젤 = (15)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 작품은 FRET 영상이 3D 하이드로 겔에서 세포 신호를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이전 연구 하이드로 겔 (38)와 세포 상호 작용의, 하이드로 겔 기판 35-37에 씨앗을 품고 세포의 FRET 영상을 시연하고, 하이드로 겔 39-41에 갇혀 분자 있지만,이 안에 포함 된 세포의 FRET 영상 기반 세포 분석을 서술 한 최초의 출판물입니다 3D 하이드로 겔. 2D에서 3D로 FRET 영상을 변환 할 때 작업은 몇 가지 구현 문제를 해결합니다. 먼저, 높은 개구 목적은 충분한 발광 신호를 수집 FRET 촬상 필요하지만, 필드의 깊이를 제한한다. 여기에서 세포는 다소이를 보상하기 위해, 유리 근처 초점면에서 세포의 수를 증가 통해 원심 침강된다. 둘째, 3 차원 하이드로 겔 지지체는 분석을 복잡 촬상시 시야에 걸쳐 드리프트 할 수있다. 하이드로 겔은 여기 COV 결합한erslip 그들은 실험을하는 동안 고정 된 상태를 유지하도록. 하이드로 겔은 세포의 가시화를 방해 할 수 있기 때문에 3 차원 FRET 적합한 하이드로 겔 조성물 셋째, 선택은 필수적이다. PC-젤 TR-겔 여기에 투명 하이드로 겔이 사용된다. 그러나, 커버 슬립 가까운 초점면 원심 분리로 세포를 수집은 하이드로 겔 diffraction.The 선택은 하이드로 겔 (42)의 리뷰에서 찾을 수 시뮬레이션해야 미세 환경 조건에 따라 그 이상 하이드로 겔의 이미지 셀에 사용될 수있다 . 넷째, 다른 계산은 단일 쇄 ICUE1 프로브의 FRET 비율 (즉, E QE = QE / CAEM)는 분석에 필요한 화상 채널의 수를 최소화함으로써, 광표백을 최소화하기 위해 여기에 사용된다. 셀당 평균 FRET 비율은 실제 FRET 비가 과소 평가를 최소화하기 위해 셀 내의 화소 당 비율의 평균으로 산출된다. 마지막으로, 선형 비율 적 분석 수단단일 쇄 이진 프로브의 활성 분획을 계산하는 것이 기재되어있다.

위드 현미경을 사용하여 성공적 FRET 실험을 수행하는 여러 가지 중요한 측면이있다. 하드웨어와 관련하여, 카메라는 새로운 과학 CMOS 카메라 및 CCD를 종래보다 더 적합한 전자 승산 CCD를두고 작은 신호 변화를 해결하기에 충분히 민감해야한다. 가장 FRET 비의 공간 분포를 분석하기 위해, 카메라는 최소 두 배의 대물 (나이 퀴 스트 기준)의 점 확산 함수의 공간 해상도를 가지고 있어야. 이 작업에 듀얼 뷰 시스템은 덜 적합하다. 더 중요한 형광 물질의 광표백을 최소화하기 위해 주어진 FRET 쌍 적절한 노광 및 이미지 획득 율을 선택한다. 감소 수집 속도는 실험 기간이 증가할수록 좋습니다. 빠른 필터 휠의 사용은 포착 율 분석하면서 피 용 영상 범위의 개수를 늘려듀얼 뷰와 터렛 필터 큐브와 이미지 등록 문제를 보내고. 불균일 조명 필드는 샘플 자기 형광 카메라 시스템 잡음에서 발생 배경 형광에 대한 정정을 복잡하게한다. 일부 히드로 겔은 특히 콜라겐 단백질을 함유하는 것을 43,44 매우 autofluorescent이다. 프렛 비율은 배경 보정없이 과소 평가한다. 여기에서는 주로 영상 (도 3b의 단계 7.2)의 중심 위에 에피 형광 조명으로 구성 할 수있는 비교적 평탄한 조명 필드에 의존하는 단순 배경의 보정 방법을 사용한다. 이 방법은 따라서이 조명 분야 내에서 그 관심의 세포를 제한합니다. 여기에 설명 된 배경 보정은 바이너리 프로브 읽기 파장 세포자가 형광을 고려하지 않습니다. 이러한 경우에, 표지 된 세포 (NO 프로브 형질) 감산 같은 조건으로 배경에서 묘화한다. m표지 및 표지 된 세포의 IX가 사용될 수 있고, 비 표지 세포 백그라운드 ROI 선택. 전체 이미지 필드 위에 세포 분석을 제공하는 다른 방법이 세포가없는 음영 마스크의 사용, 여러 배경 로아, 또는 동일한 샘플을 포함하는 프로토콜 요청에 따라 사용할 수 있습니다.

3D FRET 촬상 특정 프로브 응답은 분석 물질 (도 6)에 하이드로 겔 투과성에 매우 민감하다. 따라서 동일한 하이드로 겔 영역은 바람직 형상 대칭의 시점에서 이러한 여기에 사용 된 발판 센터 근처로, 실험적인 치료를 통해 비교된다. 다르게는, 미세 유체가 챔버 / 생물 신속하고 균일 검체 용액 (45) 하이드로 겔을 관류하는 데 사용될 수있다. 프렛 신호는 하이드로 겔의 형광도가 너무 높은 경우 (신호 대 잡음 비율이 너무 낮은 경우) 검출되지 않을 수있다; 얇은 하이드로 겔 또는 다른 프로브 (다른 형광체)를 사용한다.광 가교 하이드로 겔의 3D FRET 영상에 대해, 최소 방사선 노출과 프로브의 형광의 여기 스펙트럼 외부의 파장을 사용하는 것이 좋습니다. LAP는 또한 잠재적 인 세포 손상을 최소화 31,46 405 nm에서의 가시광 원으로 사용될 수있다. 이 프로브 표백을 최소화하기 때문에, 365 nm의 조사에 사용 LAP 권장합니다. 피크 여기에 놓여 405 내지 365 nm 인 반면는 CFP 공여체 여기 스펙트럼의 말미에있다. 대안 적으로, 프로브 식 하루 동안 회복하도록 허용 될 수있다. 이진 프로브의 사용은 발현 수준 및 도너와 억 셉터 형광 분자 확산에 차이가 감도 문제를 최소화한다. 비 이진 프로브를 사용하지만, SE 대신 여기 및 발광 스펙트럼 스펙트럼 블리드 스루에 대한 QE 이미징 및 추가 수정과 (아래 참조) 할 수있다. 또한, 저 상용화와 FRET 프로브 설계 복잡성방해가 될 수있다. 성공적인 실험에서 가장 중요한 요소는 형광 신호를 적절히 보정 분석 남아있다.

프렛 비율 대체 계산 광표백 최소화 외에 여러 추가적인 이유로 이용된다. 이진 단일 체인 프로브의 경우, 일반적으로보고 된 비율은 기증자 여기 (급냉 방출, QE), 즉 아래 기증자 방출에 기증자 여기 (증감 방출, SE)에서 수용체 방출은, 비 = SE / QE 25,47,48를 FRET. SE / QE는 FRET 효율 21,22,47의 변화에 비선형 상대적입니다. 즉, 비 프로브 (EI)의 고유 FRET 효율성 지수 함수의 비선형 관계를 갖는다 (Donius, AE, Taboas, JM 미발표 작품. (2015)), 작은 약 15 % 미만 에이 대한 비율 가장 직쇄. SE / QE는 활성화 된 프로브 (FAP, 즉, 분석을 결합 프로브의 부분)의 비율을 과소 평가합니다. Therefo다시는 SE / QE의 분석은 복잡 평형 복용량 응답 연구와 곡선 맞춤을 필요로한다. 다행히 수용체 여기에서 수용체 방출에 SE 또는 QE의 비율 (AEM)가 즉, 에이와 FAP,에 대하여 선형의 FRET 비율 SE / AEM 및 QE / AEM. SE / AEM은 종종 이진 프로브에 사용 전용 (프로브 활동 및 전체 프로브 활동에서) 엔드 - 포인트 보정이 필요하지만, 기저 세포 신호 전달이 곤란하게된다. 엔드 보정에 대한 필요성을 제거하기 위해, SE는 도너와 수용체의 여기 및 발광 스펙트럼의 스펙트럼 중첩 (스펙트럼 블리드 스루)과 결합 된 프로브의 형광과 현미경의 양자 수율 및 분광 감도 (QS)에 대해 (CSE) 보정 될 수있다 이미징 시스템. CSE에 기초하여 보정 SE FRET 비율, 즉 화상, E = SE CSE / AEM의 각 화소 내에서의 프로브 관측 FRET 효율성을 정의한다. 상업 및 자유 소프트웨어는 이러한 효과 SE를 해결하는 데 사용할 수 있으며독자는 방법 (50)에 대한 자세한 설명은 첸과 Periasamy 2006 년 작품이라고합니다. 그러나, E SE를 계산하는 시간 점 (SE, QE, AEM) 당 세 개의 영상 채널의 캡처가 필요합니다. 두 개의 영상 채널 캡처 (QE 및 AEM)가 필요합니다 QE / CAEM, - 따라서,이 연구에서 우리는 또한 다른 FRET 비율 E QE = 1을 사용합니다. 이러한 채널에서 E의 QE 계산 만 QS (CAEM = AEM은 QS를 X)에 대한 AEM 보정이 필요합니다. QS = 민주 / AEM 쉽게 민주는 수용체 표백와 기증자 여기에서 기증자 방출되는 하나의 교정 샘플에서이 이미지를 사용하여 추정된다. 임의의 순간에 FAP는 프로브의 에이 SE에 E 또는 E QE를 비교함으로써 계산 될 수있다.

결국 FRET 비 선택 (E QE = QE / CAEM 대 E SE = CSE / AEM)는 프로브 유형을 고려하여 최상의 신호 채널들에 기초한다. 모두시간이 지남에 따라 형광도의 변화를 계정에 전술 한 바와 같이 pproaches는 프레임 당 이미지의 배경 소음 보정을 포함한다. 그들은 종종 설계 현미경 필터 구성을 프로빙에 의한 경우가 민주 여기 스펙트럼으로 AEM 여기 광의 오버랩을지지 않는다. 단쇄 프로브 역시 사용할 수 있으며, 선택은, 카메라 잡음에 가장 프로브 신호 (밝기)과 SE 및 QE 채널의 배경 신호에 기초한다. ICUE1 프로브와 여기에 사용 된 실험 조건 (셀 하이드로 겔 타입)의 경우, SE는 QE보다 더 강한 신호를 가지고있다. 이중 쇄 프로브 인해 도너와 억 셉터 형광 비 등몰 분포 E SE의 사용을 필요로한다. 이러한 ICUE1으로 분석 결합에 FRET 감소 우리는 E SE = 1, 여기처럼 효율이 분석을 결합 할 때 긍정적 인 신호 변화를 제시하는 "반전"할 수 FRET 프로브 용 - CSE / AEM 나 E QE = QE / (AEM은 QS를 X).

일의 분석전자 FAP는 FRET 비율의 적절한 보정과 에이의 추정에 민감합니다. 그것은 QS에 사용 된 것과 같은 캘리브레이션 샘플 종래의 엔드 포인트와 FRET 추정 될 수 에이가 = 1- (QE 화상 수용체 광표백 및 민주 이미지 뒤에) 28 만, 치료가 취해 져야 (/ 민주이 QE)을 최소화하기 효율 분석 기증자의 실수로 표백. 우리는 QS 조정 AEM에 따라 민주의 추정, 치환 된 수정 된 버전을 설명 즉, 에이 = 1 - (QE /은 (AEM)는 QS X). 선택적으로, CSE = 에이 / AEM 사용할 수있다. 살아있는 세포의 에이의 평가는 모든 프로브 전체 FRET로 구동해야합니다. 이 분석 물을 결합에 FRET 감소 등 ICUE1 같은 프로브를위한 사실상 달성하기 어렵다. 세포 용 해물과 정제 분석을 사용하여 에이의 체외 기반으로 계산 최선이지만,이 작업의 범위 밖에. 여기에서 우리는 세포에서 캠프를 감소 2 ', 5'-Dideoxyadenosine를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 상대적으로 FAP가있다 ㄱ전자 신호의 기준 레벨로부터 유래 에이 추정을 사용하여 계산. 이러한 이유로, 연구는 대부분 작용제를 첨가하기 전에 시그널링 기준선 시그널링 포화 제 작용제를 첨가 한 후 하한 및 신호 인 엔드 보정에 기초하여 FRET 비 (여기 완료로) 또는 상대 FAP를 상부되어보고 경계. 포스 콜린 종종 된 cAMP 신호를 포화 제어 작용제로서 사용된다. 선택적으로, 캠프 유사체가 사용될 수있는 8- Bromoadenosine 3 ', 5'-시 클릭 모노 포스페이트 등. 실험적인 치료 사이의 신호 전달 경로의 잠재적 변화를 확인하는 연구의 완료에 사용 양성 대조군을 권장합니다.

셀 당 평균 신호 응답의 계산은 여러 가지 요인을 고려를 필요로한다. 우선, 평균 FRET 비율이 셀 내의 각 화소의 비율의 평균으로 계산한다, 즉 (Σ (QE/cAem)) / (화소 수) 대신 RA셀의 평균 QE 및 AEM, 즉, (ΣQE) / (ΣcAem)의 TIO. 배경 잡음이 낮은로 후자 조심 마스킹을 요구하지 않지만, 그것은 심각한 실제 평균 FRET 비가 과소. 그러나, 화소의 비율은 부동 소수점 계산과 ROI 영역을 정의하고 상기 셀 외부 배경 잡음으로부터 생성 된 스퓨리어스 비의 포함을 피하기 위해, 셀 영역의 바이너리 마스크주의를​​ 필요로한다. 셀 전체 영역이 셀 형상에 부세 결과를 피하기 위해 정량한다. 마스킹은 세포의 모양과 이동의 변화에​​ 따라 시간이 지남에 따라 재정의 될 필요가있다. 배타 기준이 QE 잘 세포 수준 미달 근처 배경 수준이다 AEM 신호로부터 화소 비율을 제거하도록 정의되는 경우, 또는, 상기 셀보다 큰 ROI를 사용할 수있다. 상기 된 분석 방법 세부 전문 소프트웨어 / 플러그인없이 FRET 분석을 위해 본 연구에 사용 된 기본 단계. 현미경 제조 업체 및 기타 업체는 추가 모듈 판매자동화 비율 계량을 지원하고 분석 FRET 자신의 현미경 소프트웨어에 대한의. 마찬가지로, 공개 ImageJ에 소프트웨어는 RiFRET 같은 입자와 FRET 분석을 위해 사용할 수있는 몇 가지 플러그인을 가지고 있습니다. 2 차원 화상이 사용되기 때문에 둘째, 픽셀 기반의 평균 FRET 비율은 3 차원 세포 구조의 실제 평균 비율을 과소. 2 차원 신호를 나타내고, z 축을 따라 평균. 생균의 FRET 비의 3 차원 공간 분포의 계산은 고속 3D 이미징없이 불가능하다 (예. 이용한 디스크 초점 현미경 회전). 이것은 2D 및 3D 배양 모두 문제이지만, 평면에서 존재하는 세포의 구조가 한층 더 차원에서 더 큰 효과를 갖는다. 이것은 세포막 EPAC1 프로브 PM-ICUE 같은 세포 구조에 지역화 프로브에 대한 큰 관심이다. Spiering 등의 알을 참조하십시오. 2,013에 대한 제안 비율 계산 (24)에 세포 두께 효과를 수정합니다. AEM의 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다프로브 조정 셀 및 이미징면의 지역에서 축적 경우 감지합니다. 이것은 또한, FRET 비의 공간 분포를 해석하는 스퓨리어스 결과를 제거하는 데 도움이 될 것 등., (낮은 AEM 영역이 낮은 프로브 농도가되며, 프로브 포화 높은 FRET 비를 나타낼 수있다 IE) 프로브 채도를 식별. 셋째, 다른 FRET 기준선 수준은, 형질 감염 효율의 차이를 나타내는 실험군 사이 발현 또는 기저 시그널링을 조사 할 수있다. "상대 분석"(단계 10.1.1)가 존재하는 경우 시간이 지남에 따라 FRET 비율 드리프트를 제거하는 데 도움이됩니다. 이 샘플 사이의 반응의 상대적인 크기의 비교를 용이하게하지만, 기준 샘플에 대한 응답 (제어 플롯 평면 라인)의 타임 코스에 비해을 방해. "절대 분석"(단계 10.1.2) 샘플 전체 응답 속도의 비교를 용이하게하지만, 각 라인은 dissim 의해 스케일링 때문에 반응의 크기를 비교하여 방해ILAR 정수입니다. 연구는 종종 시간이 지남에 따라 FRET 비율의 편차를 보정하는 기준에 선형 회귀 분석을 사용한다.

설명 된 3D FRET 방법은 제조 및 다른 프로브와 영상 방식에 적용 할 수있는 3 차원 셀 라덴 하이드로 겔의 경과 이미징을 수행하기에 유용하고 실용적인 방법이다. 전술 한 바와 같은 단일 쇄 이진 프로브 이외에 다른 FRET 시스템은 강도 계 신호의 더 복잡한 보정이 필요하다. 선택적으로, FRET (FLIM-FRET)의 형광 수명 이미징 프로브 도너의 발광 수명의 변화를 통해 FRET 효율을 계산하기 위해 사용될 수있다. 강도 기반의 FRET는 달리, FLIM-FRET은 배경 잡음 스펙트럼 블리드를 통해, 양자 효율 및 검출기 분광 감도 2에 민감하다. 그러나, FLIM 시스템은 고가의 복잡한, 그리고 드문 일이며, 하나의 지수 부패와 형광없이 FLIM 49 실행 - 오프에서 가장 잘 작동합니다. 설명 된 방법은 MO와 함께 사용될 수있다고급 현미경 플랫폼 재 (예., FRET-TIRF, 형광 이방성 및 스펙트럼 상관 FRET). 고속 공 초점 및 다 광자 현미경으로 3 차원 영상이 방법을 적용하는 시그널링 응답 서브 세포 분포의 분석을 용이하게 분석 신호의 정확성을 증가시킬 것이다. 이 3D FRET 방법은 시뮬레이션 3D 세포 미세 환경에서 고급 세포 생물학 연구를 가능하게 할 것이다. 이와 같이, 용이 약리학 및 세포 간 신호 전달 연구 및 설계 하이드로 기반 microtissues 약물 반응을 포함한 선별 재생 의료 요구에 적용 할 수있다.

Acknowledgments

저자는 피츠버그, 건강 상 K01 AR062598의 국립 연구소 및 보조금 P30의 DE030740 대학의 치과 의학의 학교의 재정 지원을 인정합니다. 저자는 ImageJ에 매크로 ImageJ에 마이클 대화방을 개발하기위한 ICUE1 플라스미드 박사 진 장, 웨인 Rasband 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Tags

분자 생물학 문제 (114) 미세 유체 microtissue 형광 포스터 비계 폴리에틸렌 글리콜 하이드로 겔 FRET 세포 내 신호 연골 세포
3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V.,… More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter