Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler

doi: 10.3791/54135 Published: August 1, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Förster resonans energi overføring (FRET) bildebehandling er et kraftig verktøy for sanntidscellebiologi studier. Her en fremgangsmåte for å FRET avbildnings cellene i fysiologiske tre-dimensjonale (3D) hydrogel microenvironments ved hjelp av konvensjonelle epifluorescens mikroskopi er presentert. En analyse for Proporsjonellekspansjon FRET prober som gir lineære forholdstall enn aktiveringsområdet er beskrevet.

Abstract

Imaging av Förster resonans energi overføring (FRET) er et kraftig verktøy for å undersøke cellebiologi i sanntid. Studier som anvender FRET vanligvis anvende to-dimensjonale (2D) kultur, som ikke etterligner den tredimensjonale (3D) cellulære mikromiljø. En fremgangsmåte for å utføre undertrykket emisjon FRET avbildning ved bruk av konvensjonelt vidfelt epifluorescens mikroskopi av cellene innenfor et 3D-hydrogel miljø presenteres. Her en analysemetode for ratiometrisk FRET prober som gir lineære forhold mellom over sonden aktiveringsområde, er beskrevet. Måling av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåene er demonstrert i kondrocytter i henhold til forskolin stimulering ved hjelp av en sonde for EPAC1 aktivering (ICUE1) og evnen til å detektere forskjeller i cAMP-signalisering avhengig av hydrogel materialtypen, her en fototverrbindingen hydrogel (PC-gel, polyetylen-glykol-dimetakrylat) og en thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Sammenlignet med 2D FRET metoder,Denne metoden krever lite ekstra arbeid. Laboratories allerede utnytte FRET avbildning i 2D kan enkelt ta i bruk denne metoden for å utføre mobiltelefon studier i en 3D-mikromiljøet. Den kan videre anvendes for high throughput screening medikament i konstruerte 3D microtissues. I tillegg er den kompatibel med andre former for FRET bildebehandling, slik som anisotropi måling og fluorescens levetid imaging (FLIM), og med avanserte mikros plattformer ved hjelp av konfokal, pulset eller modulert lys.

Introduction

Cellular signalering er både komplisert og følgeskader for en rekke felt, inkludert farmakologi, tissue engineering, og regenerativ medisin. Nyttige investigational verktøy er nødvendig for å videreutvikle vår forståelse av cellebiologi og å utvikle optimale materialer for vev gjenfødelse. Förster resonans energi overføring (FRET) bildebehandling er et viktig verktøy som muliggjør analyse av reseptor aktivering, molekylær konformasjon, og supramolekylære interaksjoner (f.eks., Protein / DNA kompleks) i levende celler. FRET er en type ikke-strålingsenergioverføring mellom fluoroforer 1. Den har en effektivitet som er omvendt proporsjonal med den sjette potens av avstanden mellom en donor og akseptor fluorofor fluorofor. Dermed kan det gi informasjon om den romlige avstanden mellom to forskjellige molekyler eller på tvers av regioner i ett molekyl på nanometer skala (vanligvis 1 - 10 nm) 2. Donor og akseptor fluoroforene kan være forskjellig molecule typer (hetero-FRET), hvor giveren har høyere energi utslipp (kortere bølgelengde), eller av den samme type (homo-FRET). FRET avbildning kan utføres på faste eller levende celler, men generelt fikserte celler blir brukt til avbildning av molekylære interaksjoner med høy romlig oppløsning ved høy hastighet konfokale systemer er utilgjengelige. Levende celler blir brukt til å studere interaksjoner og prosesser som er hemmet eller endret ved fiksering, slik som sanntids intracellulære signalrespons 3.

Levende celle-studier som anvender FRET avbildning bruk to-dimensjonale (2D) cellekulturer delvis på grunn av enkelhet og lavere bakgrunn (ingen emisjon fra ut av plane celler). Imidlertid 2D kulturer også endre en rekke cellulære prosesser i forhold til den fysiologiske mikromiljøet og tre-dimensjonale (3D) kultur 4,5. For eksempel er innfødt celle til celle og celle til ekstracellulære matriks-interaksjoner drastisk forandret i 2D kultur fører til easily observerte endringer i celle morfologi og polaritet 6. Membranmikroområder (f.eks., Caveolae og lipid flåter) og reseptorsignalisering er sterkt regulert av kulturmiljøet, blant annet fordi de binder cytoskeletal komponenter 7,8 og celleformen og cytoskeletal struktur er sterkt regulert av romlig kulturen miljø 9. Mechanotransduction er ikke bare påvirket av 3D matrix, men av de mer komplekse sekundære belastningsforhold skapt i 3D-miljøer i forhold til 2D kulturer 10. Til slutt, permeabiliteten av 3D-matriser er mindre enn kulturmediet, generelt med redusert diffusjon og økt binding av cellesignalmolekyler sammenliknet med 2D-kulturer. Med 3D-kulturer er man i stand til å skape og observere en mikromiljøet mer lik den fysiologiske forhold til lim, kjemiske og mekaniske signaler. Celle til celle interaksjoner kan fremmes og klebeegenskaper kan styres with struktur, sammensetning og arkitektur (mønster) av 3D-materiale 11-13. De mekaniske egenskapene til materialet kan likeledes tilpasses etter sammensetningen og strukturen 14,15. Dyrkning av celler i hydrogeler derfor tillater FRET studier på primærceller som ellers ville de-differensiering eller endring i fenotype ved bruk av konvensjonelle teknikker, f.eks., Celler fra leddbrusk. Det er således behov for en fremgangsmåte for å muliggjøre FRET forsøk i levende 3D-kulturer.

Hydrogel stillaser er ideelle for 3D FRET baserte studier fordi de kan gjøres optisk transparent og skreddersydd for å kontrollere mikromiljøet og for å gi cellulære signaler. Hydrogeler fremstilt fra naturlige polymerer har vært brukt i cellekultur i flere tiår, inkludert gelatin og fibrin 16. Større kontroll over den cellulære mikromiljø kan oppnås ved kjemisk modifikasjon av disse polymerer og med bruk av syntetiske polymerer 17,18. hydrogel mekanisk stivhet og permeabilitet kan kontrolleres ved å endre deres polymermaterialet og maskestørrelse (polymer og tverrbindingsdensitet) 19,20. Videre kan hydrogeler gjøres bioaktivt gjennom inkorporering av vekstfaktorer og cellulære ligander. På grunn av disse mulighetene, er utviklingen av hydrogeler for biosensing, levering av legemidler, og tissue engineering applikasjoner et meget aktivt forskningsområde 21. 3D printing av hydrogeler er også under utvikling for fabrikasjon av mikro vev og -organs 15. Således er FRET avbildning av celler i hydrogeler ikke bare nyttig som et middel for å tilnærme fysiologiske celle oppførsel, men også som et verktøy for å studere og optimalisere konstruert vevsvekst.

Binære Proporsjonal FRET-prober er svært nyttige i å studere cellesignalisering og kan anvendes i hydrogel-kulturer. For en ufullstendig liste over publiserte fluorescerende og FRET sonder, se Cell Migration Consortium hjemmeside (f.eks., Binding av et ion eller molekyl, enzymatisk spalting av region) som endrer avstanden mellom fluorophores og derfor gnage magnitude (enten høyere eller lavere) 23. En mindre vanlig, men nyttig sondetypen er avhengig av en analytt følsomt forandring i spektrale overlapping av de to fluoroforer, som endrer FRET størrelsesorden. "Single-kjede" Proporsjonal sonder utnytte en fluorophore par koblet på et enkelt molekyl. "Dual-kjede" prober utnytte fluoroforen parvis på separate molekyler, men deres ekspresjon kan koples under samme ekspresjonskassetten 24. I motsetning til studier med enkelt fluorophore uttrykk (f.eks., Fluorescerende fusion proteiner), studier med ratiometriskFRET prober krever ikke dual-transfeksjon for å kontrollere for transfeksjonseffektivitet eller celle-levedyktighet. Proporsjonal FRET prober er relativt ufølsom for transfeksjon effektivitet når uttrykt ovenfor et minimum terskel (konsentrasjon insensitive) 23,25. De er ufølsomme for eksitasjon kilde svingninger og andre intracellulære faktorer (f.eks., PH, ioner) så lenge begge fluoroforer er like forståelsesfull. I tillegg er deres respons ikke gjenstand for transkripsjonen forsinkelse, i motsetning til fluorescerende og bioluminescent promoter-reporter-konstruksjonene 26,27.

Proporsjonal FRET sonder er lett og ofte ansatt i konvensjonelle vidfelt epifluorescence mikroskop systemer. Widefield mikroskoper er foretrukket over linjen skanning confocal systemer for levende celle bildebehandling på grunn av bekymringer over systemkostnadene, fluorophore bleking, og fangst av signalendringer med tilstrekkelig tidsoppløsning. I tillegg er enkelt celle analysis over en stor populasjon av celler er mulig med en motorisert scene og bildeopptak over flere synsfelt. Widefield mikroskopi krever intensitet basert analyse av de hetero FRET sondesignaler. Selv om intensiteten analyse ikke krever komplisert maskinvare som andre FRET metoder, er mer etter oppkjøpet arbeid som er nødvendig for å korrigere for effekten av fluoroforen atferd og mikroskop / bildesystemkonfigurasjoner 28. Den fangede utslippsintensiteten av en fluorofor er en funksjon av eksitasjonsenergien, fluoroforen kvanteutbytte, og det kombinerte filteret og kamera / detektor spektralfølsomhet og linearitet 2. Disse kan være ulik for donor og akseptor og vil kreve kalibrering for kvantitativ analyse. I tillegg er avbildning av akseptor utslipps påvirket av den spektrale overlapping av fluoroforene (eksitasjon av akseptor av donor eksitatorisk lys og luft-gjennomstrømning av donor utslipp til akseptor emisjonsspektra) 2.4, enkelt-kjede "prober er internt normalisert fordi deres fluoroforer er ekvimolar i nanoskala, mens fluoroforene av" dobbel-kjede "prober kan eksistere i forskjellige støkiometrier gjennom en celle 25,28 Dersom fluoroforer i." Single-chain " prober er av samme lysstyrke (funksjon av ekstinksjonskoeffisient og kvantumutbyttet), effekten av ikke-lineær detektorfølsomhet er små og bare korrigert for bakgrunnsfluorescens og det koblede kvanteutbytte / detektorfølsomhet er nødvendig 23. Således "single-chain" proporsjonal FRET sonder lettest implementert i vidfelt mikros 24.

Dette notatet beskriver en enkel teknikk for å utføre FRET avbildning av levende celler i 3D hydrogel kulturer ved hjelp av en konvensjonell vidfelt epifluorescent mikroskop. Det kan lett vedtatt av laboratorier allerede utfører FRET eksperimenter i 2D, samt laboratorier som er interessert i intercellesignalisering i microtissues. Her viser vi metoden med FRET bildebasert måling av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåer i levende chondrocytes innen fototverr (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) og thermoresponsive (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En ratiometrisk FRET-probe blir anvendt basert på EPAC1 (ICUE1) for å detektere cAMP-nivåer i respons til forskolin, en kjemisk agonist for adenylat cyclase som katalyserer omdanning av ATP til cAMP. cAMP er en av de viktigste andre budbringere som formidler G protein-koblet reseptor signalisering og den aktiverer ulike faktorer, inkludert nedstrøms utveksle proteiner direkte aktivert av cAMP (EPACs). Fluoroforene beveger seg fra hverandre ved cAMP-binding til EPAC domene resulterer i en reduksjon i FRET. Beskrevet her er fremstilling av hydrogel materiale, celle transfeksjon med ICUE1 probe, og innstøping av cellene i 3D-hydrogeler. 3D-FRET eksperiment fremgangsmåte og bildeanalyse nødvendigeå evaluere sonde aktivitet per celle blir forklart. Vi diskuterer også de iboende begrensningene i FRET analyse i 2D og 3D ved hjelp vidfelt mikroskopi. Den teknikk som presenteres her er en forbedring i forhold til de eksisterende metoder 2D siden det muliggjør analyse i en mer fysiologisk sammenheng, og krever mindre bildekorreksjon og kalibrering. Stor nytte ligger i det faktum at mange transparente materialer kan brukes mens kan opprettholdes celle og transfeksjon preferanser.

Protocol

1. Materialer Forberedelse

  1. Fremstille polyetylenglykol dimetakrylat (PEGDM, 4000 mw) ved methacrylating polyetylenglykol i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Lin-Gibson et al., 29. Alternativt kan PEGDM kjøpes.
  2. Syntetisere fotoinitiator, litium- fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), gjennom en to-trinns prosess hvor første dimetyl phenylphosphonite omsettes med 2,4,6-trimetylbenzoyl klorid via en Michaelis-Arbuzov-reaksjonen og deretter litiumsaltet lages ved å legge litiumbromid i 2-butanon, i samsvar med Majima et al. 30.
    Merk: Alternativt kan andre fotoinitiatorer kjøpes men LAP viser bedre biokompatibilitet og kryssbinding effektivitet 31.
  3. Funksjonalisere de dekkglass for å muliggjøre binding av hydrogelen til glasset, og derved forhindre bevegelse under avbildning.
    1. I en kjemisk hette med riktig personlig verneutstyr, bruk3- (Trimethoxysilyl) propylmetakrylat henhold til produsentens protokoll for PC-geleer og epoxy silaner (3-glycidoksypropyltrimetoksysilan) for TR-gels 31. Merk: Alternativt kan forhåndsbelagt lysbilder kjøpes. Legg merke til at dekkglass må være større enn vel av PDMS fatet i trinn 3,8.

2. Cell Transfeksjon

  1. I en vevskultur hette og ved hjelp av sterile teknikker, tining og plate de ønskede cellene ved sub-konfluens (50 - 70%), heri bovine kondrocytter på 15.000 celler / cm2 i 6-brønns ikke-behandlede kulturskåler. Merk: Alle relevante celletype kan anvendes, herunder forankrings uavhengige celler.
    1. Tillate celler å gjenvinne for en dag i en inkubator ved 37 ° C. Før etterfølgende trinn, fjerne medium, skyll med PBS, og tilsett 2 ml fenol og serumfritt medium per brønn.
  2. Neste dag for hver brønn, tilsett 100 mL av fenol og serumfritt medium samt 3pl transfeksjon reagens til en Autoclaved prøverør av glass. Å blande, riste røret lett. Inkuber ved RT i 5 min. Begrense eksponering for lys.
  3. Tilsett 1 mikrogram FRET undersøke DNA og rist lett. Inkuber blandingen ved RT og borte fra lys i 30 minutter.
    Merk: I dette forsøket ICUE1 plasmid (courtesy of Dr. Jin Zhang 33) ble brukt. De fluorophores i ICUE1 er cyan fluorescerende protein (CFP, donor) og gul fluoriserende protein (YFP, akseptor). Forholdet mellom reagens-transfeksjon med plasmid DNA vil trenge justering for optimal transfeksjon av forskjellige celletyper.
  4. Fordel den fremstilte blanding (~ 104 mL) dråpevis til hvert av de 6 brønnene som inneholdt cellene pluss 2 ml fenol- og serumfritt medium. Ikke pipettér opp og ned. Rotér plate å blande.
  5. Inkuber ved 37 ° C i 48 timer. Merk: konfluens hemmer transfeksjon effektivitet og endrer endogen uttrykk av reseptorer.

3. Fabrikasjon avPDMS Former for Hydrogel Casting og kultur

  1. For å forberede et stort glass lysbilde å kaste polydimethylsiloxane (PDMS) på, rengjøre glasset først med såpe, skyll med store mengder vann, og tørk med isopropanol fulgt av luft.
    1. Unn glasset med en silikonsiering reagens som per produsentens protokoll slik at PDMS lett kan skrelles av etter herding. Skyll rest reagens ut av overflaten med toluen over et nedslagsfelt container. La overflaten luft tørke fullstendig før eller anvende varme ved 100 ° C for å redusere ventetiden.
  2. Velge en hydrogel høyde (f.eks, 1 mm) og beregne 1,2 ganger volumet av PDMS for å dekke det glass-slide med PDMS av denne tykkelse ved hjelp av dimensjonene av glass-slide og hydrogel høyde. Merk: PDMS krymper ikke.
    1. Bland PDMS kit komponenter ved et 10: 1 forhold av vekt i et begerglass. Når det er godt blandet, plasserer begeret husar vakuum Degas. Relieve vakuum hvis boblene begynner å renne over beholderen og gjenta.
      Merk: Andre hydrogeldannende tykkelser kan anvendes, men på bekostning av øket bakgrunn og øket opasitet hvis sentrifugering (trinn 6.2) ikke er i bruk.
  3. Vikle aluminiumsfolie rundt bunnen og sidene av glasset for å inneholde PDMS. Hell forsiktig den ønskede mengde av avgassede PDMS på dette glass omgitt av folie. Mål PDMS høyde. Husk at høyden av PDMS vil være den maksimale høyden av hydrogel. Hvis noen bobler skapes når du skjenker, Degas igjen eller pop dem med en slikkepott eller nål.
  4. Plasser uherdet PDMS på en plan overflate i en ovn ved 100 ° C i 2 timer, eller la ved RT i 24 timer.
  5. Fjern forsiktig PDMS fra overflaten når den har herdet. Punch ut ønsket form (f.eks sylindriske punch av 3 mm) for hydrogeler.
    Merk: fototverr vil gi litt smalere PC-gel sylindre enn formen diameter på grunnfor stopping av reaksjonen med molekylært oksygen i PDMS.
  6. Steriliser de utstansede PDMS. For kort sikt eksperimenter, senk PDMS i 70% etanol i 1 time.
  7. Monter formen ved montering av bunnen av steriliserte PDMS med en steril glass dekkglass av en tykkelse tilpasset den mikroskopobjektiv korreksjon. Sett til side for bruk i trinn 6.
  8. Fremstille et større PDMS tallerken ved hjelp av metodene ovenfor (med et godt bredere og høyere enn den hydrogel) for å inneholde den hydrogel og mediet. Romme et medium volum minst 10x mer enn hydrogel å fordype hydrogel og for å minimere utvanning av analytten.

4. Utarbeidelse av Hydrogel Forløperceller Solutions

  1. I en vev kultur hette og ved hjelp av sterile teknikker, forberede hydrogel forløper løsninger som passer for studiet umiddelbart før du legger celler. Fremstille PC-gel fra polymeren forløper som følger.
    1. Bland PEGDM pulver inn i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,2) ved 10% (vekt / volum).
    2. Tilsett fotoinitiator (f.eks LAP) ved en sluttkonsentrasjon på 0,005 til 0,01% (vekt / volum) og blandes ved pipettering. Dekk løsning med aluminiumsfolie eller skjold mot lys som LAP er lysfølsom.
      Merk: Her TR-gelen redusert vekstfaktor ekstracellulær matriks anvendt som levert av produsenten.

5. cellesuspensjon i Hydrogel Solutions

  1. I en vevskultur hette og ved hjelp av sterile teknikker, aspirere mediet fra brønnene.
  2. Legg PBS til brønnene og ta deretter til grundig skylle vedlagte cellemonolagene.
  3. Dissosiere cellene fra dyrknings underlaget med 2 til 3 ml per 25 cm2 av celledissosiasjon oppløsning. Rist, deretter inkuberes ved 37 ° C i 10 - 20 min eller inntil dissosiert. Fast trykk fatet hvis det er nødvendig å fjerne celler.
    Merk: Alternative celledissosiasjon løsninger er tilgjengelige med utvalg begrenset til de som ikke gjør jegMpact signalveien som analyseres ved spalting av reseptorer av interesse.
  4. Etter at cellene er frittliggende, tilsett 2 ml fenol og serumfritt medium, suspendere cellene, og telle celler med en hemocytometer. Merk: kjemisk definert serumfritt medium (som supplert med insulin, transferrin og selen) kan også anvendes.
  5. Alikvot det ønskede antall celler basert på celletype inn i sterile ampuller og pellet (for eksempel 2,0 x 10 6 celler pr ampulle).
  6. Fjern supernatanten, legge det ønskede volum av hydrogel-forløper og suspendere cellene ved pipettering. Bruker et volum av forløper som vil gi 2 x 10 5 celler / cm2 i xy-planet ved å visualisere z-aksen av den hydrogel som kollapset (for eksempel 1,0 ml per ampulle for en 1 mm tykk hydrogel inneholdende 2 x 10 6 celler / ml). Pass på å ikke produsere bobler.
    1. Raskt gå videre til neste trinn for å begrense negative effekter på celle levedyktighet 34 </ Sup>.

6. Hydrogel Forberedelse

  1. I en vev kultur hette og ved hjelp av sterile teknikker, legger celleholdige hydrogel forløper til støpeformer utarbeidet i trinn 3 (for eksempel 7,1 mL per diameter 3 mm x 1 mm høy mugg). Skape en ekstra hydrogel, i henhold til de samme metoder som er beskrevet, til bruk for mikroskop avbildningssystemkalibrering og sonden kalibrering (hvis den iboende sonden effektivitet er ukjent).
  2. Sentrifuger fremstilte celleholdige hydrogel forløper før gelering / kryssbindings å optimalisere avbildning ved å avgrense celler til et enkelt fokusplanet og minimalisere ut av planet signal (figur 1). Juster sentrifugering tid og kraft til den celletypen og viskositeten av forløperen (400 g i 4 minutter).
  3. Gel eller crosslink løsningen
    1. For PC-gelen hydrogel, bestråle celle-inneholdende forløper med et UV-A lyskilde (λ = 365 nm) for en eksponeringstid lik3,2 J / cm2 per millimeter tykkelse til photocrosslink.
      Merk: Bruk en 1 mm tykkelse i beregningen. Eksponeringer bør falle i 1-5 min rekkevidde. Bruke minst eksponeringstiden. Unngå over-bestråle cellene som dette vil redusere levedyktighet og bleke CFP donor. Imidlertid er eksponeringstider mindre enn 60 s anbefales ikke på grunn av høy intensitet-bestråling fører til radikal selvlukkende og dårlig celleviabilitet.
    2. For TR-gel hydrogel, plasser fylte formen i en petriskål og flytte til en inkubator for termisk gelate. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Etter gele eller kryssbinding av hydrogel, fjerne PDMS hydrogel støpeformen og erstatte den med forberedt større PDMS fatet (fra trinn 3.5). Trykk på PDMS ned på glasset med en steril spatel til å følge den.
    1. Plasser denne PDMS tallerken med dekkglass i en steril beholder, slik som en petriskål. Legg fenol-free serumfritt medium eller kjemisk definerte megdium (serumfritt medium supplert med insulin, transferrin og selen (trinn 5.4)) til brønnen laget med PDMS fatet og dekkglass for å holde hydrogelen nedsenket. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
      Merk: Hvis du bruker en spesialisert tallerken med et dekkglass, og sett dekkglass i det og på samme måte legge til medium.
    2. Alternativt utføre dette trinnet dagen før FRET bildebehandling slik at sondene å gjenopprette så bestrålingsbølgelengder overlapper med CFP donor eksitasjon spektrum.

7. 3D FRET Imaging

  1. Fjern det PDMS fatet med hydrogelen fra petriskålen, fremstilt i trinn 6.4, og sikres i en justerbar prøveholder for XY-objektbord (figur 2). Plasser prøveholder på mikroskopet scenen. Påfør oljen til målet om nødvendig. Bruke et mål på minst 40 ganger og med høy numerisk apertur (NA) (dvs. 1,3 NA) for å fange opp den forholdsvis svake fluorofore-utslippene.
  2. Konfigurer synsfelt (FOVs) for bildeopptak: Velg celler for avbildning ved hjelp overført lys bildebehandling og verifisere transfeksjon med fluorescens bildebehandling. Velge minst 15 forskjellige celler.
    1. Merk cellene som verken er for sterkt eller for svakt (som ellers kan føre til sonden overmetning eller lav sensitivitet), og med den FRET-forhold mellom 0,0 og 1,0 (noe som indikerer ellers skade eller nedbrytning av den binære probe). Deretter slå av lyset for å begrense eksponeringen.
    2. Velger FOVs nær sentrum av hydrogelen og med cellene av interesse innenfor den relativt flate belysningsfeltet (se figur 3B og trinn 9.2 nedenfor).
  3. Konfigurer kamerainnstillingene for gnage bilde kanaler. Velge mellom noen få celler i nærheten av midten av FOV for å optimalisere den "optiske utforminger" (dvs.., Eksponering og forsterknings per bilde kanal).
    Merk: nomenklatur nedenfor varierer depending av programvaren som brukes til å betjene den mikroskop og kamera. Mikroskopet programvare, NIS-Elements, er brukt her for bildetaking og analyse.
    1. For FRET analyse av enkeltkjede prober, velger to bilde kanaler pr FOV: slukket utslipp (QE), som er den donor-utslipp i henhold til donor eksitasjon og emisjon Akseptant henhold akseptor eksitasjon (AEM).
      Merk: For ICUE1 CFP-YFP sonde, en CFP eksitasjon og utslipp filter par for QE (418-442 ex, 458-482 em) og en YFP eksitasjon og emisjon par for AEM (490-510 ex, 520-550 em) er brukt.
    2. Sett eksponering for QE og AEM å skaffe seg den maksimale signalintensitet uten metning (og hvis du bruker en CCD, med minimal mulig gevinst) for å minimere bakgrunnsstøy. Hold optiske utforminger de samme for begge fluoroforer og gjennom hele forsøket, så vel som blant forsøksgrupper for å unngå forspenne resultatene (dvs. magnetiseringseffekt, iris størrelse, eksponering og kamera gain) (Figure 3A).
    3. Anskaffe ytterligere bilde kanaler for å tillate flere analysemuligheter etter kjøpet (f.eks korrigert sensibilisert utslipp (CSE) imaging (se Diskusjon)). For ICUE1 CFP-YFP sonde, erverve eksitasjon (Ex) og utslipp (Em) kanaler av Ex donor - Em donor (QE, velger CFP-CFP i mikroskop programvare), Ex donor - Em akseptor (SE velger CFP- YFP), Ex akseptor - Em akseptor (AEM, velg YFP-YFP) og Ex akseptor - Em donor (YFP-CFP) konfigurasjoner (Se figur 3A).
  4. Konfigurer fangingsgrad for time-lapse bilde oppkjøp.
    1. Reduser fangingsgrad hvis begrenset av maskinvaren. For kortsiktige analyser (for eksempel 30 - 60 min), betegne rundt 12 oppkjøp per minutt for hver FOV (5 sek samplingsfrekvens) for å fange opp signalkinetikk. Bruke minst samplingshastighet som er nødvendig for å unngå signifikantficantly fotobleking proben.
    2. Still oppkjøpet hastigheten ved å skrive periodisitet av fanger i mikroskop programvare. For langsiktige analyser (f.eks., 24 timer), begynner med den høye oppkjøpet sats for å fange den første puls respons og deretter bytte til en lav innkjøpspris hastighet, f.eks hver 5 til 10 min.
  5. Velg "Kjør nå" i mikroskop programvare for å starte bilde oppkjøp og ta bilder i 5 minutter for å etablere en basis for sonde svar på de utpekte FOVs.
  6. Etter 5 min av bildeopptak, pipette i den ønskede agonist eller antagonist analytt (f.eks Forskolin ved 100 nM), blandes ved pipettering, og fortsette avbildning.

8. FRET Kalibrering

  1. System Kalibrering: Bruk ekstra kalibrering hydrogel, fremstilt som beskrevet i trinn 6, for å skaffe AEM bilder på minst 6 representative celler ved hjelp av de samme FOV kriteriene, optiske konfigurasjoner, og kamerasetttings brukes for FRET bildebehandling ovenfor (trinn 7.1, 7.2 og 7.3).
    Merk: Kvantifisering av kvanteutbytte og spektral følsomhet (QS) for den kombinerte sonden og mikroskop imaging system er nødvendig for "absolutt" FRET analyse, men ikke for "slektning" gnage.
    1. Photobleach akseptor fluoroforen ved å velge en 5 min lang eksponering for eksitasjon lys på full intensitet (eksitasjon på AEM kanal). Bruk en smal åpning for å bleke bare cellene av interesse. Kontroller at AEM signal er minst 10% lavere enn den opprinnelige signalet ved å sammenlikne signalintensiteten histogram ( "LUT" -vinduet) før og etter fotobleking. Fortsett fotobleking hvis signaltapet er mindre enn 90%.
      Merk: Sørg for at donor fluoroforen er ikke bleket under denne prosedyren ved hjelp av AEM eksitasjon filtre som ikke overlapper med donor eksitasjon spektrum.
    2. Acquire donor utslipp i henhold donor eksitasjon med den nå bleket akseptor fluorophore (Dem) ossing den samme optiske konfigurasjon som for QE i trinn 7,3.
    3. Beregn QS per piksel som Dem delt på AEM etter bakgrunn korreksjon, som i punkt 9 nedenfor. QS = Dem / AEM
    4. Beregne gjennomsnittlig QS blant cellene fra de cellulære gjennomsnitt.
  2. Estimer iboende FRET effektiviteten av sonden (EI) ved bruk av kalibreringsprøven. Fremkall maksimal FRET av sonden og beregne Ei = 1 - QE / (AEM x QS) som i § 9 nedenfor. Alternativt bruke Ei = CSE / AEM, eller Ei beregnet ved hjelp av en konvensjonell endepunkt analyse for FRET effektivitet med Ei = 1 - (QE / Dem).
    Merk: Ei er nødvendig for å kvantifisere den absolutte andel av aktiverte prober (FAP, dvs. fraksjon av prober bindende analytt), men ikke nødvendig for "slektning" FRET analyse.
    1. Mette sonde respons ved å stimulere kultur med en agonist av analytt produksjon / aktivisering for sonder som øker i FRET på samspill med analytten.
    2. Hemme sonde interaction med analytt ved anvendelse av en antagonist av signalering for prober som forringes FRET ved binding av analytten. Merk: Når det gjelder den ICUE1 sonden, undertrykke cAMP-nivåer med en adenylcyklase inhibitorer så som 2 ', 5'-dideoksyadenosin (spesifikk) eller 3-isobutyl-methyl-xanthin (ikke-spesifikk).

9. FRET Ratio Beregning

  1. Tegn og utpeke en region av interesse (ROI) per FOV nær cellene til å definere bakgrunnsnivået (figur 3B) i hver FOV over tid, men begrense avkastningen til området med relativt homogen belysning over midten av bildet (Figur 4A ). Se diskusjonen om en forklaring på bakgrunn korrigering.
    1. Med mikroskop programvaren: Velg pilen på "Bakgrunn ROI Icon" og velg "Tegn Elliptical Bakgrunn ROI" (andre former vil fungere). Pass på at "Keep Oppdatere Bakgrunn Offset" er valgt. Aktiver viefløyen av bakgrunnen ROI ved å klikke på bakgrunn ROI-ikonet. Alternativt bruke "ROI Icon" og ROI eiendommer ligger som "Bruk som bakgrunn ROI" og "ROIs er forskjellige i hver multi".
    2. Med ImageJ: Bruk verktøylinjen for å velge den sirkulære tegneverktøy. Deretter legger form til ROI ordnede via menyen "Analyze → Verktøy → ROI Manager". Sett en annen farge for bakgrunnen ROI i ROI Manager hvis ønskelig.
    3. For hver FOV og bilde kanal (f.eks QE og AEM), trekker gjennomsnittsverdien i bakgrunnen ROI per tidspunkt for å opprette et korrigert bilde per kanal, f.eks SQE t, p = QE t, p - BQE t, p hvor t er oppkjøpet tid, er p FOV (dvs. xy posisjon), og BQE og bAem er skalare verdier av signal i bakgrunnen ROI. Bruk bilde aritmetiske funksjoner tilgjengelig i programvaren.
      1. With mikroskop programvare, bruk "ROI Bakgrunn Icon" og velg "Trekk Bakgrunn Bruk av ROI". I popup-vinduet, velg "Hver Image" under "Trekk bakgrunn ROI på" og velg "Alle Frames" under "Bruk på".
        Merk: En bakgrunn ROI må defineres i hvert FOV for at denne funksjonen skal fungere ordentlig (f.eks funksjonen ikke ordentlig trekke bakgrunn for FOV med bakgrunns ROIs hvis noen FOV har udefinerte bakgrunn Rois.).
      2. Med ImageJ, bruk "BG subtraksjon fra ROI" makro skrevet av Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Lagre det korrigerte tidsserier av bilder ved å velge "Lagre som" for følgende analyse trinn.
  2. Definere en ROI rundt cellen ved hjelp av en binær maske for hver celle som skal analyseres i hvert FOV (figur 4B). Bruk AEM kanalen til terskelen bilde per FOV i starten of eksperimentet, identifisere cellegrensene, og definert ROIs. Lagre ROIs.
    1. Med mikroskop programvaren: For hver ramme (dvs. FOV), først bruke menyen "Binary → Definer Threshold" og velg "gjelder for gjeldende ramme". Juster den nedre terskelverdi for å velge cellene. Bruk deretter "Binary → Close" funksjon for å fylle hullene i det binære maske om nødvendig. Neste bruke ROI-ikonet og velg "Copy Binary til avkastning"; det binære lag blir slettet automatisk.
      1. Tilføy ROIs for påfølgende rammer til eksisterende pool av Rois. Slett noen falsk Rois. Neste "høyreklikk" på Rois og sørge for at deres egenskaper er "Bruk som standard ROI" og "ROIs er forskjellige i hver multi".
      2. Med ImageJ: For hver FOV, først bruke menyen "Image → Juster → Threshold". Deretter bruker "Analyze → Analyser Particles" med Vis Outlines og Legg til leder velges. Bruk"Binary → Close" å fylle "hull" i det binære maske om nødvendig. Slett falsk ROIs. Gratis plugins er tilgjengelig for å automatisere denne prosessen.
  3. Beregn QE basert FRET ratio på hver piksel, SQE / saem for relativ analyse (se trinn 10) og E QE = SQE / (QS x saem) for absolutt analyse (se trinn 10) med QS oppnådd i Trinn 8.1. Bruk flytende punktet divisjon av bildene. Se diskusjonen for en forklaring av forholdet avledninger.
    1. Med mikroskop programvare: Bruk menyen "Bilde → Bilde Operations" og velg "Floating Point".
    2. Med ImageJ: Bruk enten "Process → Bilde Calculator" -funksjonen eller "Calculator_Plus.java" plugin. Merk: Alternativt til makro "pH_ratioMacro" .txt "kan tilpasses beregne gnage forholdstall Det syssels bakgrunnen korreksjon makro beskrevet ovenfor, og er tilgjengelig på.
  4. Eksportere gjennomsnittlig ratio per celle (dvs. per ROI) i et regneark og grafer programvare.
    1. Med mikroskop programvare: Bruk enten ND eksport knappen i "ROI statistikk" analyse kontrollen eller "regneark Export" -knappen i "Time Analysis" analyse kontroll.
    2. Med ImageJ: Først velger menyen "Analyze → Sett Målinger" og sørge for at "Mean value" og "Standard avvik" er valgt. Deretter bruker ROI Manager og velg knappen "Mål". Lagre den genererte resultater vinduet.

10. FRET Ratio Analysis

  1. Beregn den gjennomsnittlige mobil FRET grad over tid fra de gjennomsnittlige forholdstall per celle (eksporteres i trinn 9.4). Tenk baseline FRET forhold (forholdet før administrering analytten) i denne beregningen.
    Merk: regneark og grafer programvare brukes her for å plotte baseline-subtrhandlet gjennomsnittlig FRET forholdstall og deres standard feil av gjennomsnittet (SEM) ved bruk av en lineær regresjon på grunnlinjen som i trinn 10.1.2 og 10.1.3 nedenfor (figur 5 og 6).
    1. Relativ Analyse (omfanget av reaksjon): Normaliser hver kurve til en felles referanseprøve (som ubehandlet prøve.).
    2. Absolutt Analysis (tids løpet av respons): Shift kurvene til en felles startpunkt ved å normalisere hver kurve med sin baseline FRET ratio.
      1. I regnearket og grafer programvare, flette data (kolonner av gjennomsnittlig forholdstall per celle) med nye kolonner, slik at hver opprinnelige kolonnen er koblet sammen med en ny kolonne som inneholder bare forholdsdata for baseline periode (forholdstall før analytt tilføyd). Velg "Sett inn kolonne" for å sette inn en tom kolonne etter hver kolonne med data. Deretter kopierer grunnlagsdata i de sammenkoblede tomme kolonner.
      2. I regnearket og grafer programvare, velg "Sett inn → Ny Analyse → transform Fjern baseline "og deretter sette" Kolonne "til" alle andre ", velg" anta grunnlinjen er lineær ", og velg" Difference "under" Beregning ".
      3. Beregn den gjennomsnittlige mobilforhold og beskrivende statistikk. I regnearket og grafer programvaren, velger du "Sett inn → Nytt Analyse → XY Analyser → Row Midler med SD- eller SEM" og velg deretter "Row betyr med SEM" i pop-up vindu.

Representative Results

Alle hydrogel-forløpere, celler og støpeformer ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Cellen laden forløper løsninger ble støpt i PDMS muggsopp og deretter sentrifugert før gele / fototverr å immobilisere celler nær dekkglass og lette FRET bildeanalyse (figur 1). De hydrogeler med vedlagte dekk ble plassert i preparerte PDMS bilde brønner for mikroskopisk bildebehandling (figur 2). De optiske konfigurasjoner og bilde-innhentingsparametre ble så satt, som vist i figur 3A. Fangst av alle fire FRET relatert bilde kanaler for CFP-YFP fluoroforen parene er vist (se under "Optical Conf." I figur 3), som er nødvendig for ikke-binære prober. Men i dette arbeidet bare to bilder er nødvendig for den ene kjeden binære ICUE1 sonde, QE = "CFP CFP" og AEM = "YFP YFP" (eksitasjon utslipp). Flere FOVs (xy stillinge) ble utvalgt hvor flere celler som bodde innenfor det homogen belysning området (figur 3B). Etter tid lapse oppkjøpet ble signaldata for sonden eksporteres. ROIs for bakgrunnskorrigering av kanalsignalene og for celleanalyse ble betegnet ved hjelp av terskel AEM bilder fra starten av forsøkene (figur 4). Celler ble valgt ut blant cellen bassenget som de som uttrykker tilstrekkelig (ikke altfor svak), men ikke altfor høy (overdrevet sterke) probe (Figur 4B). De QE og SE FRET forholdstall per piksel på hvert kjøp ble beregnet ved hjelp av flytende-punkt delingen av bakgrunnen trekkes bilde kanaler. Den gjennomsnittlige FRET-forholdet per celle (dvs, pr ROI) ble beregnet, normalisert til referansesignalet før stimulering (dvs. en regresjon på grunnlinjen subtrahert fra alle tidspunkter), og plottet med feilfelt som standardfeilen for den mener (SEM). Både QE og CSE basert FRET forholdstall deTECT den økte cAMP-aktivitet i henhold til kondrocytter forskolin stimulering (100 nM, figur 5). QE FRET-forholdet var mer følsom for bakgrunnskorrigering enn CSE FRET-forholdet fordi QE-signalet var lavere på grunn av den lave basalnivået av cAMP-aktivitet i kondrocytter innebygd i hydrogeler. Begge typer hydrogel (TR-gel og PC-gel) viste en økning i FRET-forhold over tid (figur 6), noe som indikerer en økt cAMP signale respons på tilsetningen av Forskolin. Som det fremgår av QE FRET forholdet, chondrocytes i PC-gel hydrogeler viser en større endring i cAMP (vist) og en høyere basal nivå av cAMP (E QE = 0,19 i PC-gel vs. E QE = 0,09 i TR-gel, ikke vist i baseline trukket figur).

Figur 1
Figur 1: Cell Distribution i Photocrosslinked hydrogel (PC-gel) A: Celleholdig hydrogel-forløperen ble sentrifugert for å maksimere antallet celler ved et fokalplan nær dekkglass. B: Dette øker antallet av celler i FOV og reduserer bakgrunnssignalet fra ut av plane celler. (Scale bar = 200 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Hydrogel i PDMS Dish
Den hydrogel ble plassert inne i en høy PDMS godt (10x volum av hydrogel) med en dekk base for mikroskopisk bildebehandling og analytten stimulering. PC-gel hydrogeler er transparente og bundet til dekkglass, slik at de forblir på plass gjennom hele analysen. De PDMS vel kan gjøres større for å inneholde 10x mer medium enn hydrogelen volum ved hjelp av en bredere biopsi slag i tillegg til atHicker PDMS ark. (Scale bar = 2 mm) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Anskaffelses konfigurasjon for FRET Imaging
A: Oppkjøpet ble konfigurert for bildeopptak hver 7 sek på flere steder. For QE FRET forholdet beregningen, er bare to bilde kanaler nødvendig for ICUE1 probe brukes her (binær enkelt kjede probe), QE = "CFP CFP" og AEM = "YFP YFP" (eksitasjon utslipp) under "Optisk Conf." kolonne i fliken λ av mikroskopet programvare. B: FOVs ( "XY" stillinger) ble valgt som flere celler bodde i homogen belysning området. Tomten under bildet viser lysintensiteten langs den blå Pillinjensom går gjennom gjennom midten av FOV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Valg av ROIs for FRET Imaging Analysis
A: en region av interesse (ROI) fri av celler ble valgt for å korrigere for bakgrunnssignal på hver kanal. Et bilde av et cellefritt hydrogel kan i stedet anvendes for bakgrunns subtraksjon hvis celletetthet eller migrasjon er høy, eller hvis en skyggemaske ikke brukes når cellene ikke ligger innenfor en homogen belysning felt. B: Celle ROIs ble valgt ved hjelp av image terskling og binære maskering av AEM kanal. Velge en avkastning større enn cellene vil påvirke beregningen av gjennomsnittlig FRET ratio per celle på grunn av inkludering av ekstracellulære forholdstall generert fra bakgrunnen nOise. Beregning av den cellulære FRET forhold med gjennomsnittet av hver kanal per celle anbefales ikke da dette undervurderer forholdet. (Scale bar = 50 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Sammenligning av FRET prosenter i Thermoresponsive hydrogel (TR-gel)
Både QE og SE basert FRET forholdstall påvise økt cAMP aktivitet i chondrocytes henhold forskolin stimulering. Forskolin er en adenylcyklase agonist som induserer cAMP produksjon. FRET avtar når ICUE1 proben binder cAMP, og dermed QE FRET forholdet (E QE = SQE / (saem x QS)) øker. Motsatt, reduserer SE FRET grad og er dermed plottet som E SE = 1 - CSE / saem. I hydrogel innebygd chondrocytes, QE FRET forholdet er mer sensitive for bakgrunnskorreksjon enn SE FRET forholdet fordi QE signalet er lav på grunn av den lave basal cAMP aktivitet. Feilfelt = SEM, n = 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Sammenligning av FRET Ratio i forskjellige Hydrogeler
Kondrocyttene i begge hydrogel typer svarte på forskolin stimulering med en økning i cAMP-aktivitet som demonstrert ved økt QE FRET-forhold over tid. Den hydrogel typen påvirker cellulære respons gjennom flere effekter, inkludert forskjeller i permeabiliteten til forskolin og i basale cellulære cAMP-aktivitet (E QE = 0,19 i PC-gelen sammenlignet med E QE = 0,09 i TR-gel, som ikke er vist). Feilfelt = SEM, n for TR-gel= 25, n for PC-gel = 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette arbeidet viser hvordan FRET bildebehandling kan brukes til å analysere cellesignalisering i 3D hydrogeler. Mens tidligere studier har vist FRET avbildning av celler sådd på hydrogel substrater 35-37, av ekstracellulære interaksjoner med hydrogeler 38, og av molekyler fanget i hydrogeler 39-41, er dette den første publikasjonen til å beskrive FRET avbildning basert intracellulære analyse av celler innebygd i 3D-hydrogeler. Arbeidet løser flere implementering problemer når sette FRET avbildning fra 2D til 3D. Først blir høy numerisk apertur mål som er nødvendig for FRET avbildning for å samle tilstrekkelig utslipp signal, men de begrenser dybdeskarpheten. Cellene her får lov til lett avgjøre via sentrifugering for å øke antall celler i et fokalplan i nærheten av glass for å kompensere for dette. For det andre kan 3D-hydrogel stillaser svev over synsfeltet under bildebehandling som kompliserer analysen. Hydrogelene her, er bundet til coverslip slik at de ligger fast gjennom hele eksperimentet. For det tredje, valg av passende hydrogel sammensetninger for 3D-FRET er viktig fordi hydrogeler kan hindre visualiseringen av cellene. Her gjennomsiktige hydrogeler av PC-gel og TR-gel brukes. Men samle cellene med sentrifugering til et fokusplanet nær dekkglass kan brukes til bildet celler i hydrogeler med høyere diffraction.The valg av hydrogel avhenger av mikromiljøet vilkår som må være simulert, som kan finnes i en gjennomgang på hydrogeler 42 . For det fjerde er en alternativ beregnings anvendes her for FRET forholdet mellom enkeltkjede ICUE1 probe (dvs. E = QE QE / cAem) for å minimalisere antallet bilde kanaler som er nødvendige for analyse og derved minimalisere fotobleking. Den gjennomsnittlige FRET-forholdet per celle blir beregnet som gjennomsnittet av forholdene per piksel i en celle for å minimalisere en underestimering av selve FRET-forhold. Til slutt, en lineær ratiometrisk analyse og midlerå beregne den aktiverte fraksjon av enkeltkjede binære prober er beskrevet.

Det er flere viktige aspekter ved å gjennomføre vellykkede FRET eksperimenter ved hjelp av Widefield mikroskopi. Med hensyn til maskinvare, må kameraet være følsom nok til å løse små signalendringer, forlater nyere vitenskapelige CMOS-kameraer og elektron multiplisere CCD bedre egnet enn konvensjonelle CCD. For best å analysere den romlige fordeling av FRET-forholdet, må kameraet minimum eie to ganger den romlige oppløsning av punktspredefunksjonen til objektivet (Nyquist-kriteriet). Dette gjør dual-view-systemer mindre egnet til oppgaven. Mer avgjørende er å velge en passende eksponering og bildeopptak rate for gitt FRET pair for å minimere fotobleking av fluorophores. En redusert oppkjøpsprisen er anbefalt som eksperiment varighet øker. Bruken av raske filterhjul øker oppkjøpet hastighet og antall FOVs for analyse mens unngåing bilderegistrerings problemer med dual-view og turret filter kuber. Den inhomogene belysning feltet kompliserer korreksjon for bakgrunns fluorescens som oppstår fra prøve autofluorescence og kamera system støy. Noen hydrogeler, spesielt de som inneholder kollagenholdige proteiner er høyt autofluorescent 43,44. Gnage forhold blir undervurdert uten bakgrunnskorreksjon. Her benytter vi en enkel bakgrunn korreksjonsmetode som er avhengig av den relativt flat belysning felt som ofte kan konfigureres med epi-fluorescens belysning over midten av bildet (figur 3B, trinn 7.2). Denne metoden begrenser derfor celler av interesse for dem i denne belysning feltet. Bakgrunnen korreksjonen beskrevet her ikke står for mobilnettet autofluorescence i bølgelengdene lese for den binære sonde. I et slikt tilfelle, bør umerkede celler (ingen sonde transfeksjon) avbildes på samme vilkår og bakgrunn trekkes. En mix av merkede og umerkede celler kan benyttes og de umerkede celler valgt for bakgrunnen ROI. Alternative metoder som sørger for celle analyse over hele bildefeltet inkluderer bruk av en skyggemaske, flere bakgrunns Rois, eller identiske prøver uten celler og en protokoll er tilgjengelig på forespørsel.

Spesifikt til 3D FRET avbildning, er sonden reaksjon svært følsom for hydrogelen permeabiliteten til analytten (figur 6). Derfor er de samme hydrogel-regionene blir sammenlignet på tvers av eksperimentell behandling, fortrinnsvis ved et punkt av geometri symmetri eksempel i nærheten av stillaset sentrum som anvendt her. Alternativt microfluidic kamre / bioreaktorer kan anvendes for hurtig og jevnt perfuse hydrogelen med analytt-oppløsning 45. En FRET signal kan ikke bli oppdaget (signal til støyforhold er for lavt) når hydrogel er autofluorescence er for høy; en tynnere hydrogel eller en annen probe (forskjellige fluoroforer) skal brukes.Med hensyn til 3D FRET bildebehandling i photocrosslinked hydrogeler, anbefales det å bruke minimum bestråling eksponering og bølgelengder utenfor eksitasjonsspektre av sonden fluorophores. LAP kan anvendes sammen med en synlig lyskilde ved 405 nm for ytterligere å minimalisere potensiell cellulær skade 31,46. Men bruker LAP med 365 nm bestråling anbefales fordi dette reduserer probe bleking. 365 nm ligger på tampen av CFP donor eksitasjon spektrum, mens 405 nm ligger på toppen eksitasjon. Alternativt kan proben uttrykket få lov til å komme seg etter en dag. Bruk av binære sonder minimerer spørsmål om følsomhet for forskjeller i uttrykk nivåer og i molekylær diffusjon av donor og akseptor fluorophores. Ikke-binære prober kan bli anvendt, men med SE istedenfor QE avbildning og ytterligere korreksjon for spektral avblødning ved eksitasjon og emisjonsspektra (se nedenfor). Videre lav kommersiell tilgjengelighet og kompleksiteten i å utforme FRET sonderkan være en hindring. Den mest kritiske faktoren for vellykkede forsøkene forblir riktig korrigering og analyse av fluorescens-signaler.

En alternativ beregning av FRET-forholdet benyttes til flere andre grunner i tillegg til minimalisering av fotobleking. For binære enkeltkjede sonder, er den hyppigst rapporterte forholdet akseptor utslipp i henhold donor eksitasjon (sensibilisert utslipp, SE) til donor utslipp i henhold donor eksitasjon (slukket utslipp, QE), det vil si, gnage ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE er ikke-lineær i forhold til endringer i effektivitet FRET 21,22,47. Nemlig, har forholdet mellom en eksponentielt ikke-lineært forhold til iboende FRET effektivitet av sonden (Ei) (Donius, AE, Táboas, JM upubliserte arbeider. (2015)), idet forholdet mellom de lineære for Ei mindre enn omtrent 15%. SE / QE vil også undervurdere brøkdel av aktiverte prober (FAP, dvs. brøkdel av sonder bindende analytt). therefore, analyse av SE / QE krever en tungvint likevekt dose responsstudie og kurve. Heldigvis prosenter av SE eller QE til akseptor utslipp i henhold akseptor eksitasjon (AEM) er lineær med hensyn til Ei og FAP, dvs. gnage forholdstall SE / AEM og QE / AEM. SE / AEM er ofte brukt for binære prober og bare krever end-punkts kalibrering (uten probe aktivitet og full sonde aktivitet), men basal cellesignalering gjør dette vanskelig. For å eliminere behovet for endepunktet kalibrering, kan SE korrigeres (CSE) for spektral overlapping av donor og akseptor eksitasjons- og emisjonsspektrene (spectral avblødning gjennom) og for kvanteutbytte og spektralfølsomhet (QS) av de kombinerte sonde fluoroforene og mikroskop imaging system. Den korrigerte SE FRET ratio basert på CSE definerer observert FRET effektiviteten av sondene innen hver piksel i et bilde, dvs. E SE = CSE / AEM. Kommersiell og fri programvare er tilgjengelig for å korrigere SE for disse effektene oghenvises det til arbeidet med Chen og Periasamy 2006 for en detaljert forklaring av metodene 50. Men beregning E SE krever fangst av tre bilde kanaler per time-punkt (SE, QE, AEM). Derfor, i dette arbeidet også ansetter vi en alternativ FRET ratio E QE = 1 - QE / cAem, som krever fangst av bare to bilde kanaler (QE og AEM). Beregning E QE fra disse kanalene krever bare korrigere AEM for QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM er lett beregnes ved hjelp av to bilder fra en kalibreringsprøve, hvor Dem er donor utslipp i henhold donor eksitasjon med akseptor bleket. FAP på ethvert øyeblikk kan beregnes ved å sammenligne E SE E eller QE til den Ei av sonden.

Til syvende og sist bør FRET ratio utvalg (E SE = CSE / AEM vs. E QE = QE / cAem) være basert på en vurdering av sonden type og kanalene med beste signalet. både enpproaches omfatter bakgrunnsstøy korrigering av bilder per bilde som beskrevet ovenfor for å konto for endringer i autofluorescens over tid. De forutsetter ingen overlapping av AEM eksitasjonslys inn i Dem magnetisering spekteret, noe som ofte er tilfellet på grunn av probe utforming og mikroskop filterkonfigurasjonen. Single-kjeden prober kan enten bruke og valg er basert på beste sonde signal (lysstyrke) til kamera støy og bakgrunnssignal på SE og QE-kanaler. For ICUE1 sonde og eksperimentelle forhold som brukes her (celle- og hydrogel typer), har SE et sterkere signal enn QE. Dual-kjeden prober krever bruk av E SE grunn av ikke-ekvimolar distribusjon av donor og akseptor fluoroforer. For sonder som forringes FRET ved binding analytten som ICUE1, gnage effektivitet kan "omvendt" for å presentere en positiv signalendring ved binding analytten som vi gjør her, med E SE = 1 - CSE / AEM eller E QE = QE / (AEM x QS).

Analyse av the FAP er følsom for riktig korreksjon av FRET forholdstall og til estimatet av Ei. Det kan estimeres med de samme kalibreringsprøven som brukes for QS og en konvensjonell endepunkt FRET effektivitet Analyse Ei = 1- (QE / Dem) (QE bilde fulgt av akseptor fotobleking og en Dem bilde) 28, men forsiktighet må utvises for å minimalisere utilsiktet bleking av donor. Vi beskriver en modifisert versjon hvor estimat av Dem basert på AEM justert for QS erstattes, dvs. Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / AEM brukes. Beregning av Ei i levende celler krever at alle sonder bli kjørt til full gnage. Dette er vanskelig å oppnå i praksis for sonder, slik som ICUE1 som forringes FRET ved binding av analytten. En in vitro basert beregning av Ei hjelp av cellelysater og renset analytt er best, men utenfor rammen av dette arbeidet. Her anbefaler vi å bruke 2 ', 5'-dedeoksyadenosin å redusere cAMP i cellene. Imidlertid kan en relativ FAP be beregnet ved hjelp av et anslag Ei avledet fra basalnivået av signalering. Av disse grunner studier rapporterer oftest FRET-forholdet (som gjøres her) eller en relativ FAP basert på endepunkt kalibrering, hvor signaleringslinjen før tilsetning av agonist er den nedre grensen, og signalet etter at et andre agonist som metter signale den øvre bundet. Forskolin er ofte brukt som en kontroll agonist for å mette cAMP signal. Alternativt kan en cAMP analog benyttes slik som 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cyklisk monofosfat. Positive kontroller som benyttes ved gjennomføring av undersøkelser for å identifisere potensielle endringer i signalveien mellom eksperimentelle behandlinger er anbefalt.

Beregning av den gjennomsnittlige signalresponsen per celle krever vurdering av flere faktorer. Først bør den gjennomsnittlige FRET-forholdet beregnes som gjennomsnittet av forholdene ved hvert bildeelement innenfor en celle, dvs. (Σ (QE/cAem)) / (antall piksler), i stedet for ratio av den gjennomsnittlige QE og aem i en celle, dvs. (ΣQE) / (ΣcAem). Selv om sistnevnte ikke krever forsiktig maskering som bakgrunnsstøy er lav, det er alvorlig undervurderer den sanne gjennomsnittlige FRET ratio. Imidlertid bildeelementforhold krever flytberegning og forsiktig binært maskering av celleområdet for å definere ROIs og unngå inklusjon av uønskede forholdene er generert fra bakgrunnsstøy utenfor cellen. Hele celleområdet må tallfestes for å unngå spenn resultater på cellen form. Maskeringen må kanskje omdefineres over tid, avhengig av endringer i cellen form og migrasjon. Alternativt kan Rois større enn cellen brukes hvis eksklusjonskriteriene er definert til å fjerne pikselforhold fra QE og AEM signaler som faller godt under cellulære nivåer og er nær bakgrunnsnivå. Den beskrevne analysemetoder detalj de grunnleggende trinnene som brukes i dette arbeidet for FRET analyse uten spesialisert programvare / plugins. Mikroskop produsenter og andre leverandører selger tilleggsmodulens for deres mikroskop programvare som støtter automatisert proporsjonal og FRET analyse. Likeledes har det offentlige ImageJ programvare flere plugins tilgjengelig for partikkel og FRET analyse, for eksempel RiFRET. For det andre undervurderer pikselbasert gjennomsnittet FRET ratio den sanne gjennomsnittlige forholdet mellom 3D cellestruktur fordi et 2D-bilde blir brukt. 2D signalene representerer gjennomsnitt og langs z-aksen. Beregning av 3D romlig fordeling av FRET-forhold i levende celler er ikke mulig uten høy hastighet 3D avbildning (f.eks., Ved hjelp av spinne disk konfokal mikroskopi). Dette er et problem for både 2D og 3D-kulturer, men har en større effekt i 3D som mer av den cellulære strukturen eksisterer ut av flyet. Dette er av stor bekymring for sonder som lokaliserer til cellulære strukturer, slik som plasmamembranen EPAC1 probe PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 om forslag til rette for celle tykkelse effekter på forholdet beregninger 24. Analyse av fordelingen av AEM kan brukes til åoppdage om sonden samler seg i områder av cellen og avbildningsplanet justeres. Dette vil også bidra til å tolke den romlige fordelingen av FRET forhold og for å eliminere falske resultater, f.eks., Identifisere probe metning (dvs. at en lav AEM regionen har lav sonden konsentrasjon og kan fremvise sonde metning og høy FRET ratio). Tredje, ulike FRET baseline nivå kan indikere en forskjell i transfeksjon effektivitet, sondere uttrykk, eller basal signale mellom eksperimentelle grupper. "Relativ Analysis" (trinn 10.1.1) bidrar til å fjerne drift i FRET forholdet over tid hvis det finnes. Den muliggjør sammenligning av den relative størrelse av reaksjoner mellom prøver, men hindrer sammenlignet med tidsforløpet av respons for referanseprøven (kontroll plottet er en flat linje). "Absolutt Analysis" (trinn 10.1.2) muliggjør sammenligning av graden av reaksjon på tvers av prøvene, men hemmer sammenligning av størrelsen av responsen fordi hver linje blir skalert med en dissimvis lik konstant. Studier ofte bruke en lineær regresjon på grunnlinjen for å korrigere for drift i FRET forholdet over tid.

Den beskrevne 3D FRET metoden er en nyttig og praktisk måte å dikte og utføre time-lapse avbildning av celle laden 3D hydrogeler, som kan brukes til andre sonder og bildediagnostikk. Andre FRET system i tillegg til enkeltkjede binære prober vil kreve mer komplisert korrigering av intensitetsbaserte signaler, som diskutert ovenfor. Alternativt kan fluorescens levetid avbildning av FRET (FLIM-FRET) brukes for å beregne FRET effektivitet via en endring i utslipps levetiden av sonden donor. I motsetning intensitet basert slite, er FLIM-FRET ufølsom for bakgrunnsstøy, spectral blø-through, quantum effektivitet, og detektor spektral følsomhet to. Men FLIM systemer er dyrt, komplisert, og uvanlig, og fungerer best med fluorophores med én eksponent forfall og ingen FLIM avrenning 49. Den beskrevne fremgangsmåte kan også anvendes sammen med more avanserte mikroskop plattformer (f.eks., gnage-TIRF, fluorescens anisotropi, og spektral korrelasjon FRET). Bruk av denne metoden til 3D avbildning med høy hastighet konfokal mikroskopi og multiphoton vil lette analyse av sub-cellulære fordeling av signale respons og øke nøyaktigheten av signaleringsanalyse. Denne 3D FRET metoden vil gjøre avanserte cellebiologi studier i simulert 3D cellulære microenvironments. Som sådan, kan det lett anvendes på farmakologi og regenerativ medisin behov, inkludert å studere intercellular signalisering og screening av legemiddelrespons i konstruerte hydrogeldannende basert microtissues.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra School of Dental Medicine ved University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, og tilskuddet P30 DE030740. Forfatterne takker også Dr. Jin Zhang for ICUE1 plasmid, Wayne Rasband for å utvikle ImageJ og Michael Cammer for ImageJ makro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64, (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120, (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5, (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13, (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7, (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8, (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61, (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24, (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52, (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147, (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16, (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46, (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60, (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13, (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192, (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5, (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1, (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4, (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35, (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85, (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10, (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22, (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15, (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30, (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14, (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5, (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6, (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16, (1), 95-104 (2006).
FRET Imaging i Tredimensjonal Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter