Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler

doi: 10.3791/54135 Published: August 1, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning är ett kraftfullt verktyg för realtidscellbiologiska studier. Här en metod för FRET avbildning celler i fysiologiska tredimensionella (3D) hydrogel mikromiljöer med användning av konventionell epifluorescensmikroskopi presenteras. En analys för ratiometrisk FRET-prober som ger linjära förhållanden över aktiveringsintervall beskrivs.

Abstract

Avbildning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) är ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbiologi i realtid. Studier där man använt FRET använder vanligen två-dimensionell (2D) kultur, som inte efterliknar den tredimensionella (3D) cellulär mikromiljö. En metod för att utföra släcktes emission FRET avbildning med konventionell widefield epifluorescensmikroskopi av celler inom ett 3D-hydrogel miljö presenteras. Här en analysmetod för ratiometrisk FRET-prober som ger linjära förhållanden över sonden aktiveringsintervall beskrivs. Mätning av intracellulär cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) -nivåer demonstreras i kondrocyter enligt forskolin stimulering med hjälp av en sond för EPAC1 aktivering (ICUE1) och förmågan att upptäcka skillnader i cAMP signal beroende hydrogel typ, häri en fototvär hydrogel (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) och en termoresponsiv hydrogel (TR-gel). Jämfört med 2D FRET metoder,denna metod kräver lite extra arbete. Laboratorier redan utnyttjar FRET avbildning i 2D kan enkelt anta denna metod för att utföra cellstudier i en 3D mikromiljö. Det kan vidare tillämpas på hög genomströmning drogscreening i manipulerade 3D microtissues. Dessutom är den kompatibel med andra former av FRET avbildning, såsom anisotropi mätning och fluorescens livstid avbildning (FLIM), och med avancerad mikroskopi plattformar med hjälp av konfokal, pulsad eller modulerad belysning.

Introduction

Cellulär signalering är både komplex och följd för många områden, inklusive farmakologi, tissue engineering och regenerativ medicin. Användbara prövnings verktyg behövs för att öka vår förståelse av cellbiologi och utveckla optimala material för vävnadsregenerering. Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning är ett viktigt verktyg som gör det möjligt analys av receptoraktivering, molekylär konformation, och supramolekylära interaktioner (eg., Protein / DNA komplex) i levande celler. FRET är en typ av icke-radiativ energiöverföring mellan fluoroforema 1. Den har en effektivitet som är omvänt proportionell mot den sjätte potensen av avståndet mellan en donatorfluorofor och acceptorfluorofor. Det kan därför ge information om den rumsliga avståndet mellan två olika molekyler eller mellan olika regioner av en molekyl på nanometerskala (typiskt 1-10 nm) 2. Donator- och acceptor-fluoroforer kan vara olika molecule typer (hetero-FRET), där givaren har emissions högre energi (kortare våglängd), eller av samma typ (homo-FRET). FRET avbildning kan utföras på fasta eller levande celler, men i allmänhet fixerade celler används för avbildning av molekylära interaktioner med hög rumslig upplösning när höghastighets konfokala system är inte tillgängliga. Levande celler används för att studera interaktioner och processer som hämmas eller förändras genom fixering, såsom realtids intracellulära signal svar 3.

Live cellstudier som använder FRET avbildning användning tvådimensionella (2D) cellodlingar delvis på grund av enkelhet och lägre bakgrund (ingen utstrålning från ut ur planet celler). Emellertid 2D-kulturer förändrar också många cellulära processer jämfört med den fysiologiska mikromiljö och tredimensionella (3D) kultur 4,5. Till exempel är nativ cell till cell och cell till extracellulära matrix-interaktioner drastiskt förändrad hos 2D kultur som leder till de easily observerade förändringar i cellmorfologi och polaritet 6. Membranmikroområden (eg., Caveolae och lipidaggregat) och receptorsignalering är starkt reglerad av odlingsmiljö, delvis eftersom de binder cytoskelettala komponenter 7,8 och cellformen och cytoskelettala struktur är starkt reglerad av den rumsliga odlingsmiljö 9. Mechanotransduction är inte bara påverkas av 3D-matrisen, men av de mer komplexa sekundära belastningsförhållanden framkallade i 3D-miljöer jämfört med 2D kulturer 10. Slutligen är permeabiliteten av 3D-matriser mindre än odlingsmediet, i allmänhet med minskad diffusion och ökad bindning av cellsignaleringsmolekyler jämfört med 2D-kulturer. Med 3D-kulturer man kan skapa och följa en mikro mer liknar den fysiologiska förhållande till lim, kemiska och mekaniska signaler. Cell till cell interaktioner kan främjas och vidhäftningsegenskaper kan styras wed struktur, sammansättning och arkitektur (mönstring) av 3D-material 11-13. De mekaniska egenskaperna hos materialet kan likaledes skräddarsys av sammansättning och struktur 14,15. Odling av celler i hydrogeler därför tillstånd FRET studier på primära celler som annars skulle avregistrera-Differentiera eller ändra i fenotyp med hjälp av konventionella tekniker, t ex., Celler från ledbrosk. Således behövs en metod för att möjliggöra FRET analyser i levande 3D-kulturer.

Hydrogel ställningar är idealiska för 3D FRET baserade studier eftersom de kan göras optiskt transparent och skräddarsys för att styra mikro och ge cellulära signaler. Hydrogeler tillverkade av naturliga polymerer har använts i cellkultur i årtionden, inklusive gelatin och fibrin 16. Större kontroll över den cellulära mikromiljön kan uppnås med kemisk modifiering av dessa polymerer och med användningen av syntetiska polymerer 17,18. hydrogel mekanisk styvhet och permeabilitet kan styras genom att ändra deras polymerkomposition och mesh storlek (polymer och tvärbindningsdensitet) 19,20. Vidare kan hydrogeler göras bioaktivt genom inkorporering av tillväxtfaktorer och cellulära ligander. På grund av dessa möjligheter är att utveckla hydrogeler för biosensing, drug delivery, och vävnadstekniska tillämpningar ett mycket aktivt forskningsområde 21. 3D-utskrifter av hydrogeler är också under utveckling för tillverkning av mikro vävnader och -organs 15. Således är FRET avbildning av celler i hydrogeler inte bara användbart som ett medel för att approximera fysiologiska cellbeteende, utan också som ett verktyg för att studera och optimera engineered vävnadstillväxt.

Binära ratiometrisk FRET sonder är mycket användbar för att studera cellulära signalering och kan utnyttjas i hydrogel kulturer. För en ofullständig lista över publicerade fluorescerande och FRET sonder, se Cell Migration Consortium webbplats (t ex., Bindning av en jon eller molekyl, enzymatisk klyvning av den region) som förändrar avståndet mellan fluoroforer och därför FRET magnitud (antingen högre eller lägre) 23. En mindre vanlig men användbara sond typ bygger på en analyt känslig förändring i den spektrala överlappningen av de två fluoroforerna, som förändrar FRET magnitud. "Single-chain" ratiometriska sonder använder en fluorofor par kopplat på en enda molekyl. "Dual-kedja" sonder utnyttja fluorofor par på separata molekyler, men deras uttryck kan kopplas under samma expressionskassett 24. Till skillnad från studier med enda fluoroforen uttryck (eg., Fluorescerande fusionsproteiner), studier med ratiometriskFRET prober kräver inte dubbel transfektion att kontrollera för transfektion effektivitet eller cellviabilitet. Propportionell FRET-prober är relativt okänsliga för transfektion effektivitet när den uttrycks över en minimigräns (koncentration okänslig) 23,25. De är okänsliga för exciteringskällförändringar och andra intracellulära miljöfaktorer (t.ex.., PH, joner) så länge som båda fluoroforer är lika lyhörda. Dessutom är deras svar inte är föremål för transkriptions fördröjning, till skillnad från lysrör och självlysande promotor-reporter konstruktioner 26,27.

Propportionell FRET prober lätt och ofta används i konventionella mikroskopsystem widefield epifluorescence. Widefield mikroskop är att föredra framför linje scanning konfokala system för levande cell imaging på grund av oro över systemets kostnad, fluoroforen blekning, och fångst av signalförändringar med tillräcklig tidsupplösning. Dessutom enda cell anallys över en stor population av celler som är möjligt med en motoriserad skede och bildtagning över flera synfält. Widefield mikroskopi kräver intensitet baserad analys av hetero-FRET sonderingssignaler. Även intensitetsanalys inte kräver komplexa hårdvara som andra FRET metoder behövs mer efter förvärvet arbete för att korrigera för effekterna av fluoroforen beteenden och mikroskop / imaging systemkonfigurationer 28. Den tagna emissionsintensiteten hos en fluorofor är en funktion av den exciteringsenergi, fluorofor kvantutbyte, och det kombinerade filtret och kameran / detektor spektral känslighet och linjäritet 2. Dessa kan vara olika för givaren och mottagaren och kommer att kräva kalibrering för kvantitativ analys. Dessutom är avbildning av emissions acceptorn påverkas av den spektrala överlappningen av de fluoroforer (excitation av acceptorn genom donator excitationsljus och genomblödning av emission donator in i spektra acceptor emission) 2.4, Single-chain "sonder är internt normaliserade eftersom deras fluoroforer är ekvimolär i nanoskala, medan de fluoroforer av" dual-kedja "prober kan existera vid olika stoichiometries under en cell 25,28 Om fluoroforer av." Single-chain " prober med liknande ljusstyrka (funktion av extinktionskoefficienten och kvantutbytet), effekterna av icke-linjära detektorkänslighet är små och endast korrigering för bakgrundsfluorescens och den kopplade kvantutbyte / detektorkänsligheten behövs 23. Således "single-chain" proportionerlig FRET prober lättast genomförs i widefield mikroskopi 24.

Detta dokument beskriver en enkel teknik för att utföra FRET avbildning av levande celler i 3D hydrogel kulturer med hjälp av en konventionell widefield epifluorescent mikroskop. Det kan lätt antas av laboratorier redan utför FRET experiment i 2D, samt laboratorier som är intresserade av intercellulär signalering i microtissues. Här visar vi metoden med FRET avbildning baserad mätning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) -nivåer i levande kondrocyter inom fototvär (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) och termoresponsiv (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En kvotmetrisk FRET-sond utnyttjas baserat på EPAC1 (ICUE1) för att upptäcka cAMP-nivåer som svar på forskolin, ett kemiskt agonist för adenylylcyklas, som katalyserar omvandlingen av ATP till cAMP. cAMP är en av de viktigaste andra budbärare som medierar G-proteinkopplade receptorer signalering och det aktiverar olika faktorer, bland annat nedströms utbytes proteiner direkt aktiveras av cAMP (EPACs). Fluoroforerna flytta isär vid cAMP-bindning till EPAC domänen resulterar i en minskning i FRET. Beskrivs här är framställningen av hydrogelmaterial, cell transfektion med ICUE1 sonden, och inbäddning av cellerna i 3D hydrogeler. 3D FRET experiment förfarande och analys bilden nödvändigatt utvärdera sond aktivitet per cell förklaras. Vi diskuterar också de inneboende begränsningar FRET analys i 2D och 3D med hjälp av widefield mikroskopi. Tekniken som presenteras här är en förbättring jämfört med de existerande 2D metoderna eftersom det möjliggör analys på ett mera fysiologiskt sammanhang och kräver mindre bildkorrigering och kalibrering. Stor nytta ligger i det faktum att många transparenta material kan användas medan cell- och transfektion preferenser kan upprätthållas.

Protocol

1. Material Beredning

  1. Förbereda polyetylenglykoldimetakrylat (PEGDM, 4000 mw) genom methacrylating polyetylenglykol enligt metoder som beskrivits av Lin-Gibson et al. 29. Alternativt kan PEGDM köpas.
  2. Syntetisera fotoinitiator, litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), genom en två-stegsprocess där första dimetyl phenylphosphonite omsattes med 2,4,6-trimetylbensoyl klorid via en Michaelis-Arbuzov-reaktionen och därefter litiumsaltet skapas genom att lägga litiumbromid i 2-butanon, i enlighet med Majima et al. 30.
    Obs: Alternativt kan andra fotoinitiatorer köpas men LAP visar bättre biokompatibilitet och tvärbindningseffektiviteten 31.
  3. Funktionalisera de glas täckglas för att möjliggöra bindning av hydrogelen till glaset och därigenom inte rör sig under avbildning.
    1. I en kemisk huva med lämplig personlig skyddsutrustning, användning3- (trimetoxisilyl) propylmetakrylat enligt tillverkarens protokoll för PC-geler och epoxi silaner (3-glycidoxipropyltrimetoxisilan) för TR-geler 31. Obs: Alternativt kan förbelagda diabilder köpas. Notera att locket glida måste vara större än brunnen av PDMS skålen i steg 3,8.

2. Cell Transfektion

  1. I en vävnadskultur huva och med hjälp av sterila tekniker, tö och plattan de önskade cellerna vid sub-konfluens (50 - 70%), kondrocyter häri bovina vid 15.000 celler / cm 2 i 6-brunnars icke-behandlade odlingsskålar. Obs: All relevant celltyp kan användas, inklusive förankringsoberoende celler.
    1. Tillåta cellerna att återhämta sig under en dag i en inkubator vid 37 ° C. Före efterföljande steg, avlägsna mediet, skölja med PBS, och tillsätt 2 ml fenol- och serumfritt medium per brunn.
  2. Nästa dag för varje brunn, tillsätt 100 | il av fenol- och serumfritt medium samt 3il transfektion reagens till en autoklaverad glasprovrör. Att blanda, skaka röret lätt. Inkubera vid RT i 5 min. Begränsa all exponering för ljus.
  3. Tillsätt 1 mikrogram FRET sondera DNA och skaka lätt. Inkubera blandningen vid RT och borta från ljus i 30 min.
    Obs: I detta experiment ICUE1 plasmid (tillstånd av Dr Jin Zhang 33) användes. Fluoroforema i ICUE1 är cyan fluorescerande protein (GFP, donator) och gult fluorescerande protein (YFP, acceptor). Förhållandet av transfektionsreagens till plasmid-DNA kommer att behöva justeras för optimal transfektion av olika celltyper.
  4. Fördela framställda blandningen (~ 104 | il) släppa klokt att var och en av de 6 brunnar innehållande celler plus 2 ml fenol- och serumfritt medium. Inte pipettera upp och ned. Snurra försiktigt plattan för att blanda.
  5. Inkubera vid 37 ° C under 48 h. Obs: konfluens hämmar transfektion effektivitet och förändrar endogen expression av receptorer.

3. Tillverkning avPDMS formar för Hydrogel Gjutning och kultur

  1. För att förbereda en stor glasskiva att gjuta polydimetylsiloxan (PDMS) på, rengöra glaset först med tvål, skölj med rikligt med vatten, och torka sedan med isopropanol följt av luft.
    1. Behandla glaset med en silikonisering reagens enligt tillverkarens protokoll, så att de PDMS lätt kan skalas av efter härdning. Skölj resterande reagens bort från ytan med toluen under ett upptagningsområde behållare. Låt ytan luften torka helt innan eller använd värme vid 100 ° C för att förkorta väntetiden.
  2. Välj en hydrogel höjd (t.ex. 1 mm) och beräkna 1,2 gånger volymen av PDMS som behövs för att täcka glasskiva med PDMS i denna tjocklek med användning av dimensionerna hos den glasskiva och hydrogel höjd. Obs: PDMS krymper inte.
    1. Blanda PDMS kitkomponenterna vid ett 10: 1 viktförhållande i en bägare. När det blandas väl, placera bägaren i husar vakuum för avgasning. relieve vakuumet om bubblor börjar svämma över behållaren och upprepa.
      Obs: Andra hydrogel tjocklekar kan användas, men på bekostnad av ökad bakgrund och ökad opacitet om centrifugering (steg 6,2) inte används.
  3. Linda aluminiumfolie runt basen och sidorna av glaset för att innehålla de PDMS. Häll försiktigt den önskade mängden avgasade PDMS på detta glas omgiven av folie. Mät PDMS höjd. Ha i åtanke att höjden på PDMS kommer att vara den maximala höjden av hydrogelen. Om några bubblor skapas när hälla Degas igen eller pop dem med en spatel eller nål.
  4. Placera ohärdade PDMS på en plan yta i en ugn vid 100 ° C under 2 timmar, eller lämna vid RT under 24 timmar.
  5. Försiktigt bort PDMS från ytan när den har härdat. Stansa ut önskad form (t.ex. cylindriska punch 3 mm) för hydrogeler.
    Obs: fototvär kommer att ge något smalare PC-gel cylindrar än form diameter på grundtill släckning av reaktionen med molekylärt syre i PDMS.
  6. Sterilisera stansade PDMS. För kortsiktiga experiment, översvämmas PDMS i 70% etanol under 1 timme.
  7. Montera formen genom att passa basen av de steriliserade PDMS med en steril glas täckglas med en tjocklek anpassad till mikroskopobjektivet korrigering. Ställ åt sidan för användning i steg 6.
  8. Tillverka en större PDMS maträtt med hjälp av metoderna ovan (med en väl bredare och högre än hydrogel) att innehålla hydrogel och mediet. Rymma en medelhög volym minst 10x mer än hydrogelen att fördjupa hydrogelen och för att minimera utspädning av analyt.

4. Framställning av Hydrogel prekursorlösningarna

  1. I en vävnadskultur huva och med användning av sterila tekniker, förbereda hydrogelen prekursorlösningar lämpligt för studien omedelbart före tillsats celler. Framställa PC-gel från polymerprekursorn enligt följande.
    1. Blanda PEGDM pulver i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,2) vid 10% (vikt / volym).
    2. Lägga fotoinitiatorn (t.ex., LAP) vid en slutlig koncentration av 0,005 till 0,01% (vikt / vol) och blanda genom pipettering. Täck lösningen med aluminiumfolie eller sköld från ljus som LAP är ljuskänslig.
      Obs: Här TR-gel reducerad tillväxtfaktor extracellulära matrisen används som tillhandahålls av tillverkaren.

5. cellsuspensionen i Hydrogel Solutions

  1. I en vävnadskultur huva och med användning av sterila tekniker, aspirera mediet från brunnarna.
  2. Lägg PBS till brunnarna och sedan flytta till noggrant skölja bifogade cellmonoskikt.
  3. Dissociera cellerna från odlingssubstrat med användning av två till tre ml per 25 cm 2 av cell dissociationslösning. Skaka, sedan inkubera vid 37 ° C under 10 - 20 min eller tills skiljas. Knacka skålen om det är nödvändigt att få bort celler.
    Obs: Alternativa cell dissociation lösningar finns med urvalsförfarande, begränsat till dem som inte gör det iav konsekvenssignaleringsvägen som analyseras genom spjälkning receptorer av intresse.
  4. Efter cellerna lossnat, tillsätt 2 ml av fenol- och serumfritt medium, suspendera cellerna, och räkna celler med en hemocytometer. Notera: Kemiskt definierat serumfritt medium (t.ex., kompletterat med insulin, transferrin och selen) kan också användas.
  5. Alikvotera önskat antal celler baserat på celltypen in i sterila flaskor och pelleten (t.ex. 2,0 x 10 6 celler per flaska).
  6. Avlägsna supernatanten, tillsätt önskad mängd hydrogel föregångare och suspendera cellerna genom pipettering. Använda en volym av prekursor som kommer att ge 2 x 10 5 celler / cm 2 i xy-planet när visualisera z-axeln av hydrogelen som kollapsat (t.ex., 1,0 ml per ampull för ett 1 mm tjockt hydrogel innehållande 2 x 10 6 celler / ml). Var noga med att inte producera bubblor.
    1. Snabbt gå vidare till nästa steg för att begränsa negativa effekter på cellviabilitet 34 </ Sup>.

6. Hydrogel Framställning

  1. I en vävnadskultur huva och med användning av sterila tekniker, tillsätt cellinnehållande hydrogel prekursor till gjutformarna som framställdes i steg 3 (t.ex., 7,1 pl per 3 mm diameter x 1 mm höga mögel). Skapa en extra hydrogel, enligt samma metoder som beskrivits, att använda för mikroskopavbildningssystemkalibrering och sond kalibrering (om den inneboende sonden effektivitet är okänd).
  2. Centrifugera den framställda cellinnehållande hydrogel prekursor före gelning / tvärbindning för att optimera avbildnings genom att begränsa cellerna till ett enda fokalplan och minimera ut ur planet signal (Figur 1). Justera centrifugeringstiden och kraft på celltyp och viskositet av prekursorn (400 g under 4 min).
  3. Gel eller tvärbinda lösning
    1. För PC-gel hydrogel, bestråla cellinnehållande prekursorn med en UV-A-ljuskälla (λ = 365 nm) under en exponeringstid som är lika med3,2 J / cm2 per millimeter tjocklek fototvärbinda.
      Obs: Använd en 1 mm minsta tjocklek i beräkningen. Exponeringar bör falla i 1-5 min intervall. Använd den minsta exponeringstiden. Undvik över bestrålning av cellerna som detta kommer att minska lönsamheten och bleka GFP donatorn. Men exponeringstider mindre än 60 s rekommenderas inte eftersom högintensiv strålning leder till radikal självsläckning och dålig cellernas livskraft.
    2. För TR-gel hydrogel, placera den fyllda formen i en petriskål och flytta till en inkubator för att termiskt gela. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
  4. Efter gelning eller tvärbindning av hydrogelen bort PDMS hydrogel gjutformen och ersätta den med den förberedda större PDMS skålen (från steg 3,5). Tryck på PDMS ner på glaset med en steril spatel för att följa den.
    1. Placera PDMS skålen med täck i en steril behållare, såsom en petriskål. Lägga fenol-fria serumfritt medium eller kemiskt definierade meDIUM (serumfritt medium kompletterat med insulin, transferrin och selen (steg 5,4)) till brunnen skapas med PDMS skålen och täck att hålla hydrogel nedsänkt. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
      Obs: Om du använder en specialiserad skålen med en täck, sedan placera täck i det och på samma sätt lägga medium.
    2. Alternativt, utföra detta steg dagen före FRET avbildning att tillåta sonderna att återhämta sig när strålningsvåglängderna överlappar med GFP givaren excitation spektrum.

7. 3D FRET Imaging

  1. Ta bort PDMS skålen med hydrogelen från petriskålen, som framställts i steg 6,4, och säkra den i en justerbar provhållare för XY mikroskop scenen (Figur 2). Placera preparathållaren på mikroskop scenen. Applicera oljan till målet om det behövs. Använd ett mål på minst 40X och hög numerisk apertur (NA) (dvs 1,3 NA) för att fånga den relativt svaga fluorofore utsläpp.
  2. Konfigurera synfälten (FOVs) för bildtagning: Markera celler för avbildning genomfallande ljus bildbehandling och kontrollera transfektion med fluorescens avbildning. Välj åtminstone 15 olika celler.
    1. Markera celler som varken är för ljus eller för mörk (vilket annars skulle kunna leda till sonden övermättnad eller låg känslighet) och med den FRET-förhållande mellan 0,0 och 1,0 (vilka annars indikerar skada eller sönderfallet av den binära prob). Sedan släcka ljuset för att begränsa exponeringen.
    2. Välj FOVs nära centrum av hydrogelen och med cellerna av intresse inom den relativt flacka belysningsområdet (se figur 3B och steg 9,2 nedan).
  3. Konfigurera kamerainställningarna för FRET bildkanalerna. Välja mellan ett fåtal celler i närheten av centrum av den FOV att optimera den "optiska konfigurationer" (dvs., Exponering och förstärknings per bildkanalen).
    Obs: Den nomenklatur nedan varierar depending på vilken programvara som används för att driva mikroskop och kamera. Mikroskopet programvara, NIS-Elements, används här för bildfångst och analys.
    1. För FRET analys av enkelkedjiga sonder, välj två bild kanaler per FOV: Kylda emission (QE), som är utsläpp givaren enligt donator excitation och Acceptor emission enligt acceptor excitation (Aem).
      Obs: För ICUE1 CFP-YFP sond, en GFP excitation och emissionsfilterparet för QE (418-442 ex, 458-482 em) och en YFP excitation och emissions par för Aem (490-510 ex, 520-550 em) används.
    2. Ställ in exponeringen för QE och Aem att förvärva maximalt signalstyrkan utan mättnad (och om du använder en CCD med den minimala möjliga vinsten) för att minimera bakgrundsbrus. Hålla de optiska konfigurationerna är desamma för båda fluoroforema och under hela experimentet, liksom bland experimentgrupper för att undvika polarisering av resultaten (dvs excitation power, iris storlek, exponering, och kamera förstärknings) (figure 3A).
    3. Förvärva ytterligare bild kanaler för att möjliggöra fler analysalternativ efter förvärvet (t.ex. korrigerad sensibiliserade utsläpp (CSE) avbildning (se diskussion)). För ICUE1 CFP-YFP sond, förvärva excitation (Ex) och utsläpp (Em) kanaler Ex donator - Em donator (QE väljer CFP-GFP i mikroskop programvara), Ex donator - Em mottagare (SE väljer CFP- YFP), Ex acceptor - Em mottagare (Aem väljer YFP-YFP), och Ex acceptor - Em donator (YFP-GFP) konfigurationer (se figur 3A).
  4. Konfigurera inspelningshastigheten för time-lapse bildtagning.
    1. Minska avskiljningsgrad om begränsad av hårdvaran. För kortsiktiga analyser (t.ex. 30-60 min), betecknar cirka 12 förvärv per minut för varje FOV (5 sek samplingsfrekvens) för att fånga signal kinetik. Använda den minsta samplingshastighet som krävs för att undvika att signiligt fotoblekning sonden.
    2. Ställ upptagningshastigheten genom att skriva periodicitet fångar i mikroskop programvara. För långtidsanalyser (eg., 24 tim), börjar med den höga upptagningshastigheten för att fånga den initiala pulssvaret och sedan växla till en låg upptagningshastighet, t.ex., var 5: e till 10 min.
  5. Välj "Kör nu" i mikroskop programvaran för att initiera bildupptagning och ta bilder i 5 minuter för att etablera en baslinje för sond svar på de utsedda FOVs.
  6. Efter fem minuter av bildtagning, pipett i önskad agonist eller antagonist analyt (t.ex. Forskolin vid 100 nM), blanda genom att pipettera, och fortsätter avbildning.

8. FRET Kalibrering

  1. System Kalibrering: Använd ytterligare kalibrerings hydrogel, tillverkas som beskrivs i steg 6, för att förvärva Aem bilder av åtminstone 6 representativa celler använder samma FOV kriterier, optiska konfigurationer, och kameran inställdningar som används för FRET avbildning ovan (steg 7.1, 7.2, och 7.3).
    Obs: Det behövs Kvantifiering av kvantutbytet och spektrala känslighet (QS) för den kombinerade sonden och mikroskopavbildningssystemet för "absolut" FRET analys men inte för "relativ" FRET.
    1. Photobleach acceptorfluoroforen genom att välja en 5 min lång exponering för exciteringsljuset med full intensitet (excitation på Aem kanal). Använda en smal öppning för att bleka endast cellerna av intresse. Verifiera att Aem signalen är minst 10% lägre än den ursprungliga signalen genom att jämföra signalintensiteten histogram ( "LUT" fönster) före och efter fotoblekning. Fortsätt fotoblekning om signalförlust är mindre än 90%.
      Obs: Se till att donatorfluoroforen inte blekt under denna procedur med hjälp av AEM excitation filter som inte överlappar med givaren excitation spektrum.
    2. Förvärva utsläpps givare enligt donator excitation med nu blekt acceptorfluoroforen (Dem) ossing samma optiska konfiguration som för QE i steg 7,3.
    3. Beräkna QS per pixel som Dem dividerat med Aem efter bakgrundskorrektion, som i avsnitt 9 nedan. QS = Dem / Aem
    4. Beräkna den genomsnittliga QS bland cellerna från de cellulära genomsnitten.
  2. Uppskatta den inneboende FRET effektiviteten av sonden (Ei) med hjälp av kalibreringsprov. Framkalla maximal FRET av sonden och beräkna Ei = 1 - QE / (Aem x QS) som i avsnitt 9 nedan. Alternativt kan du använda Ei = CSE / Aem, eller Ei beräknas med hjälp av en konventionell slutpunkt analys för FRET effektivitet med Ei = 1 - (QE / DEM).
    Obs: Ei behövs för att kvantifiera absoluta fraktionen av aktiverade prober (FAP, dvs, bråkdel av prober som binder analyt), men inte nödvändigt för "relativ" FRET analys.
    1. Mätta sond svar genom att stimulera kulturen med en agonist analyt produktion / aktivering för sonder som ökar i FRET vid interaktion med analyt.
    2. Inhibera sond interaction med analyt med en antagonist av signalering för prober som minskar i FRET på binda analyten. Obs: När det gäller den ICUE1 sonden, undertrycka cAMP-nivåer med en adenylcyklas-hämmare såsom 2 ', 5'-dideoxiadenosin (specifik) eller 3-isobutyl-metyl-xantin (ospecifik).

9. FRET Ratio Beräkning

  1. Rita och utse en region av intresse (ROI) per FOV nära cellerna för att definiera bakgrundsnivån (Figur 3B) i varje FOV över tiden, men begränsa ROI till området relativt homogen belysning över mitten av bilden (figur 4A ). Se diskussionen för en förklaring av bakgrundskorrigeringsalternativ.
    1. Med mikroskop programvara: Välj pilen på "Background ROI Ikon" och välj "Rita elliptisk bakgrund ROI" (andra former kommer att fungera). Se till att "hålla uppdatera Bakgrund Offset" väljs. aktivera vieflygel bakgrunden ROI genom att klicka på ikonen Bakgrunds ROI. Alternativt kan du använda "ROI ikon" och ROI egenskaper som som "Använd som bakgrund ROI" och "ROI är olika i varje multi".
    2. Med ImageJ: Använd verktygsfältet för att välja den cirkulära ritverktyg. Tillsätt sedan formen till ROI manager via menyn "Analyze → Verktyg → ROI Manager". Ställ en annan färg för bakgrunden ROI i ROI Manager om så önskas.
    3. För varje FOV och bildkanalen (t.ex. QE och Aem), subtrahera medelvärdet i bakgrunden ROI per tidspunkt för att skapa en korrigerad bild per kanal, t.ex. SQE t, p = QE t, p - BQE t, p där t är uppsamlingstiden, p är FOV (dvs., xy-positionen), och BQE och BÅEM är de skalära värdena av signalen inom bakgrunden ROI. Använd bild aritmetiska funktioner som finns i programmet.
      1. Wed mikroskop programvara använder "ROI Bakgrund Ikon" och välj "Subtrahera Bakgrund Använda ROI". I popup-fönster, välj "varje bild" under "Subtrahera bakgrund ROI på" och välj "Alla Frames" under "Tillämpa på".
        Obs: En bakgrunds ROI måste definieras i varje FOV för denna funktion ska fungera korrekt (t.ex. funktionen inte korrekt subtrahera bakgrunder för FOV med bakgrunds ROI om vissa FOV har odefinierade bakgrund ROI.).
      2. Med ImageJ, använd "BG subtraktion från ROI" makro skriven av Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Spara den korrigerade tiden serie bilder genom att välja "Spara som" för följande analyssteg.
  2. Definiera en ROI kring cellen med hjälp av en binär mask för varje cell som analyseras i varje FOV (Figur 4B). Använd Aem kanalen till tröskeln bilden per FOV vid starten of experimentet identifiera cellgränserna, och definierade ROI. Spara ROI.
    1. Med mikroskop programvara: För varje ram (dvs FOV), använd först menyn "Binary → Definiera Threshold" och välj "gäller för nuvarande ram". Justera lägre tröskelvärdet för att markera cellerna. Använd sedan "Digital → Close" -funktion för att fylla i hålen i den binära masken om det behövs. Nästa använda ikonen ROI för att välja "Kopiera Binary till ROI"; den binära skiktet tas bort automatiskt.
      1. Bifoga ROI för efterföljande ramar till befintliga pool av ROI. Ta bort alla falska ROI. Nästa "högerklicka" på ROI och se till att deras egenskaper "Använd som Standard ROI" och "ROI är olika i varje multi".
      2. Med ImageJ: För varje FOV, använd först menyn "Bild → Justera → Threshold". Använd sedan "Analyze → analysera partiklar" med Visa konturer och Lägg till chef vald. Användning"Digital → Stäng" för att fylla i "hål" i den binära masken om det behövs. Radera spurious ROI. Fria plugins finns tillgängliga för att automatisera denna process.
  3. Beräkna QE baserad FRET förhållandet vid varje pixel, SQE / SAEM för relativ analys (se steg 10) och E QE = SQE / (QS x SAEM) för absolut analys (se steg 10) med QS erhållits i steg 8,1. Använd flyttals uppdelning av bilderna. Se diskussionen avsnitt för en förklaring av förhållandet härledningar.
    1. Med mikroskop programvara: Använd menyn "Bild → Bild Operations" och välj "Floating Point".
    2. Med ImageJ: Använd antingen "Process → Bild Calculator" -funktionen eller "Calculator_Plus.java" plugin. Obs: Alternativt till makrot "pH_ratioMacro" .txt "kan anpassas beräkna FRET nyckeltal Det utnyttjar bakgrundskorrigering makro beskrivits ovan och finns tillgänglig på.
  4. Exportera genomsnittliga förhållandet per cell (dvs per ROI) i ett kalkylblad och grafiska program.
    1. Med mikroskop programvara: Använd antingen export knappen ND i "ROI statistik" analys kontroll eller "kalkylblad Export" i "Time Analysis" analys kontroll.
    2. Med ImageJ: Välj först menyn "Analyze → Ställ mätningar" och se till att "Medelvärde" och "Standardavvikelse" väljs. Använd sedan ROI Manager och klicka på knappen "Measure". Spara den genererade resultatfönstret.

10. FRET Ratio Analys

  1. Beräkna den genomsnittliga cellulära FRET kvot under tiden från den genomsnittliga förhållandena per cell (exporteras i steg 9,4). Överväga baslinjen FRET förhållanden (förhållandet innan administrering av analyt) i denna beräkning.
    Obs: kalkylblad och grafiska program används för att rita baslinjen-SUBTRagerade genomsnittliga FRET-förhållanden och deras standardfel för medelvärdet (SEM) med användning av en linjär regression på baslinjen som i steg 10.1.2 och 10.1.3 nedan (fig 5 och 6).
    1. Relativ Analys (storleken på svar): Normalisera varje kurva till en gemensam referensprov (t.ex. obehandlat prov.).
    2. Absolut Analys (tidsförloppet för svar): Shift kurvorna till en gemensam startpunkt genom att normalisera varje kurva med sitt ursprungliga FRET förhållandet.
      1. I tabell och grafiska program, interfoliera data (kolumnerna i genomsnitt nyckeltal per cell) med nya kolumner, så att varje ursprunglig kolonn paras med en ny kolumn som bara innehåller relationstal för referensperioden (förhållanden innan analyt tillsatt). Välj "Infoga kolumn" för att infoga en tom kolumn efter varje kolumn med data. Kopiera sedan data baslinjen i de parade tomma kolumner.
      2. I tabell och grafiska program, välj "Infoga → Nytt Analys → Transform Ta bort baslinjen "och ställ sedan in" Selected kolumnen "till" alla andra ", välj" antar baslinjen är linjär ", och välj" Difference "under" Beräkning ".
      3. Beräkna den genomsnittliga cellulära förhållandet och beskrivande statistik. I tabell och grafiska program, välj "Infoga → Ny analys → XY Analyser → Row Medel med SD eller SEM" och välj sedan "Row betyder med SEM" i pop-up fönster.

Representative Results

Alla hydrogel prekursorer, celler och gjutformar framställdes såsom beskrivits ovan. Cell lastat prekursorlösningar göts i PDMS formar och centrifugeras sedan innan gelning / fototvär att immobilisera celler nära täck och underlätta FRET bildanalys (Figur 1). Hydrogeler med bifogade täck placerades inom preparerade PDMS avbildnings brunnar för mikroskopisk avbildning (Figur 2). De optiska konfigurationer och bildupptagning parametrar sedan in som visas i figur 3A. Infångning av alla fyra FRET relaterade bild kanaler för CFP-YFP fluorofor par visas (se under "Optical Conf." I fig 3), som behövs för icke-binära sonder. Men i detta arbete endast två bilder krävs för den enda kedjan binära ICUE1 sond, QE = "GFP GFP" och Aem = "YFP YFP" (excitation emission). Multipla FOVs (xy-positionens) valdes, i vilken flera celler bosatt i den homogena belysningen området (figur 3B). Efter time lapse förvärvet var datasignal för sonden exporteras. ROI för bakgrundskorrigering av kanalsignaler och för cellanalys betecknades med hjälp av tröskel AEM bilder från början av experimenten (Figur 4). Celler selekterades bland cell poolen som de som uttrycker tillräckligt (inte alltför dim), men inte för hög (överdrivet ljus) sond (Figur 4B). QE och SE FRET nyckeltal per pixel vid varje förvärv beräknades med hjälp av flyttals uppdelning av bakgrunden subtraheras bildkanaler. Den genomsnittliga FRET förhållandet per cell (dvs per ROI) beräknades, normaliserat till baslinjen signalen före stimulering (dvs en regression på baslinjen subtraheras från alla tidpunkter), och ritas med felstaplar som standardfelet av mean (SEM). Både QE och CSE baserad FRET nyckeltal detect den ökade cAMP-aktivitet i kondrocyter enligt forskolin stimulering (100 nM, Figur 5). QE FRET förhållandet var mer känslig för bakgrundskorrigering än CSE FRET förhållandet eftersom QE signalen var lägre på grund av den låga basala nivån av cAMP-aktivitet i kondrocyter inbäddade i de hydrogeler. Båda hydrogel typer (TR-gel och PC-gel) visade en ökning i FRET förhållande över tiden (figur 6), vilket indikerar en ökad cAMP-signalering svar på tillsats av forskolin. Såsom indikeras av QE FRET ratio, kondrocyter i PC-gel-hydrogeler uppvisar en större förändring i cAMP (visad) och en högre basal nivå av cAMP (E QE = 0,19 i PC-gel vs E QE = 0,09 i TR-gel, som inte visas i baslinjen subtraheras figur).

Figur 1
Figur 1: Cell Distribution i fototvär Hydrogel (PC-gel) A: Cellen laden hydrogel prekursor centrifugerades för att maximera antalet celler vid ett fokalplan nära täckglas. B: Detta ökar antalet celler i FOV och minimerar bakgrundssignalen från ut av plana celler. (Skala bar = 200 nm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: hydrogel i PDMS Dish
Hydrogelen placerades i en lång PDMS väl (10x volym av hydrogel) med en täck bas för mikroskopisk avbildning och analyt stimulering. PC-gel hydrogeler är transparenta och bundet till täck så att de förblir på plats under hela analysen. PDMS väl kan göras större för att innehålla 10x mer medium än hydrogelen volym med en bredare biopsistans förutom påHicker PDMS ark. (Skala bar = 2 mm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Förvärv konfiguration för FRET Imaging
A: Förvärvet konfigurerad för bildfångst var 7 sek på flera platser. För QE FRET förhållandet beräkna dem, är endast två bildkanaler som behövs för ICUE1 prob som användes här (binär enkelkedjig prob), QE = "GFP GFP" och Aem = "YFP YFP" (excitation emission) inom ramen för den "Optical Conf." kolumn på fliken λ av mikroskop programvara. B: FOVs ( "XY" positioner) valdes där flera celler bosatt i den homogena belysningen området. Handlingen under bilden visar belysningsintensitet längs den blå pil linjensom korsar genom mitten av FOV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Val av ROI för FRET bildanalys
A: En region av intresse (ROI) fri från celler valdes för att korrigera för bakgrundssignalen på varje kanal. En bild av en cellfri hydrogel kan istället användas för bakgrunds subtraktion om celltäthet eller migration är hög, eller om en skuggning mask inte används när celler inte ligga inom en homogen belysning fält. B: Cell ROI valdes med hjälp av bildtröskel och binär maskering av Aem kanalen. Välja en ROI större än cellerna kommer att påverka beräkningen av den genomsnittliga FRET förhållandet per cell på grund av införandet av extracellulära förhållanden som genereras från bakgrunds nOise. Beräkning av den cellulära FRET förhållandet med hjälp av medelvärdet av varje kanal per cell rekommenderas inte eftersom det underskattar förhållande. (Skala bar = 50 pm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Jämförelse av FRET Propositionerna i termoresponsiv Hydrogel (TR-gel)
Både QE och SE baserade FRET nyckeltal upptäcka ökad cAMP-aktivitet i kondrocyter enligt forskolin stimulering. Forskolin är ett adenylcyklas-agonist som inducerar cAMP-produktion. FRET minskar när ICUE1 proben binder cAMP, och sålunda QE FRET förhållandet (E QE = SQE / (SAEM x QS)) ökar. Omvänt minskar SE FRET-förhållande och sålunda ritas som E SE = 1 - CSE / SAEM. I hydrogel inbäddade kondrocyter, QE FRET förhållandet är mer känsliga för bakgrundskorrigering än SE FRET förhållandet eftersom QE signalen är låg på grund av den låga basala cAMP-aktivitet. Felstaplar = SEM, n = 25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Jämförelse av FRET Ratio i olika Hydrogeler
Kondrocyterna i båda hydrogel typerna svarade på forskolin-stimulering med en ökning av cAMP-aktivitet, vilket framgår av den ökade QE FRET-förhållande med tiden. De hydrogel typ påverkar cellulära svar genom flera effekter, inklusive skillnader i genomsläpplighet för forskolin och i basalcell cAMP-aktivitet (E QE = 0,19 i PC-gel vs E QE = 0,09 i TR-gel, ej visad). Felstaplar = SEM, n för TR-gel= 25, n för PC-gel = 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta arbete visar hur FRET avbildning kan användas för att analysera cellulär signalering i 3D-hydrogeler. Även tidigare studier har visat FRET avbildning av celler sådda på hydrogel substrat 35-37, av extracellulära interaktioner med hydrogeler 38, och av molekyler fångade i hydrogeler 39-41, är detta det första offentliggörandet att beskriva FRET avbildning baserad intracellulära analys av celler inbäddade i 3D-hydrogeler. Arbetet löser flera genomförandefrågor vid omräkning FRET avbildning från 2D till 3D. Först höga numeriska mål bländare som behövs för FRET avbildning för att samla tillräcklig signal utsläpp, men de begränsar skärpedjupet. Cellerna här tillåts något sedimentera via centrifugering för att öka antalet celler i ett fokalplan nära glaset för att kompensera för detta. För det andra, kan 3D-hydrogel ställningar driver över synfältet under avbildning vilket försvårar analysen. Hydrogelerna här är bundna till coverslip så att de förblir fasta under hela experimentet. Tredje, val av lämpliga hydrogelkompositioner för 3D FRET är viktigt eftersom hydrogeler kan hindra visualisering av cellerna. Här transparenta hydrogeler av PC-gel och TR-gel används. Men samla cellerna med centrifugering till ett fokalplan nära täck kan användas för att avbilda celler i hydrogeler med högre diffraction.The val av hydrogel beror på mikro villkor som måste simuleras, som kan hittas i en recension på hydrogeler 42 . För det fjärde är en alternativ beräkning som användes här för den FRET förhållandet mellan enkelkedje ICUE1 sond (dvs E QE = QE / cAem) för att minimera antalet bildkanaler som erfordras för analys och därigenom minimera fotoblekning. Den genomsnittliga FRET förhållandet per cell beräknas som genomsnittet av förhållandena per pixel inom en cell för att minimera underskattning av den verkliga FRET ratio. Slutligen, en linjär ratiometrisk analys och medelatt beräkna den aktiverade fraktionen av enkelkedjiga binära prober beskrivs.

Det finns flera viktiga aspekter att genomföra framgångsrika FRET experiment använder widefield mikroskopi. När det gäller hårdvara, måste kameran vara tillräckligt känslig för att lösa små signalförändringar, vilket nyare vetenskapliga CMOS-kameror och elektron multiplicera CCD bättre lämpade än konventionella CCD. För att på bästa analysera den geografiska fördelningen av FRET förhållandet, måste kameran åtminstone ha dubbelt den rumsliga upplösningen av punktspridningsfunktionen av målet (Nyquist kriteriet). Detta gör dubbla visa system mindre lämpade för uppgiften. Mer avgörande är att välja en lämplig exponering och bildupptagningshastigheten för den givna FRET par för att minimera fotoblekning av fluoroforer. En minskad förvärvstakt rekommenderas som experiment längd ökar. Användningen av snabba filterhjul ökar förvärvsfrekvens och antalet FOVs för analys medan undvikaing frågorna bildregistrering med dubbel-view och torn filter kuber. Den inhomogena belysning fältet komplicerar korrigering för bakgrundsfluorescens som uppstår från prov autofluorescens och kamerasystem buller. Vissa hydrogeler, i synnerhet de som innehåller kollagenproteiner är mycket autofluorescent 43,44. FRET nyckeltal skattas utan bakgrundskorrigering. Här använder vi en enkel bakgrund korrigeringsmetod som bygger på den relativt flacka belysningsfält som ofta kan konfigureras med epi-fluorescens belysning över mitten av bilden (Figur 3B, steg 7,2). Denna metod begränsar därför celler av intresse för dem inom detta belysningsområdet. Bakgrundskorrigeringen som beskrivs här inte tar hänsyn till cell autofluorescens i våglängd läsa för den binära sonden. I ett sådant fall bör omärkta celler (ingen sond transfektion) avbildas på samma villkor och bakgrund subtraheras. A mix av märkta och omärkta celler kan användas och de omärkta cellerna ut för bakgrunden ROI. Alternativa metoder som tillhandahåller cellanalys över hela bildfältet inkluderar användning av en skuggning mask, flera bakgrunds ROI, eller identiska prover utan celler och ett protokoll finns tillgänglig på begäran.

Specifik till 3D FRET avbildning, är avkännings-svars mycket känslig för hydrogelen permeabilitet för analyten (Figur 6). Därför samma hydrogel regioner jämförs över experimentella behandlingar, företrädesvis vid en punkt av geometri symmetri såsom nära ställningen centrum som används här. Alternativt mikroflödeskammare / bioreaktorer kan användas för att snabbt och jämnt BEGJUTA hydrogelen med analytlösningen 45. En FRET-signal kan inte detekteras (signal-brusförhållandet är för lågt) när hydrogelen s autofluorescens är för hög; en tunnare hydrogel eller annan sond (olika fluoroforer) bör användas.Med avseende på 3D FRET avbildning i fototvär hydrogeler, är användning av minsta bestrålning exponering och våglängder utanför exciterings- spectrums av sond fluoroforer rekommenderas. LAP kan användas tillsammans med en ljuskälla för synligt ljus vid 405 nm för att ytterligare minimera potentiell cellulär skada 31,46. Dock använder LAP med 365 nm strålning rekommenderas eftersom det minimerar sond blekning. 365 nm ligger i svansen slutet av GFP givarexciteringsspektrum, medan 405 nm ligger på toppen excitation. Alternativt kan sonden expression tillåtas att återhämta sig under en dag. Användning av binära prober minimerar frågor om känslighet för skillnader i expressionsnivåer och i molekylär diffusion av givaren och mottagaren fluoroforer. Icke-binära sönder kan användas, men med SE istället för QE avbildning och ytterligare korrigering för spektral genomblödning av excitations- och emissionsspektra (se nedan). Dessutom låg kommersiell tillgänglighet och komplexiteten i utformningen av FRET-proberkan vara ett hinder. Den mest kritiska faktorn för framgångsrika experiment fortfarande ordentlig korrigering och analys av fluorescenssignaler.

En alternativ beräkning av FRET förhållandet används för flera andra skäl förutom minimering av fotoblekning. För binära enkelkedjiga sonder, är den allmänt rapporterade förhållandet acceptor utsläpp enligt donator excitation (sensibiliserade utsläpp, SE) för utsläpp givare enligt donator excitation (kylda emission, QE), dvs FRET ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE är icke-linjär i förhållande till förändringar i FRET effektivitet 21,22,47. Nämligen, har förhållandet ett exponentiellt icke-linjärt förhållande till inneboende FRET effektiviteten av sonden (Ei) (Donius, AE, Táboas, JM opublicerat arbete. (2015)), varvid förhållandet mest linjära för Ei mindre än ca 15%. SE / QE kommer också underskatta den del av aktiverade prober (FAP, dvs, bråkdel av prober som binder analyt). Therefore, analys av SE / QE kräver en besvärlig jämvikts dos-responsstudie och kurvpassning. Lyckligtvis förhållandena SE eller QE för emission mottagaren enligt acceptor excitation (AEM) är linjär med avseende på Ei och FAP, dvs FRET nyckeltal SE / AEM och QE / AEM. SE / Aem används ofta för binära prober och kräver endast slutpunkt kalibrering (utan sond aktivitet och full sond aktivitet), men basala cellulära signalerings gör detta svårt. För att eliminera behovet av slutpunktskalibrering, kan SE korrigeras (CSE) för spektral överlappning av donator- och acceptor excitations- och emissionsspektra (spektral genomblödning) och för kvantutbyte och spektral känslighet (QS) av de kombinerade sond fluoroforer och mikroskop avbildningssystem. Den korrigerade SE FRET förhållande, baserat på CSE definierar den observerade FRET effektiviteten av sonderna inom varje pixel i en bild, det vill säga, E SE = CSE / Aem. Kommersiell och fri programvara är tillgänglig för att korrigera SE för dessa effekter ochhänvisas läsaren till arbete Chen och Periasamy 2006 för en detaljerad förklaring av de metoder 50. Men beräkna E SE kräver fångst av tre bild kanaler per tidspunkt (SE, QE, Aem). Därför, i detta arbete har vi också använda en alternativ FRET förhållandet E QE = 1 - QE / cAem, vilket kräver infångning av endast två bildkanaler (QE och Aem). Beräkning E QE från dessa kanaler endast kräver rättelse Aem för QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem / Aem lätt uppskattas med hjälp av två bilder från en kalibreringsprov, där Dem är utsläpp givaren enligt donator excitation med acceptor blekt. FAP i varje ögonblick kan beräknas genom att jämföra E SE eller E QE till Ei av sonden.

I slutändan bör FRET förhållandet val (E SE = CSE / Aem vs E QE = QE / cAem) baseras på en bedömning av typen sonden och kanalerna med bäst signal. både enpproaches inkluderar bakgrundsbrus korrigering av bilder per ram som beskrivits ovan för att ta hänsyn till förändringar i autofluorescens över tiden. De antar ingen överlappning av Aem excitationsljus i Dem exciteringsspektrum, vilket ofta är fallet på grund av att sondera design och mikroskop filterkonfiguration. Enkelkedjiga prober kan använda antingen och Urvalet baseras på bästa sondsignal (ljusstyrka) till kameran buller och bakgrundssignal på SE och QE kanaler. För ICUE1 sonden och experimentella betingelser som används här (cell- och hydrogel typer), har SE en starkare signal än QE. Dual-kedja sonder kräver användning av E SE på grund av icke-ekvimolär fördelning av givar- och acceptor fluoroforer. För prober som minskar i FRET vid bindning analyt såsom ICUE1, FRET effektivitet kan "inverterad" att presentera en positiv förändring signalering vid bindning av analyten som vi gör här, med E SE = 1 - CSE / Aem eller E QE = QE / (Aem x QS).

Analys av the FAP är känslig för korrekt korrigering av FRET nyckeltal och uppskattningen av Ei. Det kan uppskattas med samma kalibreringsprov som används för QS och en konventionell slutpunkt FRET effektivitet analys som Ei = 1- (QE / DEM) (QE bild följt av acceptor fotoblekning och en Dem bild) 28, men man måste vidtas för att minimera oavsiktlig blekning av givaren. Vi beskriver en modifierad version där uppskattningen av Dem bygger på Aem justerat för QS ersätts, det vill säga, Ei = 1 - (QE / (Aem x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / Aem användas. Uppskattningen av Ei i levande celler kräver att alla prober köras till full FRET. Detta är svårt att uppnå i praktiken för sönder, såsom ICUE1 som minskar i FRET vid bindning av analyten. En baserad beräkning in vitro av Ei använder cellysat och renad analyt är bäst, men utanför ramen för detta arbete. Här rekommenderar vi att du använder 2 ', 5'-dideoxiadenosin att minska cAMP i cellerna. Dock kan en relativ FAP be beräknas med hjälp av en Ei uppskattning härrör från grundnivån för signalering. Av dessa skäl, studier rapporterar oftast FRET ratio (som gjort här) eller en relativ FAP baserad på slutpunktskalibrering, där signalerings baslinjen före tillsats agonist är den undre gränsen och signalen efter tillsats av en andra agonist som mättar signalering är den övre bunden. Forskolin används ofta som en kontroll agonist för att mätta cAMP signal. Alternativt kan en cAMP-analog användas, såsom 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cykliskt monofosfat. Positiva kontroller som används vid slutförandet av studier för att identifiera eventuella förändringar i signalvägen mellan experimentella behandlingar rekommenderas.

Beräkning av den genomsnittliga signalsvaret per cell kräver en undersökning av flera faktorer. För det första bör det genomsnittliga FRET förhållandet beräknas som genomsnittet av förhållandena vid varje pixel i en cell, dvs, (Σ (QE/cAem)) / (antal bildpunkter), i stället för det ratio av den genomsnittliga QE och Aem i en cell, dvs, (ΣQE) / (ΣcAem). Även om den senare inte kräver noggrann maskering som bakgrundsbrus är låg, allvarligt underskattar det sanna genomsnittliga FRET ratio. Men förhållandena pixel kräver flyttalsberäkning och noggrann binär maskering av cellområdet för att definiera ROI och undvika införandet av falska förhållanden som genereras från bakgrundsbruset utanför cellen. Hela cellområdet måste kvantifieras för att undvika belastnings resultat på cellform. Maskeringen kan behöva omdefinieras över tiden beroende på förändringar i cellform och migration. Alternativt, ROI större än cellen kan användas om uteslutningskriterier definieras för att avlägsna förhållanden pixel från QE och AEM signaler som faller långt under cellulära nivåer och är nära bakgrundsnivåerna. Den beskrivna analysmetoder detalj de grundläggande stegen som används i detta arbete för FRET analys utan specialiserade program / plugins. Mikroskop tillverkare och andra leverantörer säljer tilläggsmoduls för deras mikroskop programvara, som stöder automatisk ratiometrisk och FRET analyser. På samma sätt har det offentliga ImageJ programvara flera plugins som partikel och FRET-analys, såsom RiFRET. För det andra, underskattar pixelbaserad genomsnittlig FRET förhållandet sanna genomsnittliga förhållandet mellan 3D cellstruktur eftersom en 2D-bild används. 2D signaler representerar och genomsnittet längs z-axeln. Beräkning av 3D rumsliga fördelningen av FRET förhållanden i levande celler är inte möjligt utan hög hastighet 3D-röntgen (eg., Med hjälp av spinning disk konfokalmikroskopi). Detta är ett problem för både 2D och 3D-kulturer, men har en större effekt i 3D som mer av cellstrukturen existerar ut ur planet. Detta är av stor betydelse för prober som lokaliserar till cellulära strukturer, såsom plasmamembranet EPAC1 sond PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 för förslag för att korrigera för celltjocklek effekter på förhållandet beräkningar 24. Analys av fördelningen av Aem kan användas för attupptäcka om sonden ackumuleras i områden i cellen och avbildningsplanet justeras. Detta kommer också att bidra till att tolka den geografiska fördelningen av FRET nyckeltal och att eliminera falska resultat, t ex., Identifiera sond mättnad (dvs att en låg Aem region har låg probkoncentration och kan uppvisa sond mättnad och hög FRET ratio). Tredje, olika FRET baslinjenivåer kan tyda på en skillnad i transfektionseffektivitet, sond uttryck, eller basal signalering mellan experimentella grupper. "Relativt Analysis" (steg 10.1.1) hjälper till att avlägsna drift i FRET förhållandet med tiden om det finns. Det underlättar jämförelse av den relativa storleken av svaren mellan prover, men försvårar jämförelse med tidsförloppet för svar för referensprovet (kontroll tomt är en rak linje). "Absolute Analysis" (steg 10.1.2) underlättar jämförelse av svarsfrekvensen över prover, men försvårar jämförelse av storleken på svaret, eftersom varje rad skalas av en dissimIlar konstant. Studier använder ofta en linjär regression på baslinjen för att korrigera för drift i FRET-förhållande med tiden.

Den beskrivna 3D FRET metod är ett användbart och praktiskt sätt att tillverka och utföra tidsförlopp avbildning av cell lastade 3D hydrogeler, som kan tillämpas på övriga sonder och avbildningsmetoder. Andra FRET-systemet förutom enkelkedjiga binära prober kommer att kräva mer komplex korrigering av intensitetsbaserade signaler, såsom diskuterats ovan. Alternativt kan fluorescenslivstid avbildning av FRET (FLIM-FRET) användas för att beräkna FRET effektivitet via en förändring i emissions livstid av sonden donator. Till skillnad från intensitet baserad FRET är FLIM-FRET okänslig för bakgrundsljud, spektral genomblödning, kvanteffektivitet, och detektor spektrala känslighet 2. Men flim system är dyra, komplicerade och ovanliga, och fungerar bäst med fluoroforer med enda exponent förfall och ingen FLIM avrinning 49. Det beskrivna förfarandet kan även användas med more avancerade mikroskop plattformar (eg., FRET-TIRF, fluorescensanisotropi, och spektrala korrelations FRET). Tillämpa denna metod för att 3D-bilder med hög hastighet konfokala och multifotonmikroskop underlättar analysen av sub-cellulära fördelningen av signalering svar och öka noggrannheten signalanalys. Denna 3D FRET metod gör det möjligt för avancerade cellbiologiska studier i simulerade 3D cellulära mikromiljöer. Som sådan, kan det lätt appliceras på farmakologi och regenerativ medicin behov, inklusive att studera inter signalering och screening läkemedelssvar i manipulerade hydrogel-baserade microtissues.

Acknowledgments

Författarna erkänner ekonomiskt stöd från School of Dental Medicine vid University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, och bidrag P30 DE030740. Författarna vill också tacka Dr Jin Zhang för ICUE1 plasmiden, Wayne Rasband för att utveckla ImageJ och Michael Cammer för ImageJ makro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64, (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120, (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5, (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13, (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7, (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8, (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61, (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24, (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52, (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147, (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16, (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46, (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60, (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13, (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192, (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5, (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1, (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4, (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35, (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85, (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10, (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22, (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15, (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30, (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14, (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5, (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6, (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16, (1), 95-104 (2006).
FRET Imaging i Tredimensionella Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter