Introduction
Связанные с возрастом заболевания становятся все более распространенными в современном обществе. Как медицинская наука и улучшает продолжительность жизни увеличивается, население продолжает стареть и бремя этих заболеваний растет. Эффективные способы лечения необходимы, чтобы уменьшить воздействие изнурительных условий, но остаются недостижимой во многих случаях. Только понимание причин и патологии заболеваний, связанных со старением ученые могут начать идентифицировать потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии для вмешательства. Общие условия, связанные с возрастом включают нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона (PD) и возрастной макулярной дегенерации (ВМД). PD является наиболее распространенным нарушением движения, вызванное нейродегенерации у людей. Большинство пациентов PD показывают такие симптомы, как тремор покоя, брадикинезия и жесткость после 50-летнего возраста. Раннее начало также наблюдается примерно в 10% случаев.
AMD является ведущей причиной слепоты впожилых людей, постепенно повреждая фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в глазу. Центральное зрение ухудшается, но периферийное зрение, как правило, не влияет. Есть две формы AMD. В «сухой» форме, внеклеточные белковые отложения, известные как друзы формы между ПЭС и мембраной Бруха (БМ), что приводит к географической атрофии и размытость центрального зрения. Более серьезные «мокрые» результаты формируются из неоваскуляризации из хориоидеи через БМ в РПЭ и фоторецепторов слоев и может привести к hamorrhaging под сетчатки, что приводит к необратимому повреждению ткани сетчатки. Геном широкие исследования ассоциаций ранее идентифицированы локусы, которые связаны с повышенной восприимчивостью к этому заболеванию и определили две области, представляющие интерес: фактор комплемента H (CFH) на хромосоме 1 и 10q26 локуса, где возрастная макулопатии восприимчивость 2 (ARMS2) и высокотемпературный фактор требования A1 (HTRA1) гены расположены 1-5 3-6.
КЛОХ действует как негативный регулятор альтернативного пути (AP) системы комплемента, путем ингибирования активации С3. Один нуклеотидного полиморфизма (SNP) был связан с повышенным риском AMD, в результате чего обмен тирозина 402 в экзоне 9 с гистидин из - за Т до С замещения 1. В AMD полагают, что точка доступа является misregulated из-за потери функции КЛОХ но SNP играет причинную роль неясно, будет ли. Одна гипотеза состоит в том, что положительно заряженные гистидин , как полагают, свести на нет способность CFH связываться с взаимодействующих белков С-реактивного белка и гепаринсульфат 1,7. В пробирке исследования CFH Y402H обеспечивают противоречивые результаты более функциональных различий между вариантами, и в Vivo работу в <EM> CFH - / - мышей , выражающие гуманизированное CFH продолжается 8. ARMS2 расположена выше по потоку от HTRA1 в геноме приматов, хотя ген отсутствует у мышей. HTRA1 представляет собой серин-протеазы, но ARMS2 плохо охарактеризованы. Неравновесия по сцеплению между ОНП в AMD-ассоциированной локуса затрудняет определить вклад в риск отдельных мутаций генов в этом регионе, но недавняя работа предположил, что избыточная экспрессия HTRA1, а не ARMS2, что приводит к неоваскуляризации и субретинальном белковые отложения 9-11. Тем не менее, близость генов в этом локусе может позволить взаимодействий, которые не могут быть исследованы с помощью случайным образом вставленные трансгенов.
В дополнение к AMD, семейство HtrA сериновых протеаз было связано со многими заболеваниями человека. Все белки HtrA содержат домен сериновой протеазы с последующей по меньшей мере, одного С-концевого домена PDZ. HTRA1, HtrA3 и HtrA4 разделяют грвкусишь от гомологии, состоящий из сигнального пептида, инсулиноподобного фактора роста связывающий домен, домен ингибитора протеазы Kazal, домен сериновой протеазы и домен PDZ. HtrA2 имеет другой N-конец, состоящий из последовательности митохондриальной локализации, трансмембранный домен и ингибитор апоптоза связывающего домена следуют протеазы и PDZ доменов 12-16. Млекопитающим HTRA1 регулируется ремоделирования субстрат-индуцированного в активном центре своей области протеазы 17-20, и HtrA2 также может быть модулирован за счет взаимодействия между сериновых протеаз и PDZ доменами , который подавляет активность протеазы 21. Интересно отметить , что домен PDZ как представляется , не придавать подобное регулирование к HtrA3 16. Протеазы HtrA также можно регулировать с помощью внешних факторов: это было недавно показано , что существует регулирующую взаимодействие между HTRA1 и протопорфиринов 22 и HtrA2 может регулироваться с помощью фосфорилирования при активации р38 МАР - киназыпуть в PINK1-зависимым способом 23. Удаление отдельных членов семьи HtrA у мышей было документально подтверждено, однако механистические эффекты в основном остаются неясными отчасти из-за отсутствия видимых фенотипов.
HTRA1 играет важную роль в контроле качества белка и его misregulation или мутация была связана со многими различными заболеваниями человека , включая артрит, рак и повышенным риском 3,4,24-32 AMD. Потеря функции HtrA2 в нервных тканях было связано с PD фенотипов у людей и мышей, в то время как его потеря от не-нервных тканей приводит к ускоренному старению 33-37. HtrA3 дисрегуляция было связано с болезнями , включая преэклампсии и некоторых видов рака 38,39. Up-регулирование HtrA4 наблюдается в плаценте больных преэклампсией , но нокаутных мышей не обнаруживают явную фенотип 40,41. Отсутствие фенотипов наблюдается у некоторых мышей с былопостулируется результатом компенсации между членами семьи HtrA: считается , что оба HtrA4 и HTRA1 взаимодействуют с TGF-B семейства белков, что позволяет компенсации путем HTRA1 при удалении HtrA4 41. Точно так же, полагают , что , так как HTRA1 и HtrA3 имеют высокую степень гомологии доменов они могут иметь дополнительные функции , 42. Тем не менее, было высказано предположение , что HtrA белки могут иметь частично антагонистические роли, конкурируя регулировать общие цели 43.
Для дальнейшего изучения этих факторов риска были созданы три очеловеченные стук в линии мыши. В CfH TM1 (CFH * 9) jhoh и CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh, экзона 9 гена CFH заменяется экзоне 9 человеческого гомолога. CfH TM1 (CFH * 9) jhoh кодирует без заболевания , связанного тирозин остаток в положении 402, тогда как CfH ТМ2 (CFH * 9) jhoh несет Y402H, риск-ассоциированной SNP. ВARMS2 tm1jhoh человеческой последовательности ARMS2 была направлена на область вверх по течению от HTRA1. LoxP-фланкирован последовательность СТОП помещен выше последовательности гена , но ниже по потоку от включенного UbiC промотора , был вырезан путем скрещивания с мышами OzCre, которые выражают Cre рекомбиназу под контролем промотора Rosa26, как было описано выше 34. В дополнение к этим цепную в линиях, условных нокаута аллеля CfH и HTRA1 (CFH tm1jhoh и HTRA1 tm1jhoh), а также других известных членов семьи HtrA генерировались: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) и HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Нокауты зародышевой линии были созданы путем скрещивания мышей OzCre к животным спроектированных для фланкирования конкретных экзонов с LoxP сайтов, таким образом, что удаление вызывает смещение кадра и / или удаление активного домена (CFH; экзона 3, HTRA1; экзоны 2-3, HtrA2: экзоны 2-4, HtrA3; экзон 3, HtrA4; экзоны 4-6) 34,41. Нейронные удаление HtrA2, удаленные с помощью Cre рекомбиназу под контролем промотора Nestin (HtrA2 Flox; Tg (NES-CRE) 1Kln / J), также был описан 34. Только мыши, лишенные HtrA2, либо системно, либо в нервных тканях, отображаются четкие фенотипы, представляя с паркинсонизмом фенотипов.
Поскольку некоторые из этих генов интерес положенное быть локализованы в митохондриях 11,44-47 и удаление HtrA2 генерируется Parkinsonian фенотипы, режим фенотипирования с митохондриальной и неврологического фокус описан здесь и репрезентативные результаты испытаний , представляющих интерес предоставляются , Для того чтобы исследовать методом генной инженерии мышей, полученные для исследования человека, связанные с возрастом заболевания тщательно и систематически был создан первоначальный график фенотипирования, состоящий из серии испытаний, связанных с двумя основнымизаболевания интерес: AMD и Паркинсона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: Исследования с участием животных были проведены в соответствии с национальными институтами рекомендаций здравоохранения в Руководстве для использования Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных и Уходу за животными и (IACUC) в Йельском университете.
1. Поведенческий тест генномодифицированных мышей
Примечание: Все мыши должны быть подвергнуты той же схеме тестирования, чтобы ограничить различия в привыканием к обработке. Тесты должны выполняться в то же время суток каждый раз.
- Новорожденных Hind Лимб Тест
Примечание: Тест задних конечностей проводится ежедневно с постнатальный день (P) 4 к P10 для оценки проксимального задних конечностей силы мышц, слабость и усталость.- Транспорт мышей к тестированию области и позволяют отдыхать в течение 30 минут перед испытанием.
- Подготовка опытного устройства путем очистки 50 мл коническую трубку с 70% -ным этанолом, толкая два (P4-P8) или один (Р9-Р10) ватные шарики в нижней части ТUbe и закрепление в вертикальном положении.
- Удалите один детеныша из клетки и записывать вес. Держите щенка в проведении лоток на тепловой площадку всякий раз, когда не испытывая.
- Осторожно приостановить задних конечностей новорожденному через край конической трубки, таким образом, чтобы она была обращена вниз в направлении ватные шарики. Подсчитайте количество выдвижных попыток и измерить задержки падения с помощью секундомера.
- Повторите еще раз, а затем пометить детеныша с маркером. Затем определить P6 щенков от носка вырезку. Руб щенков аккуратно с подстилкой из домашней клетки перед заменой.
- Протрите коническую трубку с 70% этанола.
- Повторите тестирование на следующей щенком, пока весь мусор не был проверен.
- Утилизировать ватным тампоном и коническую трубку. Промывайте все оборудование с 70% этанола.
- Тест по наблюдению сосущих
Примечание: Тест наблюдения вводится ребенок, недавно отнятый от груди ежедневно с P19 до P21, чтобы выиграть уровни движения и общей активности.- Транспорт мышей к тестированию учаСткае позволяют отдыхать в течение 30 минут перед испытанием.
- Подготовка тестирования окно Plexiglas помеченный 6x6 сеткой 2 дюйма квадратов на основании путем очистки с 70% -ным этанолом. Настройка видеооборудования в сторону таким образом, что вся коробка находится в поле зрения. Держите установить и окрестности тот же каждый день, чтобы избежать введения новизны.
- Удалите один сосущих из клетки и поместить в чистую чашку холдинга. Запись веса.
- Начните видеозапись, снимая удостоверение личности теста, с идентификационным номером мыши, возраст и дата испытания. Перенесите мышь от проведения чашку к центральной площади. Время в течение трех минут, подсчета количества линий, пересекаемых обеими передними лапами мыши во время испытания.
- Возвращение мыши в чистую клетку и окончания записи видео.
- Для очистки устройства тестирования с 70% этанола.
- Повторяйте, пока все мусор не тестируется, а затем вернуть все щенков в домашней клетке.
- Промывайте все оборудование для испытаний с 70% этанола.
- Проволочная сетка Возьмитесь испытание на прочность
Примечание: испытание на прочность сцепления проводится через день между P22 и P26, для оценки нервно-мышечную силу.- Транспорт мышей к тестированию области и позволяют отдыхать в домашней клетке в течение 30 мин перед испытанием.
- Подготовьте устройство путем очистки коробки и защитной сетки из плексигласа с 70% этанола. Поместите пузырчатую пленку в нижней части окна и накрыть бумагой.
- Отдельные мышей на группы по три, размещение в отдельных чашках холдинга.
- Поместите первую мышь на центр проволочной сетки и медленно инвертировать 10-20 см над мягкой поверхностью в нижней части коробки плексигласа. Измерьте задержку падения с помощью секундомера. Прекратить тестирование после 60 секунд прошло, если мышь непадать.
- Возвращение мыши проведение чашку, салфетку сетка с 70% этанола и заменить бумагу над пузырчатую пленку. Провести тест на оставшихся двух мышей в группе, прежде чем вернуться к первому. Повторите до тех пор, пока каждая мышь была протестирована в общей сложности три раза.
- Возвращение группы в чистую клетку и продолжить с остальными группами. Если имеется меньше трех мышей в любой группе, убедитесь, что в 5 мин между пробный интервал восстановления допускается.
- Возвращение всех мышей в домашней клетке, утилизации бумаги и чистого оборудования тестирования с 70% этанола.
2. Исследование структуры Ретинального
- Анестезировать животными в P30-35 путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Оценка глубины анестезии, зажимая подушечку и исходить только при отсутствии ответа, в соответствии с руководящими принципами IACUC. Заливать с 4% PFA / PBS 48.
- Чтобы удалить глаза, очищают кожу на надрез сит.е с 70% -ным этанолом, перед нарезкой через кожу у основания черепа. Отогните кожи подвергать черепа и чистой с 70% этанола. Использование чистых инструментов, тщательно вырезать через череп, чтобы достигнуть глазницы и подвергать глаза. Sever зрительного нерва, осторожно удалить глаз из гнезда и промыть в PBS.
- Закрепить глаза в 4% PFA / PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите глаза в небольшую чашку Петри, содержащую PBS. Сделайте небольшой надрез в центре роговицы с помощью ножниц удаления стежка. Удалить роговицу разрезанием кромка между роговицей и склерой. Используйте пинцет, чтобы удалить диафрагму. И, наконец, слезть ПЭС слои, оставляя нетронутыми сетчатки глаза и объектив на месте.
Примечание: 4% PFA / PBS, фиксация вызовет RPE отряду что позволяет ПЭС быть легко отделен от внешней поверхности сетчатки. - Повторное исправление в 4% PFA / 30% сахарозы / PBS в течение 15 мин при комнатной температуре перед возвратом в глаза в чашку Петри, содержащую PBS. Вытяните Lenс с помощью пинцета, в результате чего стекловидное тело вместе с ним.
- Cryoprotect в 30% сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Coat глаза в оптимальном температуры резания соединения (ОКТ) и передачи вложению формы, содержащей свежий OCT. Сориентируйте глаз таким образом, что в сагиттальной плоскости параллельна режущей поверхности, используя в качестве несколько движений, как это возможно, и избежать введения пузырьков воздуха. Флэш-замораживание путем погружения формы в бане сухой лед / этанол. Хранить блоки при -80 ° С.
- Использование криостат, сократить 20 мкм сагиттальных срезов и собирать на предварительно очищенные горками.
- Пятно разделы гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными протоколами 49. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для светлого поля микроскопии.
3. Гистохимическая Окрашивание
- Базовые приготовления
- Эвтаназии животных в P30-35 используя изофлуран передозировку (30% в пропиленгликоле) с помощью открытой капли ингаляции. Оценка эвтаназию прекращениемдыхания, сердцебиение и отсутствие реакции на ущемление подушечку. Подтверждение смерти путем смещения шейных позвонков и удаление органов, в соответствии с руководящими принципами IACUC.
- Для того, чтобы извлечь мозг, очищать кожу в месте разреза с 70% -ным этанолом, перед нарезкой через кожу у основания черепа. Отогните кожи подвергать черепа и чистой с 70% этанола. Использование чистых инструментов, тщательно вырезать через череп и удалить подвергать мозг. Удалите мембраны, и осторожно извлечь мозг из полости черепа. Полоскание в PBS.
- Coat мозг в ОСТ и переход к вложению формы, содержащей свежий ОКТ. Сориентируйте мозг таким образом, что в сагиттальной плоскости параллельна режущей поверхности, используя в качестве несколько движений, как это возможно, и избежать введения пузырьков воздуха. Флэш-замораживание путем погружения формы в сухом бане со льдом / этанол и хранят при -80 ° С.
- Использование криостат, вырезать 10 мкм сагиттальных срезов и собирать на предварительно очищенные горками.
<литий> НАДН Диафораза Окрашивание - Приготовьте 0,05 М Трис-буфера, рН 7,6 путем растворения 5,72 г Трис-HCl и 1,66 г трис-основания в 1 л деионизованной воды. Хранить при температуре 4 ° С в течение до шести недель.
- Приготовьте раствор NADH (2,25 мМ NADH в 0,05 М Трис-буфера). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- Приготовьте раствор NBT (2,5 мМ Нитро-тетразолия в 0,05 М Трис-буфера). Хранить при температуре 4 ° С в течение шести недель в стеклянной бутылке.
- Комбинат равные объемы раствора NADH и раствора NBT сделать окрашивание раствора и добавляют 1 мл для каждого слайда. Инкубируют при 37 ° С в увлажненной камере в течение 30 мин.
- Красящий раствор Аспирируйте и мыть три раза с дН 2 O.
- Промыть три раза каждый по восходящей и нисходящей концентрации ацетона / дН 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Промыть три раза в дН 2 O и смонтировать разделы с водной средой. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для яркого FIELD микроскопия. Синий окрашивание соответствует ферментативной активности.
- Сукцинатдегидрогеназу гистохимическим окрашиванием
- Приготовьте 0,2 М одноосновного фосфата натри / дН 2 O и 0,2 М двухосновного фосфата натрия / дН 2 O.
- Сделать 0,2 М фосфатный буфер, рН 7,6, комбинируя 3 части одноосновного фосфата с двухосновной фосфат 20 частей натрия.
- Приготовьте окрашивание раствора (0,1 М сукцинат натрия, 1,25 М NBT в 0,2 М фосфатном буфере) и добавляют 1 мл для каждого слайда. Инкубируют при 37 ° С в увлажненной камере в течение 60 мин.
- Красящий раствор Аспирируйте и мыть три раза в дН 2 O.
- Промыть три раза каждый по восходящей и нисходящей концентрации ацетона / дН 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Промыть три раза в дН 2 O и смонтировать разделы с водной средой. Изображение с помощью светового микроскопа, оборудованного для светлого поля микроскопии. Синий окрашивание соответствует ENzymatic активность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе описываются примеры результатов, получаемых с помощью этих методов. В тесте задних конечностей, число попыток тянуть и сделал латентность падать суммируются в течение двух последовательных тестов на каждый день. Этот тест может быть использован для сравнения генетически различных групп , чтобы отличить мышей с пониженной нервно - мышечной силы HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) мышей на рисунке 1А. - В не демонстрируют никаких изменений в количестве и тяг задержки падать с P4-6 с последующим снижением в нервно-мышечной силы в P7-10, по сравнению с однопометные (HtrA2 WT). Ожидаемое повышение прочности с возрастом наблюдается также у животных дикого типа. Для испытания на смотровую отъемышей, общая активность может быть оценена путем суммирования всех событий (линии пройденного, выращивание и ухаживание события), в среднем по три последовательных дней тестирования. В качестве альтернативы, каждый конкретный тип события может быть individuallу проанализированы. Здесь репрезентативные результаты представлены, демонстрируя пониженную активность HtrA2 мышей KO по сравнению с WT однопометные. Эти данные свидетельствуют о том, что общая активность может быть количественно измерена и сравнивали между группами (фиг.1С). Кроме того, можно дать количественную оценку различий в силе захвата путем вычисления ежедневно в среднем от трех повторах, выполненных на каждом тестирования день. Когда мышей HtrA2 KO сравнивают с контрольными однопометница, снижение прочности проявляется в более короткой задержки падения (рис 1D).
H & E окрашивание сетчатки генерирует изображения , в которых структура сетчатки глаза могут быть рассмотрены и сопоставлены (Рисунок 2). Слои типов клеток, которые составляют сетчатку четко разграничены позволяет проводить сравнения между генетическими группами. Здесь HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh мышей не обнаруживают никаких изменений в структуре сетчатки глаза, по сравнению с HtrA2
Рисунок 1:. Поведенческие Фенотипирование генетически сконструированных мышей HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 КО) мышей подвергали описанным поведенческим тестированием и по сравнению с диким типом (WT) HtrA2 управления однопометница. (A - B) Испытание задней подвески конечности выполнена на WT и KO новорожденных от P4-P10 и демонстрирует снижение нервно - мышечнойСила в KO животных (WT: п = 28, KO: п = 19). (A) KO щенками изначально сделать такое же количество попыток тянуть как WT братьев и сестер, но показывают уменьшение попыток , сделанных в более поздние моменты времени. Задержка (B) KO новорожденные 'падать также изначально нормальным , но уменьшается от Р7 года. (C) оценка общей активности наблюдения был снижен ребенок , недавно отнятый от груди в KO животных по сравнению с WT однопометные, в соответствии с пониженной активностью этих мышей (WT: п = 19, КО: п = 12). (D) KO животные также имели сокращение времени ожидания , чтобы упасть во время испытания инверсии сетки, демонстрируя снижение силы хвата мышей HtrA2 KO (WT: п = 17, КО: п = 9). Данные представляют собой среднее ± SEM (# 0,1 <р <0,05, * р <0,05, ** р <0,001, *** р <0,001 независимыми т-тестов). Эта цифра была изменена с Паттерсон и др. 34 Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.
Рис . 2: Н & Е окрашивание сетчатки окрашивания срезов сетчатки гематоксилином и эозином позволяет исследовать структуры, разграничением слоев сетчатки. Здесь участки от P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (А) и HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) дисплей нормальная структура сетчатки глаза. ПЭС: пигментный эпителий сетчатки глаза, ОС: наружные сегменты, IS: внутренние сегменты, ОНЛ: наружный ядерный слой, OPL: наружный сетчатый слой, INL: внутренний ядерный слой, IPL: внутренний слой сетчатого, GCL; слой клеток нервного узла. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 3: респираторный комплекс активность Гистохимическая окрашивание NADH диафоразы (комплекс I) и сукцинатдегидрогеназы (комплекса II) активности проводили на поперечных срезах мозга P25 HtrA2 Flox / Flox; Tg (Нес-CRE) 1Kln / J (НЭСКО) и HtrA2 + / Flox; Tg (Нес-CRE) 1Kln / J (NesWT) однопометники. Активность фермента диафораза NADH снижается в мозжечке (Crbl, B) и стриатуме (D) НЭСКО мозга по сравнению с NesWT управления (A, C), но не в коре головного мозга (Е - F). Активность СЦИ подобным же образом уменьшается в мозжечке и стриатуме НЭСКО мышей (H, J) , по сравнению с контрольной NesWT (G, I) , но нет никаких изменений в коре головного мозга (K - L). Шкала бар = 200 мкм. Этацифра была изменена с Паттерсона и др. 34 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Надежные процедуры необходимы, чтобы ограничить влияние изнурительных условий, связанных с старения человека, но они остаются неуловимыми для многих условий. Для того, чтобы определить потенциальные терапевтические цели и разработать стратегии вмешательства, причины и патология заболеваний, связанных со старением необходимо сначала понять. Не все генетически модифицированные мыши сразу присутствующие с четкими фенотипами, которые связаны с заболеванием интереса, даже если эти гены ранее были связаны с состоянием в исследованиях на людях. Поэтому более систематические исследования необходимы и генетически модифицированные мыши, должны быть подвергнуты соответствующих экспериментов с целью выявления фенотипов, которые могут быть связаны с заболеваниями, связанными в организме человека.
Myriad поведенческие тесты существуют для анализа неврологическую функцию у мышей 50,51. Поведенческие тесты, описанные здесь, подходят к гипотезам фенотипов на основе человеческих выводов и фактических фенотипов OBSErved у мышей. Кроме того, эти тесты просты для выполнения в лабораториях с небольшим или даже без опыта в проведении поведенческих экспериментов. Там не требуется для сложного оборудования, но результаты являются значимыми и информативными при правильном собраны, что делает их полезными в качестве первого шага в изучении фенотип генетически модифицированных мышей, которые, как ожидается, имеют нервно-мышечных дефектов. Полученные данные могут быть использованы, чтобы направить фокус дальнейшего тестирования, потенциально более сложные устройства для тестирования.
Кроме того , многие методы существуют для оценки дыхательной функции в тканях 52. Измерение скорости синтеза АТФ, потребление кислорода или изменения в митохондриальной мембранного потенциала являются важными показания митохондриальной функции , но они могут быть сложным и отнимает много времени для выполнения, требующих специфических реагентов и оборудования 52-55. Кроме того, они часто ограничены уровнем mitochondРион или клетка, опираясь на культивируемые клетки, лизатов или изолированных митохондрий. Гистохимическая окрашивание является полезным первым шагом в определении дисфункцию митохондрий без больших затрат времени и ресурсов. Кроме того, способность окрашивать срезы ткани поддается быстрой идентификации региональных различий, которые могут быть не столь очевидными с другими методами, например, площадь-специфическая потеря ферментативной окрашивания, наблюдаемого в HtrA2-дефицитных мозга. В то время как метод ограничен в своей способности измерить кратные изменения в дыхательной способности, она намечает определенные участки мозга, которые затем могут быть преследуемых с использованием более сложных методов.
В то время как методы, представленные в рамках этого графика фенотипирования просты проводить, выполняя определенные шаги должным образом имеет решающее значение для успеха экспериментов. Для поведенческого фенотипа, большое внимание должно быть приняты для обеспечения испытаний выполняются в то же время и в том же месте, каждый день, чтобы ограничить вариации интрообразуемых новизной местоположения или различием в циркадного ритма. Оборудование должно быть организовано таким же образом, каждый день по тем же причинам. Организация комната имеет особенно важное значение для проверки активности, где небольшие изменения в новизне может значительно влиять на активность мыши. При измерении силы сцепления, исследователи должны убедиться, что мыши имеют надлежащее удержание сетки до инверсии. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность, чтобы должным образом приостановить щенка перед выпуском в тесте задних конечностей или результатов испытаний будет перекос в сторону более короткой задержкой падать.
Для фенотипирования ткани, получение хороших участков имеет жизненно важное значение. Познавательная окрашивание сетчатки зависит от эффективной фиксации перед тем рассечение или артефакты будут возникать во время секционирования и рассечения и искажают морфологии. Гистохимическая окрашивание требует мозги должны быть заморожены быстро после вскрытия, чтобы сохранить функцию фермента, но время инкубации аналогично Criticaл; небольшие колебания температуры или в продолжительности времени может вызвать различия в интенсивности окрашивания. Там, где это возможно, образцы должны быть обработаны в то же время, чтобы провести сравнение между группами.
Здесь режим тестирования используется для изучения генетически модифицированных мышей, как ожидается, отображать тонкие фенотипы, связанные с возрастными заболеваниями, а именно AMD и PD, описан. Этот график Фенотипирование может быть использован для выявления дефицитов в нервно-мышечной силы и активности, а также для выявления структурных и функциональных дефектов в тканях, представляющих интерес. Этот график предусматривает систематический анализ ранних фенотипов у молодых, генетически измененных мышей. В будущем этот метод может быть применен к любой генетически модифицированных мышей, как ожидается, представит с фенотипа AMD или PD связаны между собой, а также тех, неизвестной этиологии, которые появляются явно нормально. Простота испытаний позволяет производить тестирование без значительных затрат, но может быть использован для получения данных для Studies. Объединив тестирования поведения с клеточного фенотипа, можно ограничить число мышей, используемых и непосредственно сравнить животных производительность с физиологическим состоянием. Этот график Фенотипирование обеспечивает первоначальный анализ, который может быть использован, чтобы направить фокус последующих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансирование этого исследования пришли из Rosebay Фонда медицинского и исследовательского фонда Йельского медицинской школе Дина (JH). Мы благодарим доктора Клэр Koenig за помощь в поведенческих экспериментах. Генно-инженерных мышей линий были получены в Ozgene (Перт, Австралия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
