Summary
Möss producerar en komplex multisyllabisk repertoar av ultraljudsvokaliseringar (USV). Dessa USVs används ofta som readouts för neuropsykiatriska störningar. Detta protokoll beskriver några av de metoder vi lärde oss och utvecklade för att konsekvent inducera, samla in och analysera de akustiska funktionerna och syntaxen hos muslåtar.
Abstract
Möss producerar ultraljud vocalizations (USV) i en mängd olika sociala sammanhang under utveckling och vuxen ålder. Dessa USVs används för morpopulation 1 , ungdomsinteraktioner 2 , motsatta och samma könsinteraktioner 3 , 4 , 5 och territoriella interaktioner 6 . Under årtionden har amerikanerna använts av utredare som proxies för att studera neuropsykiatriska och utvecklings- eller beteendestörningar 7 , 8 , 9 och mer nyligen för att förstå mekanismer och utveckling av vokalkommunikation bland ryggradsdjur 10 . Inom de sexuella interaktionerna producerar vuxna manliga möss USV-låtar, som har vissa funktioner som liknar låtfåglar 11 . Användningen av en sådan multisyllabisk reperToires kan öka den potentiella flexibiliteten och informationen de bär, eftersom de kan varieras i hur element organiseras och rekombineras, nämligen syntax. I detta protokoll beskrivs en tillförlitlig metod för att framkalla USV-sånger från manliga möss i olika sociala sammanhang, såsom exponering för fräsch kvinnlig urin, bedövade djur och estrushunner. Detta inkluderar villkor för att inducera en stor mängd stavelser från mössen. Vi minskar inspelningen av omgivande ljud med billiga ljudkammare och presenterar en kvantifieringsmetod för att automatiskt detektera, klassificera och analysera USV. Den senare innefattar utvärdering av samtal, vokalrepertoar, akustiska parametrar och syntax. Olika sätt och insikter på att använda uppspelningar för att studera ett djurs preferens för specifika sångtyper beskrivs. Dessa metoder användes för att beskriva akustiska och syntaxförändringar över olika sammanhang hos hanmöss och låtpreferenser hos kvinnliga möss.
Introduction
I förhållande till människor producerar möss både låg- och högfrekvensvokaliseringar, de senare kallas ultraljudsvokaliseringar (USVs) ovanför vårt hörselområde. USV: erna produceras i en mängd olika sammanhang, däribland från mor-pup-hämtning, ungdomsinteraktioner, mot vuxna interaktioner eller motsatta könsrelaterade interaktioner 4 , 12 . Dessa USVs består av en mångsidig multisyllabisk repertoar som kan kategoriseras manuellt 9 eller automatiskt 10 , 11 . Dessa USV: s roll i kommunikationen har varit under ökad utredning de senaste åren. Dessa inkluderar att använda USVs som utläsningar av musmodeller av neuropsykiatriska, utvecklings- eller beteendestörningar 7 , 8 och interna motivations- / emotionella tillstånd 13 . USVs menas att förmedla tillförlitlig information på eMitters tillstånd som är användbart för mottagaren 14 , 15 .
Under 2005, Heliga och Guo 11 , avancerade tanken att vuxna manliga möss USVs organiserades som en följd av multisyllabiska samtalselement eller stavelser som liknar sångfåglar. I många arter tillåter en multisyllabisk repertoar emitteren att kombinera och beställa stavelser på olika sätt för att öka den potentiella informationen som bärs av låten. Variation i denna syntax antas ha en etologisk relevans för sexuellt beteende och kompispreferenser 16 , 17 . Efterföljande studier visade att manliga möss kunde ändra den relativa sammansättningen av stavelsetyper de producerar före, under och efter närvaron av en kvinna 5 , 18 . Det vill säga, de vuxna hanmöserna använder sina USVs för domstolsbeteende, antingen för att locka till sigEller upprätthålla nära kontakt med en kvinna eller för att underlätta parningen 19 , 20 , 21 . De emitteras också i man-man-interaktioner, förmodligen förmedla social information under interaktioner 4 . För att fånga dessa förändringar i repertoarer mäter vetenskapsmän vanligtvis spektralfunktionerna (akustiska parametrar, såsom amplitud, frekvenser etc. ), antal USVs stavelser eller samtal och latens till första USV. Men få ser faktiskt på sekvensdynamiken hos dessa USVs i detalj 22 . Nyligen har vår grupp utvecklat en ny metod för att mäta dynamiska förändringar i USV-stavelsekvenserna 23 . Vi visade att stavelsesordningen i en sång om (nämligen syntax) inte är slumpmässig, att den ändras beroende på det sociala sammanhanget och att de lyssnade djuren upptäcker dessa förändringar som etologiskt relevanta.
Vi noterar thHos många utredare som studerar djurkommunikation bifogar inte termen "syntax" samma exakta mening som syntax som används i mänskligt tal. För djurkommunikationsstudier menar vi helt enkelt en ordnad, icke-slumpmässig, ljudsekvens med vissa regler. För människor är dessutom specifika sekvenser kända att ha specifika betydelser. Vi vet inte om det här är fallet för möss.
I det här dokumentet och tillhörande video strävar vi efter att tillhandahålla tillförlitliga protokoll för att spela in manliga mössens USV-förhör i olika sammanhang och utföra uppspelningar. Användningen av tre sekventiellt använda programvara för: 1) automatiska inspelningar; 2) stavelse detektering och kodning; Och 3) en djupgående analys av stavelsegenskaper och syntax visas ( Figur 1 ). Detta gör det möjligt för oss att lära oss mer om manliga möss USV struktur och funktion. Vi tror att sådana metoder underlättar dataanalyser och kan öppna nya horisonter för att karakterisera normal och onormal vokal kommunikation i mouSe modeller av kommunikations- och neuropsykiatriska störningar.
Protocol
Etikutlåtande: Alla försöksprotokoll godkändes av Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) enligt protokollet # A095-14-04. Obs! Se Tabell 1 i avsnittet " Material och utrustning " för detaljer om programvara som används.
1. Stimulera och spela in mus USVs
- Förberedelse av männen före inspelningssessionerna
OBS: De representativa resultaten erhölls med användning av B6D2F1 / J unga vuxna hanmus (7-8 veckor gamla). Detta protokoll kan anpassas för varje belastning.- Ange djurrummets ljuscykel på en 12-timmars ljus / mörk cykel, om inte annat krävs. Följ standardhusreglerna från 4 till 5 män per bur om inget annat krävs eller behövs. Tre dagar före inspelningen exponerar hanar individuellt för en sexuellt mogen och mottaglig kvinna (upp till 3 män med en kvinna per bur) av samma stam över natten.
- Nästa dag ta bortKvinnan från manens bur och hyr männen utan kvinnorna i minst två dagar före den första inspelningssessionen för att öka den sociala motivationen att sjunga (baserat på våra test- och felanekdotiska analyser).
- Förberedelse av inspelningsboxarna
- Använd en strandkylare (inre dimensioner är L 27 x W 23 x H 47 cm) för att fungera som ljuddämpningsboxstudio ( Figur 2A ). Borra ett litet hål ovanpå lådan för att låta mikrofonens tråd tränga in.
OBS! Att registrera djuren i en ljuddämpad och visuellt isolerad miljö är att föredra, för att spela in dussintals möss samtidigt utan att de hör eller ser varandra, förhindra att man registrerar förorenande rumsutrustningsbuller och personer i rummet och för att få ren Ljudinspelningar av mössen ( figur 2B ). Vi har inte noterat ljud echos eller snedvridningar till ljudet när vi jämför vibrationer av samma mus inuti mot utsidan av tHan låter dämpningskammaren ( figur 2C ); Hellre, där kan ljuden bli högre och få färre övertoner inuti kammaren. - Anslut mikrofonen till ledningen, kabeln till ljudkortet och ljudkortet till datorn för att arbeta med en ljudinspelningsprogramvara ( t.ex. Programvara A i Figur 1 och Tabell 1 ). En tillräcklig ljudinspelning är nödvändig, till exempel programvara A som genererar .wav ljudfiler.
- Placera en tom bur (58 x 33 x 40 cm) inuti den ljudisolerade lådan och justera mikrofonens höjd så att mikrofonens membran är 35 - 40 cm över botten av buren och att mikrofonen är centrerad ovanför buret ( Se figur 2A ).
- Använd en strandkylare (inre dimensioner är L 27 x W 23 x H 47 cm) för att fungera som ljuddämpningsboxstudio ( Figur 2A ). Borra ett litet hål ovanpå lådan för att låta mikrofonens tråd tränga in.
- Konfiguration av inspelningsprogram A ( tabell 1 ) för kontinuerlig inspelning
- Dubbelklicka och öppna programvara A. Klicka och öppna menyn "konfiguration" och välj Enhet som heter, Samplingsfrekvens (250 000 Hz), Format (16 bitar).
- Välj tangenten "Trigger" och välj "Växla".
OBS! Med denna inställning kan du starta inspelningen genom att trycka på en knapp (F1, F2, etc. ) medan du placerar stimulansen i musens bur. - Ange musens ID under parametern "Namn".
- Ställ in den maximala filstorleken till önskat registreringsminne (vi brukar ställa in till 5 min).
OBS: Ju längre minuter som krävs, behövs det större mängd datalagringsminne. Om kontinuerligt läge inte är inställt, skärs programvaran av låtspel i början eller slutet av en sekvens baserat på inställda parametrar, och därför kan man inte på ett tillförlitligt sätt kvantifiera sekvenser.
- Spela in USVs med hjälp av olika stimuli. Obs! Varje stimulans kan användas oberoende av användarens experimentella behov.
- Lyft försiktigt djuret som ska registreras av svansen och lägg det i en bur utan sängkläder (för att förhindra rörelseEmentbrus på sängkläderna) inuti den ljudisolerade lådan, och placera buret med öppet metalltråd på toppen av det med locket uppåt.
- Stäng ljuddämpad låda och låt djuret habituera till det i 15 minuter. Utför stimuliberedningen (1.4) just nu.
- Stimuliberedning
- Framställning av friska urinprover (UR) som en stimulans
- Hämta urinprover högst 5 minuter före inspelningssessionen för att säkerställa maximal effekt vid inducering av sång från männen. OBS! Urin som har suttit längre och speciellt för timmar eller över natten är inte lika effektiv 24 , 25 , vilket vi har empiriskt verifierat 23 .
- Välj en kvinna eller en man (beroende på kön av stimulansen som ska användas) i ett bur, ta tag i huden bakom nacken och håll djuret i ena handen som för ett läkemedelsinjektionsförfarande med den exponerade magen.
- Välj sedan en annan bur. Och upprepa samma procedur med en annan kvinna eller man, men med samma bomullsspets som tidigare använts.
ANMÄRKNING: Denna procedur är säker på att blanda urinen med minst två kvinnor eller män från två oberoende burar på samma bomullsspets för att säkerställa mot östro eller andra individuella effekter, eftersom det är känt att estruscykeln kan påverka sångbeteendet 18 , 26 . - Placera bomullsspetsen som ska användas i en ren glas eller plast petriskål.
OBS! Eftersom bomullspetsen med urin kommer att behöva användas inom de närmaste 5 minuterna, behöver du inte täcka den för att förhindra avdunstning.
- PreparatiPå stimulans för levande kvinnlig (FE) stimulans
- Välj en eller två nya burar av sexuellt mogna honor. Identifiera kvinnor i pro-estrus eller estrus-scenen genom visuell inspektion (bred vaginaöppning och rosa omgivning som visas i 27 , 28 ). Separera dem i en annan bur tills användning.
- Förberedelse av de bedövade djuren honor (AF) eller män (AM) som en stimulans
- För AF, välj en kvinna från poolen ovan (antingen i pro-estrus eller estrus). För AM, välj en man från en bur av vuxna manliga möss.
- Bedöva hon eller man med en intraperitoneal injektion av en lösning av ketamin / xylazin (100 respektive 10 mg / kg).
- Använd ögonsalva för att förhindra uttorkning av ögonen medan djuret är bedövat. Kontrollera ordentlig anestesi genom att testa retraktionsreflexen när den kläms fast. Placera det bedövade djuret i en ren bur på en pappershandduk, vitH buret på värmepuden ställs på "minsta värme" för att säkerställa kontroll av kroppstemperaturen.
- Använd samma djur upp till 2 till 3 gånger för olika inspelningar om det behövs innan de vaknar (vanligtvis ca 45 min). Sätt tillbaka dem på värmepuden efter varje inspelningssession.
- Kontrollera andningsfrekvensen genom visuell inspektion (~ 60 - 80 andetag per minut) och kroppstemperatur genom att röra djuret var 5: e minut (var varmt att röra vid).
- När du är redo att spela in, klicka på "Spela in" -knappen på programvara A.
OBS: Inspelningarna startar inte om inte användaren klickar på knappen som är associerad med varje kanal. Övervaka levande ljudmatning från burarna på datorskärmen för att försäkra dig om att djuren sjunger och inspelningarna på rätt sätt erhålls. - Tryck samtidigt på den associerade knappknappen för önskad låda (er) som ska spelas in ( dvs F1 för ruta 1) och introducera önskad stimulans.
- Presentera en av stimuli enligt följande. Placera bomullsspetsen med färska urinprover inuti buret eller placera den levande kvinnan inuti buret eller placera ett av de bedövade djuren (AF eller AM) ovanpå burets metalllock.
- Stäng lätt inspelningsboxen och låt inspelningen gå för det förinställda antalet minuter ( t ex 5 min enligt beskrivningen i avsnitt 1.3).
- Efter inspelning klickar du på den röda knappen för stopprutan för att stoppa inspelningen.
- Om ett bedövat djur användes som en stimulans, öppna den ljudisolerade inspelningsboxen, ta det bedövade djuret från burets metalllocket och sätt tillbaka det på värmepuden före nästa inspelningssession eller om inte längre använda djuret som en stimulanskontroll Det var 15: e minut tills det har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternal recumbency.
- Öppna buret och ta bort det medvetna testdjuret och placera det tillbaka till sin hembur. Rengör provburet med 70% alkohol aDestillerat vatten.
- Framställning av friska urinprover (UR) som en stimulans
2. Bearbetning av .wav-filer och uppladdningsbar kodning med hjälp av Mouse Song Analyzer v1.3
- Öppna kodningssoftware B ( Figur 1 , Tabell 1 ) och sätt mappen som innehåller programvaruskriptet C av "Mouse Song Analyzer" ( Figur 1 , Tabell 1 ) i programvarans B-sökväg genom att klicka på "Set path" och lägg till mappen på programvara B. Stäng sedan programvara B för att spara.
- Konfigurera de kombinerade programvaran B + Cs stavelsesidentifieringsinställningar. OBS! Programkodens C-kod skapar automatiskt en ny mapp som heter "sonogram" med filer i .sng-format i samma mapp där .wav-filerna finns. Det är vanligtvis bättre att sätta alla .wav-filer från samma inspelningssession som genereras med hjälp av programvara A i samma mapp.
- Öppna programvara B konfigurerad med C.
OBS! Den här versionen av programvara B är helt cOmpatibel med programvaruscript C. Det kan inte garanteras att några senare versioner accepterar alla funktioner som ingår i den aktuella koden. - Navigera till den mapp av intresse som innehåller inspelning .wav-filer som ska analyseras med hjälp av fönstret "Aktuell mapp".
- I kommandofönstret anger du kommandot "whis_gui".
- I det nya whis-gui-fönstret, observera flera delfönstersektioner med olika parametrar ( Figur 3 ), inklusive "Sonogram Parameters", "Whistle Options" och alla andra. Justera parametrarna för att upptäcka USVs. Använd följande parametervärden för att detektera USVs stavelser från laboratoriemus ( t.ex. B6D2F1 / J och C57BL / 6J musstammar som används i våra studier):
- I avsnittet Sonogramparametrar ställer du in minfrekvensen till 15.000 Hz, maxfrekvensen till 125.000 Hz, samplingsfrekvensen ( antal frekvenser ) tO 256 kHz och tröskeln till 0,3.
- I avsnittet Whistle Options, justera Renhetströskeln till 0.075, Min Stavelse av stavelsen till 3 ms, Minfrekvensen sopa till 20 000 Hz och Filterlängden till 3 ms.
- I de andra sektionerna, justera Min Notation Duration till 3 ms, och Min Note Count till 1.
- För stavelsekategoriseringsprotokoll , välj rutor i mellansektionen i whis_gui-fönstret:
Standardkategoriseringen är baserad på Holy and Guo 11 och Arriaga et al. 10 , som kodar stavelse med antalet stighopp och hoppens riktning: S för enkel kontinuerlig stavelse; D för en nedåtstigningshopp; U för en upphoppning hoppa; DD för två sekventiella hoppbackar; DU för en dowN och ett hopp Etc. Detta kommer att vara standard om användaren inte väljer något. Användaren har möjlighet att köra analysen på vissa stavelsetyper genom att välja vart och ett av de representativa rutorna.
Att välja stavelse kategorisering som beskrivs av Scattoni et al. 9 , dessutom välja Split s kategori, som skiljer denna typ i fler underkategorier baserat på stavform.
Välj Harmonics om användaren vill vidareforma stavelser till dem med och utan övertoner.
- Öppna programvara B konfigurerad med C.
- Klassificera stavelserna i .wav-filerna av intresse
- Välj alla .wav-filer från en inspelningssession i övre vänstra delen av whis_gui-fönstret.
- Klicka på "Få sonogram" mitt i whis_gui-fönstret ( Figur 3 ). En ny mapp som innehåller sonogrammen kommer att skapas med .sng filformat. Välj alla sonogrammen (.sng-filer) i övreVänstra hörnet av whis-gui-fönster. Ange "Animal ID" och "Session ID" i rutorna under sonogramfilfönstret. Klicka sedan på process sonogram.
- Observera tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (innehåller information om anteckningarna extraherade från stavelserna), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (innehåller värden för alla Klassificerade stavelser, inklusive deras spektrala egenskaper och det totala antalet stavelser som detekteras i sonogrammen), "Animal ID-Session ID-Traces.mat", (innehåller grafiska representationer av alla stavelser).
OBS! Filen "Animal ID-Session ID -Syllables" innehåller ibland en liten procent (2 - 16%) av oklassificerade USV-stavelser som är mer komplexa än de valda, eller som har två djurs stavelser överlappar varandra 23 . Dessa kan granskas separat från spårningsfilen om det behövs.
- Observera tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (innehåller information om anteckningarna extraherade från stavelserna), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (innehåller värden för alla Klassificerade stavelser, inklusive deras spektrala egenskaper och det totala antalet stavelser som detekteras i sonogrammen), "Animal ID-Session ID-Traces.mat", (innehåller grafiska representationer av alla stavelser).
3. Kvantifiering av Syllabla Akustisk Struktur och Syntax
OBS! Instruktioner för stegen att ta till för första syntaxanalyser ingår i "LÄS MIG!" Kalkylblad i filen "Song Analysis Guide v1.1.xlsx", vår anpassade kalkylarksberäknare E ( Figur 1 , Tabell 1 ).
- Öppna mjukvaruskriptet C-filutgång "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" som erhållits i avsnittet ovan med kalkylprogram D ( Figur 1 , Tabell 1 ). Den innehåller det totala antalet stavelser som upptäckts i alla sonogrammen och alla deras spektrala egenskaper.
- Om inte konverterad än, konvertera den här .csv-filen till kollapseparation i programvara D i kalkylarksprogrammet D för att lägga varje värde i enskilda kolumner.
- Öppna filen "Song Analysis Guide v1.1.xlsx" även i programvara D. Klicka sedan på thE mall kalkylblad och kopiera och klistra in filen "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" i det här arket enligt rekommendationerna i Mall-anvisningarna. Ta bort rader med kategorin "Oklassificerade" stavelser.
- Efter att ha tagit bort de "oklassificerade" raderna, först kopiera och räkna om ISI (intervall mellan stavelsintervall) i kolumn O i kolumn E. Därefter kopieras alla data från kolumn A till N till "Data" -kalkylbladet.
- I datakalkylbladet anger du djur-ID (kolumn AF) och inspelningslängd (i minuter, kolumn AC).
OBS! Djur-ID-erna måste matcha den som har angetts i inspelningsuppsättningen. Filen kommer att upptäcka de angivna tecknen och jämföra den med namnet på .wav-filerna. - Bestäm ISI cutoff för att definiera en sekvens med hjälp av kalkylbladet med etiketten "Density ISI", "ISI plot" -resultatet.
OBS! I vår tidigare studie 23 satte vi avklippningen på två ställenRd avvikelser från mitten av den sista toppen. Den bestod av långa intervall (LI) på mer än 250 ms, vilket skilde olika låtsträvningar i en sangsession. - Visa de viktigaste resultaten i kalkylbladet "Funktioner" (gruppering av alla spektralfunktioner uppmätta från varje djur).
OBS! Om användaren använde standardinställningen för stavningskategorin i mjukvaruscript C beskrivet i avsnitt 2.8.9, klassificeras stavelserna vidare i 4 kategorier som beskrivits ovan och i Chabout et al. 23 : 1) enkel stavelse utan några hoppa hopp, «s»; 2) två anteckningsstavlar separerade av ett enda uppåt («u») hoppa; 3) två noteringsstavlar separerade av ett enda nedåtgående hopp («d»); Och 4) mer komplexa stavelser med två eller flera tonhoppar mellan anteckningar («m»). - För syntax värden, klicka på "Global Probabilities" kalkylbladet som beräknar sannolikheter för varje par sYllable övergångstyper oavsett startstavler, med användning av följande ekvation 23 .
P (Förekomst av övergångstyp) = Totalt antal förekomster av övergångstyp / Totalt antal övergångar av alla typer - Klicka på "Villkorliga sannolikheter" kalkylblad för att beräkna de villkorliga sannolikheterna för varje övergångstyp i förhållande till startstavelser som använder följande ekvation:
P (förekomst av en övergångstyp som gav startstavelsen) = Totalt antal förekomster av övergångstyp / Totalt antal förekomster av alla övergångstyper med samma startstavstav - För att testa om och vilka av ovanstående övergångssannolikheter skiljer sig från icke-slumpmässiga, med användning av en första-ordning Markov-modell, följd av tillvägagångssättet i 23 , för att använda anpassad programvara F ( t.ex. Syntaxdekorator i R-studio; Figur 1 , <Strong> Tabell 1) med följande R-skript: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R för inom grupper under olika förhållanden; Eller Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R för mellan grupper under samma förutsättningar.
- Utför ett Chi-kvadrattest eller ett annat test av din preferens för att testa för statistiska skillnader i övergångssannolikheterna för samma djur i olika sammanhang (parvis), följt tillvägagångssättet i 23 .
OBS! Mer information om den statistiska modellen som används för att jämföra syntax bland grupper finns i 23 . Forskare kan använda andra metoder för att analysera de globala eller villkorliga övergångssannolikheter som de eller andra utvecklat. - För att grafiskt visa sekvenserna som syntaxdiagram, ange värdena i en nätverksgrafikprogramvara G (se Figur 1 , Tabell 1 ), med noder som anger olika stavelse cateGorier och pilfärg och / eller tjocklekspixel som representerar intervall av sannolikhetsvärden mellan stavelser.
ANMÄRKNING: För tydligheten visar vi för de globala sannolikhetsgraferna endast övergångar högre än 0,005 (högre än 0,5% av riskfel). För de villkorliga sannolikheterna använder vi ett tröskelvärde på 0,05 eftersom varje sannolikhet i den "globala modellen" är lägre med tanke på att vi delar upp med det totala antalet stavelser och inte bara av en viss stavelsestyp.
4. Sångredigerings- och testpreferens för en sorts typ
OBS! Uppspelningar av USV kan användas för att experimentellt testa ett djurs beteenderespons, inklusive preferens för en viss låttyp. Eftersom kvinnliga preferenser kan förändras beroende på estrus tillstånd, för kvinnor se till att de befinner sig i samma östra tillstånd innan de testas enligt följande:
- Förbered kvinnor med sexuell erfarenhet flera dagar före uppspelningsexperimentet
- Övervaka östruscykeln, och när pro-estrus eller estrus är uppenbart (vaginalöppning och rosa omgivning som visat i 27 ), sätta kvinnor tillbaka i sin egen bur. De är redo att provas nästa dag.
- Använd kopia och klistra in funktioner i en ljudbehandlingsprogram H ( t.ex. SASLap Pro; Figur 1 , Tabell 1 ) för att skapa två redigerade .wav-filer med de önskade villkoren som ska användas för stimuli. För att skydda mot antal vokaliseringar som en variabel, se till att de två ljudfilerna innehåller samma antal sYllables och längd av sekvenser (song bouts) från samma eller olika män / kvinnor från önskade sammanhang ( t.ex. UR).
- Öppna den första filen som innehåller låt från villkor 1 i programvara H. Gå sedan till Arkiv> Specialerbjudanden> Lägg till kanal (er) från fil och välj den andra ljudfilen som ska testas från villkor 2. Detta skapar 2 kanaler, en för varje skick.
- Justera volymen visuellt om det behövs för att se till att volymerna i de två filerna matchar varandra genom att gå till Redigera> Volym.
- Gå sedan till Redigera> Format> Samplingsfrekvensomvandling och välj konvertera från 250.000 Hz till 1.000.000 Hz för att omvandla .wav-filerna från en samplingsfrekvens på 256 kHz till 1 MHz. Detta steg är nödvändigt för att uppspelningsenheten ska kunna läsa .wav-filerna.
- Spara dessa nya filer som testfilerna som ska spelas upp. Se till att du identifierar vilken låt som finns i vilken kanal (1 eller 2). För tydlighetens ändamål namnge det "file name.wav".
- Gå till EXit> Format> Byt kanaler och byt de två kanalerna. Spara de bytte versionerna med ett annat namn. OBS: Detta kommer att vara motsatt kopia med kanalerna inverterade, namnet senare filnamn_swapped.wav.
- Rengör uppspelningsapparaten "Y-labyrint" med 70% alkohol följt av destillerat vatten. Torka det med pappershanddukar. Vår Y-labyrint är ett hemlagat, ogenomskinligt, svart svart plastapparat med armar på 30 cm och två borrade hål i labyrintens yttersta ändar för att låta ultraljudshögtalaren passa på våningsplanens nivå ( Figur 4A ).
- Kontrollera att högtalarna är i rätt position och ansluten till ljudkortet och kortet är anslutet till datorn.
- Öppna programvara A, välj Spela upp> Enhet och välj uppspelningsljudkortsenheten. Välj "använd filhuvudfrekvens". Gå till Play> Playlist och ladda filen av intresse som innehåller de två chaNnels ( dvs "file.wav"). Välj "loop-läge". Ställ in videobandspelaren ovanför labyrinten för att täcka hela labyrinten.
- Placera provkvinnan i labyrinten i en 10-minuters uppehållstid. Efter 10 minuter, om honan inte befinner sig i startarmen, tryck försiktigt honan tillbaka till startarmen och stäng plastskyddsfönstret.
- Välj den förberedda filen ("file.wav") för att spela upp och spela upp den. Starta videoinspelningen och se till att du identifierar vilken kanal som är placerad på vilken Y-labyrintens arm ( dvs : UR i vänster eller FE i höger arm) med en pappersnotering i videobildningsfältet.
- Låt kvinnan höra låtarna i loop-läge och utforska labyrinten under ett önskat antal minuter ( dvs 5 min): det här är en session. Återvänd honan tillbaka till startarmen. Låt henne vila i 1 minut när du förbereder nästa session. RemDet finns några urinspår och utmatning med destillerat vatten.
- Ladda filen "file_swapped.wav". Byt plats för pappersnoteringar för videoinspelningen. Flytta den vänstra till höger och vice versa. Efter 1 minut spelar du filen. Frigör kvinnan för den andra sessionen .
- Upprepa steg 4.4.3 till 4.4.4 för totalt 4 sessioner x 5 minuter för att kontrollera för att detektera potentiell sidprofil under testet. Stoppa videoinspelningen i slutet av alla sessioner genom att klicka på den röda stoppknappen. Rengör labyrinten med 70% alkohol och destillerat vatten mellan kvinnor.
- Upprepa alla steg med olika låtexemplar en vecka senare med samma honor för att få tillräckliga resultat för att testa pålitligheten av resultaten.
- Senare observera videon och använd timern på videon och en stoppur för att mäta den tid som kvinnorna spenderar i varje arm för varje session. Analysera den resulterande data statistiskt för möjliga låtinställningar.
Representative Results
I föreliggande protokoll karakteriserades förändringar i vokalbeteende och syntax av manliga B6D2F1 / J-möss. I allmänhet kunde vi med hjälp av detta protokoll i genomsnitt registrera 675 ± 98,5 klassificerade stavelser i genomsnitt per manlig per 5 minuters session som svar på kvinnlig UR, 615,6 ± 72 i FE, 450 ± 134 i AF, 75,6 ± 38,9 i AM och 0,2 ± 0,1 i manlig UR (n = 12 män). Priserna var ~ 130 stavelser / min för kvinnliga UR, ~ 120 stavelser / min för FE, eller ~ 100 stavelser / min för AF-kontekster ( Figur 5A ). Manspersoner producerar en mycket större mängd stavelser som svar på nyuppsamlad urin i förhållande till över natten samlad urin 10 , 23 . Män sjunger också betydligt mindre i närvaro av en bedövad manlig eller färsk manlig urin Figur 5A ). Manspersoner ändrar också sin repertoar över sammanhang 23 . Till exempel ökar B6D2F1 / J-män signifikant Produktion av multipel hoppa "m" kategorisymboler i kvinnlig urin tillstånd ( Figur 5B ). De ändrar också akustiska egenskaper hos enskilda stavelser över kontext. B6D2F1 / J-män sjunger exempelvis stavelser med högre amplitud och bandbredd i kvinnlig urinkontext och högre spektral renhet i det vakna kvinnliga sammanhanget jämfört med de andra ( Figur 6 ) 23 .
Detta protokoll tillhandahåller också ett sätt att mäta dynamiska funktioner i sekvensen och därmed syntaxändringar. Med användning av en anpassad metod från Ey et al. 22 använder vi ISI för att definiera luckorna mellan sekvenser ( Figur 7A ) 23 och använd sedan luckorna för att skilja och analysera temporala mönster av stavelsessekvenser. Vi visade längre sekvenslängder produceras i det vakna kvinnliga sammanhanget ( Figur 7B )F "> 23. Denna teknik tillåter oss att beräkna förhållandet mellan komplexa sekvenser (sammansatt av minst 2 förekomster av" m "stavelsestypen) i motsats till enkla sekvenser (sammansatt av en eller ingen" m "-typ och sålunda mestadels genom" S-typ). Vi fann att med B6D2F1 / J-män utlöste urinkontexten ett högre förhållande jämfört med de andra ( figur 7C ) 23 , vilket indikerar att de producerade mer komplexa stavelser i kvinnliga urinförhållanden, men också att sådana stavelser fördelas Över flera sekvenser.
Vi kan även beräkna de villkorliga övergångssannolikheterna från en stavelse typ till en annan (24 övergångstyp totalt inklusive övergångarna från och till "tystnad" -staten) 23 . Vi fann att i olika sammanhang skiljer sig musens val av övergångstyper för given startstavler, och att det finns flera syntax divErsättning i kvinnliga urinförhållanden ( Figur 8 ) 23 . Dessa observationer överensstämmer med tidigare rapporter som visar att män kan ändra akustiska egenskaper eller repertoarkomposition av deras vokaliseringar som svar på olika stimuli och erfarenheter 4 , 5 , 24 .
Slutligen ger föreliggande protokoll vägledning för att testa kvinnliga preferenser med uppspelningar. Vi fann att B6D2F1 / J-kvinnorna föredrar mer komplexa låtar (innehåller 2 eller flera "m" stavelser) i förhållande till enkla låtar 23 . De flesta kvinnor valde att stanna oftast på sidan av Y-labyrinten som spelade komplexa låtarna ( Figur 4B ).
Figur 1: Flödesschema över SofTware Använd och analyser. Varje program och tillhörande kod ges ett brevnamn för att förklara deras identitet och användning i huvudtexten. I () är de specifika programmen vi använder i vårt protokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konfigurera för inspelning av manliga musslar. (A) Bild på en ljuddämpningsbox och ställ in för att spela in USV-vokaliseringar. (B) Exempel på sonogram av en inspelning gjord med Programvara A ( Tabell 1 ), inklusive detaljerade spektralfunktioner beräknade med "Mouse Song Analyzer v1.3": varaktighet, interfeltsintervall (ISI), toppfrekvens min (Pf min), Toppfrekvens max (Pf max), toppfrekvensstart (Pf start), toppfrekvens Slutet (Pf slut) och bandbredd. (C) Sonogram från en annan manlig sång till en levande kvinna, inne i ljuddämpningsboxen och utanför lådan på labbbänken i samma rum. Våra anekdotiska observationer indikerar att inspelningarna i lådan av samma djur visar större volym (starkare intensitet) och mindre övertoner, men inga tecken på ekon i lådan utan ljudskum. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skärmdump av "Mouse Song Analyzer v1.3" whis_gui Fönster Visar olika alternativ tillgängliga för analyser. De parametrar som visas är de som används för att registrera manliga USV i figurerna och dataanalyser presenterade (förutom min noteringstid var 3 ms). .com / filer / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvinnliga val mellan uppspelningar av komplexa och enkla låtar. (A) Bild av den använda Y-labyrinten och dimensionmätningar. (B) Kvinnornas tid i varje arm, spelar antingen från en komplex (kvinnlig urinutvecklad) eller enklare (vaken kvinnlig framkallad) sång från samma man. Data presenteras för n = 10 B6D2F1J kvinnliga möss som medelvärde ± SE, med individuella värden också visade; 9 av de 10 kvinnorna visade en preferens för den mer komplexa stavelsen / sekvenslåt. * P <0,05 parat student t-test. Figur modifierad från Chabout et al. 23 med tillstånd.Blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Antal utställningar och repertoire över villkor . (A) Lämplig produktionshastighet för män i olika sammanhang. (B) Repertoarkompositioner av manliga när i närvaro av kvinnlig urin (UR), bedövad honkvinna (AF), vaken kvinnlig (FE) och anestetiserad manlig (AM) -kontext. Data presenteras som medelvärde ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 för post-hoc parat elevtest efter Benjamini och Hochberg-korrigering (n = 12 män). Figur från Chabout et al. 23 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
together.within-sida = "1"> 
Figur 6: Exempel på spektrala funktioner i olika sammanhang. (A) Amplitude. * P <0,025 för post-hoc-parat elevtest efter korrigering. (B) Frekvensområde eller Bandbredd. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 efter korrigering. (C) Spellens renhet i stavelserna. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 efter korrigering. Förkortningar: kvinnlig urin (UR), bedövad kvinna (AF), vaken kvinna (FE) och anesteserad man (AM). Siffror modifierade från Chabout et al. 23 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
37fig7.jpg "/>
Figur 7: Sekvensmätningar. (A) Användning av ISI för att skilja sekvensen. Kort ISI (SI) och medium ISI (MI) används för att separera stavelser inom en sekvens, och lång ISI över 250 ms (LI) separerar två sekvenser. (B) Sekvensens längd, mätt som antal stavelser per sekvens, producerad av män i olika sammanhang. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 efter korrigering. (C) Förhållandet mellan komplexa låtar över enkla låtar producerade av män i olika sammanhang. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 efter korrigering. Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 12 män). Figur från Chabout et al. 23 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Synliga syntaxdiagram över sekvenser baserat på villkorliga förutsättningar för varje kontext. Piltjockleken är proportionell mot den förutsebara sannolikheten förekomsten av en övergångstyp i varje sammanhang som är medelvärde från n = 12 manliga: P (förekomst av en övergång givet startstavelsen). För tydligheten visas inte sällsynta övergångar under en sannolikhet på 0,05. Figur från Chabout et al. 23 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll tillhandahåller tillvägagångssätt för att samla in, kvantifiera och studera manliga mössdomstolar i laboratoriet över en rad mestadels kvinnliga relaterade stimuli. Såsom presenteras tidigare i Chabout et al. 23 och i de representativa resultaten fick användningen av denna metod oss att upptäcka kontextberoende vokaliseringar och syntax som är viktiga för de mottagande kvinnorna. Standardiseringen av dessa stimuli kommer att ge insamling av ett tillförlitligt antal USV och möjliggöra detaljerade analyser av manens courtship-låtar och repertoarer.
När en levande kvinna är närvarande med mannen, tillåter protokollet inte oss att tydligt identifiera sändaren av vokaliseringen. Tidigare studier visade emellertid att majoriteten av vokaliseringen emitterades i detta sammanhang var av mannen 26 , 29 . De flesta studierna använder en speciell (man eller kvinna)Som en stimulans för männen tror att mängden kvinnlig vokaliseringar i dessa sammanhang är försumbar 4 , 5 , 22 , 30 . Emellertid använde en nyligen använt papper triangulering för att lokalisera vocaliseringen av emitteren i grupphusförhållanden 31 och visade att kvinnan inom en dyad bidrar till ~ 10% av USV: erna. I det föreliggande protokollet tillåter användningen av den bedövade kvinnan användaren att studera manliga vokaliseringarna i närvaro av en kvinna utan hennes vocalizing. Till skillnad från förväntningarna i den här nya studien 31 fann vi ingen skillnad i antalet stavelser emitterade mellan FE och AF-förhållandena 23 . Det är möjligt att levande kvinnor inte bidragit avsevärt till inspelningarna eller att männen vocalized mindre i närvaro av levande honor jämfört med anestesierad female. Trots detta tror vi att framtida experiment bör överväga användningen av denna trianguleringsmetod för att bedöma den potentiella effekten av kvinnans bidrag.
Det finns annan programvara tillgänglig som kan göra några steg som vi har skisserat, även om vi inte tror på det sätt som är tillräckligt för de frågor som vi frågade med en kombination av tre program: Software A, Mouse Song Analyzer programvara C med hjälp av programvara B, Syntaxanalysprogramvara med hjälp av D + E-beräkningar av kalkylarksprogram och syntaxdekorator med R. Exempelvis presenterade ett nyligen publicerat program en programvara med namnet VoICE som tillåter användaren att automatiskt extrahera akustiska variabler från sonogrammen eller direkt på enheter som hade blivit manuella Vald av användaren 32 . Men de automatiserade eller halvautomatiska sekvensanalyserna är inte lika detaljerade som vår metod. Vissa kommersiella program kan automatiskt analysera de akustiska funktionerna, men ger inte en automAtisk klassificering av stavelserna Användaren måste sortera de olika stavelserna efteråt. Grimsley, Gadziola, et al. 33 utvecklade ett tabellbaserat virtuellt mus vocal organprogram som kluster stavelser baserat på delade akustiska funktioner, men ger inte automatisk detektering av stavelserna. Deras program 34 är unikt genom att det skapar nya sekvenser från inspelade låtar med hjälp av Markov-modeller, och har därmed mer avancerade funktioner än enkel redigering.
De flesta tidigare kommunikationsstudier på möss har fokuserat på emitterens sidor 35 , 36 . Få studier har undersökt mottagarens sida 30 , 37 , 38 . Uppspelnings- och diskrimineringsprotokoll ger ett enkelt test för att studera mottagarens sida, som den som nyligen beskrivits av Asaba, Kato, etal. 39 . I den studien använde författarna en dubbelvalstestbox separerad med akustiskt skum istället för den Y-labyrint som beskrivs här. Båda valinställningarna har fördelar och nackdelar. För det första isolerar Y-labyrinten inte ljudet från en arm till den andra, men tvåvalskassen gör det. Men med hjälp av Y-labyrinten kan djuret snabbt utvärdera de två låtarna som spelas samtidigt och flytta mot den föredragna. Icke desto mindre bestämmer uppspelningsexperiment i allmänhet experimentera betydelsen och därmed funktionerna hos vokalisationerna som genereras för specifika djur. Sammanfattningsvis bör läsarna, efter att ha mastrat teknikerna för detta protokoll och analyser, kunna hantera många frågor som påverkar mus USVs kontext, genetik och neurobiologi.
Med hjälp av B6D2F1 / J-möss utlöser kvinnliga associerade stimuli nästan alltid USVs från de män som vi testat i vårt laboratorium. Det är kritiskt för kollegaenCt nog stavelser (> 100 i 5 min) för att kunna få en stark statistisk analys. För felsökning, om inga USV-filer spelas in (eller inte tillräckligt), kontrollera konfigurationen så att ljuden spelas in. Gör en levande inspektion av vad som händer i buret under inspelningen genom att titta på realtidssonogrammet på datorskärmen efter introduktionen av stimulansen. Annars försöker du återställa mannen till en sexuellt mogen / mottaglig kvinna över natten och sedan placera dem ensamma i flera dagar eller upp till en vecka innan du spelar in igen. Baserat på anekdotiska observationer finner vi att vissa män sjunger mycket på en dag (för nästan hela 5 min), och inte mycket nästa dag, och sedan igen en dag. Vi vet inte orsaken till att sådana inom ämnesvariationen inträffar, men vi antar att det förmodligen är en motiverande eller säsongsbetonad för männen, och estrusstaten för kvinnlig urin. Om inga USV-inspelningar registreras, försök att registrera djuret på flera dagar för att hämta dessa variabla effekter. UnlIke i sångfåglar, har vi inte noterat öppna skillnader i antalet sånger baserat på tid på dagen. Vi finner att männen inte sjunger mycket (<100 stavelser på 5 min) innan de är 7 veckor gamla.
Detekteringsmetoderna som presenteras här kan extrahera tusentals stavelser och alla akustiska parametrar om några minuter. Men som en automatisk detekteringsmetod är den mycket känslig för bakgrundsbrus. Med hjälp av Mouse Song Analyzer-programvaran med bullriga inspelningar (till exempel från djur som spelats in med sängkläder) kan det krävas justering av detektionsgränsen för att ge större flexibilitet. Detta ökar dock antalet falska positiva stavelser och den automatiska detektering kan misslyckas. Under sådana omständigheter kan manuell kodning användas.
Som tidigare sagt är antalet, repertoarierna och latensen av vokaliseringar varierande varierande beroende på stammen, så man måste ändra parametrar (inspelningslängd,Stimulans, automatiserad stavelse detektering, etc. ) för vissa stammar för att säkerställa optiska inspelningar för statistiska analyser.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute fonder till EDJ. Vi tackar Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - University Paris south XI - FRANCE) för att låna oss högtalarhårdvaran. Vi tackar också medlemmarna i Jarvis Lab för deras stöd, diskussioner, korrigeringar och kommentarer om detta arbete, särskilt Joshua Jones Macopson för hjälp med siffror och test. Vi tackar Dr. Gustavo Arriaga för hjälp med Mouse Song Analyzer-programvaran, uppgradering av den för oss till V1.3 och andra aspekter av detta protokoll. V1.0 av mjukvaran utvecklades av Holy and Guo, och v1.1 och v1.3 av Arriaga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | - | 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | - | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | - | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip |
|
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http://www.graphviz.org | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20 mg/mL) | Anased | - | |
| Ketamine HCl (100 mg/mL) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
- Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
- Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
- Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
- Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
- Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
- Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
- Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
- Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
- Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
- Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
- White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
- Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
- Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
- Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
- Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
- Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
- Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).
