Summary
Mus producerer et komplekst multisyllabelt repertoire af ultralyd vocalizations (USVs). Disse USV'er anvendes i vid udstrækning som læsninger til neuropsykiatriske lidelser. Denne protokol beskriver nogle af de metoder, vi har lært og udviklet til konsekvent at fremkalde, indsamle og analysere de akustiske egenskaber og syntaksen af musesange.
Abstract
Mus producerer ultralyd vocalizations (USV'er) i en række sociale sammenhænge gennem udvikling og voksenalder. Disse USV'er anvendes til moderpuppersøgning 1 , ungdomsinteraktioner 2 , modsatte og samme kønsinteraktioner 3 , 4 , 5 og territoriale interaktioner 6 . I flere årtier er USV'erne blevet brugt af efterforskere som proxyer til at studere neuropsykiatriske og udviklingsmæssige eller adfærdsmæssige lidelser 7 , 8 , 9 og for nylig at forstå mekanismer og udvikling af vokalkommunikation blandt hvirveldyr 10 . Inden for de seksuelle interaktioner producerer voksne mandlige mus USV sange, som har nogle funktioner, der ligner sangfugle i sangfugle 11 . Anvendelsen af en sådan multisyllabisk reperToires kan øge potentiel fleksibilitet og information, de bærer, da de kan varieres i, hvordan elementer organiseres og rekombineres, nemlig syntaks. I denne protokol beskrives en pålidelig metode til at fremkalde USV sange fra hanmus i forskellige sociale sammenhænge, såsom eksponering for frisk kvindelig urin, bedøvede dyr og østrushunner. Dette indbefatter betingelser for at fremkalde en stor mængde stavelser fra musene. Vi reducerer optagelse af omgivende lyde med billige lydkamre og præsenterer en kvantificeringsmetode til automatisk detektering, klassificering og analyse af USV'erne. Sidstnævnte omfatter evaluering af call rate, vokal repertoire, akustiske parametre og syntaks. Forskellige fremgangsmåder og indsigt i brugen af afspilninger for at studere et dyrs præference for specifikke sangtyper er beskrevet. Disse metoder blev anvendt til at beskrive akustiske og syntaksændringer på tværs af forskellige kontekster hos hanmus og sangpræferencer hos hunmus.
Introduction
I forhold til mennesker producerer mus både lave og højfrekvente vokaliseringer, de senere kendt som ultralydvokaliseringer (USV'er) over vores høreområde. USV'erne produceres i en række sammenhænge, herunder fra moderpuppersøgning, ungdomsinteraktioner, til modsatte eller samme køn voksne interaktioner 4 , 12 . Disse USV'er er sammensat af et mangfoldigt multisyllabisk repertoire, der kan kategoriseres manuelt 9 eller automatisk 10 , 11 . Disse USVs rolle i kommunikationen har været under stigende efterforskning de seneste år. Disse omfatter at bruge USV'erne som udlæsninger af musemodeller af neuropsykiatriske, udviklingsmæssige eller adfærdsmæssige forstyrrelser 7 , 8 og interne motiverende / følelsesmæssige tilstande 13 . USV'erne menes at formidle pålidelige oplysninger om eMitters tilstand, der er nyttig for modtageren 14 , 15 .
I 2005 avancerede Hellige og Guo 11 ideen om, at voksne mandlige USV'er blev organiseret som en række multisyllabiske opkaldselementer eller stavelser, der lignede sangfugle. I mange arter giver et multisyllabisk repertoire emitteren mulighed for at kombinere og bestille stavelser på forskellige måder for at øge den potentielle information, der bæres af sangen. Variation i denne syntaks antages at have en etologisk relevans for seksuel adfærd og mage præferencer 16 , 17 . Efterfølgende undersøgelser viste, at hanmus kunne ændre den relative sammensætning af stavelsetyper, de producerer før, under og efter tilstedeværelsen af en kvinde 5 , 18 . Det vil sige, at de voksne hanmus bruger deres USV'er til domstolsadfærd, enten for at tiltrækkeEller opretholde tæt kontakt med en kvinde eller for at lette parringen 19 , 20 , 21 . De udsendes også i mandlige interaktioner, sandsynligvis at formidle sociale oplysninger under interaktioner 4 . For at fange disse ændringer i repertoirerne måler forskerne sædvanligvis spektralfunktionerne (akustiske parametre, såsom amplitude, frekvenser osv. ), Antal USVs stavelser eller opkald og latens til den første USV. Men få ser faktisk på sekvensdynamikken af disse USV'er i detaljer 22 . For nylig udviklede vores gruppe en ny metode til at måle dynamiske ændringer i USV-stavelsesekvenserne 23 . Vi viste at stavelsesordre inden for en sang om (nemlig syntaks) ikke er tilfældig, at den ændres afhængigt af den sociale kontekst, og at de lyttende dyr opdager disse ændringer som etologisk relevante.
Vi bemærker thHos mange forskere, der studerer dyrekommunikation, vedhæfter ikke udtrykket "syntaks" den samme nøjagtige betydning som syntaks anvendt i menneskelig tale. Til dyre kommunikationsstudier betyder vi simpelthen en ordnet, ikke-tilfældig, lydsekvens med nogle regler. For mennesker er der også kendte specifikke sekvenser at have specifikke betydninger. Vi ved ikke, om det er tilfældet med mus.
I dette dokument og tilhørende video sigter vi på at levere pålidelige protokoller til optagelse af hanmusens uskyldige USV'er i forskellige sammenhænge og udføre afspilninger. Anvendelsen af tre sekventielt anvendte software til: 1) automatiske optagelser; 2) stavelsesdetektering og kodning; Og 3) dybtgående analyse af stavelsesfunktionerne og syntaxen er demonstreret ( figur 1 ). Dette giver os mulighed for at lære mere om mannlige mus USV struktur og funktion. Vi mener, at sådanne metoder letter dataanalyser og kan åbne nye horisonter for at karakterisere normal og unormal vokal kommunikation i mouSe modeller af kommunikation og neuropsykiatriske lidelser, henholdsvis.
Protocol
Etik erklæring: Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i henhold til protokol nr. A095-14-04. Bemærk: Se Tabel 1 i afsnittet " Materialer og udstyr " for detaljerede oplysninger om den anvendte software.
1. Stimulere og optage mus USV'er
- Forberedelse af mændene før optagelserne
BEMÆRK: De repræsentative resultater blev opnået ved anvendelse af B6D2F1 / J unge voksne hanmus (7-8 uger gamle). Denne protokol kan tilpasses til enhver belastning.- Sæt lysrummet på dyrrummet i en 12-h lys / mørk cyklus, medmindre andet er påkrævet. Følg standardhusreglerne fra 4 til 5 mænd pr. Bur, medmindre andet er påkrævet eller nødvendigt. Tre dage før optagelse udsættes mænd individuelt for en seksuelt moden og modtagelig kvinde (op til 3 mænd med en kvinde pr. Bur) af samme belastning natten over.
- Næste dag fjerneKvinden fra mandens bur og huser hannerne uden hunnerne i mindst to dage før den første optagelsessession for at øge den sociale motivation til at synge (baseret på vores forsøg og fejl anekdotiske analyser).
- Forberedelse af optagelsesbokse
- Brug en strandkøler (interne dimensioner er L 27 x W 23 x H 47 cm) for at fungere som lyddæmpningsboksstudio ( Figur 2A ). Bor et lille hul oven på boksen for at lade mikrofonens ledning løbe ind.
BEMÆRK: Optagelse af dyrene i et lyddæmpet og visuelt isoleret miljø er at foretrække for at optage snesevis af mus på én gang uden at høre eller se hinanden, forhindre registrering af forurening af omgivende rum udstyrsstøj og mennesker i rummet og for at opnå ren Lydoptagelser af musene ( figur 2B ). Vi har ikke bemærket lyd ekkoer eller forvrængninger til lyden, når vi sammenligner vokaliseringer af den samme mus indenfor mod uden for tHan lyder dæmpningskammeret ( figur 2C ); Derimod lyder der måske højere og har færre harmonier inde i kammeret. - Tilslut mikrofonen til ledningen, ledningen til lydkortet og lydkortet til computeren for at arbejde med en lydoptagelsessoftware ( f.eks. Software A i figur 1 og tabel 1 ). En passende lydoptagelsessoftware er nødvendig, såsom software A, der genererer .wav lydfiler.
- Anbring et tomt bur (58 x 33 x 40 cm) inde i den lydisolerede boks, og juster mikrofonens højde, så mikrofonens membran er 35 - 40 cm over bunden af buret, og at mikrofonen er centreret over buret ( Se figur 2A ).
- Brug en strandkøler (interne dimensioner er L 27 x W 23 x H 47 cm) for at fungere som lyddæmpningsboksstudio ( Figur 2A ). Bor et lille hul oven på boksen for at lade mikrofonens ledning løbe ind.
- Konfiguration af optagelsessoftware A ( Tabel 1 ) til kontinuerlig optagelse
- Dobbeltklik og åben software A. Klik og åben menuen "konfiguration" og vælg den angivne enhed, Samplinghastighed (250.000 Hz), Format (16 bit).
- Vælg tasten "Trigger" og vælg "Toggle".
BEMÆRK: Med denne indstilling kan du starte optagelsen ved at trykke på en tast (F1, F2 osv. ), Mens du placerer stimulus i musens bur. - Indtast musens id under "Navn" parameteren.
- Indstil den maksimale filstørrelse til de ønskede minutter med optagelse (vi sætter normalt til 5 min).
BEMÆRK: Jo længere minutter, desto større mængde computerlagerhukommelse er nødvendig. Hvis kontinuerlig tilstand ikke er indstillet, afbryder softwaren sangudfald i begyndelsen eller slutningen af en sekvens baseret på indstillede parametre, og derfor kan man ikke pålideligt kvantificere sekvenser.
- Optag USV'er ved hjælp af de forskellige stimuli. Bemærk: Hver stimulus kan bruges uafhængigt afhængigt af brugerens eksperimentelle behov.
- Løft forsigtigt dyret, der skal registreres ved halen, og læg det i et bur uden strøelse (for at forhindre bevægelseEment støj på strøelse) inde i den lydisolerede boks, og sæt buret åbent kablet metal låg oven på det, med låget opad.
- Luk den lyddæmpede kasse og lad dyret habituere til det i 15 minutter. Udfør stimuli forberedelsen (1.4) på dette tidspunkt.
- Stimuli forberedelse
- Fremstilling af friske urinprøver (UR) som en stimulus
- Få urinprøver i højst 5 minutter før optagelsessessionen for at sikre maksimal effekt ved at fremkalde sang fra mændene. BEMÆRK: Urin, der har siddet længere, og især i timer eller natten over, er ikke så effektiv 24 , 25 , som vi har empirisk verificeret 23 .
- Vælg en kvindelig eller en mand (afhængig af stimulusets køn, der skal bruges) i et bur, tag huden bag halsen og hold dyret i den ene hånd som for en lægemiddelindsprøjtningsprocedure med maven eksponeret.
- Vælg derefter et andet bur. Og gentag samme procedure med en anden kvinde eller mand, men med den samme bomuldsspids som tidligere blev brugt.
BEMÆRK: Denne procedure sørger for at blande urinen med mindst to hunner eller mænd fra to uafhængige bur på samme bomuldspids for at sikre mod østrus eller andre individuelle effekter, da det er kendt, at østruscyklus kan påvirke sangadfærd 18 , 26 . - Placer bomuldsspidsen, der skal bruges i en ren glas eller plast petriskål.
BEMÆRK: Da bomuldsspidsen med urin skal bruges inden for de næste 5 minutter, er der ingen grund til at dække det for at forhindre fordampning.
- PreparatiPå den levende kvindelige (FE) stimulus som en stimulus
- Vælg et eller to nye bur af seksuelt modne kvinder. Identificere kvinder i pro-estrus eller østrus-scenen ved visuel inspektion (bred vagina åbning og pink surround som vist i 27 , 28 ). Adskille dem i et andet bur til brug.
- Forberedelse af de bedøvede dyr hunner (AF) eller hanner (AM) som en stimulus
- For AF vælges en kvindelig fra poolen ovenfor (enten i pro-estrus eller østrus). For AM skal du vælge en mand fra et bur af voksne hanmus.
- Bedøve kvinden eller hanen med en intraperitoneal injektion af en opløsning af henholdsvis ketamin / xylazin (henholdsvis 100 og 10 mg / kg).
- Brug øjensalve for at forhindre dehydrering af øjnene, mens dyret er bedøvet. Tjek korrekt bedøvelse ved at teste paw tilbagetrækningsrefleksen, når den klemmes. Anbring det bedøvede dyr i et rent bur på et papirhåndklæde, hvidtH buret på varmepuden indstilles på "minimumsvarme" for at sikre kontrol af kropstemperaturen.
- Genbruge de samme dyr op til 2 til 3 gange til forskellige optagelsessessioner, hvis det er nødvendigt, før de vågner op (normalt omkring 45 minutter). Sæt dem tilbage på varmepuden efter hver optagesession.
- Kontroller åndedrætsfrekvensen ved visuel inspektion (~ 60-80 åndedræt pr. Minut) og kropstemperatur ved at berøre dyret hvert 5. minut (skal være varmt at røre ved).
- Når du er klar til at optage, skal du klikke på "Optag" -knappen for software A.
BEMÆRK: Optagelserne starter ikke, medmindre brugeren klikker på tasten, der er knyttet til hver kanal. Overvåge live audio feed fra burene på computerskærmen for at sikre dyrene synger og optagelserne er korrekt opnået. - Tryk samtidigt på den tilhørende nøgleknap for den ønskede boks (er), der skal optages ( dvs. F1 for boks 1), og introducer den ønskede stimulus.
- Præsenter en af stimuli som følger. Placer bomuldsspidsen med friske urinprøver inde i buret eller læg den levende kvindelige inde i buret eller læg et af de bedøvede dyr (AF eller AM) oven på burets metallåg.
- Luk luk optagelsesboksen, og lad optagelsen gå i det forudindstillede antal minutter ( f.eks. 5 minutter som beskrevet i afsnit 1.3).
- Efter optagelse skal du klikke på den røde knap for stopfirkant for at stoppe optagelsen.
- Hvis et bedøvet dyr blev anvendt som en stimulus, skal du åbne den lydisolerede optagelsesboks, tage det bedøvede dyr fra burets metallåg og sætte det tilbage på varmepuden inden næste optagesession eller hvis du ikke længere bruger dyret som en stimuluskontrol Det hvert 15. minut, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
- Åbn buret og fjern det bevidste testdyr, og læg det tilbage til sit hjemmebure. Rengør testburet med 70% alkohol aDestilleret vand.
- Fremstilling af friske urinprøver (UR) som en stimulus
2. Behandling .wav-filer og udfyldbar kodning ved hjælp af Mouse Song Analyzer v1.3
- Åben kodningssoftware B ( Figur 1 , Tabel 1 ) og læg den mappe, der indeholder Software Script C i "Mouse Song Analyzer" ( Figur 1 , Tabel 1 ) i software B's sti ved at klikke på "Set path" og tilføje mappen på software B. Luk derefter software B for at gemme.
- Konfigurer de kombinerede software B + Cs stavelsesidentifikationsindstillinger. BEMÆRK: Software-script C-koden opretter automatisk en ny mappe kaldet "sonogrammer" med filer i .sng-format i den samme mappe, hvor .wav-filerne er placeret. Det er normalt bedre at sætte alle .wav-filer fra den samme optagesession, der genereres ved hjælp af software A i samme mappe.
- Åbn software B konfigureret med C.
BEMÆRK: Denne version af software B er helt cUmpatible med software script C. Det kan ikke garanteres, at eventuelle senere versioner vil acceptere alle de funktioner, der er inkluderet i den nuværende kode. - Naviger til den mappe af interesse, der indeholder de indspillede .wav-filer, der skal analyseres ved hjælp af vinduet "nuværende mappe".
- Indtast kommandoen "whis_gui" i "kommandovinduet".
- I det nye whis-gui vindue skal du observere flere undervinduesektioner med forskellige parametre ( figur 3 ), herunder "Sonogram Parameters", "Whistle Options" og alle andre. Juster parametrene til detektering af USV'er. Brug følgende parameterindstillinger til at registrere USVs stavelser fra laboratoriemus ( f.eks. B6D2F1 / J og C57BL / 6J musestammer anvendt i vores undersøgelser):
- I sektionen Sonogramparametre skal du justere Minfrekvensen til 15.000 Hz, Maxfrekvensen til 125.000 Hz, Prøvetagningsfrekvensen ( Antal frekvenser ) tO 256 kHz og tærsklen til 0,3.
- I sektionen Whistle Options skal du indstille Renhedstærsklen til 0,075, Min Varighed af stavelsen til 3 ms, Minfrekvens feje til 20.000 Hz og Filtervarigheden til 3 ms.
- I de andre sektioner skal du justere Min Noter Duration til 3 ms, og Min Note Count til 1.
- For stavelseskategoriseringsprotokol skal du vælge bokse i den midterste del af whis_gui-vinduet:
Standardkategoriseringen er baseret på Holy and Guo 11 og Arriaga et al. 10 , som koder stavelse ved antallet af sprangspring og hoppens retning: S for simpel kontinuerlig stavelse; D for et nedehøjdehoppe; U for en op-pitch-hoppe; DD for to sekventielle down-hoppe; DU for en dowN og et hoppe op Osv. Dette vil være standard, hvis brugeren ikke vælger noget. Brugeren har mulighed for at køre analysen på bestemte stavelsestyper ved at vælge hver af de repræsentative felter.
At vælge kategorisering af stavelser som beskrevet af Scattoni et al. 9 , desuden vælge Split s kategori, som adskiller denne type til flere underkategorier baseret på stavelse form.
Vælg Harmonics, hvis brugeren vil yderligere sortere stavelser i dem med og uden harmoniske.
- Åbn software B konfigureret med C.
- Klassificer stavelserne i .wav-filerne af interesse
- Vælg alle .wav-filer fra en optagesession i den øverste venstre del af whis_gui-vinduet.
- Klik på "Få sonogrammer" midt i whis_gui vinduet ( Figur 3 ). En ny mappe med sonogrammerne vil blive oprettet med .sng filformat. Vælg alle sonogrammerne (.sng filer) i øversteVenstre hjørne af whis-gui vinduet. Angiv "Animal ID" og "Session ID" i boksen under sonogram fil vinduet. Klik derefter på proces sonogrammer.
- Overhold tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-session ID -Notes.csv" (indeholder oplysninger om noterne hentet fra stavelserne), "Animal ID-session ID -Syllables.csv" (indeholder værdier af alle de Klassificerede stavelser, herunder deres spektrale egenskaber og det samlede antal stavelser, der er påvist i sonogrammerne), "Animal ID-Session ID-Traces.mat" (indeholder grafiske repræsentationer af alle stavelser).
BEMÆRK: Filen "Animal ID-Session ID -Syllables" indeholder nogle gange en lille procentdel (2-16%) uklassificerede USV-stavelser, som er mere komplekse end de valgte, eller der har to dyrs stavelser overlappende hinanden 23 . Disse kan undersøges separat fra sporfilen, hvis det er nødvendigt.
- Overhold tre filtyper i sonogrammappen: "Animal ID-session ID -Notes.csv" (indeholder oplysninger om noterne hentet fra stavelserne), "Animal ID-session ID -Syllables.csv" (indeholder værdier af alle de Klassificerede stavelser, herunder deres spektrale egenskaber og det samlede antal stavelser, der er påvist i sonogrammerne), "Animal ID-Session ID-Traces.mat" (indeholder grafiske repræsentationer af alle stavelser).
3. Kvantificering af Sætbar Akustisk Struktur og Syntax
BEMÆRK: Instruktioner for trin til at tage til første syntaksanalyser er inkluderet i "READ ME!" Regneark i filen "Sanganalyseguide v1.1.xlsx", vores brugerdefinerede regnearkregner E ( figur 1 , tabel 1 ).
- Åbn software script C fil output "Animal ID-session ID -Syllables.csv" opnået i afsnittet ovenfor med regneark software D ( Figur 1 , tabel 1 ). Den indeholder det samlede antal stavelser, der er registreret i alle sonogrammerne og alle deres spektrale egenskaber.
- Hvis det ikke er konverteret endnu, konverterer du i denne regnearksoftware D denne .csv-fil til kolonneparation i software D for at sætte hver værdi i individuelle kolonner.
- Åbn filen "Sanganalyseguide v1.1.xlsx" også i software D. Klik derefter på thE skabelon regneark, og kopier og indsæt filen "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" i dette ark som anbefalet i vejledningen til skabelonark. Fjern rækker med kategorien "Unclassified" i stavelser.
- Efter at have fjernet de 'Ikke-klassificerede' rækker, skal du først kopiere og genberegne ISI-data (mellem stavelsesinterval) i kolonne O i kolonne E. Dernæst skal du kopiere alle data fra kolonne A til N til 'Data'-regnearket.
- Indtast dyre-id'er (kolonne AF) og optagelseslængde (i minutter, kolonne AC) i dataarket.
BEMÆRK: Dyr-id'erne skal svare til den, der er indtastet i optagelsesopsætningen. Filen vil registrere de indtastede tegn og sammenligne den med navnet på .wav-filerne. - Bestem ISI cutoff for at definere en sekvens ved at bruge regnearket mærket "Density ISI", "ISI plot" resultatet.
BEMÆRK: I vores tidligere undersøgelse 23 satte vi cutoff på to standaRd afvigelser fra midten af den sidste top. Det bestod af lange intervaller (LI) på mere end 250 ms, som adskilt forskellige sangkonkurrencer inden for en sang sang. - Se de vigtigste resultater i 'Funktions' regneark (gruppering af alle spektrale egenskaber målt fra hvert dyr).
BEMÆRK: Hvis brugeren anvendte standard stavelse kategori indstilling i software script C beskrevet i afsnit 2.8.9, er stavelserne derefter yderligere klassificeret i 4 kategorier som beskrevet ovenfor og i Chabout et al. 23 : 1) simpel stavelse uden nogen sprangspring, «s»; 2) to notat stavelser adskilt af et enkelt opadgående («u») hoppe; 3) to notat stavelser adskilt af et enkelt nedadgående spring («d»); Og 4) mere komplekse stavelser med to eller flere tonehoppe mellem noter («m»). - For syntaksværdier skal du klikke på "Global Probabilities" regnearket, der beregner sandsynligheder for hvert par sYllable overgangstyper uanset startstavler, ved brug af følgende ligning 23 .
P (Forekomst af overgangstype) = Samlet antal forekomster af overgangstype / Samlet antal overgange af alle typer - Klik på 'Conditional probabilities' regnearket for at beregne de betingede sandsynligheder for hver overgangstype i forhold til start stavelser, der bruger følgende ligning:
P (forekomst af en overgangstype givet startstavlen) = Samlet antal tilfælde af overgangstype / Samlet antal forekomster af alle overgangstyper med samme startstavle - For at afprøve om og hvilken af de ovennævnte overgangs sandsynligheder adskiller sig fra ikke-tilfældige, ved brug af en første-ordnings Markov model, efter fremgangsmåden i 23 , bruger brugerdefineret software F ( fx Syntax decorator i R studio; Figur 1 , <Strong> Tabel 1) med følgende R scripts: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R for indenfor grupper under forskellige forhold; Eller Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R for mellem grupper under de samme forhold.
- Udfør en Chi-square test eller en anden test af din præference for at teste for statistiske forskelle i overgangssandsynlighederne for det samme dyr i forskellige sammenhænge (parvis) efter fremgangsmåden i 23 .
BEMÆRK: Flere detaljer om den statistiske model, der bruges til at sammenligne syntaks blandt grupper, findes i 23 . Forskere kan bruge andre metoder til at analysere de globale eller betingede overgangs sandsynligheder, som de eller andre udviklede. - For at grafisk vise sekvenserne som syntaxdiagrammer, indtast værdierne i et netværksgrafikprogram G (se figur 1 , tabel 1 ) med noder, der angiver forskellige stavelser cateGories og pil farve og / eller tykkelse pixel repræsenterer områder af sandsynlighedsværdier mellem stavelser.
BEMÆRK: For tydelighedens skyld viser vi for de globale sandsynlighedsgrafer kun overganger højere end 0,005 (højere end 0,5% af tilfældigheden). For de betingede sandsynligheder bruger vi en tærskel på 0,05, fordi hver sandsynlighed i den "globale model" er lavere i betragtning af at vi deler med det samlede antal stavelser og ikke kun af en bestemt stavelsestype.
4. Sangredigering og testpræference for en sangtype
BEMÆRK: Afspilninger af USV'er kan bruges til at eksperimentelt teste et dyrs adfærdsrespons, herunder præference for en bestemt sangtype. Fordi kvindelige præferencer kan ændre sig afhængigt af østrusstilstanden, skal kvinder sikre sig, at de er i samme østrus tilstand, før de testes som følger:
- Forbered kvinder med seksuel oplevelse flere dage før afspilningseksperimentet
- Overvåg østruscyklusen, og når pro-estrus eller østrus er tydelig (vaginal åbning og pink surround som vist i 27 ), sæt hunner tilbage sammen i deres eget bur. De er klar til at blive testet næste dag.
- Brug kopi og indsæt funktioner i en lydbehandlingssoftware H ( fx SASLap Pro; Figur 1 , Tabel 1 ) for at oprette to redigerede .wav-filer med de ønskede betingelser, der skal bruges til stimuli. For at beskytte antallet af vokaliseringer som en variabel skal du sørge for at de to lydfiler indeholder det samme antal sYllables og længde af sekvenser (song bouts) fra de samme eller forskellige mænd / kvinder fra de ønskede sammenhænge ( f.eks. UR).
- Åbn den første fil, der indeholder sang fra tilstand 1 i software H. Gå derefter til Filer> Specials> Tilføj kanal (er) fra fil, og vælg den anden lydfil, der skal testes fra tilstand 2. Dette skaber 2 kanaler, en for hver tilstand.
- Juster lydstyrken visuelt, hvis det er nødvendigt for at sikre, at mængderne af de to filer matcher hinanden ved at gå til Rediger> Lydstyrke.
- Gå derefter til Rediger> Format> Sampling Frequency Conversion og vælg konverter fra 250.000 Hz til 1.000.000 Hz for at omdanne .wav-filerne fra en samplingsfrekvens på 256 kHz til 1 MHz. Dette trin er nødvendigt for afspilningsenheden at læse .wav-filerne.
- Gem disse nye filer som de testfiler, der skal afspilles. Sørg for at identificere, hvilken sang der er i hvilken kanal (1 eller 2). For klarhedens formål navngive det "file name.wav".
- Gå til EXit> Format> Byt kanaler og bytt de to kanaler. Gem de bytte versioner med et andet navn. BEMÆRK: Dette vil være den modsatte kopi med kanalerne inverterede, navngivet senere 'file name_swapped.wav'.
- Rengør afspilningsapparatet "Y-labyrint" med 70% alkohol efterfulgt af destilleret vand. Tør det med papirhåndklæder. Vores Y-labyrint er et hjemmelavet, uigennemtrængeligt, solidt sort plastikapparat med arme på 30 cm lang og to borede huller på labyrintets yderste ender, så ultralydshøjttaleren passer til gulvniveauet på armene ( figur 4A ).
- Sørg for, at højttalerne er i deres rigtige positioner og tilsluttet lydkortet, og kortet er tilsluttet computeren.
- Åbn software A, vælg Afspil> Enhed, og vælg lydkortets enhed for afspilning. Vælg "brug fil header rate". Gå til Afspil> Afspilningsliste og indlæse filen af interesse, der indeholder de to chaNnels ( dvs. "file.wav"). Vælg "sløjfe tilstand". Indstil videooptageren over labyrinten for at dække hele labyrinten.
- Placer testkvinde i labyrinten i en 10-minutters opholdstid. Efter 10 minutter, hvis kvinden ikke er i startarmen, skal du forsigtigt skubbe kvinden tilbage til startarmen og lukke vinduet med separering af plast.
- Vælg den forberedte fil ("file.wav") for at afspille og afspille den. Start videooptagelsen, og sørg for at identificere, hvilken kanal der er placeret på hvilken Y-labyrints arm ( dvs .: UR i venstre eller FE i højre arm) med en papirnote i videooptagelsesfeltet.
- Tillad kvinden at høre sangene i sløjfemodus og udforske labyrinten i et ønsket antal minutter ( dvs. 5 min): dette er en session. Ret kvinden tilbage i startarmen. Lad hende hvile i 1 minut, mens du forbereder næste session. RemOve nogen urin spor og udskæring med destilleret vand.
- Indlæs filen "file_swapped.wav". Skift placeringen af papirnoterne til videooptagelsen. Flyt den venstre til højre og omvendt. Efter 1 minut skal du afspille filen. Gratis kvinden til den anden session .
- Gentag trin 4.4.3 til 4.4.4 i alt 4 sessioner x 5 minutter for at styre for at detektere potentiel sidesideforstyrrelser under testen. Stop videooptagelsen i slutningen af alle sessioner ved at klikke på den røde stopknap. Rengør labyrinten med 70% alkohol og destilleret vand mellem kvinder.
- Gentag alle trin med forskellige sangeksemplarer en uge senere med de samme kvinder for at opnå tilstrækkelige resultater til at teste pålideligheden af resultaterne.
- Se senere videoerne, og brug timeren på videoen og et stopur til at måle den tid, kvinderne bruger i hver arm for hver session. Analysér de resulterende data statistisk for mulige sangindstillinger.
Representative Results
I den nuværende protokol blev ændringer i vokaladfærd og syntaks af mandlige B6D2F1 / J-mus karakteriseret. I almindelighed kunne vi ved hjælp af denne protokol optage i gennemsnit 675 ± 98,5 klassificerede stavelser som svar på kvindelig UR, 615,6 ± 72 i FE, 450 ± 134 i AF, 75,6 ± 38,9 i AM og 0,2 ± 0,1 i mandlig UR (n = 12 mænd). Satserne var ~ 130 stavelser / min for kvindelige UR, ~ 120 stavelser / min for FE, eller ~ 100 stavelser / min for AF kontekster ( Figur 5A ). Mandlige producerer en meget større mængde stavelser som reaktion på friskindsamlet urin i forhold til natten over opsamlet urin 10 , 23 . Mænd synger også betydeligt mindre i nærvær af en bedøvet mandlig eller frisk mandur urin Figur 5A ). Mænd ændrer også deres repertoire på tværs af sammenhæng 23 . For eksempel øges B6D2F1 / J mændene signifikant Produktion af flere stavspring "m" kategori stavelser i kvindelig urin tilstand ( Figur 5B ). De ændrer også akustiske egenskaber af individuelle stavelser over hele sammenhængen. For eksempel synger B6D2F1 / J hanner stavelser med højere amplitude og båndbredde i kvindelig urin kontekst og højere spektral renhed i den våde kontekst sammenlignet med de andre ( Figur 6 ) 23 .
Denne protokol giver også et middel til at måle dynamiske træk i sekvensen og dermed syntaxændringer. Ved anvendelse af en tilpasset metode fra Ey et al. 22 bruger vi ISI'en til at definere hullerne mellem sekvenser ( figur 7A ) 23 og derefter bruge hullerne til at skelne og analysere tidsmønstre af stavelsessekvenser. Vi viste længere sekvenslængder produceres i den våde kontekst ( Figur 7B )F "> 23. Denne teknik gør det muligt for os at beregne forholdet mellem komplekse sekvenser (sammensat af mindst 2 forekomster af" m "stavelsestype) versus simple sekvenser (sammensat af en eller ingen" m "-type og således hovedsagelig ved" S "-type). Vi fandt ud af, at hos kvinder med B6D2F1 / J viste urinkonteksten et højere forhold sammenlignet med de andre ( figur 7C ) 23 , hvilket tyder på, at de producerede mere komplekse stavelser i kvindelig urintilstand, men også at sådanne stavelser er fordelt Over flere sekvenser.
Vi kan også beregne de betingede overgangssandsynligheder fra en stavelsestype til en anden (24 overgangstypenumre inklusive overgangene fra og til "tavshedstilstand") 23 . Vi fandt ud af, at musens valg i overgangstyper i forskellige sammenhænge adskiller sig fra hinanden, og at der er flere syntax divErstatning i kvindelig urintilstand ( figur 8 ) 23 . Disse observationer stemmer overens med tidligere rapporter, der viser, at mænd kan ændre de akustiske egenskaber eller repertoirsammensætningen af deres vokaliseringer som reaktion på forskellige stimuli og erfaringer 4 , 5 , 24 .
Endelig giver den nuværende protokol vejledning til at teste kvindelige præferencer med afspilninger. Vi fandt, at B6D2F1 / J kvinder foretrækker mere komplekse sange (indeholdende 2 eller flere "m" stavelser) i forhold til simple sange 23 . De fleste kvinder valgte at blive oftere på siden af Y-labyrinten, der spillede de komplekse sange ( figur 4B ).
Figur 1: Flowdiagram af SofTware Brug og analyser. Hvert program og tilhørende kode er givet et bogstavnavn for at hjælpe med at forklare deres identitet og brug i hovedteksten. I () er de specifikke programmer, vi bruger i vores protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning til optagelse af mandmus sange. (A) Billede af en lyddæmpningsoptagelsesboks og indstillet til optagelse af USV vocalizations. (B) Eksempel sonogram af en optagelse lavet med Software A ( Tabel 1 ), herunder detaljerede spektrale funktioner beregnet ved "Mouse Song Analyzer v1.3": Varighed, inter-stavelsesinterval (ISI), Top Frequency Min (Pf min) Topfrekvens max (Pf max), topfrekvensstart (Pf start), topfrekvens Ende (Pf ende) og båndbredde. (C) Sonogrammer af en anden mandlig sang til en levende kvinde, inde i lyddæmpningsboksen og uden for boksen på laboratoriebænken i samme rum. Vores anekdotiske observationer viser, at optagelserne i kassen af det samme dyr viser større volumen (stærkere intensitet) og mindre harmoniske, men ingen tegn på ekko i kassen uden lydskum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skærmbillede af vinduet "Mus Song Analyzer v1.3" whis_gui Viser de forskellige muligheder, der er tilgængelige for analyser. De viste parametre er dem, der bruges til at registrere mandlige USV'er i figurerne og dataanalyser præsenteret (bortset fra min varighed var 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvindelige valg mellem afspilninger af komplekse og enkle sange. (A) Billede af det anvendte Y-labyrintapparat og dimensionsmålinger. (B) Kvindernes tid i hver arm spiller enten fra en kompliceret (kvindelig urin fremkaldt) eller mere simpel (vågen kvinde fremkaldt) sang fra samme mand. Data præsenteres for n = 10 B6D2F1J kvindelige mus som gennemsnit ± SE, med individuelle værdier også vist; 9 ud af de 10 hunner viste en præference for den mere komplekse stavelse / sekvens sang. * P <0,05 parret student t-test. Figur modificeret fra Chabout et al. 23 med tilladelse.Blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Antal Syllables Emitted og Repertoire Over Conditions . (A) Sælbar produktionshastighed for mænd i forskellige sammenhænge. (B) Repertoire kompositioner af mænd, når i nærvær af kvindelig urin (UR), bedøvet kvindelig (AF), vågen kvinde (FE) og bedøvede hanlige (AM) kontekster. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 for post-hoc parret elevtest efter Benjamini og Hochberg korrektion (n = 12 mænd). Figur fra Chabout et al. 23 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
together.within-side = "1"> 
Figur 6: Eksempler på spektrale egenskaber i forskellig sammenhæng. (A) Amplitude. * P <0,025 for post-hoc parret student t-test efter korrektion. (B) Frekvensområde eller båndbredde. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 efter korrektion. (C) Spektral renhed af stavelserne. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 efter korrektion. Forkortelser: Urin urin (UR), bedøvet kvinde (AF), vågen kvinde (FE) og bedøvet mand (AM). Figurer modificeret fra Chabout et al. 23 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
37fig7.jpg "/>
Figur 7: Sekvensmålinger. (A) Anvendelse af ISI'en til at adskille sekvensen. Kort ISI (SI) og medium ISI (MI) bruges til at adskille stavelser inden for en sekvens, og lang ISI over 250 ms (LI) adskiller to sekvenser. (B) Sekvensernes længde målt som antal stavelser pr. Sekvens produceret af mænd i forskellige sammenhænge. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 efter korrektion. (C) Forholdet mellem komplekse sange over enkle sange produceret af mænd i forskellige sammenhænge. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 efter korrektion. Data præsenteres som middel ± SEM (n = 12 mænd). Figur fra Chabout et al. 23 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sætbare syntaksdiagrammer af sekvenser baseret på betingede sandsynligheder for hver kontekst. Piltykkelsen er proportional med den betingede sandsynligheds forekomst af en overgangstype i hver kontekst i gennemsnit fra n = 12 hanner: P (forekomst af en overgang givet startstavlen). Af klarhed er sjældne overgange under en sandsynlighed på 0,05 ikke vist. Figur fra Chabout et al. 23 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol tilvejebringer metoder til at indsamle, kvantificere og studere mandlige museprocedurer i laboratoriet på tværs af en række primært kvindelige relaterede stimuli. Som tidligere beskrevet i Chabout et al. 23 og i de repræsentative resultater fik brugen af denne metode os til at opdage kontekstafhængige vokaliseringer og syntaks, der betyder noget for de modtagende kvinder. Standardiseringen af disse stimuli vil tilvejebringe indsamling af et pålideligt antal USV'er og tillade detaljerede analyser af mandens hoftsange og repertoirer.
Når en levende kvinde er til stede hos hanen, tillader protokollen os ikke klart at identificere emitteren af vokaliseringen. Tidligere undersøgelser viste imidlertid, at størstedelen af vokaliseringen udsendt i en sådan sammenhæng var af mand 26 , 29 . De fleste af undersøgelserne bruger en konspecifik (mand eller kvinde)Som et stimulus for mændene mener at mængden af kvinders vokaliseringer i disse sammenhænge er ubetydelig 4 , 5 , 22 , 30 . Imidlertid har en nylig papir anvendt triangulering til lokalisering af vokaliseringen af emitteren i gruppehusbetingelser 31 , og viste at i en dyad bidrager kvinden til ~ 10% af USV'erne. I den foreliggende protokol tillader brugen af den bedøvede kvindelige bruger at studere mandlige vokaliseringer i nærværelse af en kvinde uden hendes vokalisering. I modsætning til forventningerne til denne nylige undersøgelse 31 fandt vi ingen forskel i antallet af stavelser emitteret mellem FE og AF-betingelserne 23 . Det er muligt, at levende kvinder ikke bidrager væsentligt til optagelserne, eller at mændene vokaliserede mindre i nærværelse af levende kvinder mod bedøvet females. Ikke desto mindre mener vi, at fremtidige eksperimenter bør overveje anvendelsen af denne trianguleringsmetode for at vurdere den potentielle virkning af kvinders bidrag.
Der er anden software til rådighed, der kan gøre nogle af de trin, vi har skitseret, selv om vi ikke tror på en måde, der er tilstrækkelig til de spørgsmål, vi stillede ved hjælp af en kombination af tre programmer: Software A, Mouse Song Analyzer software script C ved hjælp af software B, Syntaxanalyseprogrammer ved hjælp af en D + E-beregning af brugerdefinerede regnearksoftware og syntetisk dekorator ved hjælp af R. For eksempel har et nyere papir foreslået en software med navnet VoICE, der giver brugeren mulighed for automatisk at udvinde akustiske variabler fra sonogrammerne eller direkte på enheder, der var manuelt Valgt af brugeren 32 . Men de automatiserede eller semi-automatiserede sekvensanalyser er ikke så detaljerede som vores tilgang. Nogle kommercielle software kan automatisk analysere de akustiske funktioner, men giver ikke en automatAtisk klassifikation af stavelserne; Brugeren skal sortere de forskellige stavelser bagefter. Grimsley, Gadziola, et al. 33 udviklede et tabelbaseret virtuelt mus vocal organprogram, der klynger stavelser baseret på delte akustiske egenskaber, men giver ikke automatisk registrering af stavelserne. Deres program 34 er unikt, fordi det skaber nye sekvenser fra indspillede sange ved brug af Markov-modeller, og har således mere avancerede funktioner end simpel redigering.
De fleste tidligere kommunikationsstudier på mus har fokuseret på emitterens side 35 , 36 . Få studier har undersøgt modtagerens side 30 , 37 , 38 . Afspilnings- og diskriminationsprotokoller giver en simpel test for at studere modtagerens side, som den, der for nylig er beskrevet af Asaba, Kato, etal. 39 . I den undersøgelse anvendte forfatterne en to-valg testboks adskilt med akustisk skum i stedet for den Y-labyrint, der er beskrevet her. Begge valgopsætninger har fordele og ulemper. For det første isolerer Y-labyrinten ikke lyden fra den ene arm til den anden, men to-valgboksen gør det. Ved at bruge Y-labyrintdesignet kan dyret dog hurtigt evaluere de to sange, der spilles samtidigt, og bevæge sig mod den foretrukne. Ikke desto mindre hjælper afspilningseksperimenter generelt eksperimenter med at bestemme betydningen og dermed funktionerne af vokaliseringen, der genereres til specifikke dyr. Afslutningsvis bør læserne, efter at have mestret teknikkerne i denne protokol og analyser, være i stand til at behandle mange spørgsmål, der påvirker musens USVs kontekst, genetik og neurobiologi.
Ved hjælp af B6D2F1 / J-mus udløser de kvindelige associerede stimuli næsten altid USV'er fra de mænd, vi har testet i vores lab. Det er kritisk for kollegaenCt nok stavelser (> 100 i 5 min) for at kunne opnå stærk statistisk analyse. For fejlfinding, hvis der ikke er registreret USV'er (eller ikke nok), skal du kontrollere konfigurationen for at sikre, at lyde optages. Lav en levende inspektion af hvad der sker i buret under optagelse ved at se på real-time sonogrammet på computerskærmen efter introduktionen af stimulus. Ellers forsøge at genudsætte hanen til en kønsmodne / modtagelig kvinde natten over og derefter huske dem alene i flere dage eller op til en uge før optagelse igen. Baseret på anekdotiske observationer finder vi, at nogle mænd synger meget på en dag (i næsten hele 5 min), og ikke meget den næste dag, og så igen en anden dag. Vi kender ikke grunden til, at sådanne inden for fagvariationer forekommer, men vi antager, at det sandsynligvis er motiverende eller sæsonbestemt for mændene og østrus tilstanden for kvindelig urin. Hvis der ikke registreres USV'er, skal du prøve at registrere dyret på flere dage for at afhente disse variable effekter. UbegrIke i sangfugle, har vi ikke bemærket åbenlyse forskelle i sangmængden baseret på tid på dagen. Vi finder, at mændene ikke synger meget (<100 stavelser om 5 minutter), før de er 7 uger gamle.
Detekteringsmetoderne, der præsenteres her, kan udtrække tusindvis af stavelser og alle de akustiske parametre om få minutter. Men som en hvilken som helst automatisk detekteringsmetode er den meget følsom over for baggrundsstøj. Ved brug af Mouse Song Analyzer-registreringssoftware med støjende optagelser (f.eks. Fra dyr optaget med sengetøj) kan det kræves, at detekteringen "tærskel" justeres for at give større fleksibilitet. Dette vil dog også øge antallet af falske positive stavelser, og den automatiske detektering kan mislykkes. Under sådanne omstændigheder kan manuel kodning anvendes.
Som nævnt er antallet, repertoarerne og latensen af vokaliseringer meget variable afhængigt af belastningen, og man må derfor ændre parametre (optagelseslængde,Stimulering, automatiseret stavelsesdetektering osv. ) For nogle stammer for at sikre optimale optagelser til statistiske analyser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute-midler til EDJ. Vi takker Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Universitet Paris syd XI - FRANKRIG) for at udlåne os højttalerens hardware. Vi takker også medlemmer af Jarvis Lab for deres support, diskussioner, rettelser og kommentarer til dette arbejde, især Joshua Jones Macopson for hjælp med tal og test. Vi takker Dr. Gustavo Arriaga for hjælp med Mouse Song Analyzer-softwaren, opgradering af den til os til V1.3 og andre aspekter af denne protokol. V1.0 af softwaren blev udviklet af Holy and Guo, og v1.1 og v1.3 af Arriaga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | - | 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | - | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | - | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip |
|
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http://www.graphviz.org | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20 mg/mL) | Anased | - | |
| Ketamine HCl (100 mg/mL) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
- Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
- Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
- Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
- Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
- Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
- Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
- Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
- Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
- Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
- Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
- White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
- Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
- Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
- Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
- Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
- Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
- Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).
