Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Eliciting וניתוח זכר העכבר Ultrasonic ווקאליזציה (USV) שירים

Published: May 9, 2017 doi: 10.3791/54137
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3
1Department of Neurobiology, Duke University, 2Howard Hughes Medical Institute, 3The Rockefeller University

Summary

עכברים לייצר רפרטואר multisyllabic מורכבים של vocalizations קולי (USVs). אלה USVs נמצאים בשימוש נרחב כמו readouts עבור הפרעות נוירופסיכיאטריות. פרוטוקול זה מתאר כמה מהנוהלים שלמדנו ופיתחנו כדי לעקב באופן עקבי, לאסוף ולנתח את התכונות האקוסטיות והתחביר של שירי העכבר.

Abstract

עכברים לייצר vocalizations קולי (USVs) במגוון של הקשרים חברתיים לאורך התפתחות ובגרות. אלה USVs משמשים אחזור אם אמא 1 , אינטראקציות לנוער 2 , מול אינטראקציות מין אותו 3 , 4 , 5 , אינטראקציות טריטוריאלית 6 . במשך עשרות שנים, USVs היו בשימוש על ידי חוקרים כמו proxies ללמוד נוירופסיכיאטרית והתפתחותית או הפרעות התנהגותיות 7 , 8 , 9 , ולאחרונה להבין מנגנונים ואבולוציה של תקשורת קולית בקרב חוליות 10 . בתוך אינטראקציות מיניות, עכברים זכרים בוגרים לייצר שירים USV, אשר יש כמה תכונות דומות שירי חיזור של ציפורי שיר 11 . שימוש כזה reper multisyllabicToires יכול להגדיל את הגמישות הפוטנציאלית ואת המידע שהם נושאים, כפי שהם יכולים להיות מגוונים כיצד אלמנטים מאורגנים recombined, כלומר תחביר. בפרוטוקול זה שיטה אמינה כדי לעורר שירים USV מעכברים זכרים בהקשרים חברתיים שונים, כגון חשיפה שתן נקבה טרי, בעלי חיים הרדים, ונקבות הנבלות הוא תיאר. זה כולל תנאים כדי לגרום כמות גדולה של הברות מן העכברים. אנו מפחיתים את ההקלטה של ​​רעשי הסביבה עם תאי קול זולים, ומציגים שיטת כימות כדי לזהות, לסווג ולנתח באופן אוטומטי את USVs. האחרונה כוללת הערכה של שיעור שיחה, רפרטואר קולי, פרמטרים אקוסטיים ותחביר. גישות שונות תובנה על שימוש השמעה ללמוד העדפה של בעלי חיים עבור סוגי שירים ספציפיים מתוארים. שיטות אלה שימשו לתיאור שינויים אקוסטיים ותחביר בין הקשרים שונים בעכברים זכריים, והעדפות שירים בעכברים הנשיים.

Introduction

יחסית לבני אדם, עכברים מייצרים הן קוליות בתדר נמוך והן בתדר גבוה, הנקראות מאוחר יותר בשם "קולי קולי" (USVs) מעל טווח השמיעה שלנו. USVs מיוצרים במגוון של הקשרים, כולל מ אחזור הגור אמא, אינטראקציות לנוער, על יחסי מין או יחסי מין למבוגרים אותו 4 , 12 . אלה USVs מורכבים רפרטואר multisyllabic מגוונים אשר ניתן לסווג ידנית 9 או באופן אוטומטי 10 , 11 . תפקידם של USVs אלה בתקשורת נמצא תחת חקירה גוברת בשנים האחרונות. אלה כוללים שימוש USVs כמו readouts של מודלים העכבר של הפרעות נוירופסיכיאטריות, התפתחותיות או התנהגותיות 7 , 8 , ומצבים מוטיבציוניים / רגשיים פנימיים 13 . USVs נחשבים להעביר מידע אמין על המצב של מיטר כי הוא שימושי עבור מקלט 14 , 15 .

בשנת 2005, הקדוש ו Guo 11 , את הרעיון כי עכברים זכרים בוגרים USVs היו מאורגנים כמו רצף של אלמנטים להתקשר multisyllabic או הברות הדומות ציפורי שיר. במינים רבים, רפרטואר multisyllabic מאפשר emitter לשלב ולהזמין הברות בדרכים שונות כדי להגדיל את המידע הפוטנציאלי נשאו על ידי השיר. שינוי בתחביר זה הוא האמין כי יש רלוונטיות אתית עבור התנהגות מינית והזדווגות העדפות 16 , 17 . מחקרים שנערכו לאחר מכן הראו כי עכברים זכרים הצליחו לשנות את ההרכב היחסי של סוגי הברה שהם מייצרים לפני, במהלך ולאחר נוכחות של נקבה 5 , 18 . כלומר, עכברים זכרים בוגרים להשתמש USVs שלהם עבור התנהגות החיזור, או כדי למשוךאו לשמור על קשר קרוב עם נקבה, או כדי להקל על ההזדווגות 19 , 20 , 21 . הם גם נפלטים באינטראקציות בין גברים לגברים, כנראה כדי להעביר מידע חברתי במהלך אינטראקציות 4 . כדי ללכוד שינויים אלה רפרטואר, מדענים בדרך כלל למדוד את תכונות ספקטרלי (פרמטרים אקוסטיים, כגון משרעת, תדרים, וכו ' ), מספר USVs הברות או שיחות, ואת חביון הראשון USV. עם זאת, מעטים באמת להסתכל על רצף הדינמיקה של USVs אלה בפירוט 22 . לאחרונה הקבוצה שלנו פיתחה שיטה חדשנית למדידת שינויים דינמיים ברצף ההברה של USV 23 . הראינו כי הסדר הברה בתוך שיר (כלומר תחביר) אינו אקראי, כי הוא משתנה בהתאם להקשר החברתי, וכי בעלי החיים מקשיב לזהות שינויים אלה כמו רלוונטיים מבחינה אתית.

אנו מציינים thבחוקרים רבים החוקרים תקשורת בבעלי חיים אינם מצרפים למונח 'תחביר' בדיוק אותה משמעות כמו תחביר המשמש בדיבור האנושי. עבור לימודי התקשורת בבעלי חיים, אנו פשוט מתכוון רצף הורה, לא אקראי, של צלילים עם כמה כללים. עבור בני אדם, בנוסף, רצפים ספציפיים ידועים משמעויות ספציפיות. אנחנו לא יודעים אם זה המקרה של עכברים.

במאמר זה ואת הווידאו הקשורים, אנו שואפים לספק פרוטוקולים אמינים כדי להקליט החיזור של עכברים USVs החיזור על פני הקשרים שונים, ולבצע פלייבקים. השימוש של שלושה תוכנות ברצף בשימוש עבור: 1) הקלטות אוטומטיות; 2) זיהוי הברה קידוד; ו 3) ניתוח מעמיק של תכונות ההברה תחביר הוא הפגינו ( איור 1 ). זה מאפשר לנו ללמוד יותר על עכברים זכר מבנה USV ופונקציה. אנו מאמינים כי שיטות אלה להקל על ניתוחים לנתונים יכול לפתוח אופקים חדשים באפיון תקשורת קול רגיל נורמלי ב mouמודלים של תקשורת והפרעות נוירופסיכיאטריות, בהתאמה.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הפרוטוקולים הניסוייים אושרו על ידי אוניברסיטת דיוק המכון טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (IACUC) תחת פרוטוקול # A095-14-04. הערה: ראה טבלה 1 בסעיף " חומרים וציוד " לקבלת פרטים על תוכנה בשימוש.

1. גירוי והקלטת USVs עכבר

  1. הכנת הזכרים לפני ההקלטה
    הערה: תוצאות נציג התקבלו באמצעות B6D2F1 / J עכברים צעירים זכר (7 - 8 שבועות). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל זן.
    1. הגדר את מחזור האור של חדר בעלי החיים על מחזור של 12 שעות אור / כהה, אלא אם כן נדרש אחרת. עקוב אחר כללי הדיור הסטנדרטי של 4 עד 5 זכרים לכלוב, אלא אם כן נדרש אחרת או צורך. שלושה ימים לפני ההקלטה, חושפים את הזכרים באופן אינדיבידואלי לנקבה בוגרת מבחינה מינית וקליטה (עד 3 זכרים עם נקבה אחת לכלוב) באותו זן בן לילה.
    2. למחרת להסירהנקבה מהכלוב של הגבר ומביאה את הזכרים ללא הנקבות לפחות יומיים לפני ישיבת ההקלטה הראשונה כדי להגביר את המוטיבציה החברתית לשיר (בהתבסס על הניסוי שלנו וטעינות אנקדוטיות).
  2. הכנת תיבות ההקלטה
    1. השתמש במקרר החוף (הממדים הפנימיים הם L 27 x W 23 x H 47 ס"מ) לפעול כמו אולפן קול attenuation תיבת ( איור 2 א ). קידוח חור קטן על גבי הקופסה כדי לאפשר את המיקרופון של חוט לרוץ פנימה.
      הערה: יש להקליט את בעלי החיים בצליל מועט וסביבה מבודדת מבחינה ויזואלית, על מנת להקליט עשרות עכברים בבת אחת ללא שמיעה או לראות אחד את השני, למנוע הקלטה של ​​זיהום אוויר בחדר ציוד רעש ואנשים בחדר, כדי לקבל נקי הקלטות קול של עכברים ( איור 2 ב ). אנחנו לא ציין eHos קול או עיוותים לקול בעת השוואת vocalizations של העכבר אותו בתוך לעומת מחוץ tהוא נשמע החדר הנחתה ( איור 2 ג ); במקום זאת, יש את הצלילים עשויים להיות חזק יותר ויש לי פחות הרמוניות בתוך החדר.
    2. חבר את המיקרופון לחוט, את התיל לכרטיס הקול ואת כרטיס הקול למחשב כדי לעבוד עם תוכנת הקלטת קול ( לדוגמה, תוכנה א ' באיור 1 ובטבלה 1 ). תוכנה נאותה להקלטת קול נחוצה, כגון תוכנה שמייצרת קבצי קול .WAV.
    3. הניחו כלוב ריק (58 x 33 x 40 ס"מ) בתוך התיבה האטומה לרעש, והתאימו את גובה המיקרופון כך שקרום המיקרופון הוא 35-40 ס"מ מעל תחתית הכלוב, וכי המיקרופון מרוכז מעל הכלוב ( ראה איור 2 א ).
  3. קביעת תצורה של תוכנת ההקלטה ( טבלה 1 ) להקלטה מתמשכת
    1. לחיצה כפולה ותוכנות פתוחות א. לחץ על התפריט "תצורה" ופתח אותו ובחר את ההתקן בשם, קצב הדגימה (250,000 הרץ), פורמט (16 סיביות).
    2. בחר את המפתח "טריגר" אפשרות לבדוק "החלף".
      הערה: הגדרה זו מאפשרת את הפעלת ההקלטה על ידי לחיצה על מקש (F1, F2 וכו ' ) תוך הנחת הגירוי בכלוב העכבר.
    3. הזן את מזהה העכבר מתחת לפרמטר "שם".
    4. הגדר את גודל הקובץ המקסימלי לדקות הרצויות של ההקלטה (אנחנו בדרך כלל מוגדר 5 דקות).
      הערה: ככל שהדקות ארוכות יותר, יש צורך בכמות גדולה יותר של זיכרון אחסון במחשב. אם מצב רציף אינו מוגדר, התוכנה חותכת את התקפי השיר בתחילת או בסוף רצף המבוסס על פרמטרים להגדיר, ולכן אחד לא יכול לכמת באופן אמין רצפים.
  4. הקלט USVs באמצעות גירויים שונים. הערה: כל גירוי יכול לשמש באופן עצמאי בהתאם לצרכים הניסיוניים של המשתמש.
    1. בעדינות להרים את החיה כדי להיות מוקלט על ידי הזנב, ומניחים אותו בכלוב ללא מצעים (כדי למנוע movרעש רעש על המצעים) בתוך התיבה האטומה לרעש, והניח את מכסה המתכת הפתוח על כלוב, כשהמכסה פונה כלפי מעלה.
    2. סגור את תיבת הקול attenuated ולתת את החיה להרגיל אותו במשך 15 דקות. לבצע את ההכנות גירויים (1.4) ברגע זה.
  5. הכנת גירויים
    1. הכנת דגימת שתן טרי (UR) כמו גירוי
      1. השג דגימות שתן לכל היותר 5 דקות לפני ההקלטה ההקלטה כדי להבטיח אפקט מקסימלי להשראת שיר מן הזכרים. הערה: שתן כי ישבו סביב יותר, במיוחד במשך שעות או לילה, אינו יעיל כמו 24 , 25 , אשר יש לנו אימות אמפירי 23 .
      2. בחר נקבה או זכר (בהתאם למין של הגירוי לשמש) בכלוב אחד, לתפוס את העור מאחורי הצוואר לרסן את החיה ביד אחת כמו הליך הזרקת סמים עם הבטן חשוף.
      3. לאחר מכן, בחר כלוב אחר. וחזור על אותו הליך עם נקבה או זכר אחרים, אבל עם קצה כותנה אותו בעבר בשימוש.
        הערה: הליך זה מקפיד לערבב את השתן של לפחות שתי נקבות או זכרים משני כלובים עצמאיים על קצה כותנה זהה כדי להבטיח נגד כל הדר או השפעות בודדות אחרות כפי שהוא ידוע כי מחזור הדרמה יכול להשפיע על התנהגות שירה 18 , 26 .
      4. מניחים את קצה כותנה לשמש זכוכית נקייה או צלחת פטרי פלסטיק.
        הערה: מאז קצה כותנה עם שתן יהיה צורך להשתמש בתוך 5 דקות הבא, אין צורך לכסות אותו כדי למנוע אידוי.
    2. Preparatiעל גירוי נקבה נקבה (FE) כמו גירוי
      1. בחר אחד או שניים כלובים חדשים של נשים בוגרות מינית. זיהוי נקבות בשלב פרו-אסטרוס או אדרס על ידי בדיקה חזותית (פתיחת הנרתיק רחב סראונד להקיף כמוצג ב 27 , 28 ). הפרד אותם בכלוב אחר עד לשימוש.
    3. הכנה של הנקבות בעלי חיים מורדמים (AF) או זכרים (AM) כגירוי
      1. עבור AF, בחר נקבה מן הבריכה מעל (או pro-estrus או estrus). עבור AM, בחר זכר מכלוב של עכברים זכרים בוגרים.
      2. להרדים את הנקבה או הזכר עם הזרקת intraperitoneal של פתרון של קטמין / Xylazine (100 ו -10 מ"ג / ק"ג בהתאמה).
      3. השתמש משחה עין כדי למנוע התייבשות של העיניים בעוד החיה הוא הרדים. בדוק הרדמה נאותה על ידי בדיקת רפלקס רפרקס כפה כאשר צבט. מניחים את החיה הרדים בכלוב נקי על מגבת נייר, שנינותH כלוב על כרית חום להגדיר על "חום מינימלי" כדי להבטיח שליטה על טמפרטורת הגוף.
      4. Re-use בעלי חיים אותו עד 2 עד 3 פעמים עבור הפעלות הקלטה שונים אם יש צורך לפני שהם מתעוררים (בדרך כלל בסביבות 45 דקות). שים אותם בחזרה על כרית החום לאחר כל הקלטה.
      5. בקרת קצב הנשימה על ידי בדיקה ויזואלית (~ 60 - 80 נשימות לדקה) וטמפרטורת הגוף על ידי נגיעה החיה כל 5 דקות (צריך להיות חם למגע).
    4. כאשר מוכן להקליט, לחץ על כפתור "הקלטה" של התוכנה א.
      הערה: ההקלטות לא יתחילו אלא אם המשתמש לוחץ על לחצן המקש המשויך לכל ערוץ; לפקח על להאכיל את האודיו לחיות מן הכלובים על מסך המחשב כדי לוודא את החיות לשיר את הקלטות מקבלות כראוי.
    5. בעת ובעונה אחת לחץ על לחצן המקש המתאים של התיבה הרצויה (es) כדי להקליט ( כלומר, F1 עבור תיבה 1), ולהציג את הגירוי הרצוי.
      1. להציג את אחד הגירויים כדלקמן. מניחים את קצה כותנה עם דגימות שתן טרי בתוך הכלוב, או מקום נקבה חיה בתוך הכלוב, או במקום אחד של הרדים, בעלי חיים (AF או AM) על גבי מכסה המתכת של הכלוב.
    6. סגור את תיבת ההקלטה בשקט, והנח להקליט את מספר הדקות שנקבע מראש ( לדוגמה, 5 דקות כמתואר בסעיף 1.3).
    7. לאחר ההקלטה, לחצו על הלחצן האדום האדום כדי לעצור את ההקלטה.
    8. אם בעל חיים מורדם שימש גירוי, לפתוח את תיבת ההקלטה לרעש, לקחת את החיה הרדים מן המכסה מתכת של הכלוב והחזיר אותו על כרית חימום לפני הפגישה הבאה הקלטה, או אם כבר לא באמצעות החיה כמו בדיקת גירוי זה כל 15 דקות עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה שכיבה.
    9. פתח את הכלוב ולהסיר את החיה הבדיקה מודעת, ומניחים אותו בחזרה לכלוב הבית שלה. נקה את הכלוב הבדיקה עם אלכוהול 70% אNd מים מזוקקים.

עיבוד קבצי. WAV ו הברה קידוד באמצעות עכבר השיר Analyzer v1.3

  1. פתח את תוכנת קידוד B ( איור 1 , טבלה 1 ) והניח את התיקייה המכילה את הסקריפט של התוכנה C של "Mouse Song Analyzer" ( איור 1 , טבלה 1 ) במסלול B של התוכנה על ידי לחיצה על "set path" והוספת התיקייה בתוכנה לאחר מכן סגור את התוכנה B כדי לשמור.
  2. הגדר את ההגדרות המשולבות של התוכנה B + C של הגדרות זיהוי הברה. הערה: סקריפט התוכנה C קוד יוצר באופן אוטומטי תיקיה חדשה בשם "sonograms" עם קבצים בפורמט .sng באותה תיקייה היו קבצי wav. זה בדרך כלל טוב יותר לשים את כל קבצי .WAV מ מושב ההקלטה אותו שנוצר באמצעות תוכנה א באותה תיקייה.
    1. פתח את התוכנה B עם C.
      הערה: גרסה זו של תוכנה B היא לגמרי cOmpatible עם התסריט תוכנה C. זה לא יכול להיות מובטח כי כל הגירסאות המאוחרות יקבלו את כל הפונקציות הכלולות בקוד הנוכחי.
    2. נווט לתיקיה של עניין המכיל את קבצי ההקלטה .WAV כדי לנתח באמצעות "התיקיה הנוכחית" חלון.
    3. ב "חלון הפקודה", הזן את הפקודה "whis_gui".
    4. בחלון החדש של Windows-GUI, שימו לב למספר חלקים של תת-חלון עם פרמטרים שונים ( איור 3 ), כולל "פרמטרים של Sonogram", "אפשרויות שריקה", וכל השאר. התאם את הפרמטרים לזיהוי USVs. השתמש בהגדרות הפרמטרים הבאים לאיתור הברות USV מעכברי מעבדה ( כגון זני עכבר B6D2F1 / J ו- C57BL / 6J המשמשים במחקר שלנו):
    5. במקטע Sonogram Parameters, כוונן את התדר המינימלי ל - 15,000 הרץ, התדר המקסימלי ל - 125,000 הרץ, תדר הדגימה ( מספר התדירות ) tO 256 קילוהרץ, והסף ל -0.3.
    6. בסעיף אפשרויות שריקה, כוונן את סף הטוהר ל -0.775 , את משך המינימום של ההברה ל -3 ms, את התדר המינימלי ל -20,000 הרץ ואת משך המסנן ל -3 ms.
    7. בקטעים האחרים, התאם את משך הערה מינימלי ל 3 ms, ואת ספירת הערה מינימלית ל 1.
    8. עבור פרוטוקול הברה סיווג , בחר תיבות בחלק האמצעי של החלון whis_gui:
      סיווג ברירת המחדל מבוסס על הקודש ו Guo 11 ו Arriaga et al. 10 , אשר קודי ההברה על ידי מספר קפיצות המגרש ואת כיוון הקפיצה: S להברה פשוטה מתמשכת; D עבור קפיצה אחת למטה המגרש; U עבור אחד לקפוץ לקפוץ; DD עבור שני קפיצות מטה ברציפות; DU עבור דאו אחדN אחד לקפוץ; וכו ' זה יהיה ברירת המחדל אם המשתמש לא לבחור שום דבר. למשתמש יש אפשרות להפעיל את הניתוח על סוגי הברה מסוימים על ידי בחירת כל תיבות הייצוג.
      כדי לבחור סיווג הברה כפי שתואר על ידי Scattoni, et al. 9 , בנוסף לבחור פיצול של הקטגוריה, אשר מפריד את זה סוג לתוך קטגוריות משנה יותר מבוסס על צורת ההברה.
      בחר הרמוניות אם המשתמש רוצה עוד מיון הברות לאלה עם וללא הרמוניות.
  3. לסווג את ההברות של קבצי WAV עניין
    1. בחר את כל קבצי .WAV בהפעלה אחת הקלטה בחלק השמאלי העליון של החלון whis_gui.
    2. לחץ על "קבל sonograms" באמצע החלון whis_gui ( איור 3 ). תיקייה חדשה המכילה את sonograms ייווצר, עם פורמט. Sng הקובץ.בחר את כל sonograms (קבצי .ng) העליוןבפינה השמאלית של window.Enter whi. "מזהה בעלי חיים" ו "מזהה מושב" בתיבות מתחת לחלון קובץ sonogram. לאחר מכן לחץ על תהליך sonograms.
      1. שימו לב לשלושה סוגי קבצים בתיקיית הסונוגרמה: "Animal ID-Session ID-Notes.csv" (מכיל מידע על ההערות שהופקו מתוך ההברות), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" (מכיל ערכים של כל הברות מסווגות, כולל תכונות ספקטרליות שלהם ואת המספר הכולל של הברות שזוהו ב sonograms), "Animal ID-Session ID -Traces.mat", (מכיל ייצוגים גרפיים של כל ההברות).
        הערה: קובץ "Animal ID-Session-Syllables" מכיל לעיתים אחוז קטן (2 - 16%) של הברות USV לא מסווגות המורכבות יותר מאלו שנבחרו, או שיש להן שתי הברות של בעלי חיים החפות זו על זו 23 . אלה ניתן לבדוק בנפרד מקובץ עקבות במידת הצורך.

3. כימות מבנה אקוסטי הברה ותחביר

הערה: הוראות לגבי הצעדים הנדרשים לצורך ניתוח תחביר ראשוני נכללים בסעיף "קרא אותי!" גיליון אלקטרוני של "ניתוח שיר מדריך v1.1.xlsx" קובץ, מותאם אישית שלנו מעוצב גיליון אלקטרוני מחשבון ( איור 1 , טבלה 1 ).

  1. פתח את התסריט של התוכנה C פלט הקובץ "מזהה מזהה בעל מזהה ID -Syllables.csv" שהושג בסעיף לעיל עם תוכנת גיליון אלקטרוני D ( איור 1 , טבלה 1 ). הוא מכיל את המספר הכולל של הברות שזוהו בכל sonograms, ואת כל התכונות הספקטראליות שלהם.
  2. אם לא מומרים עדיין, בתוך תוכנת גיליון אלקטרוני D להמיר את הקובץ. CSV כדי הפרדת עמודה בתוכנה D כדי לשים כל ערך לתוך עמודות בודדות.
  3. פתח את "מדריך ניתוח שיר v1.1.xlsx" הקובץ גם בתוכנה ד לאחר מכן לחץ על הE גיליון אלקטרוני, ולהעתיק ולהדביק את "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" נתוני הקובץ לגיליון זה כפי שמומלץ בהוראות גיליון התבנית. הסר שורות עם הקטגוריה 'לא מסווג' של הברות.
  4. לאחר הסרת שורות 'Unclassified', הראשון להעתיק ולחשב מחדש ISI (inter inter הברה) נתונים בעמודה O לתוך עמודה E. שנית, להעתיק את כל הנתונים מהעמודה א 'אל לתוך גיליון נתונים' נתונים '.
  5. בגיליון הנתונים הזן את מזהה בעלי החיים (עמודה AF) ואת אורך ההקלטה (בתוך דקות, עמודה AC).
    הערה: זיהוי בעלי חיים צריך להתאים את אחד נכנסו להקליט להגדיר. הקובץ יזהה את התווים שהוזנו והשווה אותם לשם של קבצי wav.
  6. קביעת חתך ISI להגדיר רצף באמצעות גיליון אלקטרוני שכותרתו "צפי ISI", את התוצאה "ISI העלילה".
    הערה: במחקר העבר שלנו 23 , קבענו את החיתוך בשני סטנדאפיםRd חריגות ממרכז השיא האחרון. זה היה מורכב מרווחי זמן (LI) של יותר מ -2,000 ms, אשר מופרדים בין שירים שונים בתוך הפגישה של שירה.
  7. הצג את התוצאות העיקריות בגיליון האלקטרוני 'תכונות' (קיבוץ כל התכונות הספקטריות הנמדדות מכל בעל חיים).
    הערה: אם המשתמש השתמש בהגדרת הקטגוריה של הברה המוגדרת כברירת מחדל בתסריט תוכנה C המתואר בסעיף 2.8.9, ההברות מסווגות עוד יותר ל -4 קטגוריות כמתואר לעיל וב- Chabout, et al. 23 : 1) הברה פשוטה ללא כל קפיצות המגרש, «s»; 2) שתי הברות הערה מופרדים על ידי קפיצה אחת כלפי מעלה ("u"); 3) שתי הברות הערה מופרדות על ידי קפיצה אחת כלפי מטה («ד»); ו 4) הברות מורכבות יותר עם שניים או יותר נפילה נפילה בין הערות («מ '»).
  8. עבור ערכי תחביר, לחץ על גיליון "הסתברויות גלובליות" אשר מחשב הסתברויות של כל זוג sYllable סוגי המעבר ללא התחלות הברות, באמצעות המשוואה הבאה 23 .
    P (התרחשות של סוג מעבר) = סה"כ מספר המופעים של סוג מעבר / מספר כולל של מעברים מכל הסוגים
  9. לחץ על גיליון "הסתברויות מותנה" כדי לחשב את ההסתברויות מותנה עבור כל סוג מעבר ביחס להברות החל, אשר משתמשת במשוואה הבאה:
    P (התרחשות של סוג מעבר בהתחשב בהברה ההתחלתית) = סך כל המופעים של סוג מעבר / סך כל המופעים של כל סוגי המעבר עם אותה הברה התחלתית
  10. כדי לבדוק אם ואילו ההסתברויות המעבר לעיל נבדלים לא אקראי, באמצעות מודל Markov הסדר הראשון, בעקבות הגישה 23 , להשתמש בתוכנה מותאמת אישית F ( למשל תחביר תחביר בסטודיו R, איור 1 , <Strong> טבלה 1) עם הסקריפטים הבאים של R: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R עבור קבוצות בתנאים שונים; או Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R בין הקבוצות באותם תנאים.
  11. בצע בדיקה מרובעת כימית, או מבחן אחר של העדפתך, כדי לבדוק הבדלים סטטיסטיים בהסתברות המעבר של אותה חיה על פני ההקשר אחר (זוג חכם), בעקבות הגישה 23 .
    הערה: פרטים נוספים על המודל הסטטיסטי המשמש להשוואת תחביר בין הקבוצות נמצאים ב 23 . החוקרים יכולים להשתמש בגישות אחרות כדי לנתח את הסתברויות המעבר העולמי או מותנה כי הם או אחרים פיתחו.
  12. כדי להציג בצורה גרפית את sequences כמו דיאגרמות תחביר להזין את הערכים לתוך רשת גרף תוכנה G (ראה איור 1 , טבלה 1 ), עם צמתים המציינים את ההברה cate שוניםGories, ואת צבע החץ ו / או פיקסל עובי המייצגים טווחים של ערכי הסתברות בין הברות.
    הערה: לצורך הבהירות, עבור גרף ההסתברות הגלובלית, אנו מציגים רק מעברים הגבוהים מ - 0.005 (יותר מ 0.5% - מהמקרים). עבור ההסתברויות המותנות, אנו משתמשים בסף של 0.05 מכיוון שכל הסתברות ב"מודל העולמי "נמוכה יותר בהתחשב בעובדה שאנו מתחלקים במספר ההברות הכולל ולא רק לפי סוג הברה מסוים.

4. עריכת שיר ובדיקת העדפה לסוג של שיר

הערה: ניתן להשתמש בפלייבקים של USVs כדי לבחון בצורה ניסויית תגובה התנהגותית של בעל חיים, כולל העדפה לסוג שיר מסוים. בגלל ההעדפות הנשי עשוי להשתנות בהתאם למצב של אפרס, עבור נקבות לוודא שהם נמצאים באותו מצב estrus לפני הבדיקה כדלקמן:

  1. הכן נקבות עם ניסיון מיני כמה ימים לפני הניסוי ההשמעה לחשוף נקבות מיניות בוגרות (7 שבועות) לזכר במשך 3 ימים לפני הניסויים כדי לגרום להרס (אפקט Whitten 28 ), על ידי הצבתם בכלוב הפרדה (פלסטיק מוצק ברור עם חורים קדוחים בו) המאפשרת לנקבה לראות ו להריח את הזכר, אך למנוע יחסי מין.
  2. עקוב אחר מחזור המחזור, וכאשר פרו-אסטרוס או אדרס ניכרים (פתח נרתיקי וסראונד ורוד כפי שמוצג ב -27 ), החזירו את הנקבה חזרה לכלוב שלהם. הם מוכנים להיבדק למחרת.
  • הכינו את קבצי השירים להקרנה
    1. השתמש בהעתקה והדבקה של פונקציות בתוכנת עיבוד קול H ( למשל SASLap Pro, איור 1 , טבלה 1 ) כדי ליצור שני קבצי WAV. עם התנאים הרצויים לשמש גירויים. כדי להגן מפני כמות של קולות כמשתנה, ודא שני קבצי הקול מכילים את אותו מספר של sYllables ואורך sequences (bouts השיר) מאותו זכר או זכר שונה מן ההקשרים הרצויים ( למשל UR).
    2. פתח את הקובץ הראשון המכיל שיר ממצב 1 בתוכנה H. לאחר מכן עבור אל קובץ> מבצעים> הוסף ערוצים (ים) מקובץ, ובחר את קובץ הקול השני כדי לבדוק מהמצב 2. זה יוצר 2 ערוצים, אחד עבור כל תנאי.
    3. כוונן את עוצמת הקול חזותית אם יש צורך לוודא את אמצעי האחסון של שני הקבצים להתאים אחד את השני, על ידי הולך ערוך> אמצעי אחסון.
    4. לאחר מכן עבור אל עריכה> תבנית> הדגימה תדר המרה, ובחר להמיר מ 250,000 הרץ ל 1,000,000 הרץ כדי להפוך את קבצי .WAV מתדר דגימה של 256 קילוהרץ ל 1 MHz. שלב זה נחוץ עבור התקן ההשמעה לקריאת קבצי wav.
    5. שמור קבצים חדשים אלה כמו קבצי הבדיקה להיות שיחק בחזרה. הקפד לזהות איזה שיר נמצא באיזה ערוץ (1 או 2). למטרות הבהירות שם "file.wav הקובץ".
    6. עבור אל EXit> Format> החלפת ערוצים והחלפת שני הערוצים. שמור את הגרסאות המחליפות באמצעות שם אחר. הערה: זה יהיה עותק ההפוך עם ערוצי הפוך, בשם "file name_swapped.wav" מאוחר יותר.
  • הכן את מנגנון ההשמעה
    1. נקו את מנגנון ההשמעה "Y- מבוך" עם אלכוהול 70% ואחריו מים מזוקקים. יבש אותו עם מגבות נייר. המבוך Y שלנו הוא אטום פלסטיק ביתי מוצק פלסטיק אטום, עם זרועות של 30 ס"מ אורך, ושני חורים קדוח על הקצוות הקיצוניים של המבוך כדי לאפשר את הדובר אולטרסאונד להתאים ברמת הרצפה של הזרועות ( איור 4 א ).
    2. ודא שהרמקולים נמצאים במצבם הנכון ומחוברים לכרטיס הקול, והכרטיס מחובר למחשב.
    3. פתח את התוכנה A, בחר Play> Device (התקן) <Device (התקן) ובחר את התקן כרטיס הקול להפעלה. בחר "השתמש כותרת כותרת הקובץ". עבור אל Play> Playlist וטען את קובץ העניין המכיל את שני הצ'אNnels ( כלומר "file.wav"). בחר "מצב לולאה". הגדר את מקליט הווידאו מעל מבוך כדי לכסות את המבוך כולו.
  • בצע את הניסוי ההשמעה
    1. מניחים את הנקבה הבדיקה במבוך במשך 10 דקות הרגל. לאחר 10 דקות, אם הנקבה אינה בזרוע ההתחלה ולאחר מכן בעדינות לדחוף את הנקבה בחזרה הזרוע ההתחלתית, ולסגור את חלון ההפרדה הפלסטית.
    2. בחר את הקובץ מוכן ("file.wav") כדי השמעה לנגן אותו. התחל את הקלטת וידאו, ולוודא לזהות איזה ערוץ ממוקם על זרוע Y- מבוך ( כלומר : UR בצד שמאל, או FE בזרוע ימין) עם פתק נייר בתחום הקלטת וידאו של תצוגה.
    3. אפשר לנקבה לשמוע את השירים במצב לולאה ולחקור את מבוך במהלך מספר הרצוי של דקות ( כלומר 5 דקות): זה מפגש אחד. להחזיר את הנקבה בחזרה הזרוע ההתחלה. לאפשר לה לנוח במשך 1 דקות בעת הכנת הפגישה הבאה. RemOve כל עקבות שתן צואה עם מים מזוקקים.
    4. טען את הקובץ "file_swapped.wav", החלף את המיקום של הערות הנייר עבור הקלטת הווידאו, הזז את הצד השמאלי לצד ימין ולהיפך, לאחר דקה, הפעל את הקובץ. .
    5. חזור על שלבים 4.4.3 עד 4.4.4 עבור סך של 4 מפגשים x 5 דקות כדי לשלוט על גילוי הטיה צד פוטנציאלי במהלך הבדיקה. הפסק את הקלטת הסרטון בסוף כל הפעילויות באתר על ידי לחיצה על הלחצן 'עצור אדום'. לנקות את המבוך עם אלכוהול 70% ו מים מזוקקים בין הנקבות.
    6. חזור על כל השלבים עם שיר אחר להמחיש שבוע לאחר מכן עם אותן נקבות כדי לקבל תוצאות מספיקות כדי לבדוק את האמינות של הממצאים.
    7. מאוחר יותר לצפות בקטעי וידאו, ולהשתמש טיימר על וידאו סטופר כדי למדוד את הזמן המושקע על ידי הנקבות בכל זרוע עבור כל מפגש. לנתח את הנתונים שהתקבלו סטטיסטית עבור העדפות השיר אפשרי.

    • Representative Results

    בפרוטוקול הנוכחי, שינויים התנהגות קולי ו תחביר של גברים B6D2F1 / J עכברים אופיינו. באופן כללי, באמצעות פרוטוקול זה הצלחנו להקליט, בממוצע לכל זכר לכל 5 דקות הפעלה, 675 ± 98.5 הברות מסווגות בתגובה אור נקבה, 615.6 ± 72 ב FE, 450 ± 134 ב AF, 75.6 ± 38.9 AM ו 0.2 ± 0.1 ב UR זכר (n = 12 גברים). השיעורים היו ~ 130 הברות / דקות עבור UR, ~ 120 הברות / דקות עבור FE, או ~ 100 הברות / דקות עבור הקשרים AF ( איור 5 א ). גברים מייצרים כמות הרבה יותר גדולה של הברות בתגובה לשתן שנאסף טרי יחסית לשתן שנאסף בן לילה 10 , 23 . גברים גם לשיר הרבה פחות נוכחות של גבר הרדים או שתן זכר טריים איור 5 א ). הזכרים גם משנים את הרפרטואר שלהם בהקשר 23 . לדוגמה, B6D2F1 / J גברים להגדיל באופן משמעותי הייצור של מספר רב של קפיצה המגרש "מ" קטגוריה הברות במצב השתן הנשי ( איור 5 ב ). הם גם משנים תכונות אקוסטיות של הברות בודדות על פני ההקשר. לדוגמה, הזכרים B6D2F1 / J מזמרים הברות במשרעת וברוחב פס גבוה יותר בהקשר של השתן הנשי, וטוהר ספקטרלי גבוה יותר בהקשר הנשי העולה בהשוואה לאחרים ( איור 6 ).

    פרוטוקול זה מספק גם אמצעי למדידת תכונות דינמיות של רצף ולכן שינויים תחביר. שימוש בשיטה מותאמת מ- Ey, et al. 22 , אנו משתמשים ISI כדי להגדיר את הפערים בין רצפים ( איור 7 א ) 23 , ולאחר מכן להשתמש פערים להבחין ולנתח תבניות זמניות של רצפים ההברה. הראינו אורך אורכים ארוכים יותר מיוצרים בהקשר נשית ער ( איור 7 ב ).23 טכניקה זו מאפשרת לנו לחשב את היחס בין רצפים מורכבים (המורכבים על - ידי לפחות 2 מופעים של סוג ה ה "מ") לעומת רצפים פשוטים (המורכבים מסוג אחד או ללא "m", ולכן בעיקר על ידי " ), מצאנו כי אצל B6D2F1 / J, הקשר בין השתן הנשי הפעיל יחס גבוה יותר בהשוואה לאחרים ( איור 7 ג ) 23 , דבר המצביע על כך שהפיקו הברות מורכבות יותר במצב השתן הנשי, אך גם כי הברות אלו מופצות על רצפים יותר.

    כמו כן, אנו מסוגלים לחשב את ההסתברות למעבר מותנה מסוג הברה אחת לאחרת (24 סוגי מעבר כולל המעברים מ - אל "השתיקה"). מצאנו כי בהקשרים שונים, הבחירה של סוגי העכברים בסוגי מעבר של הברות התחלתיות שונות, וכי יש יותר div תחבירErsity במצב השתן הנשי ( איור 8 ) 23 . התצפיות הללו תואמות את הדיווחים הקודמים שמראים שהגברים יכולים לשנות את התכונות האקוסטיות או את הרפרטואר של ההרכב שלהם בתגובה לגירויים ולחוויות שונים 4 , 5 , 24 .

    לבסוף, פרוטוקול זה מספק הדרכה כדי לבדוק את ההעדפות הנשיות עם פלייבקים. מצאנו כי בנות B6D2F1 / J מעדיפות שירים מורכבים יותר (המכילים 2 או יותר "הברות") ביחס לשירים פשוטים 23 . רוב הנשים בחרו להישאר לעתים קרובות יותר בצד של מבוך Y ששיחק את השירים המורכבים ( איור 4 ב ).

    איור 1
    איור 1: תרשים זרימה של SofTware השתמש וניתוח. כל תוכנית וקוד קשור מקבלים שם מכתב שיסייע להסביר את זהותם ואת השימוש שלהם בטקסט הראשי. ב () הם תוכניות ספציפיות אנו משתמשים בפרוטוקול שלנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    איור 2
    איור 2: הגדר להקלטת שירי עכבר זכר. (A) תמונה של תיבת הקלטת הנחתה קול ולהגדיר להקלטות קול USV. (ב) דוגמה sonogram של הקלטה שנעשו עם תוכנה A ( טבלה 1 ), כולל תכונות ספקטרליות מפורט מחושב על ידי "עכבר Song Analyzer v1.3": משך, בין ההברה מרווח (ISI), תדר שיא דקות (PF דקות) שיא מקסימלי שיא (Pf מקסימום), תדר שיא להתחיל (התחלה PF), תדר שיא (סוף Pf), ואת רוחב הפס. (ג) סונוגרמות של שירה זכר נוספת אל נקבה חיה, בתוך תיבת הנחתה קול ומחוץ לקופסה על ספסל המעבדה באותו חדר. התצפיות האנקדוטיות שלנו מציינות שההקלטות בתיבה של אותה חיה מראות נפח גדול יותר (עוצמה חזקה יותר) ופחות הרמוניות, אך אין עדות להדים בתיבה ללא קצף קול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    איור 3
    איור 3: מסך של "שיר העכבר Analyzer v1.3" whis_gui חלון מציג את האפשרויות השונות הזמינות עבור ניתוח. הפרמטרים המוצגים הם אלה המשמשים כדי להקליט USVs זכר בנתונים ונתונים לנתח הציג (למעט משך הערה דקות היה 3 אלפיות השנייה). "לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank" לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4: אפשרויות נקבות בין השמעת שירים מורכבים ופשוטים. (א) תמונה של המנגנון Y- מבוך המשמש מדידות מימד. (ב) הזמן המושקע על ידי הנקבות בכל זרוע, משחק או מתוך מורכבות (שתן נשית נקבה) או פשוט יותר (ערער נקבה הנפתחת) השיר מאותו זכר. הנתונים מוצגים עבור n = 10 B6D2F1J נקבה עכברים כמו ממוצע ± SE, עם ערכים בודדים מוצגים גם; 9 מתוך 10 הנקבות הראו העדפה לשיר ההברה / רצף המורכב יותר. * P <0.05 זיווג סטודנט מבחן. איור שונה מ Chabout, et al. 23 ברשות. ריק "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 5
    איור 5: מספר ההברות הנפלטות ורפרטואר מעבר לתנאים . (א) שיעור הייצור ההברה של זכרים בהקשרים שונים. (ב) יצירות רפרטואר של זכרים כאשר בנוכחות של שתן נקבה (UR), נקבה הרדים (AF), נשים ערות (FE), והקשר הרדים (AM) הרדים. הנתונים מוצגים כ ממוצע ± SEM. * P <0.03; ** p <0.005; *** p <0.0001 עבור מבחן פוסט-הוק סטודנט לאחר פוסט-הוק לאחר תיקון בנג'מיני והוכברג (n = 12 גברים). איור מתוך Chabout, et al. 23 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    יחד .within-page = "1"> איור 6
    איור 6: דוגמאות לתכונות ספקטרליות בהקשר שונה. (A) משרעת. * P <0.025 עבור מבחן פוסט-הוק סטודנט משויך לאחר תיקון. (ב) טווח תדרים או רוחב פס. *: P <0.041; **: p <0.005; ***: <0.0001 לאחר תיקון. (ג) טוהר ספקטרלי של ההברות. * P: <0.025; **: p <0.005; ***: <0.0001 לאחר תיקון. קיצורים: שתן נקבה (UR), נקבה מורדמת (AF), נקבה ער (FE), ו הרדים זכר (AM). דמויות משופר מחברות, ואח '. 23 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    37fig7.jpg "/>
    איור 7: מדידות רצף. (א) שימוש של ה- ISI להפריד את רצף. ISI קצר (SI) ו ISI בינוני (MI) משמשים להפריד הברות בתוך רצף, ו- ISI ארוך מעל 250 ms (LI) להפריד שני רצפים. (ב) אורך הרצפים, הנמדדים כמספר ההברות לפי רצף, המיוצר על ידי זכרים בהקשרים שונים. *: P <0.025; ** p <0.005; *** p <0.0001 לאחר תיקון. (ג) יחס של שירים מורכבים על שירים פשוטים המיוצרים על ידי זכרים בהקשרים שונים. * P <0.041; ** p <0.005; *** p <0.0001 לאחר תיקון. הנתונים מוצגים כ ממוצע ± SEM (n = 12 גברים). איור מתוך Chabout, et al. 23 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    Ogether.within-page = "1"> הספרה 8
    איור 8: הברה תחביר דיאגרמות של רצפים על בסיס הסתברות מותנה עבור כל ההקשרים. עובי החץ הוא פרופורציונלי להתרחשות ההסתברות המותנית של סוג המעבר בכל הקשר בממוצע מ- n = 12 זכרים: P (התרחשות של מעבר בהתחשב בהברה ההתחלתית). לשם הבהירות, מעברים נדירים מתחת להסתברות של 0.05 אינם מוצגים. איור מתוך Chabout, et al. 23 ברשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    Discussion

    פרוטוקול זה מספק גישות לאסוף, לכמת, ולחקור הזכרים חיזור wocalizations במעבדה על פני מגוון רחב של גירויים הקשורים בעיקר נקבה. כפי שהוצג בעבר Chabout, et al. 23 ובתוצאות המייצגות, השימוש בשיטה זו איפשר לנו לגלות קוליות ותלות תלויי הקשר, שחשובים לגבי הנקבות המקבלות. התקינה של גירויים אלה תספק אוסף של מספר אמין של USVs ולאפשר ניתוח מפורט של שירי החיזור של הגבר רפרטואר.

    כאשר נקבה חיה נמצאת עם הזכר, הפרוטוקול אינו מאפשר לנו לזהות בבירור את הפולט של הקול. עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי רוב הקולות הנפלט בהקשר זה היו על ידי זכר 26 , 29 . רוב המחקרים באמצעות קונספסיפיק (זכר או נקבה)כגירוי לגברים מאמינים שכמות הקולות של נשים בהקשרים אלה היא זניחה 4 , 5 , 22 , 30 . עם זאת, לאחרונה נייר המשמש triangulation כדי למקם את הקול של הפולט בתנאים קבוצה מגורים 31 , והראה כי בתוך dyad, הנקבה תורמת ~ 10% של USVs. בפרוטוקול הנוכחי, השימוש בנשים הרדמה מאפשר למשתמש ללמוד את הזמרות הגבריות בנוכחות נקבה ללא הקול שלה. בניגוד לציפיות ממחקר זה 31 , לא מצאנו הבדל במספר ההברות הנפלטות בין ה - FE ל - AF 23 . זה אפשרי כי נשים לחיות לא תרמו באופן משמעותי להקלטות או כי הזכרים השמיעו פחות בנוכחות של נקבות חיות לעומת femed anaesthetizedאלס. עם זאת, אנו מאמינים כי ניסויים עתידיים צריכים לשקול את השימוש בשיטת טריאנגולציה זו כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של התרומה הנשית.

    ישנן תוכנות אחרות הזמינות שיכולים לעשות כמה הצעדים שציינו, אם כי אנחנו לא מאמינים בצורה מספקת לשאלות שאלנו באמצעות שילוב של שלוש תוכניות: תוכנה, A השיר שיר Analyzer סקריפט תוכנה C באמצעות תוכנה B, תוכנת ניתוח תחביר באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני מותאם אישית D + E חישובים, ואת תחביר תחביר באמצעות R. לדוגמה, נייר שהוצע לאחרונה תוכנה בשם VoICE המאפשר למשתמש לחלץ משתנים אקוסטיים באופן אוטומטי מן sonograms או ישירות על יחידות שהיו ידנית שנבחר על ידי המשתמש 32 . אבל, אוטומטיות או חצי אוטומטיות ניתוח רצף אינם מפורטים כמו הגישה שלנו. תוכנות מסחריות מסוימות יכולות לנתח באופן אוטומטי את התכונות האקוסטיות, אך אינן מספקות אוטומציההסיווג האטי של ההברות; המשתמש צריך למיין את ההברות השונות לאחר מכן. Grimsley, Gadziola, et al. 33 פיתחה תוכנית וירטואלית המבוססת על טבלה של עכבר וירטואלי המבוססת על תכונות אקוסטיות משותפות, אך אינה מספקת זיהוי אוטומטי של ההברות. התוכנית שלהם 34 היא ייחודית בכך שהיא יוצרת רצפים חדשים מתוך שירים מוקלטים באמצעות מודלים מרקוב, ולכן יש תכונות מתקדמות יותר מאשר עריכה פשוטה.

    רוב מחקרים קודמים על תקשורת התמקדו בצד של emitter 35 , 36 . מחקרים מעטים בחנו את הצד של המקלט 30 , 37 , 38 . פרוטוקולי השמעה ואפליה מספקים בדיקה פשוטה כדי לחקור את הצד של המקלט, כמו זה המתואר גם לאחרונה על ידי Asaba, Kato, etאל. 39 . במחקר זה, המחברים השתמשו בתיבת בדיקה דו-ברירה שהופרדה עם קצף אקוסטי במקום בתיבה מבוך Y המתוארת כאן. שני setups הבחירה יש יתרונות וחסרונות. ראשית, ה- Y- מבוך לא מבודד את הצליל מזרוע אחת לאחרת, אבל תיבת הבחירה שתי עושה. עם זאת, באמצעות עיצוב Y- מבוך, החיה יכולה להעריך במהירות את שני השירים המופעלים בו זמנית, ולעבור לכיוון המועדף. עם זאת, ניסויים השמעה באופן כללי לעזור הניסויים לקבוע את המשמעות ואת הפונקציות ובכך של הזויות שנוצרו עבור בעלי חיים קונספסיפיק. לסיכום, לאחר מאסטרינג את הטכניקות של פרוטוקול זה וניתוחים, הקוראים צריכים להיות מסוגלים לענות על שאלות רבות המשפיעות על הקשר, גנטיקה, נוירוביולוגיה של USVs העכבר.

    באמצעות B6D2F1 / J עכברים, גירויים הקשורים נקבה כמעט תמיד להפעיל USVs מן הזכרים בדקנו במעבדה שלנו. זה קריטי כדי קולג 'Ct מספיק הברות (> 100 ב 5 דקות) כדי להיות מסוגל לקבל ניתוח סטטיסטי חזק. לפתרון בעיות, אם לא נרשמו USVs (או לא מספיק), בדוק את התצורה כדי לוודא שהקלטות מוקלטות. לעשות בדיקה חיה של מה שקורה בכלוב במהלך ההקלטה על ידי מבט על sonogram בזמן אמת על מסך המחשב לאחר כניסתה של הגירוי. אחרת נסה לחשוף מחדש את הזכר לנקבה מינית / קולטנית מינית בן לילה ולאחר מכן הבית אותם לבד במשך כמה ימים או עד שבוע לפני ההקלטה שוב. בהתבסס על תצפיות אנקדוטיות, אנו מוצאים כי כמה זכרים לשיר הרבה ביום אחד (כמעט 5 דקות מלא), ולא הרבה למחרת, ואז שוב עוד יום. איננו יודעים מדוע הסיבה לכך מתרחשת בשונות משתנה, אך אנו מניחים שהיא כנראה מוטיבציה או עונתית עבור הזכרים, ומצב השתן עבור שתן נשית. אם לא USVs נרשמות, לנסות להקליט את החיה על מספר ימים כדי להרים את השפעות אלה משתנה. UnlIke בציפורי שיר, אנחנו לא ציינו הבדלים גלויים כמות השירה על פי השעה ביום. אנו מוצאים כי הזכרים אינם שרים הרבה (<100 הברות ב 5 דקות) לפני שהם 7 שבועות.

    שיטות האיתור המוצגות כאן יכולות לחלץ אלפי הברות וכל הפרמטרים האקוסטיים תוך מספר דקות. אבל כמו כל שיטת זיהוי אוטומטי, הוא רגיש מאוד רעש רקע. באמצעות עכבר השיר Analyzer זיהוי תוכנה עם הקלטות רועש (למשל מבעלי חיים שנרשמו עם תשתית) עשויים לדרוש התאמת סף "זיהוי" כדי לאפשר גמישות רבה יותר. עם זאת, זה יגדיל גם את מספר ההברות חיוביות שווא ואת זיהוי אוטומטי עלול להיכשל. בנסיבות כאלה, ניתן להשתמש בקידוד ידני.

    כאמור, מספר, repertories, חביון של vocalizations משתנים באופן נרחב בהתאם לזן, ולכן ייתכן שיהיה צורך לשנות את הפרמטרים (אורך ההקלטה,גירוי, זיהוי הברה אוטומטית, וכו ' ) עבור כמה זנים כדי להבטיח הקלטות אופטימלי עבור ניתוחים סטטיסטיים.

    Disclosures

    למחברים אין מה לחשוף.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי הווארד יוז רפואי קרן כספים EDJ. אנו מודים לפרו. סילבי גרנון (NeuroPSI - אוניברסיטת פריז דרום XI - צרפת) עבור ההלוואות לנו את החומרה דובר. אנו מודים גם לחברי ג'ארביס מעבדה על תמיכתם, דיונים, תיקונים והערות על עבודה זו, במיוחד יהושע ג 'ונס Macopson לעזרה עם דמויות ובדיקות. אנו מודים לד"ר Gustavo Arriaga לעזרה עם תוכנת העכבר Mouse Analyzer, לשדרג את זה לנו V1.3, וכן היבטים אחרים של פרוטוקול זה. V1.0 של התוכנה פותחה על ידי הקודש גואו, ו v1.1 ו v1.3 על ידי Arriaga.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sound proof beach cooler See Gus paper has more info on specific kind Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
    Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 Includes extension cable 
    Ultrasound Gate 1216H sound card Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34175 12 channel sound card
    Ultrasound Gate Player 216H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #70117 2 channels playback player
    Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #60103 2 playback speakers
    Test cage  Ace #PC75J 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
    plexiglas separation home made - 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
    Video camera Logitech C920 logitech HD Pro webcam C920
    Heat pad  Sunbeam 722-810-000
    Y-maze  Home made - Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
    Tweezers
    Software
    Avisoft Recorder (Software A) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    MATLAB R2013a (Software B) MathWorks - MATLAB R2013a (8.1.0.604)
    Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_
    v1.3-2015-03-23.zip
    Microsoft Office Excel 2013 (Software D) Microsoft - Microsoft Office Excel
    Song Analysis Guide v1.1 (Software E) Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
    Syntax decorder v1.1 (Software F) Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    Graphiz (Software G) AT&T Research and others  http://www.graphviz.org
    Avisoft SASLab (Software H) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    Reagents
    Xylazine (20 mg/mL) Anased -
    Ketamine HCl (100 mg/mL) Henry Schein #045822
    distilled water
    Eye ointment  Puralube Vet Ointment  NDC 17033-211-38
    Cotton tips
    Petri dish

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
    2. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
    3. Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
    4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
    5. Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
    6. Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
    7. Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
    8. Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
    9. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
    10. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
    11. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
    12. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
    13. Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
    14. Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
    15. Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
    16. Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
    17. Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
    18. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
    19. Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
    20. White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
    21. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
    22. Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
    23. Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
    24. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
    25. Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
    26. Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
    27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
    28. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
    29. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
    30. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
    31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
    32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
    33. Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
    34. Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
    35. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
    36. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
    37. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
    38. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
    39. Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).

    Tags

    התנהגות גליון 123 Vocalizations Ultrasonic (USVs) תקשורת קולית ניתוח אקוסטי תחביר שירים הקשרים חברתיים העדפה נשית
    Eliciting וניתוח זכר העכבר Ultrasonic ווקאליזציה (USV) שירים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Chabout, J., Jones-Macopson, J.,… More

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter