Summary
小鼠产生超声发声（USV）的复杂多音节曲目。这些USV被广泛用作神经精神障碍的读数。该协议描述了我们学习和开发的一些实践，以始终如一地引导，收集和分析鼠标歌曲的声学特征和语法。
Abstract
在整个发展和成年期间，小鼠在各种社会环境中产生超声发声（USV）。这些USV用于母婴检索1 ，少年交互2 ，相反和相同的性交互3，4，5和领土交互6 。几十年来，USVs被调查人员用作研究神经精神和发育障碍或行为障碍7,8,9 ，最近才了解脊椎动物之间的声音通信的机制和演变10 。在性交互作用中，成年雄性小鼠产生USV歌曲，其中有一些类似于歌鸟11的求爱歌曲的功能。使用这种多音节乐器可以增加他们携带的潜在的灵活性和信息，因为它们可以在元素如何组织和重组中变化，即语法。在该协议中，描述了在各种社会环境中引出来自雄性小鼠的USV歌曲的可靠方法，例如暴露于新鲜的女性尿液，麻醉的动物和发情女性。这包括从小鼠中诱导大量音节的条件。我们通过廉价的音箱减少环境噪音的记录，并提出了一种自动检测，分类和分析USV的量化方法。后者包括呼叫率，声乐曲目，声学参数和语法的评估。描述了使用播放来研究动物对特定歌曲类型的偏好的各种方法和洞察。这些方法用于描述男性小鼠不同背景下的声学和语法变化，以及女性小鼠的歌曲偏好。
Introduction
相对于人类，小鼠产生低频和高频发声，后来被称为高于我们的听力范围的超声发声（USV）。 USVs是在各种情况下生产的，包括从母婴检索，青少年互动，到相反或同性成人的交互4,12。这些USV由多种多音节曲目组成，可以手动分类9或自动分类10,11 。近年来，这些USV在交流中的作用日益增加。这些包括使用USV作为神经精神，发育或行为障碍7,8以及内部动机/情绪状态的小鼠模型的阅读。 USV被认为在e上传达可靠的信息mitter的状态对于接收器14,15是有用的。
2005年，Holy和Guo 11提出了成年男性小鼠USVs被组织为连续的多音节调用元素或类似于鸣鸟的音节的想法。在许多物种中，多音节曲目允许发射器以不同的方式组合和排序音节，以增加歌曲携带的潜在信息。这种语法的变化被认为具有与性行为和伴侣偏好有关的病理学意义16,17 。随后的研究表明，雄性小鼠能够改变在女性5,18之间，之前和之后产生的音节类型的相对组成。也就是说，成年男性小鼠使用他们的USV进行求偶行为，以吸引或与女性保持紧密接触，或促进交配19,20,21 。他们也是在男性与男性的互动中排除，可能在交互过程中传达社会信息4 。为了捕捉这些变化，科学家通常测量光谱特征（声学参数，如振幅，频率等 ），USV音节数或呼叫数，以及第一个USV的延迟。然而，很少有人仔细看这些USV的序列动态22 。最近我们的小组开发了一种测量USV音节序列23动态变化的新方法。我们表明，一首关于（即语法）的歌曲中的音节顺序不是随机的，它根据社会语境而变化，听力动物将这些变化发现为病理学相关性。
我们注意到在许多研究动物传播的调查人员，并没有将术语“语法”与人类言语中使用的语法相同的确切含义。对于动物交流研究，我们只是用一些规则来表示有序，非随机的声音序列。此外，对于人来说，已知特定的序列具有特定的含义。我们不知道这是否是老鼠的情况。
在本文和相关视频中，我们的目标是提供可靠的协议来记录雄性小鼠在各种环境下的求爱USV，并执行播放。使用三个顺序使用的软件：1）自动录音; 2）音节检测和编码;和3）对音节特征和语法的深入分析被证明（ 图1 ）。这使我们能够了解更多有关雄性小鼠USV结构和功能的信息。我们认为，这样的方法可以缓解数据分析，并可能开辟新的视野，以表征缪尔正常和异常的声音通信分别通信和神经精神障碍模型。
Protocol
道德声明：所有实验方案均由杜克大学机构动物保护和使用委员会（IACUC）根据协议＃A095-14-04批准。注意：有关使用的软件的详细信息，请参见“ 材料和设备 ”部分的表1 。
刺激和记录鼠标USVs
- 录音前准备男性
注意：使用B6D2F1 / J年轻成年雄性小鼠（7 - 8周龄）获得代表性结果。该协议可适用于任何应变。- 除非另有要求，否则在12小时光照/黑暗循环中设置动物室的光循环。除非另有要求或需要，否则请按照每笼5至5名男性的标准住房规定。录制前3天，将同一菌株中的男性单独暴露于同一菌株的性成熟和接受性女性（每个笼子最多3名男性，一名女性）。
- 第二天删除男性笼罩的女性，并且在没有女性的男性之前，在第一次记录会议之前，至少提前两天，增加社会动员（根据我们的试验和错误轶事分析）。
- 录音盒的准备
- 使用海滩凉爽（内部尺寸为L 27 x W 23 x H 47厘米）作为声音衰减盒工作室（ 图2A ）。在盒子的顶部钻一个小洞，让麦克风的电线进入。
注意：将动物录制在声音衰减和视觉隔离的环境中，以便立即记录数十只小鼠，而不会听到或相互看到，防止记录污染环境室设备噪音和房间人员，并获得清洁老鼠的录音（ 图2B ）。当比较相同鼠标内部和外部之间的发声时，我们没有注意到声音的声音或扭曲他的声衰减室（ 图2C ）;相反，声音可能会更大，并且在腔室内有较少的谐波。 - 将麦克风连接到电线，将电线连接到声卡，将声卡连接到计算机以使用录音软件（ 例如 图1和表1中的软件A）。需要足够的录音软件，例如生成.wav声音文件的软件A.
- 在隔音箱内放一个空的笼子（58 x 33 x 40厘米），并调整麦克风的高度，使麦克风的隔膜在保护架底部35 - 40厘米处，麦克风位于笼子的上方（ 见图2A ）。
- 使用海滩凉爽（内部尺寸为L 27 x W 23 x H 47厘米）作为声音衰减盒工作室（ 图2A ）。在盒子的顶部钻一个小洞，让麦克风的电线进入。
- 记录软件A的配置（ 表1 ），用于连续录制
- 双击并打开软件A.单击并打开“配置”菜单，然后选择名为“设备”，采样率（250,000 Hz），格式（16位）。
- 选择键“Trigger”选项并选中“Toggle”。
注意：此设置允许通过按下键（F1，F2 等 ）开始录制，同时将刺激放在鼠标笼中。 - 在“名称”参数下输入鼠标的ID。
- 将最大文件大小设置为所需的录制分钟数（我们通常设置为5分钟）。
注意：计算机存储内存所需的时间越长。如果连续模式未设置，软件会根据设置的参数在序列的开头或结尾处截断歌曲，因此无法可靠地量化序列。
- 使用不同的刺激记录USV。注意：每个刺激可以根据用户的实验需要独立使用。
- 轻轻地抬起动物记录尾巴，将其放在没有床垫的笼子里（以防止动作隔音箱内的隔音噪音，并将笼子开放式金属盖放在其顶部，盖子朝上。
- 关闭声音衰减盒子，让动物习惯它15分钟。此时进行刺激准备（1.4）。
- 刺激准备
- 制备新鲜尿液（UR）样品作为刺激物
- 在记录会议之前最多5分钟获取尿液样本，以确保从男性引发歌曲的最大效果。注意：已经坐在更长的时间，特别是几个小时或过夜的尿液不是24,25 ，我们经过实证验证23 。
- 选择一个女性或男性（取决于所使用的刺激的性别）在一个笼子里，抓住脖子后面的皮肤，一只手约束动物，一个腹部暴露的药物注射程序。
- 然后，选择另一个笼子。并与另一个女性或男性重复相同的程序，但使用与之前使用的相同的棉签。
注意：该程序确保将来自两个独立笼子的至少两名女性或男性的尿液混合在同一棉絮上，以确保不会发生任何发情或其他个体影响，因为已知发情周期可能会影响歌唱行为18,26。 - 将棉签放在干净的玻璃或塑料培养皿中。
注意：由于需要在接下来的5分钟内使用带有尿液的棉签，因此不需要覆盖以防止蒸发。
- Preparati以活女（FE）刺激为刺激
- 选择一两个新成熟雌性的笼子。通过目视检查（宽阴道开放和粉红色环绕，如27,28所示）识别发情期或发情期的女性。将它们分成不同的笼子直到使用。
- 麻醉动物雌性（AF）或雄性（AM）作为刺激物的制备
- 对于AF，从上面的池中选择一名女性（在发情期或发情期）。对于AM，从成年雄性小鼠笼中选择一名雄性。
- 用腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪（分别为100和10mg / kg）的方法麻醉女性或男性。
- 使用眼膏防止动物麻醉时眼睛脱水。通过测量夹紧后的爪缩回反射来检查适当的麻醉。将麻醉的动物放在纸巾上的干净的笼子里h将加热垫上的笼子设置为“最小热量”，以确保体温的控制。
- 唤醒之前，如果需要，通常在45分钟左右，重复使用相同的动物进行不同的录音会话2到3次。每次录音后将它们放回热垫上。
- 通过目视检查（每分钟约60-80次呼吸）和体温每5分钟接触动物控制呼吸频率（应温暖触摸）。
- 准备录制时，点击软件A的“录制”按钮。
注意：除非用户单击与每个通道相关联的按键按钮，录音将不会启动;监视计算机屏幕上的保持架中的现场音频信号，以确保动物正常唱歌并正确获取录音。 - 同时按下要记录的所需盒子的相关键按钮（ 即框1的F1），并引入所需的刺激。
- 其中一个刺激如下。将新鲜的尿液样品放在笼子内，或将活的雌性放在笼子内，或将其中一只麻醉动物（AF或AM）放在笼子的金属盖上。
- 静音关闭录音盒，让记录进行预设的分钟数（ 如第1.3节所述的5分钟）。
- 录制后，单击停止方形红色按钮停止录制。
- 如果使用麻醉动物作为刺激措施，打开隔音录音盒，将下一次记录期间的麻醉动物从笼子的金属盖上放回加热垫上，或者如果不再使用动物作为刺激检查它每15分钟一直恢复足够的意识来维持胸骨的躺卧。
- 打开笼子，取出有意识的测试动物，并将其放回家中的笼子上。用70％酒精清洁测试笼a蒸馏水。
- 制备新鲜尿液（UR）样品作为刺激物
2.使用鼠标歌曲分析器v1.3处理.wav文件和音节编码
- 打开编码软件B（ 图1 ， 表1 ），通过点击“设置路径”将包含“鼠标乐谱分析仪”（ 图1 ， 表1 ）的软件脚本C的文件夹放在软件B的路径中，并将软件添加到软件然后关闭软件B保存。
- 配置组合软件B + C的音节识别设置。注意：软件脚本C代码自动创建一个名为“sonograms”的新文件夹，文件格式为.ng格式的.wav文件所在的文件夹。通常最好将来自同一文件夹中使用软件A生成的同一记录会话的所有.wav文件。
- 打开软件B配置为C.
注意：此版本的软件B完全是c与软件脚本C不兼容。不能保证任何更高版本的版本都能接受当前代码中包含的所有功能。 - 使用“当前文件夹”窗口导航到包含要分析的录制.wav文件的感兴趣的文件夹。
- 在“命令窗口”中输入“whis_gui”命令。
- 在新的窗口中，观察不同参数的几个子窗口部分（ 图3 ），包括“Sonogram参数”，“Whistle Options”，以及所有其他。调整检测USV的参数。使用以下参数设置来检测来自实验室小鼠的USVs音节（ 例如我们研究中使用的B6D2F1 / J和C57BL / 6J小鼠品系）：
- 在Sonogram参数部分中，将最小频率调整为15,000 Hz，将最大频率调整为125,000 Hz，采样频率（频率数 ）to 256 kHz， 阈值为 0.3。
- 在“哨子选项”部分，将纯度阈值调整为0.075，将音节的最小持续时间调整为3 ms，将最小频率扫描调整为20,000 Hz，将“ 滤波器持续时间”调整为3 ms。
- 在其他部分中，将“ 最小注释持续时间”调整为3 ms，将“ 最小注释计数”调整为1。
- 对于音节分类协议 ，在whis_gui窗口的中间部分选择框：
默认分类是基于Holy和Guo 11和Arriaga 等人 10 ，音节跳数编号音节和跳跃方向： S为简单连续音节; D为一个俯仰跳跃; U一个俯仰跳; DD用于两个连续的下跳跃; DU为一个道具n和一个跳;如果用户没有选择任何内容，这将是默认值。用户可以通过选择每个代表框来选择在某些音节类型上运行分析。
选择由Scattoni 等人描述的音节分类9 ，另外选择拆分类别，它根据音节形状将这种类型分为更多的子类别。
如果用户想要进一步将音节分类为具有和不具有谐波的音节，则选择Harmonics。
- 打开软件B配置为C.
- 将感兴趣的.wav文件中的音节分类
- 从whis_gui窗口左上角的一个记录会话中选择所有的.wav文件。
- 在whis_gui窗口中点击“获取超声波图 ”（ 图3 ）。将创建一个包含声波图的新文件夹，带有.sng文件格式。在上面选择所有声像图（.sng文件）whi-gui窗口的左上角。在sonogram文件窗口下面的框中输入“动物ID”和“会话ID”。然后点击过程声纳图。
- 在sonogram文件夹中观察三种文件类型：“Animal ID-Session ID -Notes.csv”（包含从音节中提取的注释的信息），“Animal ID-Session ID -Syllables.csv”，（包含所有分类音节，包括其频谱特征和在声像图中检测到的音节的总数），“动物ID-会话ID -Traces.mat”（包含所有音节的图形表示）。
注意：“动物ID - 会话ID -Syllables”文件有时包含比所选择的更复杂的或者有两个动物音节相互重叠的未分类的USV音节的小百分比（2 - 16％） 23 。如有必要，可以从跟踪文件分开检查。
- 在sonogram文件夹中观察三种文件类型：“Animal ID-Session ID -Notes.csv”（包含从音节中提取的注释的信息），“Animal ID-Session ID -Syllables.csv”，（包含所有分类音节，包括其频谱特征和在声像图中检测到的音节的总数），“动物ID-会话ID -Traces.mat”（包含所有音节的图形表示）。
音节声学结构和语法的量化
注意：“READ ME！”中包含了初始语法分析步骤的说明。 “Song Analysis Guide v1.1.xlsx”文件的电子表格 ，我们定制的电子表格计算器E（ 图1 ， 表1 ）。
- 使用电子表格软件D打开软件脚本C文件输出“动物ID-Session ID -Syllables.csv”（ 图1 ， 表1 ）。它包含在所有声波图中检测到的音节总数及其所有光谱特征。
- 如果还没有转换，在电子表格软件D中，将.csv文件转换为软件D中的列分离，以便将每个值都放入单独的列中。
- 在软件D中打开“Song Analysis Guide v1.1.xlsx”文件。然后点击e 模板电子表格，并按照“ 模板表”说明中的建议，将“动物ID会话ID -Syllables.csv”文件数据复制并粘贴到此工作表中。使用“未分类”类别的音节删除行。
- 删除“未分类”行后，首先将列O中的ISI（音节间隔）数据复制并重新计算到列E中。其次，将列A中的所有数据复制到N到“数据”电子表格中。
- 在数据电子表格中，输入动物ID（列AF）和记录长度（以分钟为单位）。
注意：动物ID必须与录制设置中输入的动物ID相匹配。该文件将检测输入的字符，并将其与.wav文件的名称进行比较。 - 通过使用标有“密度ISI”的电子表格“ISI图”结果确定ISI截止值来定义序列。
注意：在我们以前的研究23中 ，我们将截止值设置在两个标准与最后一个峰值的中心偏差。它由超过250毫秒的长间隔（LI）组成，在一段歌唱中分离出不同的歌曲。 - 在“特征”电子表格中查看主要结果（对从每只动物测量的所有光谱特征进行分组）。
注意：如果用户使用第2.8.9节中描述的软件脚本C中的默认音节类别设置，则音节将进一步分为4类，如上所述，并在Chabout 等人中。 23 ：1）简单的音节没有任何音调跳跃， 2）由单个向上（“u”）跳跃分开的两个音符音节; 3）由单个向下跳跃分开的两个音符音节（“d”）;和4）在音符之间具有两个或更多音调跳跃的更复杂的音节（«m»）。 - 对于语法值，单击“全局概率”电子表格，计算每对的概率yllable转换类型，无论起始音节如何，使用以下等式23 。
P（转换类型的发生）=转换类型的总出现次数/ 所有类型的转换总数 - 单击“条件概率”电子表格以计算相对于起始音节的每个转换类型的条件概率，其使用以下等式：
P（给出起始音节的转换类型的发生）=转换类型的总出现次数/具有相同起始音节的所有转换类型的总出现次数 - 为了测试上述转移概率是否与以下任何一个不同，使用第一阶马尔可夫模型，按照23中的方法，使用定制软件F （ 例如 ，R工作室中的语法解码; 图1 ，strong>表1）与以下R脚本：Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R在不同条件下的组内;或相同条件下的组之间的Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R。
- 按照23中的方法，进行卡方检验或您偏好的其他测试，以测试同一动物在不同上下文（成对）中的转换概率的统计差异。
注意：有关用于比较组之间语法的统计模型的更多详细信息，请参见23 。研究人员可以使用其他方法来分析他们或其他人开发的全局或条件转移概率。 - 为了以图形方式显示序列作为语法图，将值输入网络图形软件G （参见图1 ， 表1 ），其中节点指定不同的音节类型gories和箭头颜色和/或厚度像素，表示音节之间的概率值的范围。
注意：为了清楚起见，对于全局概率图，我们只显示高于0.005（高于偶然发生的0.5％）的转变。对于条件概率，我们使用阈值为0.05，因为“全局模型”中的每个概率都较低，因为我们除以总音节数，而不仅仅是一个特定的音节类型。
歌曲的编辑和测试偏好
注意：USV播放可用于实验测试动物的行为反应，包括对特定歌曲类型的偏好。因为女性喜好可能会根据发情情况而有所变化，女性在测试前应确保他们处于相同的发情状态，如下所示：
- 在播放实验前几天准备有性经验的女性
- 监测发情周期，当发情或发情明显（阴道开放和粉红色环绕如27所示）时，将女性放在自己的笼子里。他们准备在第二天进行测试。
- 在声音处理软件H （ 例如 SASLap Pro; 图1 ， 表1 ）中使用复制和粘贴功能创建两个编辑的.wav文件，并具有用于刺激的所需条件。为了防止声音数量的变化，请确保两个声音文件包含相同数量的syllables和来自与所需语境（ 例如 UR）相同或不同的男性/女性的序列长度（歌曲开始）。
- 在软件H中打开包含条件1的第一个包含歌曲的文件。然后从文件中选择文件>特殊设置>添加频道，然后从条件2中选择要测试的第二个声音文件。这将创建2个通道，每个条件一个。
- 如果需要，请调整卷，以确保两个文件的卷彼此匹配，方法是转到“编辑”>“卷”。
- 然后转到编辑>格式>采样频率转换，并选择从250,000 Hz转换为1,000,000 Hz，将.wav文件从256 kHz的采样频率转换为1 MHz。播放设备读取.wav文件是必要的。
- 将这些新文件保存为要播放的测试文件。确定哪个歌曲位于哪个频道（1或2）。为了清楚起见，将其命名为“file name.wav”。
- 去Exit>格式>交换通道并交换两个通道。使用不同的名称保存交换的版本。注意：这将是相反的副本，通道反转，后来命名为“file name_swapped.wav”。
- 用70％酒精清洁播放设备“Y迷宫”，然后用蒸馏水清洗。用纸巾擦干。我们的Y迷宫是一个自制的不透明实心黑色塑料设备，臂长30厘米，迷宫末端有两个钻孔，以使超声波扬声器适合手臂的地板水平（ 图4A ）。
- 确保扬声器处于正确的位置并连接到声卡，并将卡连接到计算机。
- 打开软件A，选择播放>设备，然后选择播放声卡设备。选择“使用文件头速率”。去播放>播放列表并加载包含两个cha的感兴趣的文件nnels（ 即 “file.wav”）。选择“循环模式”。在迷宫之上设置录像机，以覆盖整个迷宫。
- 将测试女性置于迷宫中10分钟的习惯期。 10分钟后，如果女性不在起始臂上，则轻轻地将雌性推回到起始臂，并关闭塑料分离窗。
- 选择准备的文件（“file.wav”）进行播放并播放。开始视频录制，并确保通过视频录制视野中的纸条识别哪个Y迷宫的手臂（ 即左侧的UR或右侧的FE）中的哪个通道。
- 允许女性以循环模式听到歌曲，并在所需的分钟（ 即 5分钟）内探索迷宫：这是一个会话。将女性回到起始手臂。让她休息1分钟，同时准备下一届会议。雷姆用任何尿迹和排泄物用蒸馏水。
- 加载“file_swapped.wav”文件“切换视频录制的纸张笔记的位置，将左侧移动到右侧，反之亦然，1分钟后播放文件，释放第二个会话的女性。
- 重复步骤4.4.3至4.4.4总共4个会话x 5分钟，以控制在测试期间检测潜在的侧偏置。通过点击红色停止按钮，停止所有会话结束时的录像。在女性之间用70％酒精和蒸馏水清洁迷宫。
- 一周后用相同的女性重复所有步骤与不同的歌曲样本获得足够的结果来测试结果的可靠性。
- 稍后观察视频，并使用视频上的计时器和秒表来衡量每个会话中每个手臂中女性花费的时间。统计分析结果数据可能的歌曲偏好。
Representative Results
在本协议中，对男性B6D2F1 / J小鼠的声乐行为和语法的变化进行了表征。一般来说，使用这个方案，平均每男性每5分钟一次记录675±98.5个音节，分别为女性UR，615.6±72 FE，AF为450±134，AM为75.6±38.9，男性UR为±0.1（男性12例）。女性UR为130音节/分钟，FE为120音节/分钟，AF为100个音节/分钟（ 图5A ）。相对于过夜收集的尿10,23，男性产生大量的音节以响应新鲜收集的尿液。在麻醉的男性或新鲜的男性尿液的存在下，男性也唱得相当少。男性也改变了他们的语境23 。例如，B6D2F1 / J男性显着增加在女性尿液条件下产生多个跳跃“m”类音节（ 图5B ）。他们还改变了单个音节的语音特征。例如，B6D2F1 / J男性在女性尿液环境中以更高的幅度和带宽唱歌曲，并且与其他女性相比，清醒女性背景中的更高的光谱纯度（ 图6 ） 23 。
该协议还提供了一种用于测量序列的动态特征以及语法变化的方法。使用Ey 等人的适应方法22 ，我们使用ISI定义序列之间的差距（ 图7A ） 23 ，然后使用差距来区分和分析音节序列的时间模式。我们显示更长的序列长度在清醒的女性环境中产生（ 图7B ）这种技术允许我们计算复杂序列（由至少2次“m”音节类型组成）与简单序列（由一个或不是“m”型组成，并且因此主要由“我们发现，与B6D2F1 / J男性相比，女性尿液中的上下文触发了比其他人更高的比例（ 图7C ） 23 ，表明它们在女性尿液条件下产生更复杂的音节，而且这些音节也分布在超过更多的序列。
我们还可以计算从一个音节类型到另一个音节类型的条件转换概率（包括从“静音”状态转换到“静音”状态）的24个转换类型总和）。我们发现，在不同的语境中，老鼠对给定起始音节的过渡类型的选择是不同的，而且有更多的语法div女性尿液状况较差（ 图8 ） 23 。这些观察结果与以前的报告一致，表明男性可以根据不同的刺激和经验，改变其发声的声学特征或曲调组成4,5,24。
最后，本协议提供了通过播放测试女性偏好的指导。我们发现B6D2F1 / J女性喜欢更复杂的歌曲（包含2个或更多的“m”音节）相对于简单的歌曲23 。大多数女性选择更多地留在玩迷迭代的Y迷宫的一边（ 图4B ）。
图1：索菲流程图tware使用和分析。给每个程序和相关代码一个字母名称，以帮助解释他们的身份和在正文中的使用。 In（）是我们在协议中使用的具体程序。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：设置用于录制男性小鼠歌曲。 （A）声音衰减记录盒的图片，并设置记录USV发声。 （B）使用软件A（ 表1 ）制作的记录的示例声像图，包括由“Mouse Song Analyzer v1.3”计算的详细光谱特征：持续时间，音节间间隔（ISI），峰值频率最小值（Pf min）峰值频率最大值（Pf max），峰值频率起始（Pf起始），峰值频率 （Pf结束）和带宽。 （C）另一个男性唱歌的声音图，在同一个房间里的实验室工作台上的一个活的女性，在衰减箱内部和盒子外面。我们的轶事观察表明，同一动物盒子中的录音显示体积较大（强度更高）和谐波较少，但没有声音回声的声音没有声音泡沫。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：“Mouse Song Analyzer v1.3”的屏幕截图whis_gui显示可用于分析的不同选项的窗口。所显示的参数是用于在图中记录雄性USV并且提供的数据分析（除了最小记录持续时间为3ms）。 .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图4：复杂和简单歌曲播放之间的女性选择。 （A）使用的Y迷宫装置的图片和尺寸测量。 （B）女性在每只手臂中花费的时间，来自同一男性的复杂（女性尿液）或更简单（醒目的女性诱发）歌曲。数据以n = 10 B6D2F1J雌性小鼠为平均值±SE，其个体值也显示; 10位女性中有9位表示偏爱更复杂的音节/顺序歌曲。 * p <0.05配对学生t检验。从Chabout 等人修改的图23许可。空白“>请点击此处查看此图的较大版本。
图5：跨条件发出和汇编的音节数 。 （A）不同背景下男性的音节生产率。 （B）在存在女性尿液（UR），麻醉女性（AF），清醒女性（FE）和麻醉男性（AM））情境的情况下，男性的汇辑组合物。数据以平均值±SEM表示。 * p <0.03; ** p <0.005;在本杰明和霍赫伯格校正后（n = 12男），*** p <0.0001用于事后配对学生t检验。来自Chabout， et al。 23许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图6：不同背景下的光谱特征示例。 （A）幅度。校正后的特设配对学生t检验的p <0.025。 （B）频率范围或带宽。 *：p <0.041; **：p <0.005; ***：矫正后p <0.0001。 （C）音节的光谱纯度。 * p：<0.025; **：p <0.005; ***：矫正后p <0.0001。缩写：女性尿液（UR），麻醉女性（AF），清醒女性（FE）和麻醉男性（AM）。从Chabout， et al。 23许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图7：序列测量。 （A）使用ISI分离序列。短ISI（SI）和中等ISI（MI）用于分离序列内的音节，并且超过250毫秒（LI）的长ISI分离两个序列。 （B）序列的长度，以每个序列的音节数测量，由不同上下文中的男性产生。 *：p <0.025; ** p <0.005; ***校正后，p <0.0001。 （C）复杂歌曲与男性在不同背景下制作的简单歌曲的比例。 * p <0.041; ** p <0.005; ***校正后，p <0.0001。数据以平均值±SEM（n = 12个男性）表示。来自Chabout， et al。 23许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
图8：基于每个上下文的条件概率的序列的音节语法图。箭头厚度与从n = 12男性平均的每个上下文中的转换类型的条件概率发生成比例：P（给出起始音节的转换的发生）。为了清楚起见，未示出低于概率0.05的罕见转变。来自Chabout， et al。 23许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
该方案提供收集，量化和研究实验室中各种大多数女性相关刺激的雄性小鼠求爱发声的方法。如之前在Chabout， et al。在代表性的结果中，使用这种方法使我们能够发现与接收女性相关的上下文相关发声和语法。这些刺激的标准化将提供可靠数量的USV的收集，并允许详细分析男性的求爱歌曲和曲目。
当一个活着的女性与男性在一起时，协议不允许我们清楚地识别发声器的声音。然而，以前的研究表明，大多数在这种情况下发出的发声是男性26 29 。大多数使用特定（男性或女性）作为男性的刺激，相信在这些情况下，女性发声的数量可以忽略不计4，5，22，30。然而，最近的一篇论文使用三角测量来定位群体居住条件中发射器的发声31 ，并表明在一个二进制中，女性贡献了约10％的USV。在本议定书中，使用麻醉的女性允许用户在没有她的发声的情况下研究女性在场的男性发声。与最近的研究31的预期相反，我们发现FE和AF条件之间发音的音节数量没有差异23 。活的女性可能没有显着地贡献录音，或男性在活着的女性与麻醉的女性的存在下发出较少的声音啤酒。然而，我们认为，未来的实验应考虑使用这种三角测量方法来评估女性贡献的潜在影响。
还有其他可用的软件可以做一些我们所概述的步骤，尽管我们不相信我们使用三个程序组合的问题的方式足够：软件A，鼠标乐谱分析器软件脚本C使用软件B，使用自定义电子表格软件D + E计算的语法分析软件，以及使用R的语法解码顺序。例如，最近的一篇文章提出了一种名为VoICE的软件，该软件允许用户从声像图自动提取声变量，或者直接在手动单元上提取声变量由用户32选择。但是，自动或半自动序列分析并不像我们的方法那么详细。一些商业软件可以自动分析声学特征，但不提供自动化音节的分类;用户之后必须对不同的音节进行排序。 Grimsley，Gadziola， et al。 33开发了一种基于表的虚拟鼠标声乐器程序，其基于共享声学特征聚集音节，但不提供音节的自动检测。他们的节目34是独特的，因为它使用马尔可夫模型从录制的歌曲创建新的序列，因此具有比简单编辑更高级的特征。
大多数以前关于小鼠的沟通研究集中在发射体的侧面35,36 。很少有研究探讨了接收方30,37,38 。播放和辨别协议提供了一个简单的测试来研究接收方，如最近由Asaba，Kato 等人描述的人。 39 。在这项研究中，作者使用了一个双声道测试箱，用隔音泡沫代替这里描述的Y型迷宫盒。两种选择设置都有优缺点。首先，Y迷宫不会将声音从一个手臂隔离到另一个手臂，而是双选框。然而，通过使用Y迷宫设计，动物可以快速评估同时播放的两首歌曲，并向首选方向移动。然而，回放实验通常帮助实验者确定为特定动物产生的声音的意义和功能。总之，掌握本协议的技术和分析之后，读者应该能够解决影响小鼠USV的背景，遗传和神经生物学的许多问题。
使用B6D2F1 / J小鼠，女性相关刺激几乎总是触发我们在实验室测试的男性的USV。对于大学来说至关重要ct足够的音节（> 5分钟> 100）可以获得强大的统计学分析。对于故障排除，如果没有记录USV（或不足够），请检查配置以确保记录声音。在进行刺激后，通过观察计算机屏幕上的实时超声波图像，对录像过程中发生的情况进行现场检查。否则，尝试将男性重新暴露于性成熟/接受性的女性一夜之间，然后将他们独自存放数天或长达一周，然后再录制。根据轶事观察，我们发现有一些男性在一天（几乎全部5分钟）唱了很多，第二天没有多少，然后再一天。我们不知道为什么会出现主题变异的原因，但我们认为这可能是男性的动机或季节性，女性尿液的发情状态。如果没有记录USV，请尝试在几天内记录动物以接收这些可变效应。 UNL在鸣鸟中，我们没有注意到基于时间的歌唱量的明显差异。我们发现，在7周龄之前，男性不会唱多少（5分钟内<100个音节）。
这里提出的检测方法可以在几分钟内提取数千个音节和所有的声学参数。但是作为任何自动检测方法，它对背景噪声非常敏感。使用具有嘈杂录音的鼠标乐谱分析仪检测软件（例如从记录有床上用品的动物）可能需要调整检测“阈值”以允许更多的灵活性。然而，这也将增加假阳性音节的数量，并且自动检测可能会失败。在这种情况下，可以使用手动编码。
如前所述，根据应变，发声的数量，余数和延迟量变化很大，因此可能需要改变参数（记录长度，刺激，自动音节检测等 ），以确保用于统计分析的最佳记录。
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
霍华德·休斯医学研究所资助EDJ的这项工作得到了支持。我们感谢Pr。 Sylvie Granon（NeuroPSI - 大学巴黎南XI - 法国）为我们提供扬声器硬件。我们还感谢Jarvis实验室的成员对这项工作的支持，讨论，更正和评论，特别是Joshua Jones Macopson的帮助和数据和测试。我们感谢Gustavo Arriaga博士对Mouse Song Analyzer软件的帮助，将其升级到V1.3，以及此协议的其他方面。该软件的v1.0由Holy和Guo开发，v1.0和v1.3由Arriaga开发。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | - | 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | - | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | - | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_ v1.3-2015-03-23.zip |
|
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http://www.graphviz.org | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20 mg/mL) | Anased | - | |
| Ketamine HCl (100 mg/mL) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
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