Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs

doi: 10.3791/54137 Published: May 9, 2017

Summary

Muizen produceren een complex multisyllabic repertoire van ultrasone vocalisaties (USV's). Deze USV's worden op grote schaal gebruikt als uitlezingen voor neuropsychiatrische stoornissen. Dit protocol beschrijft enkele van de praktijken die we hebben geleerd en ontwikkeld om consequent de akoestische eigenschappen en syntaxis van muisliedjes te induceren, verzamelen en analyseren.

Abstract

Muizen produceren ultrasone vocalisaties (USV's) in een verscheidenheid aan sociale contexten gedurende de ontwikkeling en volwassenheid. Deze USV's worden gebruikt voor moeder-pup retrieval 1 , jeugdinteracties 2 , tegengestelde en hetzelfde geslachtsinteracties 3 , 4 , 5 en territoriale interacties 6 . Gedurende decennia zijn de onderzoekers gebruikt als proxies om neuropsychiatrische en ontwikkelings- of gedragsstoornissen 7 , 8 , 9 te bestuderen en meer recentelijk mechanismen en evolutie van vocale communicatie bij vertebraten 10 te begrijpen. Binnen de seksuele interacties produceren volwassen mannelijke muizen USV-liedjes, die een aantal eigenschappen hebben die vergelijkbaar zijn met hoflieden van zangvogels 11 . Het gebruik van een dergelijke multisyllabische reperToires kunnen de potentiële flexibiliteit en informatie die ze dragen, vergroten, omdat ze kunnen worden gevarieerd in de wijze waarop elementen worden georganiseerd en gecombineerd, namelijk syntaxis. In dit protocol wordt een betrouwbare methode beschreven om USV-liedjes uit mannelijke muizen in verschillende sociale contexten te ontwaken, zoals blootstelling aan verse vrouwelijke urine, verdovende dieren en estrusvrouwen. Dit omvat voorwaarden om een ​​grote hoeveelheid lettergrepen uit de muizen te induceren. We verminderen de opname van omgevingsgeluiden met goedkope geluidskamers, en presenteren een kwantificeringsmethode om de USV's automatisch te detecteren, classificeren en analyseren. Het laatstgenoemde omvat evaluatie van bellen, vocale repertoire, akoestische parameters en syntaxis. Verschillende benaderingen en inzicht in het gebruik van afspelen om de voorkeur van een dier voor specifieke liedsoorten te bestuderen worden beschreven. Deze methoden werden gebruikt om akoestische en syntaxveranderingen te omschrijven in verschillende contexten in mannelijke muizen en liedvoorkeuren bij vrouwelijke muizen.

Introduction

In vergelijking met mensen produceren muizen zowel lage als hoge frequentie vocalisaties, die later bekend staan ​​als ultrasone vocalisaties (USV's) boven ons gehoorbereik. De USV's worden geproduceerd in een verscheidenheid van contexten, waaronder van moeder-pup herwinning, jeugdinteracties, tegenovergestelde of hetzelfde geslachtsvolwasseneninteracties 4 , 12 . Deze USV's bestaan ​​uit een divers multisyllabic repertoire dat manueel 9 of automatisch 10 , 11 kan categoriseren. De rol van deze USV's in communicatie is in de afgelopen jaren onder toenemend onderzoek geweest. Deze omvatten het gebruik van de USV's als uitleesingen van muismodellen van neuropsychiatrische, ontwikkelings- of gedragsstoornissen 7 , 8 en interne motiverende / emotionele toestanden 13 . De USV's zijn van mening dat betrouwbare informatie over de e wordt overgedragenMitter's toestand die nuttig is voor de ontvanger 14 , 15 .

In 2005 bracht Holy and Guo 11 het idee dat volwassen mannelijke muizen USV's werden georganiseerd als een opvolging van multisyllabische oproepelementen of lettergrepen die vergelijkbaar zijn met zangvogels. Bij veel soorten biedt een multisyllabische repertoire de emitter de lettergrepen op verschillende manieren te combineren en ordenen om de potentiële informatie die door het lied wordt gedragen te vergroten. Variatie in deze syntaxis wordt geacht een ethologische relevantie te hebben voor seksueel gedrag en mate voorkeuren 16 , 17 . Uitgaande studies toonden aan dat mannelijke muizen de relatieve samenstelling van lettergreepstypen die zij voor, tijdens en na de aanwezigheid van een vrouw 5 , 18 kunnen veranderen, veranderen. Dat wil zeggen, de volwassen mannelijke muizen gebruiken hun USV's voor het gedrag van het hof, ofwel om te trekkenOf in contact houden met een vrouw, of om paring 19 , 20 , 21 te vergemakkelijken. Ze worden ook uitgezonden in mannelijke interacties, waarschijnlijk sociale informatie overdragen tijdens interacties 4 . Om deze veranderingen in repertoires vast te leggen, meet de wetenschappers meestal de spectrale eigenschappen (akoestische parameters, zoals amplitude, frequenties, enz. ), Aantal USV's lettergrepen of oproepen en latentie aan de eerste USV. Echter, weinig bekijken in werkelijkheid de sequentiedynamiek van deze USV's in detail 22 . Onlangs ontwikkelde onze groep een nieuwe methode om dynamische veranderingen in de USV-lettergreepsequenties te meten 23 . We hebben aangetoond dat de lettergreep in een lied over (syntaxis) niet willekeurig is, dat het verandert afhankelijk van de sociale context en dat de luisterende dieren deze veranderingen als ethologisch relevant detecteren.

Wij noteren thBij veel onderzoekers die dierencommunicatie bestuderen, verbinden de term 'syntax' niet dezelfde betekenis als syntaxis die in menselijke toespraak wordt gebruikt. Voor dierlijke communicatiestudies bedoelen we gewoon een geordende, niet-willekeurige volgorde van geluiden met enkele regels. Voor mensen zijn bovendien specifieke sequenties bekend om specifieke betekenissen te hebben. We weten niet of dit het geval is voor muizen.

In dit document en bijbehorende video streven wij ernaar om betrouwbare protocollen te leveren om mannelijke muizencommissie USV's in verschillende contexten op te nemen en afspelen te verrichten. Het gebruik van drie opeenvolgende gebruikt software voor: 1) geautomatiseerde opnames; 2) lettergreep detectie en codering; En 3) een diepgaande analyse van de lettergreep en syntaxis wordt aangetoond ( figuur 1 ). Dit stelt ons in staat om meer te weten te komen over mannelijke muizen USV structuur en functie. Wij geloven dat dergelijke methoden gegevensanalyses vergemakkelijken en nieuwe horizonten kunnen openbaren om normale en abnormale vocale communicatie in mou te herkennen.Zie respectievelijk modellen van communicatie en neuropsychiatrische aandoeningen.

Protocol

Etiekverklaring: Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) onder het protocol # A095-14-04. Opmerking : zie tabel 1 in de sectie " Materialen en apparatuur " voor details over de gebruikte software.

1. Stimuleren en opnemen Muis USVs

  1. Voorbereiding van de mannen voor de opnamesessies
    OPMERKING: De representatieve resultaten werden verkregen met behulp van B6D2F1 / J jonge volwassen mannelijke muizen (7 tot 8 weken oud). Dit protocol kan aangepast worden voor elke stam.
    1. Stel de lichtcyclus van de dierkamer in op een 12-uur licht / donker cyclus, tenzij anders nodig. Volg standaard huisvestingsregels van 4 tot 5 mannen per kooi, tenzij anders nodig of nodig. Drie dagen voor opname, blootstellen mannen individueel aan een seksueel volwassen en ontvankelijk vrouw (tot 3 mannen met een vrouw per kooi) van dezelfde stam overdag.
    2. De volgende dag verwijderenHet vrouwtje uit de mannelijke kooi en woon de mannen zonder de vrouwtjes minstens twee dagen voor de eerste opnamesessie om de sociale motivatie te zingen om te zingen (op basis van onze trial and error anekdotische analyses).
  2. Voorbereiding van de opname dozen
    1. Gebruik een strandkoeler (interne afmetingen zijn L 27 x W 23 x H 47 cm) om als een geluidsdempingsstudio te werken ( Figuur 2A ). Boor een klein gat bovenop de doos om de draad van de microfoon in te voeren.
      OPMERKING: het opnemen van de dieren in een geluidsdempende en visueel geïsoleerde omgeving is de voorkeur om tientallen muizen tegelijkertijd op te nemen zonder hen te horen of elkaar te zien, te voorkomen dat er sprake is van vervuiling van de omgevingskamer en mensen in de kamer en schoonmaken Geluidsopnamen van de muizen ( figuur 2B ). We hebben geen geluidseffecten of vervormingen op het geluid gemerkt bij het vergelijken van vocalisaties van dezelfde muis binnen tegenover buiten tHij klinkt verzwakkingskamer ( figuur 2C ); Liever, daar kunnen de geluiden harder zijn en minder harmoniën in de kamer hebben.
    2. Sluit de microfoon aan op de draad, de draad naar de geluidskaart en de geluidskaart naar de computer om te werken met een geluidsopnameprogramma ( bijv. Software A in figuur 1 en tabel 1 ). Een adequate geluidsopnameprogramma is nodig, zoals software A die .wav geluidsbestanden genereert.
    3. Plaats een lege kooi (58 x 33 x 40 cm) in de geluidsdichte doos en stel de hoogte van de microfoon aan zodat de membraan van de microfoon 35 tot 40 cm boven de bodem van de kooi ligt en dat de microfoon boven de kooi is gecentreerd ( Zie figuur 2A ).
  3. Configuratie van opnamesoftware A ( Tabel 1 ) voor continue opname
    1. Dubbelklik en open software A. Klik op en open het menu 'Configuratie' en selecteer het aangewezen apparaat, Bemonsteringssnelheid (250.000 Hz), Formaat (16 bit).
    2. Selecteer de optie "Trigger" en selecteer "Wissel".
      OPMERKING: Met deze instelling kunt u de opname starten door op een toets (F1, F2, enz. ) Te drukken terwijl u de stimulus in de kooi van de muis plaatst.
    3. Voer de muis ID in onder de parameter "Naam".
    4. Stel de maximale bestandsgrootte in op de gewenste minuten van opname (we stellen meestal op 5 minuten).
      OPMERKING: hoe langer de minuten de benodigde hoeveelheid geheugen voor computeropslag nodig heeft. Als de continue modus niet is ingesteld, snijdt de software de liedjes in het begin of het einde van een reeks op basis van de ingestelde parameters. Daarom kan men sequenties niet betrouwbaar kwantificeren.
  4. Record USVs met behulp van de verschillende stimuli. Opmerking: elke stimulus kan onafhankelijk van de experimentele behoeften van de gebruiker worden gebruikt.
    1. Zet het dier voorzichtig op om door de staart te worden opgenomen en plaats het in een kooi zonder beddengoedEment geluid op het beddengoed) in de geluidsdichte doos, en breng de koker open-bedekte metalen deksel erop, met de deksel naar boven gericht.
    2. Sluit de geluidsdempende doos en laat het dier 15 minuten lang wachten. Voer de stimuli voorbereiding (1.4) op dit moment uit.
  5. Stimuli voorbereiding
    1. Bereiding van verse urine (UR) monsters als een stimulus
      1. Verkrijg urinemonsters gedurende maximaal 5 minuten voor de opnamesessie om maximaal effect te waarborgen bij het induceren van liedjes van de mannen. OPMERKING: Urine die langere tijd zit, en vooral voor uren of 's nachts, is niet zo effectief 24 , 25 , die we empirisch geverifieerd hebben 23 .
      2. Kies een vrouw of man (afhankelijk van het geslacht van de gebruikte stimulus) in een kooi, pak de huid achter de nek en hou het dier in één hand vast als bij een injectieprocedure met de buik blootgesteld.
      3. Selecteer vervolgens een andere kooi. En herhaal dezelfde procedure met een ander vrouwelijk of mannelijk, maar met dezelfde eerder gebruikte katoenen tip.
        OPMERKING: Deze procedure zorgt ervoor dat de urine van ten minste twee vrouwtjes of mannen uit twee onafhankelijke kooien op dezelfde katoenen tip gemengd wordt om te voorkomen dat er sprake is van oestrus of andere individuele effecten, omdat het bekend is dat de estruscyclus het zanggedrag 18 , 26 kan beïnvloeden.
      4. Plaats de katoenen tip in een schone glas of plastic petri schotel.
        OPMERKING: Aangezien de katoenen punt met urine binnen de volgende 5 minuten moet worden gebruikt, hoeft u het niet te bedekken om verdamping te voorkomen.
    2. preparatiOp van de levende vrouwelijke (FE) stimulus als een stimulus
      1. Selecteer een of twee nieuwe kooien van seksueel volwassen vrouwtjes. Identificeer vrouwtjes in het pro-estrus of estrus stadium door middel van visuele inspectie (brede vagina opening en roze surround zoals getoond in 27 , 28 ). Scheid ze in een andere kooi tot gebruik.
    3. Voorbereiding van de verdovende dieren vrouwelijk (AF) of mannetjes (AM) als een stimulus
      1. Voor de AF selecteer een vrouw uit het bovenstaande zwembad (ofwel in pro-estrus of estrus). Selecteer voor de AM een mannetje uit een kooi volwassen mannelijke muizen.
      2. Verdoof het vrouwelijke of mannelijke met een intraperitoneale injectie van een oplossing van respectievelijk Ketamine / Xylazine (respectievelijk 100 en 10 mg / kg).
      3. Gebruik oogsalf om uitdroging van de ogen te voorkomen, terwijl het dier verdoofd is. Controleer de juiste verdoving door het terugtrekken van de pootretractie te testen wanneer het wordt geknepen. Plaats het verdovende dier in een schone kooi op een papieren handdoek, witH de kooi op de warmtepaneel ingesteld op "minimum warmte" om de lichaams temperatuur te controleren.
      4. Gebruik opnieuw dezelfde dieren tot 2 tot 3 keer voor verschillende opnamesessies, indien nodig, voordat ze wakker worden (meestal ongeveer 45 minuten). Zet ze na elke opnamesessie weer op de warmtepaneel.
      5. Controleer de ademhalingssnelheid door middel van een visuele inspectie (~ 60-80 ademhalingen per minuut) en lichaamstemperatuur door het dier elke 5 minuten aan te raken (moet warm zijn om aan te raken).
    4. Wanneer u klaar bent met opname, klikt u op de knop "Opnemen" van software A.
      OPMERKING: de opnamen worden niet gestart, tenzij de gebruiker op de knop knoopt die met elk kanaal is geassocieerd. Controleer de live audio feed van de kooien op het computerscherm om ervoor te zorgen dat de dieren zingen en de opnames goed worden verkregen.
    5. Raak tegelijkertijd de bijbehorende toetsknop van de gewenste vak (en) aan die u wilt opnemen ( dwz F1 voor doos 1) en voer de gewenste stimulus in.
      1. Presenteer een van de stimuli als volgt. Plaats de katoenen punt met verse urinemonsters in de kooi of plaats de levende vrouw in de kooi of plaats een van de verdovende dieren (AF of AM) bovenop het metaaldeksel van de kooi.
    6. Sluit de opname doos stil en laat de opname voor het vooraf ingestelde aantal minuten (bijvoorbeeld 5 minuten zoals beschreven in paragraaf 1.3).
    7. Na het opnemen klikt u op de rode knop van het stopkwartier om de opname te stoppen.
    8. Als een verdovingsdier als stimulus wordt gebruikt, open de geluidsdichte opname doos, neem het verdovingsdier uit het metaaldeksel van de kooi en plaats het op de verwarmingspaneel voor de volgende opname sessie of als het dier niet meer gebruikt wordt als stimuluscontrole Het om de 15 minuten totdat het voldoende bewustzijn heeft hersteld om de sternale recumbency te behouden.
    9. Open de kooi en verwijder het bewuste testdier en plaats het terug naar zijn huiskooi. Reinig de proefkooi met 70% alcohol aGedistilleerd water.

2. Verwerking van .wav-bestanden en afleesbare codering met behulp van Mouse Song Analyzer v1.3

  1. Open codingssoftware B ( Figuur 1 , Tabel 1 ) en plaats de map met de Software Script C van "Mouse Song Analyzer" ( Figuur 1 , Tabel 1 ) in het pad van software B door op "Set path" te klikken en de map op software toe te voegen B. Sluit vervolgens software B om te opslaan.
  2. Configureer de gecombineerde software B + C's syllable identificatie instellingen. OPMERKING: De softwarecode C-code maakt automatisch een nieuwe map genaamd "sonogrammen" met bestanden in .sng-formaat in dezelfde map waar de .wav-bestanden zijn geplaatst. Het is meestal beter om alle .wav-bestanden van dezelfde opnamesessie te maken die gegenereerd is met software A in dezelfde map.
    1. Open software B geconfigureerd met C.
      OPMERKING: Deze versie van software B is volledig cOnpasbaar met het software script C. Het kan niet gegarandeerd worden dat alle latere versies alle functies in de huidige code accepteren.
    2. Navigeer naar de map van interesse die de opname .wav-bestanden bevat die geanalyseerd moeten worden met behulp van het venster 'Huidige map'.
    3. Voer in het "command window" de "whis_gui" commando in.
    4. In het nieuwe whis-gui venster, observeer meerdere subvenstersecties met verschillende parameters (afbeelding 3 ), inclusief "Sonogram Parameters", "Whistle Options" en alle anderen. Pas de parameters aan voor het detecteren van USV's. Gebruik de volgende parameterinstellingen voor het opsporen van USV-lettergrepen uit laboratoriummuizen ( bijv. B6D2F1 / J en C57BL / 6J muisstammen die in onze studies gebruikt worden):
    5. Instel in de sectie Sonogramparameters de Minfrequentie op 15.000 Hz, de maximale frequentie tot 125.000 Hz, de bemonsteringsfrequentie ( aantal frequenties ) tO 256 kHz, en de drempel tot 0,3.
    6. In de sectie Whistle Options past u de zuiverheidsdrempel aan op 0,075, de minduur van de lettergreep naar 3 ms, de minfrequentie tot 20.000 Hz en de filterduur tot 3 ms.
    7. In de overige secties, stel de Min Note Duration in op 3 ms, en de Min Note Count op 1.
    8. Selecteer voor het lettertype categoriseringsprotocol vakjes in het midden van het whis_gui venster:
      De standaardcategorisatie is gebaseerd op Holy and Guo 11 en Arriaga et al. 10 , die lettergreep codeert door het aantal sprongen en de richting van de sprong: S voor simpel continu lettergreep; D voor een down pitch jump; U voor een up pitch jump; DD voor twee achtereenvolgende down-sprongen; DU voor een dowN en een sprong; Etc. Dit wordt standaard als de gebruiker niets selecteert. De gebruiker heeft de mogelijkheid om de analyse op bepaalde lettergrepen uit te voeren door elk van de representatieve dozen te selecteren.
      Om te kiezen voor categorisatie van lettergrepen zoals beschreven door Scattoni, et al. 9 , selecteer daarnaast Split's categorie, die dit type scheidt in meer subcategorieën op basis van lettergreepvorm.
      Selecteer Harmonics als de gebruiker lettergrepen verder wilt sorteren in die met en zonder harmonieën.
  3. Klassificeer de lettergrepen in de .wav-bestanden die interessant zijn
    1. Selecteer alle .wav-bestanden uit één opnamesessie in de linkerbovenhoek van het venster whis_gui.
    2. Klik in het midden van het whis_gui-venster op 'Krijg sonogrammen' ( Figuur 3 ). Een nieuwe map die de sonogrammen bevat, wordt gemaakt met .sng file format. Selecteer alle sonogrammen (.sng-bestanden) in bovensteLinkse hoek van whis-gui venster. Voer "Animal ID" en "Session ID" in de vakken onder het venster van het sonogram-bestand. Klik vervolgens op proces sonogrammen.
      1. Let op drie bestandstypes in de map Sonogram: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (bevat informatie over de noten die uit de lettergrepen worden geëxtraheerd), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (bevat waarden van alle Ingedeelde lettergrepen, inclusief hun spectrale eigenschappen en het totale aantal lettergrepen gedetecteerd in de sonogrammen), "Animal ID-Session ID-Traces.mat", (bevat grafische voorstellingen van alle lettergrepen).
        OPMERKING: het bestand "Animal ID-Session ID -Syllables" bevat soms een kleine procent (2 - 16%) van niet-geclassificeerde USV-lettergrepen die complexer zijn dan die geselecteerd zijn, of die twee lettergrepen van elkaar overlappen 23 . Deze kunnen, indien nodig, apart van het trace bestand worden onderzocht.

3. Kwantificering van Syllabiele Akoestische Structuur en Syntaxis

OPMERKING: Instructies voor de stappen voor initiële syntaxanalyses zijn opgenomen in de "READ ME!" Spreadsheet van het bestand "Song Analysis Guide v1.1.xlsx", onze op maat gemaakte spreadsheet calculator E ( Figuur 1 , tabel 1 ).

  1. Open het software script C bestand uitvoer "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" verkregen in het gedeelte hierboven met spreadsheet software D ( Figuur 1 , Tabel 1 ). Het bevat het totale aantal lettergrepen gedetecteerd in alle sonogrammen, en al hun spectrale eigenschappen.
  2. Als dat nog niet is geconverteerd, converteer dit in het spreadsheet software D dit .csv-bestand naar kolom scheiding in software D om elke waarde in individuele kolommen te zetten.
  3. Open ook het bestand "Song Analysis Guide v1.1.xlsx" in software D. Klik dan op thE sjabloon spreadsheet, en kopieer en plak de bestandsdata "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" in dit blad zoals aanbevolen in de instructies van het sjabloonblad. Verwijder rijen met de 'Unclassified' categorie lettergrepen.
  4. Nadat u de 'Niet geklassificeerde' rijen hebt verwijderd, moet u eerst de gegevens van ISI (inter-syllable interval) in kolom O in kolom E kopiëren en opnieuw berekenen. Vervolgens kopieer u alle gegevens van kolom A naar N naar de 'Data'-spreadsheet.
  5. Voer in de data-spreadsheet de dieren-id's (kolom AF) en opnamelengte in (in minuten, kolom AC).
    OPMERKING: De dieren-ID's moeten overeenkomen met die welke in de opname-instelling is ingevoerd. Het bestand zal de ingevoerde tekens detecteren en vergelijken met de naam van de .wav-bestanden.
  6. Bepaal de ISI cutoff om een ​​sequentie te definiëren met behulp van de spreadsheet genaamd "Density ISI", het 'ISI plot' resultaat.
    OPMERKING: In ons verleden studie 23 , zetten we de cutoff op twee standaAfwijkingen van het midden van de laatste piek. Het bestond uit lange intervallen (LI) van meer dan 250 ms, die verschillende liedjes uit elkaar zongen in een zangsessie.
  7. Bekijk de belangrijkste resultaten in de 'Functies'-spreadsheet (groepering van alle spectrale eigenschappen gemeten van elk dier).
    OPMERKING: als de gebruiker de standaardinstelling van de lettergreep in software script C gebruikt, beschreven in paragraaf 2.8.9, worden de lettergrepen verder ingedeeld in 4 categorieën zoals hierboven beschreven en in Chabout et al. 23 : 1) eenvoudige lettergreep zonder enige spitsprong, «s»; 2) twee noot lettergrepen gescheiden door een enkele omhoog («u») sprong; 3) twee noot lettergrepen gescheiden door een enkele neerwaartse sprong («d»); En 4) complexere lettergrepen met twee of meer toonhoogtes tussen noten («m»).
  8. Voor syntaxwaarden, klik op de 'Globale waarschijnlijkheden' spreadsheet die de waarschijnlijkheden van elk paar s berekentOverlappende typen, ongeacht de beginnende lettergrepen, met behulp van de volgende vergelijking 23 .
    P (Voorkomen van een overgangstype) = Totaal aantal gebeurtenissen van een overgangstype / Totaal aantal overgangen van alle typen
  9. Klik op de 'Conditional probabilities' spreadsheet om de voorwaardelijke waarschijnlijkheden voor elk transitie type te berekenen in vergelijking met start lettergrepen, die de volgende vergelijking gebruikt:
    P (voorkomen van een overgangstype dat de start lettergreep geeft) = Totaal aantal gebeurtenissen van een overgangstype / Totaal aantal gebeurtenissen van alle overgangstypen met dezelfde start lettergreep
  10. Om te testen of en welke van de bovenstaande overgangswaarschijnlijkheden anders dan niet-willekeurig zijn, gebruik van een eerste-orde Markov-model, volgend op de aanpak in 23 , om aangepaste software F te gebruiken (bijvoorbeeld Syntax-decorator in R-studio; Figuur 1 , <Strong> Tabel 1) met de volgende R scripts: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R voor binnen groepen in verschillende omstandigheden; Of Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R voor tussen groepen in dezelfde omstandigheden.
  11. Voer een Chi-square test of een andere test van uw voorkeur uit om te testen voor statistische verschillen in de overgangswaarschijnlijkheden van hetzelfde dier in een andere context (paar-wijs), na de aanpak in 23 .
    OPMERKING: Meer informatie over het statistisch model dat wordt gebruikt om de syntaxis tussen groepen te vergelijken, vindt u in 23 . Onderzoekers kunnen andere benaderingen gebruiken om de globale of voorwaardelijke overgangswaarschijnlijkheden die zij of anderen ontwikkelden te analyseren.
  12. Om de sequenties grafisch weer te geven als syntaxdiagrammen, voer de waarden in op een netwerkgrafiesoftware G (zie Figuur 1 , Tabel 1 ), met knooppunten die verschillende lettergrepe aanwijzenGorieën en pijlkleur en / of diktepixel die waarden van waarschijnlijkheidswaarden tussen lettergrepen vertegenwoordigen.
    OPMERKING: Voor de duidelijkheid, voor de globale waarschijnlijkheidsgrafieken tonen we alleen transities hoger dan 0,005 (hoger dan 0,5% kansgeval voorkomen). Voor de voorwaardelijke waarschijnlijkheden gebruiken we een drempel van 0,05 omdat elke waarschijnlijkheid in het 'global model' lager is, gezien het feit dat we door het totale aantal lettergrepen verdelen en niet alleen door een specifiek lettertype.

4. Liedbewerking en testvoorkeur voor een type liedje

OPMERKING: Afspelen van USV's kunnen gebruikt worden om het gedragsrespons van een dier experimenteel te testen, met inbegrip van de voorkeur voor een specifiek liedtype. Omdat vrouwelijke voorkeuren kunnen veranderen afhankelijk van de estrusstaat, zorgen voor vrouwen ervoor dat ze in dezelfde estrus staat voordat ze als volgt worden getest:

  1. Bereid vrouwen met seksuele ervaring een paar dagen voor het afspeelt experiment Zet seksueel volwassen vrouwtjes (> 7 weken) aan een man voor 3 dagen voor de experimenten om estrus te veroorzaken (Whitten 28 effect), door ze in een scheidingshok te plaatsen (duidelijk vast kunststof met geboorde gaten daarin) waardoor het vrouwtje kan zien en Ruik het mannetje maar voorkom seksuele omgang.
  2. Monitor de estruscyclus, en wanneer pro-estrus of estrus duidelijk is (vaginale opening en roze omring zoals getoond in 27 ), zet de vrouwtjes samen in hun eigen kooi. Ze zijn klaar om de volgende dag getest te worden.
  • Bereid de songbestanden voor afspelen op
    1. Gebruik de kopieer- en plakfuncties in een geluidsverwerkingssoftware H ( bijv. SASLap Pro; Figuur 1 , Tabel 1 ) om twee bewerkte .wav-bestanden te maken met de gewenste condities die worden gebruikt voor stimuli. Om te voorkomen dat het aantal vocalisaties als variabele is, zorg ervoor dat de twee geluidsbestanden hetzelfde aantal s bevattenYllables en lengte sequences (song bouts) van dezelfde of verschillende mannen / vrouwen uit de gewenste contexten ( bijv. UR).
    2. Open het eerste bestand dat lied bevat van conditie 1 in software H. Ga dan naar Bestand> Specials> Voeg kanaal (en) toe van bestand en selecteer het tweede geluidsbestand om uit conditie 2 te testen. Dit creëert 2 kanalen, één voor elke conditie.
    3. Pas het volume visueel aan om ervoor te zorgen dat de volumes van de twee bestanden elkaar overeenkomen, door te gaan naar Bewerken> Volume.
    4. Ga dan naar Bewerken> Formaat> Sampling Frequency Conversion en selecteer omzetten van 250.000 Hz tot 1.000.000 Hz om de .wav-bestanden te transformeren vanaf een bemonsteringsfrequentie van 256 kHz tot 1 MHz. Deze stap is nodig voor het afspeelapparaat om de .wav-bestanden te lezen.
    5. Sla deze nieuwe bestanden op als de testbestanden die u wilt afspelen. Zorg ervoor om te identificeren welk liedje in welk kanaal is (1 of 2). Voor de duidelijkheid doeleinden het "file name.wav".
    6. Ga naar EXit> Formaat> Wisselkanalen en wissel de twee kanalen. Sla de geswapte versies op met een andere naam. OPMERKING: dit is het omgekeerde exemplaar met de omgekeerde kanalen, die later 'file name_swapped.wav' genoemd worden.
  • Bereid het afspeelapparaat voor
    1. Reinig het afspeelapparaat "Y-maze" met 70% alcohol, gevolgd door gedestilleerd water. Droog het met papieren handdoeken. Onze Y-doolhof is een zelfgemaakte ondoorzichtig massief zwart plastic apparaat met 30 cm lange armen en twee geboorde gaten aan de uiterste uiteinden van het doolhof om de ultrasone luidspreker toe te passen op de vloerhoogte van de armen ( figuur 4A ).
    2. Zorg ervoor dat de luidsprekers op de juiste plaats zijn en op de geluidskaart zijn aangesloten en de kaart is aangesloten op de computer.
    3. Open software A, selecteer Play> Device en selecteer het afspeel geluidskaartapparaat. Selecteer 'gebruik header rate file'. Ga naar afspelen> afspeellijst en laad het bestand met belangstelling die de twee cha bevatNnels ( dwz "file.wav"). Selecteer "lusmodus". Stel de videorecorder boven het doolhof op om het hele doolhof te bedekken.
  • Voer het afspeel experiment uit
    1. Plaats de testvrouw in de doolhof voor een periode van 10 minuten. Na 10 minuten, als het vrouwtje niet in de startarm zit, duw de vrouwelijk terug naar de startarm en sluit het plastic scheidingsvenster.
    2. Selecteer het voorbereide bestand ("file.wav") om te afspelen en afspelen. Start de video-opname en zorg ervoor dat u kunt identificeren welk kanaal is gepositioneerd op welke Y-doolsarm ( dwz : UR in de linkerzijde, of FE in de rechterarm) met een papiernoot in het videobewegingsveld.
    3. Laat het vrouwtje de liedjes in de loopmodus horen en verken het doolhof gedurende een gewenst aantal minuten ( dwz 5 min): dit is een sessie. Keer de vrouw terug in de startarm. Laat haar rusten gedurende 1 minuut tijdens de voorbereiding van de volgende sessie. RemOven sporen en afscheiding met gedestilleerd water.
    4. Plaats het bestand "file_swapped.wav". Schakel de locatie van de papiernoten voor de video-opname in. Verplaats de linker naar rechts en omgekeerd. Speel na 1 minuut het bestand. Bevrijd de vrouw voor de tweede sessie. .
    5. Herhaal stappen 4.4.3 tot 4.4.4 voor een totaal van 4 sessies x 5 minuten om te controleren of er potentiële zijdelingse voorspellingen zijn tijdens de test. Stop de video-opname aan het einde van alle sessies door op de rode stopknop te klikken. Maak het doolhof schoon met 70% alcohol en gedestilleerd water tussen de vrouwtjes.
    6. Herhaal alle stappen met verschillende liedjes een week later met dezelfde vrouwtjes om voldoende resultaten te verkrijgen om de betrouwbaarheid van de bevindingen te testen.
    7. Volg later de video's en gebruik de timer op de video en een stopwatch om de tijd die de vrouwtjes in elke arm doorbrengen voor elke sessie te meten. Analyseer de verkregen data statistisch voor mogelijke liedvoorkeuren.
  • Representative Results

    In het huidige protocol werden veranderingen in vocaal gedrag en syntaxis van mannelijke B6D2F1 / J-muizen gekenmerkt. Door dit protocol te gebruiken, waren we in staat om gemiddeld 675 ± 98,5 ingedeelde lettergrepen gemiddeld gemiddeld per mannetje per 5 minuten te registreren in reactie op vrouwelijke UR, 615,6 ± 72 in FE, 450 ± 134 in AF, 75,6 ± 38,9 in AM en 0,2 ± 0,1 in mannelijke urine (n = 12 mannen). De tarieven waren ~ 130 lettergrepen / min voor vrouwelijke UR, ~ 120 lettergrepen / min voor FE, of ~ 100 lettergrepen / min voor AF contexten ( Figuur 5A ). Mannetjes produceren een veel grotere lettergreep als reactie op vers verzamelde urine ten opzichte van de overgenomen urine 10 , 23 in de nacht . Mannetjes zingen ook aanzienlijk minder in aanwezigheid van een verdoofd mannelijk of vers mannelijk urine Figuur 5A ). Mannelijk veranderen ook hun repertoire over context 23 . Bijvoorbeeld, B6D2F1 / J mannen stijgen aanzienlijk Productie van meerdere lettersprings "m" categorie lettergrepen in de vrouwelijke urine conditie ( figuur 5B ). Ze veranderen ook akoestische eigenschappen van individuele lettergrepen in de context. Bijvoorbeeld, B6D2F1 / J mannetjes zingen lettergrepen bij een hogere amplitude en bandbreedte in de vrouwelijke urine context, en hogere spectrale zuiverheid in de wakker vrouwelijke context in vergelijking met de anderen ( Figuur 6 ) 23 .

    Dit protocol biedt ook een middel om dynamische kenmerken van de volgorde te meten en dus veranderingen in de syntaxis. Met behulp van een aangepaste methode van Ey, et al. 22 gebruiken we de ISI om de kloof tussen sequenties te definiëren ( Figuur 7A ) 23 , en gebruik dan de leemten om temporale patronen van lettergreepsequenties te onderscheiden en te analyseren. We lieten zien dat langere sequentielengten in de wakker vrouwelijke context worden geproduceerd ( figuur 7B )F "> 23. Deze techniek stelt ons in staat om de verhouding van complexe sequenties te berekenen (gecomponeerd door ten minste 2 voorkomingen van het m-lettertype) tegenover eenvoudige sequenties (samengesteld uit een of geen" m "type en dus meestal door" S 'type). We hebben geconstateerd dat bij vrouwen met B6D2F1 / J de vrouwelijke urinecontext een hogere verhouding heeft geactiveerd ten opzichte van de andere ( Figuur 7C ) 23 , wat aangeeft dat ze meer complexe lettergrepen in de vrouwelijke urine conditie hebben geproduceerd, maar ook dat dergelijke lettergrepen worden verdeeld Over meer sequenties.

    We kunnen ook de voorwaardelijke overgangswaarschijnlijkheden berekenen van het ene lettertype naar het andere (24 overgangs types totaal inclusief de overgangen van en naar de "stilte" -status) 23 . We hebben geconstateerd dat de muizen in verschillende contexten de keuze hebben van overgangstypes voor gegeven start lettergrepen en dat er meer syntax div isVervanging in de vrouwelijke urine conditie ( Figuur 8 ) 23 . Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met eerdere rapporten die aantonen dat mannen de akoestische eigenschappen of repertoire samenstelling van hun vocalisaties kunnen veranderen in reactie op verschillende stimuli en ervaringen 4 , 5 , 24 .

    Tenslotte biedt het onderhavige protocol richtlijnen om vrouwelijke voorkeuren te testen met afspelen. We vonden dat B6D2F1 / J vrouwtjes liever complexere liedjes verkiezen (met 2 of meer "m" lettergrepen) ten opzichte van eenvoudige liedjes 23 . De meeste vrouwen kiezen ervoor om bij de Y-doolhof te blijven die de complexe liedjes speelde ( figuur 4B ).

    Figuur 1
    Figuur 1: Stroomschema van SofTware gebruiken en analyses. Elk programma en bijbehorende code krijgt een letternaam om hun identiteit en gebruik in de hoofdtekst te helpen uit te leggen. In () zijn de specifieke programma's die we in ons protocol gebruiken. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2: Instellen voor het opnemen van mannelijke muizenliedjes. (A) Afbeelding van een geluidsdempende opnamebox en opstelling om USV vocalizations op te nemen. (B) Voorbeeld sonogram van een opname gemaakt met Software A ( Tabel 1 ), met inbegrip van gedetailleerde spectrale functies, berekend door "Mouse Song Analyzer v1.3": duur, inter-lettergreep interval (ISI), piekfrequentie min (Pf min) Piekfrequentie max (Pf max), piekfrequentie start (Pf start), piekfrequentie Einde (Pf einde) en bandbreedte. (C) Sonogrammen van een ander mannelijk zingen naar een levend vrouw, in de geluidsdempende doos en buiten de doos op de laboratoriumbank in dezelfde kamer. Onze anekdotische waarnemingen geven aan dat de opnames in de doos van hetzelfde dier groter volume (sterkere intensiteit) en minder harmonische tonen, maar geen bewijs van echo's in de doos zonder geluidskuim. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 3
    Afbeelding 3: Screenshot van het venster "Mouse Song Analyzer v1.3" whis_gui Met de verschillende opties die beschikbaar zijn voor analyses. De getoonde parameters zijn gebruikt om mannelijke USV's op te nemen in de cijfers en data analyses gepresenteerd (behalve de min notitie duur was 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4: Vrouwelijke keuzes tussen afspelen van complexe en eenvoudige nummers. (A) Afbeelding van de gebruikte Y-dool apparaat en afmetingen. (B) Tijd van de vrouwtjes in elke arm, ofwel uit een complexe (vrouwelijke urine opgewekte) of simpeler (wakker vrouwelijk uitgesproken) liedje van hetzelfde mannetje. Gegevens worden voor n = 10 B6D2F1J vrouwelijke muizen voorgesteld als gemiddelde ± SE, waarbij ook individuele waarden worden getoond; 9 van de 10 vrouwtjes liet een voorkeur zien voor het complexere lettergreep / sequentielied. * P <0,05 gepaarde student t-test. Figuur gewijzigd van Chabout, et al. 23 met toestemming.Leeg "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

    Figuur 5
    Figuur 5: Aantal uitgezonden stemplaten en Repertoire over de voorwaarden . (A) Afleesbaar productiepercentage van mannen in verschillende contexten. (B) Repertoire composities van mannen wanneer aanwezig in vrouwelijke urine (UR), verdoofd vrouw (AF), wakker vrouw (FE) en verdovende mannelijke (AM) contexten. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 voor post-hoc gepaarde student t-test na Benjamini en Hochberg correctie (n = 12 mannen). Figuur uit Chabout, et al. 23 met toestemming. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    together.within-page = "1"> Figuur 6
    Figuur 6: Voorbeelden van spectrale eigenschappen in verschillende contexten. (A) Amplitude. * P <0,025 voor post-hoc gekoppelde student t-test na correctie. (B) Frequentiebereik of bandbreedte. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 na correctie. (C) Spectrale zuiverheid van de lettergrepen. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 na correctie. Afkortingen: vrouwelijke urine (UR), verdoofd vrouw (AF), wakker vrouw (FE) en verdoofd man (AM). Cijfers gemodificeerd uit Chabout, et al. 23 met toestemming. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    37fig7.jpg "/>
    Figuur 7: Sequence Measurements. (A) Gebruik van de ISI om de sequentie te scheiden. Korte ISI (SI) en medium ISI (MI) worden gebruikt om lettergrepen in een reeks te scheiden, en lange ISI over 250 ms (LI) scheiden twee sequenties. (B) Lengte van de sequenties, gemeten als aantal lettergrepen per sequentie, geproduceerd door mannen in verschillende contexten. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 na correctie. (C) Verhouding van complexe liedjes over eenvoudige liedjes geproduceerd door mannen in verschillende contexten. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 na correctie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 12 mannen). Figuur uit Chabout, et al. 23 met toestemming. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.


    Figuur 8: Syllabiele Syntaxdiagrammen van Sequenties op basis van Voorwaardelijke Voorwaarden voor elke Context. De dikte van de pijl is evenredig aan de voorwaardelijke waarschijnlijkheid van een overgangstype in elke context, gemeten uit n = 12 mannen: P (voorkomen van een overgang die de start lettergreep geeft). Voor de duidelijkheid worden zeldzame overgangen onder een waarschijnlijkheid van 0,05 niet getoond. Figuur uit Chabout, et al. 23 met toestemming. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Discussion

    Dit protocol biedt aanpakken om mannelijke muizencommissie vocalisaties in het laboratorium te verzamelen, te kwantificeren en te bestuderen over een groot aantal meestal vrouwelijke gerelateerde stimuli. Zoals eerder in Chabout, et al. 23 en in de representatieve resultaten heeft het gebruik van deze methode ons mogelijk gemaakt om contextafhankelijke vocalisaties en syntaxen te ontdekken die voor de ontvangende vrouwtjes van belang zijn. De standaardisatie van deze stimuli zorgt voor het verzamelen van een betrouwbaar aantal USV's en laat gedetailleerde analyses van de mannelijke feestliedjes en repertoires toe.

    Wanneer een live vrouw aanwezig is bij de man, laat het protocol ons niet toe om de emitter van de vocalisaties duidelijk te identificeren. Echter, eerdere studies toonden aan dat de meerderheid van de vocalisaties die in deze context werden uitgezonden, door de man 26 , 29 waren . De meeste studies gebruiken een conspecific (man of vrouw)Als een stimulans voor de mannen geloven dat het aantal vrouwelijke vocalisaties in deze context onbeduidend is 4 , 5 , 22 , 30 . Echter, in een recent papier gebruikte triangulatie om de vocalisatie van de emitter in gelokaliseerde condities 31 te lokaliseren, en bleek dat het vrouwelijk binnen een dyad draagt ​​bij tot ~ 10% van de USV's. In het onderhavige protocol kan het gebruik van het verdoofde vrouw de gebruiker de mannelijke vocalisaties bestuderen in de aanwezigheid van een vrouw zonder haar vocalisering. In tegenstelling tot de verwachtingen van deze recente studie 31 , vonden we geen verschil in het aantal lettergrepen dat is uitgezonden tussen de FE en AF-omstandigheden 23 . Het is mogelijk dat levende vrouwtjes niet significant bijgedragen hebben aan de opnames of dat de mannen minder minder in aanwezigheid van levende vrouwen versus verdoofd femdenales. Desalniettemin geloven we dat toekomstige experimenten het gebruik van deze triangulatie methode moeten overwegen om het potentiële effect van de vrouwelijke bijdrage te beoordelen.

    Er zijn andere software beschikbaar die de stappen die we hebben beschreven kunnen doen, hoewel we niet voldoende geloven op de vragen die we hebben gevraagd met behulp van een combinatie van drie programma's: Software A, Mouse Song Analyzer software script C met software B, de Syntaxanalysesoftware met behulp van een D + E-berekening van de spreadsheetsoftware en een syntaxdecorator met behulp van R. Bijvoorbeeld, in een recent document werd een software genaamd VoICE voorgesteld waarmee de gebruiker akoestische variabelen automatisch uit de sonogrammen of rechtstreeks op eenheden die handmatig werden gehaald Geselecteerd door de gebruiker 32 . Maar de geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde sequentieanalyses zijn niet zo gedetailleerd als onze aanpak. Sommige commerciële software kan de akoestische eigenschappen automatisch analyseren, maar bieden geen automAtische classificatie van de lettergrepen; De gebruiker moet daarna de verschillende lettergrepen sorteren. Grimsley, Gadziola, et al. 33 ontwikkelde een Tabel-based virtueel muis vocaal orgelprogramma dat clusters lettergrepen op basis van gedeelde akoestische eigenschappen, maar biedt geen automatische detectie van de lettergrepen. Hun programma 34 is uniek omdat het nieuwe sequenties van opgenomen liedjes maakt met behulp van Markov-modellen, en heeft dus meer geavanceerde functies dan eenvoudig bewerken.

    De meeste eerdere communicatiestudies op muizen hebben zich gericht op de emitter's zijde 35 , 36 . Weinig studies hebben de kant 30 , 37 , 38 van de ontvanger onderzocht . Afspeel- en discriminatieprotocollen geven een eenvoudige test om de kant van de ontvanger te bestuderen, zoals die ook onlangs beschreven door Asaba, Kato, etal. 39 . In die studie gebruikden de auteurs een twee-keus testbox gescheiden met akoestisch schuim in plaats van de hier beschreven Y-labyrint. Beide keuzemogelijkheden hebben voor- en nadelen. Ten eerste isoleren de Y-doolhof het geluid niet van de ene arm naar de andere, maar de twee-keuzedoos doet het. Door het Y-doolhofontwerp te gebruiken, kan het dier echter snel de twee liedjes die gelijktijdig worden gespeeld, evalueren en naar de gewenste voorkeur gaan. Niettemin bepalen experimenten met behulp van afspeel experimenten de betekenis en daarmee de functies van de vocalisaties die worden gegenereerd voor specifieke dieren. Concluderend, na het beheersen van de technieken van dit protocol en analyses, moeten de lezers veel vragen kunnen aanpakken die de context, de genetica en de neurobiologie van muisgebruikers beïnvloeden.

    Met behulp van B6D2F1 / J muizen trekken de vrouwelijke geassocieerde stimuli bijna altijd USV's uit de mannen die we in ons lab hebben getest. Het is cruciaal voor colCt genoeg lettergrepen (> 100 in 5 minuten) om een ​​sterke statistische analyse te kunnen verkrijgen. Voor het oplossen van problemen, als er geen USV's zijn opgenomen (of niet genoeg), controleer dan de configuratie om ervoor te zorgen dat er geluiden worden opgenomen. Doe een live inspectie van wat er in de kooi gebeurt tijdens opname door na het introduceren van de stimulus het real-time sonogram op het computerscherm te bekijken. Probeer het mannetje om een ​​nacht na een seksueel volwassen / ontvankelijke vrouw opnieuw te openbinden en houd ze dan enkele dagen of maximaal een week voor de opname opnieuw. Op basis van anekdotische waarnemingen vinden we dat sommige mannen zelden veel zingen (voor bijna de volledige 5 minuten) en niet veel de volgende dag, en dan weer een andere dag. We kennen niet de reden waarom zulke binnenvakvariatie optreedt, maar we vermoeden dat het waarschijnlijk een motivatie of seizoensgebonden is voor de mannen en de estrusstaat voor vrouwelijke urine. Als er geen USV's zijn opgenomen, probeer het dier op meerdere dagen op te nemen om deze variabele effecten op te halen. UnlIke in zangvogels, we hebben geen openlijke verschillen in het aantal zingen op basis van de tijd van de dag genoteerd. We vinden dat de mannen niet zingen veel (<100 lettergrepen in 5 minuten) voordat ze 7 weken oud zijn.

    De hier beschreven detectiemethoden kunnen duizenden lettergrepen en alle akoestische parameters in een paar minuten herhalen. Maar als een automatische detectiemethode is het zeer gevoelig voor achtergrondgeluid. Met behulp van de Muis Song Analyzer detectie software met lawaaierige opnamen (bijv. Van dieren die zijn opgenomen met beddengoed) kunnen aanpassingen van de detectie "drempel" nodig zijn om meer flexibiliteit mogelijk te maken. Dit zal echter ook het aantal verkeerde positieve lettergrepen verhogen en de automatische detectie kan mislukken. Onder dergelijke omstandigheden kan handmatige codering worden gebruikt.

    Zoals eerder vermeld is het aantal, de repertoire en de latentie van vocalisaties veel variabel afhankelijk van de spanning, dus men moet parameters wijzigen (opname lengte,Stimulus, geautomatiseerde lettergreepdetectie, enz. ) Voor sommige stammen om optimale opnames voor statistische analyses te waarborgen.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Acknowledgments

    Dit werk werd ondersteund door de fondsen van Howard Hughes Medical Institute aan EDJ. Wij bedanken Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Universiteit Parijs Zuid-XI - FRANKRIJK) om ons de luidsprekerhardware uit te lenen. We bedanken ook leden van het Jarvis Lab voor hun steun, discussies, correcties en opmerkingen over dit werk, met name Joshua Jones Macopson voor hulp bij cijfers en tests. Wij danken Dr. Gustavo Arriaga voor hulp met de Mouse Song Analyzer-software, die het voor ons opvullen naar V1.3 en andere aspecten van dit protocol. V1.0 van de software is ontwikkeld door Holy and Guo, en v1.1 en v1.3 door Arriaga.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sound proof beach cooler See Gus paper has more info on specific kind Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
    Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 Includes extension cable 
    Ultrasound Gate 1216H sound card Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34175 12 channel sound card
    Ultrasound Gate Player 216H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #70117 2 channels playback player
    Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #60103 2 playback speakers
    Test cage  Ace #PC75J 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
    plexiglas separation home made - 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
    Video camera Logitech C920 logitech HD Pro webcam C920
    Heat pad  Sunbeam 722-810-000
    Y-maze  Home made - Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
    Tweezers
    Software
    Avisoft Recorder (Software A) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    MATLAB R2013a (Software B) MathWorks - MATLAB R2013a (8.1.0.604)
    Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_
    v1.3-2015-03-23.zip
    Microsoft Office Excel 2013 (Software D) Microsoft - Microsoft Office Excel
    Song Analysis Guide v1.1 (Software E) Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
    Syntax decorder v1.1 (Software F) Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    Graphiz (Software G) AT&T Research and others  http://www.graphviz.org
    Avisoft SASLab (Software H) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    Reagents
    Xylazine (20 mg/mL) Anased -
    Ketamine HCl (100 mg/mL) Henry Schein #045822
    distilled water
    Eye ointment  Puralube Vet Ointment  NDC 17033-211-38
    Cotton tips
    Petri dish

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
    2. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
    3. Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
    4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
    5. Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
    6. Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
    7. Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
    8. Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
    9. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
    10. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
    11. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
    12. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
    13. Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. 81-97 (2013).
    14. Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
    15. Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
    16. Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
    17. Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
    18. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
    19. Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
    20. White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
    21. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
    22. Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
    23. Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
    24. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
    25. Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
    26. Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
    27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
    28. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
    29. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
    30. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
    31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
    32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
    33. Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
    34. Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
    35. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
    36. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
    37. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
    38. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
    39. Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. (2015).
    Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).More

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter