Abstract
التنظيمية تي (T ريج) الخلايا، التي تعبر عن Foxp3 كعامل النسخ، هي مجموعات فرعية من خلايا CD4 + T. خلايا تي ريج تلعب أدوارا حاسمة في التسامح المناعة، وصيانة التوازن من خلال تنظيم الاستجابة المناعية. الدور الأساسي للخلايا ريج T هو قمع انتشار المستجيب تي (T EFF) الخلايا وإنتاج السيتوكينات مثل IFN-γ، TNF-α، و IL-2. وقد ثبت أن قدرة خلايا T ريج "لمنع وظيفة الخلايا ممثل المؤسسة تي تتعزز خلال العدوى الممرض استمرار وتطور مرض السرطان. لتوضيح وظيفة الخلايا ريج T تحت يستريح أو الملتهبة الظروف، ومجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر قمع باستخدام الماوس أو تي الخلايا البشرية ريج وقد وضعت. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة لمقارنة الاختلافات في النمط الظاهري وظيفة القمعية بين الراحة والمفعلين تي ريجالخلايا. لعزل تنشيط خلايا T ريج، والفئران المصابة مع الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV) استنساخ 13 (CL13)، سلالة مزمن في LCMV. خلايا تي ريج معزولة عن الطحال من الفئران المصابة CL13-LCMV أظهرت كل من النمط الظاهري تنشيط وتعزيز النشاط القمعية مقارنة مع يستريح خلايا ريج تي المعزولة من الفئران ساذجة. هنا، نحن تصف البروتوكول الأساسي للخارج الحي تحليل النمط الظاهري للتمييز تنشيط خلايا T ريج من يستريح خلايا تي ريج. وعلاوة على ذلك، نحن تصف بروتوكول لقياس النشاط القمعية من خلايا ريج T تشغيلها بالكامل.
Introduction
التنظيمية خلايا تي (T ريج) تعبر عن P3 مربع forkhead (Foxp3) باعتباره عامل النسخ لتنميتها وظيفة 1. بالإضافة إلى ذلك، خلايا تي ريج تعبر عن مختلف الجزيئات الأخرى مثل CD25 2، اللمفاويات التنشيط الجيني 3 (LAG-3) 3، الناجم عن جلايكورتيكود عامل نخر الورم مستقبلات 4، والسامة للخلايا اللمفاوية التائية-بروتين يرتبط 4 (CTLA-4) 5 على سطحها أو منطقة داخل الخلايا. خلال العدوى المزمنة مع أنواع مختلفة من مسببات الأمراض مثل الفيروسات 6،7، 8،9 البكتيريا، والطفيليات 10-12، أو في سياق تطور مرض السرطان 13،14، تصبح خلايا T ريج متباينة في خلايا تفعيلها، تظهر تعزيز وظيفة القمعية خلايا تستهدف المستجيب CD4 + و CD8 + T. وقد اقترح عدد من الأوراق أن الخلايا ريج T توسيع وتنشيط تساهم في ضعف في رد و الخلايا CD8 + Tالبريد خلال صديق الارتجاعي (اناث) عدوى 15-17. الناجم FV-خلايا تي ريج تمنع IFN-γ أو التعبير باء granzyme للتفاعل السامة للخلايا من خلايا CD8 + T 15-17. وعلاوة على ذلك، في الهربس البسيط نموذج عدوى فيروس، أفيد أن استنفاد الخلايا ريج CD4 + CD25 + T أدى إلى توسيع الخلايا CD8 + T الفيروس محددة وتلف الأنسجة الشديد نتيجة لتسلل immunopathogenic خلايا CD4 + T 18-20.
الفئران المصابة بشكل مزمن مع سلالة استنساخ 13 من فيروس المشيمي اللمفاوي (LCMV CL13) 21-24 وقد استخدمت على نطاق واسع لوصف النمط الظاهري وظيفة الخلايا التائية المستجيب (T EFF) والخلايا ريج T خلال عدوى فيروس المزمن. خلال العدوى LCMV المستمر، الفيروس محددة الخلايا التائية ممثل المؤسسة يفقد تدريجيا وظيفة المستجيب وأصبحت منهكة خلايا تي (T EXH). من ناحية أخرى، Tخلايا ريج تعزز قدرتها على قمع الفيروس محددة تي استجابة الخلية 25. انخفاض في قدرة فاعلة من الخلايا ممثل المؤسسة T يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل مثل upregulation من المستقبلات المثبطة على خلايا ممثل المؤسسة T، وظيفة تغيير الخلايا العارضة للمستضد، وإنتاج السيتوكينات immunoregulatory، وزيادة تواتر أو تعزيز وظيفة تي ريج خلايا 26. ومن بين العوامل التي تدخل في تي قمع الخلايا، موت الخلية المبرمج البروتين 1 (PD-1) واعتبرت على نطاق واسع -expressing خلايا EXH تي وخلايا T ريج باعتبارها من أهم دعامات استمرار مستضد والبيئة القمعية. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الحصار المفروض على مسار PD-1 والاجتثاث من خلايا ريج T يؤدي إلى تعزيز وظيفة الخلايا التائية وانخفض الحمل الفيروسي خلال LCMV عدوى مزمنة 27. وعلاوة على ذلك، يتم تنشيط خلايا T ريج خلال العدوى المزمنة من الفئران مع LCMV 23،25 25. وأعربت PD-1 كبير على خلايا T ريج وكذلك خلايا T EXH، ومستوى PD-1 أعرب من قبل خلايا ريج T يرتبط مع قوة من وظيفتها القمعية لمنع انتشار الخلايا التائية 25.
هنا، نحن تصف طريقة لمقارنة خصائص الخلايا ريج T تنشيط معزولة من الفئران المصابة مع LCMV CL13 ويستريح خلايا تي ريج معزولة من الفئران ساذجة. وعلاوة على ذلك، نفسر سلسلة من العمليات لفصل تنشيط خلايا T ريج ودراسة على النمط الظاهري خارج الحي، وكذلك قياس النشاط القمعية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذه الدراسة، تم الحفاظ على الفئران في منشأة معينة خالية من مسببات الأمراض من مركز بحوث الحيوان مختبر يونسي من جامعة يونسي. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الكورية للغذاء والدواء باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام الدولية من مركز بحوث الحيوان مختبر يونسي في جامعة يونسي.
1. إعداد حلول
- إعداد 2٪ RPMI وسائل الإعلام عن طريق تمييع الدم بقري جنيني (FBS) إلى 2٪ والبنسلين ستربتومايسين إلى 1٪ في RPMI
- إعداد وسائل الاعلام RPMI كاملة. لRPMI تضيف وسائل الإعلام 10٪ من FBS، 1٪ من البنسلين ستربتومايسين، 1٪ من L-الجلوتامين، و 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول.
- إعداد مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) العازلة. للقيام بذلك المالحة، الفوسفات، ملحق (PBS) مع 2٪ من FBS.
- إعداد T عازلة العزلة الخلية. للقيام بذلك، تكملة برنامج تلفزيوني مع 2٪ من FBS و 2 ethylenediaminetetraa مليحمض CETIC.
2. عزل الطحال اللمفاويات
- إزالة الطحال من الفئران ساذجة أو المصابين CL13-LCMV كما هو موضح سابقا 19 ووضعها في 60 ملم × 15 ملم أطباق بتري تحتوي على 10 مل من 2٪ وسائل الاعلام RPMI.
ملاحظة: في هذه التجارب الدراسة، من 5 إلى القديم أسابيع 6 C57B1L / 6J الفئران الإناث تلقي 2 × 10 6 وحدات تشكيل الترسبات (PFU) من LCMV CL13 من خلال الحقن في الوريد عن طريق الوريد الذيل. التضحية الفئران في يوم 16 بعد العدوى (16 د بي) 25. وكانت الفئران ساذجة تحليل جنرال الكتريك المتطابقة في نفس اليوم. - وضع مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل وشطفه مع 2 مل من 2٪ وسائل الاعلام RPMI. وضع الطحال على مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وطحن باستخدام المكبس من حقنة. شطف مصفاة الخلية مع 2 مل من 2٪ وسائل الاعلام RPMI وإزالته من أنبوب 50 مل.
- ملء الأنبوب مع 2٪ سائل الإعلام RPMI وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspendبيليه خلية في 1 مل من ACK العازلة الناشر. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: حجم ACK العازلة الناشر المشار إليه أعلاه هو لالطحال واحد. التوسع في حجم وفقا لذلك للحصول على عينات الطحال المجمعة. - ملء الأنبوب مع 2٪ سائل الإعلام RPMI وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل في وسائل الإعلام RPMI كاملة.
ملاحظة: للحصول على عد الخلايا الحية، وخلايا وصمة عار مع التريبان الأزرق والعد فقط الخلايا التي لا الملون باستخدام عدادة الكريات العيش.
3. Phenotyping من الطحال تي التقليدية (T التحويل) خلايا والخلايا التائية ريج
ملاحظة: قبل عزل الخلايا التائية ريج، ودراسة النمط الظاهري من الخلايا الليمفاوية الطحال معزولة من الفئران ساذجة أو إصابة قبل تلطيخ الخلايا مع مختلف الأجسام المضادة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.
- نقل 50 ميكرولتر من الخلايا(5 × 5 10 خلايا) بين مجموع الخلايا الليمفاوية الطحال في كل بئر من لوحة 96-جيدا الجديدة ش القاع، وإضافة 150 ميكرولتر من FACS العازلة لكل بئر. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف. تستنهض الهمم بيليه الخلية وإضافة 200 ميكرولتر من FACS العازلة لكل بئر. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية (2 مرات).
- تحضير كوكتيل الأجسام المضادة لعلامات سطح الخلية تلطيخ في 50 ميكرولتر من FACS العازلة لكل بئر مع الأجسام المضادة والكواشف التالية. مكافحة CD4 الصبغة البنفسجية، ومكافحة CD25 الصبغة الخضراء، ومكافحة PD-1 البنفسجي صبغ، ومكافحة CD8 PerCP-Cy5.5 صبغ وخلية الجدوى كشف كاشف الأشعة تحت الحمراء القريبة (IR) الفلورسنت صبغ رد الفعل.
ملاحظة: لمزيد من التحليل والنمط الظاهري للخلايا ريج T تفعيلها، ومكافحة CD103 23،25 يمكن أن تضاف لتلطيخ الخلايا السطحية علامة. - Resuspend وبيليه الخلية مع 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مرتين معFACS العازلة بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- بعد الخطوة غسل النهائي، صب طاف وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية مع 100 ميكرولتر من العازلة تثبيت أعدت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- غسل الخلايا مرتين مع غسل العازلة permeabilization (أعدت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إعداد الحل الضد لتلطيخ Foxp3 داخل الخلايا، و resuspend الخلية بيليه مع 50 ميكرولتر من مكافحة Foxp3 حل الأجسام المضادة.
ملاحظة: لمزيد من تحليل الظواهر تي التحويل والخلايا ريج T، ويمكن أن يضاف لمكافحة CTLA في هذه الخطوة. - احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية، وتكرار الخطوة 3.6. بعد الخطوة غسل النهائي، resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة FACS ودراسة النمط الظاهري من الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي 25.
- بوابة شعبية الخلايا الحيةنشوئها. لتحليل الظواهر من خلايا تي التحويل خلال العدوى LCMV CL13، ودراسة وتيرة Foxp3 - PD-1 + خلايا بين خلايا CD4 + أو CD8 + T.
ملاحظة: بناء على النتائج التجريبية، نسبة Foxp3 - PD-1 + أكثر من 50٪ في كل من CD4 + و CD8 + T السكان الخلية في 16 د بي مع LCMV CL13.- لتحليل الترددات والظواهر من خلايا ريج T، دراسة ترددات Foxp3 + أو + Foxp3 PD-1 + خلايا بين خلايا CD4 + T.
ملاحظة: بناء على النتائج التجريبية، نسبة Foxp3 + أو + Foxp3 PD-1 + خلايا أكثر من 20٪ في عدد السكان خلايا CD4 + T، على التوالي.
- لتحليل الترددات والظواهر من خلايا ريج T، دراسة ترددات Foxp3 + أو + Foxp3 PD-1 + خلايا بين خلايا CD4 + T.
4. عزل الخلايا ريج CD4 + CD25 + T
ملاحظة: وحدات التخزين من جميع الكواشف المبينة أدناه هي لبدءا عدد الخلايا 1 × 10 7 مجموع splenocytes.
- إعداد الخلايا كما هو موضح في القسم 2 باستخدام الفئران ساذجة وLCMV إصابة مزمنة. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من T عازلة العزلة الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما و resuspend بيليه الخلية في 40 ميكرولتر من العازلة.
- لتخصيب خلايا CD4 + T باستخدام نظام فصل الخلية المغناطيسي، وإضافة 10 ميكرولتر من الكوكتيل البيوتين الأجسام المضادة وتخلط جيدا. احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة 30 ميكرولتر من العازلة، 20 ميكرولتر من مكافحة البيوتين الخرز الصغير لوصفها عدم CD4 خلايا + T و 10 ميكرولتر من CD25-PE الأجسام المضادة لوضع العلامات الفلورية من CD25 + الخلايا. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- إضافة 2 مل من العازلة وتمر الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر الخلية في أنبوب 50 مل جديدة لإزالة الحطام الخلية. غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.تجاهل طاف تماما و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر عازلة في مناطق ذات كثافة تصل إلى 1.25 × 10 8 خلايا.
- تطبيق الخلايا على العمود وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود. غسل العمود بإضافة 2 مل من العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما وresuspend الخلايا CD4 + T معزولة في 90 ميكرولتر من العازلة.
- لوضع العلامات المغناطيسي للخلايا CD25 +، إضافة 10 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة PE، وتخلط جيدا، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إضافة 2 مل من العازلة وغسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من العازلة في مناطق ذات كثافة تصل إلى 1 × 10 8 خلايا.
- لتخصيب الخلايا ريج CD4 + CD25 + T، تطبيق الخلايا على العمود لاختيار إيجابية، وغسل كولومن بإضافة 2 مل من العازلة. تكرار غسل ثلاث مرات.
- عندما عمود فارغ بعد الخطوة غسل النهائي، إضافة 1 مل من العازلة على العمود، وطرد CD4 + CD25 المسمى مغناطيسيا + الخلايا باستخدام المكبس.
- كرر الخطوات من 4،8-4،9 لتعزيز نقاء الخلايا ريج CD4 + CD25 + T معزولة. غسل الخلايا مع العازلة FACS بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا ريج CD4 + CD25 + T معزولة بتركيز 2 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام RPMI كاملة.
- للتحقق من نقاء الخلايا ريج معزولة CD4 + CD25 + T، استخدام 2 × 10 5 خلايا من مجموع الخلايا ريج معزولة CD4 + CD25 + T. وصمة عار على الخلايا مع 50 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على مكافحة CD4 FITC وبقاء الخلية كشف كاشف الأشعة تحت الحمراء القريبة من رد الفعل صبغ الفلورسنت.
وصفت CD25 بالفعل مع المؤسسة العامة خلال العزلة: ملاحظة. - احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مع العازلة FACS بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الغسيل، resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من FACS العازلة والتحقق من نقاء التدفق الخلوي.
- بوابة السكان الخلية الحية. لتحليل نقاء خلايا ريج T، تأكيد النسبة المئوية للخلايا CD4 + CD25 +.
ملاحظة: بناء على النتائج التجريبية، النسبة المئوية للخلايا CD4 + CD25 + بين خلايا النقاء انتهت حوالي 80٪.
5. عزل الخلايا CD8 + T ووسمها خلايا CD8 + T
ملاحظة: وحدات التخزين من جميع الكواشف المبينة أدناه هي لبدء عدد الخلايا 1 × 10 7 مجموع splenocytes.
- إعداد الخلايا كما هو موضح في القسم 2 باستخدام الفئران ساذجة. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من برتقالي تي زنزانة انفراديةإيه. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما، و resuspend بيليه الخلية في 40 ميكرولتر من العازلة.
- لزنزانة انفرادية CD8 + T باستخدام نظام فصل الخلية المغناطيسي، وإضافة 10 ميكرولتر من الكوكتيل البيوتين الأجسام المضادة لعدم CD8 + T-الخلية ووضع العلامات وتخلط جيدا. احتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 30 ميكرولتر من العازلة و 20 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تطبيق الخلايا على العمود وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود. غسل العمود بإضافة 2 مل من العازلة ثلاث مرات.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما وresuspend الخلايا CD8 + T معزولة في 2 مل من العازلة.
- للتحقق من نقاء الخلايا المعزولة، وإعداد 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في المخزن FACS. Resuspend و2 × 10 5 خلايا معزولة بين CD8 + T سلليرة سورية في 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة.
ملاحظة: لإعداد حل الأجسام المضادة، إضافة لمكافحة CD8 FITC، وكشف عن بقاء الخلية كاشف (بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت رد الفعل) إلى FACS العازلة. - احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مع العازلة FACS بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الغسيل، resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من FACS العازلة، والتحقق من نقاء الخلايا عن طريق التدفق الخلوي.
- بوابة السكان الخلية الحية. للتحقق من نقاء خلايا CD8 + T، تأكيد النسبة المئوية للخلايا CD8 + T.
ملاحظة: بناء على النتائج التجريبية، نسبة CD8 + الخلايا بين الخلايا تنقيته انتهت حوالي 90٪. - إضافة برنامج تلفزيوني للخلايا CD8 + T معزولة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. resuspend الخلايا CD8 + T معزولة في تركيز 1 × 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
- لتسمية م CD8 + TLLS لفي المختبر قمع الفحص، تمييع تكاثر الخلايا تتبع البنفسجي صبغ في برنامج تلفزيوني للحصول على تركيز من 5 ميكرومتر في RT.
ملاحظة: التقريبية الإثارة وانبعاث قمم تكاثر الخلايا الصبغة تتبع البنفسجي المستخدمة في هذه الدراسة هي 405 و 450 نانومتر، على التوالي. - خلط كميات متساوية جيدا من تكاثر الخلايا تتبع البنفسجي صبغ (5 ميكرومتر) وتعليق خلية (1 × 10 7 خلية / مل من خلايا CD8 + T) في أنبوب 15 مل، واحتضان في 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. دوامة أنبوب كل 10 دقيقة.
- ملء الأنبوب مع البرد وسائل الاعلام RPMI كاملة، وترك الأنبوب لمدة 10 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف تماما، وresuspend الخلايا بتركيز 2 × 10 6 خلية / مل مع وسائل الاعلام RPMI كاملة تحسنت مسبقا. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
6. إعداد وفي المختبر فحص قمع عن طريق CD4 + CD25 + T <فرعية> ريج وخلايا CD8 + T
- لإعداد حبات المغلفة CD28 مكافحة CD3 /، ونقل حجم مناسب من حبات مغناطيسية إلى 15 مل من أنبوب (2.5 ميكرولتر / 1 × 10 5 خلايا). إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني وتخلط. غسل الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. تمييع حبات مغناطيسية في وسائل الإعلام كاملة (50 ميكرولتر / جيد).
- قسامة 50 ميكرولتر من خلايا ريج CD4 + CD25 + T لكل بئر من لوحة 96-جيدا-ش السفلي (1 × 10 5 خلايا / جيد). إضافة 50 ميكرولتر من خلايا CD8 + T والمستجيب تي (T التن) خلايا لكل بئر (1 × 10 5 خلايا / جيد). إضافة 50 ميكرولتر من مكافحة CD3 / حبات المغلفة CD28 المخفف إلى لكل بئر.
ملاحظة: في هذه الخطوة، والتسمية وانشاء آبار المراقبة على النحو التالي: "unstimulated الخلية CD8 + T فقط" وليس لها مضادات-CD3 / حبات المغلفة CD28. "CD8 + T الخلية فقط" مع حبات المغلفة CD28 مكافحة CD3 /. "خلية CD8 + T فقط"مع anti-CD3 / حبات المغلفة CD28.". تي خلية ريج فقط "مع مكافحة CD3 / حبات المغلفة CD28 يمكن أن تضعف الخلايا ريج T من وسائل الإعلام كاملة وشارك في تربيتها مع خلايا تي التن في نسبة مختلفة من T خلايا التركيب: خلايا T ريج (1: ،25-1: 1). - إضافة 50 ميكرولتر أو حجم مناسب من وسائل الإعلام في جميع الآبار لإجمالي حجم 200 ميكرولتر. تغطية لوحة بورق واحتضان في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
7. تحليل CD8 + T خلية انتشار وخلوى الإنتاج من خلايا CD8 + T
- لتحليل إنتاج السيتوكينات، بعد 3 أيام من الثقافة، وفصل طاف من كل بئر في لوحة أخرى وإجراء فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA).
ملاحظة: قد يتم aliquoted وطاف وتخزينها في -70 درجة مئوية. في هذه التجربة، وكان يستخدم لمكافحة الماوس الإنترفيرون جاما لوحة المغلفة الأجسام المضادة للكشف عن الإنترفيرون γ إنتاج اتفاقجي لبروتوكول الشركة المصنعة الصورة. لتحديد إنتاج الإنترفيرون γ من الخلايا المتكاثرة CD8 + T على مستوى خلية واحدة، داخل الخلايا خلوى تلطيخ لا يمكن أن يؤديها. - بعد فصل طاف من كل بئر، وغسل لوحة تحتوي على خلايا مع العازلة FACS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية (3 مرات).
- بعد الغسيل، وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه الخلية مع 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لتلطيخ الخلايا CD8 + T انتشرت. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لإعداد الأجسام المضادة كوكتيل، إضافة لمكافحة CD4 FITC، ومكافحة CD8 PerCP-Cy5.5، وكاشف كشف بقاء الخلية (بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت رد الفعل) إلى FACS العازلة.
ملاحظة: أجسام مضادة ضد علامات مختلفة مثل CD44 CD69 أو يمكن الجمع بين الأضداد أخرى لتأكيد تنشيط خلايا CD8 + T. تذكر أن الخلايا CD8 + T سبق أن وصفت مع تكاثر الخلايا تتبع الخامسصبغ iolet في الخطوة 5.10. - يغسل مرتين بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الخطوة غسل النهائي، تجاهل طاف، وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية مع 100 ميكرولتر من العازلة التثبيت.
- يغسل مرتين بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. resuspend الخلايا مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة وقياس انتشار تكاثر الخلايا تتبع البنفسجي خلايا CD8 + T المسمى صبغ التدفق الخلوي.
- بوابة السكان الخلايا CD8 + T بين الخلايا الحية. قياس نسب الخلايا المنقسمة وغير مقسمة وفقا للتخفيف من انتشار الخلايا الصبغة تتبع البنفسجي وCD8 + T تخفيف الخلية وفقا للمعادلة التالية. ٪ تثبيط = [(٪ من تكاثر الخلايا CD8 + T في حالة عدم وجود خلايا T ريج -٪ من خلايا CD8 + T انتشرت في وجود خلايا T ريج) / (٪ من تكاثر الخلايا CD8 + T فيغياب الخلايا التائية ريج)] س 100. وعلاوة على ذلك تحليل البيانات باستخدام التدفق الخلوي البرمجيات 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ولدت لنا الفئران مع عدوى فيروس المستمر من قبل حقنها بمادة 2 × 10 6 PFU من LCMV CL13 عن طريق الوريد. ولبحث التغيرات المظهرية في الخلايا ريج T و T التحويل الخلايا خلال عدوى فيروس المزمن، كانت ملطخة الخلايا الليمفاوية الطحال تم الحصول عليها من الفئران ساذجة والمصابة مع مختلف الأجسام المضادة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. في 16 د بي، وupregulated PD-1 في كل من Foxp3 - CD4 + T التحويل (الشكل 1A، اللوحة العليا) وFoxp3 - خلايا CD8 + T التحويل (1B الشكل، لوحة العليا). وكان تردد من خلايا ريج Foxp3 + CD4 + T العالي مرتين في الفئران المصابة CL13-LCMV مما كانت عليه في الفئران ساذجة (الشكل 1A). على وجه الخصوص، أكثر من Foxp3 + الخلايا ريج CD4 + T عرض النمط الظاهري تنشيط، معربا عن مستويات عالية منPD-1 في هذه المرحلة الزمنية (الشكل 1A).
لفي المختبر قمع الفحص، ويتطلب عددا كبيرا من خلايا التحويل CD8 + T والخلايا ريج CD4 + CD25 + T. للحصول على 1 × 10 7 خلية تتبع انتشار البنفسجي خلايا CD8 + T المسمى صبغ، وكان يتم تجميع splenocytes من اثنين من الطحال من الفئران ساذجة. للحصول على 2 × 10 6 أو 3 × 10 6 خلايا ريج CD4 + CD25 + T، لا يقل عن ثلاثة الطحال من الفئران ساذجة والمصابين CL13-LCMV، على التوالي، وكان يتم تجميع. تم فصل خلايا CD8 + T والخلايا التركيب تي بنجاح دون تلوث كبير مع الخلايا المناعية الأخرى (الشكل 2A). ويمكن أيضا أن تكون معزولة خلايا تي ريج، ويبلغ عدد سكانها السائد للخلايا CD25 + CD4 + T مع أكثر من 80٪ النقاء (الشكل 2B).
لمقارنة وظيفة القمعية من خلايا تي ريج ساذجة والمزمنة، وحضنت يموزين تي معزولة والخلايا التركيب تي معا تحت التحفيز مع حبات مكافحة CD3 / المغلفة CD28 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. وزادت٪ تثبيط CD8 + T تكاثر الخلايا التركيب في تي ريج خلية تعتمد DESE-الطريقة (الشكل 3A). عندما كانت CD8 + T الخلايا التركيب شارك في تربيتها مع خلايا تي ريج المزمنة في نسبة 1: 1، وتثبيط تكاثر الخلايا التركيب CD8 + T بشكل ملحوظ (الشكل 3B). كان إنتاج الإنترفيرون γ الخلايا التركيب CD8 + T أيضا تحول دون بشكل ملحوظ عندما كانت CD8 + الخلايا التركيب T شارك في تربيتها مع تنشيط خلايا T ريج من الفئران المصابة بشكل مزمن وليس مع يستريح خلايا ريج T من الفئران السذاجة في ريج T (الشكل 3C).
الشكل 1: الظواهر من خلايا CD4 + و CD8 + T في الطحال من الفئران ساذجة أو الفئران المصابة CL13-LCMV في 16 د بي (A) التعبير عن PD-1 أو CD25 على Foxp3 - CD4 + T التحويل وFoxp3 + CD4 + خلايا تي ريج. (ب) التعبير عن PD-1 أو CD25 على Foxp3 - CD8 + T خلايا التحويل. كانت ملطخة الخلايا الليمفاوية الطحال مع الأجسام المضادة ضد CD4، CD8، CD25، PD-1، وFoxp3. البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة. لوحة وتم تعديلها من 25 كمرجع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النقاوات الخلايا التركيب تي المعزولة من الفئران ساذجة والخلايا ريج تي المعزولة من الفئران ساذجة أو المصابين CL13-LCMV (أ) النسبة المئوية للخلايا CD8 + T بعد العزلة. (ب) النسبة المئوية للخلايا CD4 + T ريج، معربا عن CD25 بعد العزلة. تم تحديد كل رباعي في الفقرة (ب) من خلال مستويات التعبير عن CD4 وCD25. البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليه / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
الشكل (3): تأثير خلايا T ريج تفعيلها على استجابة الخلايا CD8 + T (A)٪ تثبيط خلايا CD8 + T شارك في تربيتها مع خلايا تي ريج بطريقة تعتمد على الجرعة الخلايا التائية ريج. (ب) انتشار خلايا CD8 + T شارك في تربيتها مع الخلايا ريج تي في نسبة 1: 1. (C) IFN-γ إنتاج خلايا CD8 + T شارك في تربيتها مع خلايا تي ريج بطريقة تعتمد على الجرعة الخلايا التائية ريج. وقد تم قياس انتشار الخلايا CD8 + T من التخفيف من انتشار الخلايا تتبع البنفسجي الصبغة في تكاثرت الخلايا CD8 + T وإفراز الإنترفيرون γ تم تقييمها من قبل ELISA. وحفز تكاثر الخلايا تتبع البنفسجي خلايا CD8 + T المسمى صبغ مع anti-CD3 / حبات المغلفة CD28 لمدة 3 أيام في حالة غياب أو وجود T
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من مجرد عدد قليل من الخلايا ريج T موجودة في الفئران والبشر، فمن المهم أن نفهم وظيفة لأنها تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابة المناعية والحفاظ على التسامح المناعي. عدد والقمعية وظائف تي ريج خلايا زيادات خلال عدوى فيروس المزمن 15-20 وكذلك سرطان التقدم 13،14. هذا ربما يرجع إلى استمرار التحفيز مستضد. لتقييم خلايا تي ريج تعمل تحت استمرار مستضد وتطور المرض، يحتاج إلى قياس نشاطهم القمعية.
هنا، نحن تصف بروتوكول لتحليل النمط الظاهري خارج الحي من خلايا تي ريج وقياس نشاطهم القمعية باستخدام نظام المشاركة في ثقافة في المختبر من CD8 + T والخلايا ريج T. الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي هي التحليل وعزل الخلايا T ريج. حية وطازجة معزولة T
من أجل التحقيق في نشاط القمعية، كانت خلايا تي التن وخلايا T ريج شارك في تربيتها في نسبة 1 إلى 1. التعاون مع ثقافة تي ريجالخلايا من الفئران المصابة بشكل مزمن إلى خفض كبير CD8 + T تكاثر الخلايا وإفراز الإنترفيرون جاما بالمقارنة مع خلايا ريج T من الفئران ساذجة. وهذا يعني أن إنتاج انتشار وخلوى الخلايا CD8 + T شارك في تربيتها مع خلايا تي ريج ترتبط عكسيا مع وظيفة القمعية الخلايا ريج T. على الرغم من أن هذا البروتوكول يوصي استخدام نظام فصل الخلية المغناطيسي للزنزانة انفرادية تي ريج، التلوث مع خلايا ريج غير T-لا يمكن استبعاده. خلايا تي ريج تم الحصول عليها من Foxp3-GFP الفئران مراسل 28-30 هي أفضل المرشحين للتحقيق بدقة وظيفة خلايا تي ريج من نظام فصل الخلية المغناطيسي، وغالبا ما هى overexpressed CD25 على CD4 + T التحويل وكذلك خلايا ريج T تفعيلها.
تم تقييم وظيفة القمعية الخلايا ريج T من مختلف في المختبرالمقايسات قمع 16،28،31-34. ميزة في المختبر قمع الفحص هو أنه يقيم التأثير المباشر للخلايا T ريج على تثبيط استجابة الخلايا CD8 + T، فقط لأن الخلايا التركيب تي هي شارك في تربيتها مع خلايا تي ريج. بالإضافة إلى خلايا CD8 + T، وCD25 - خلايا CD4 + T يمكن استخدامها بدلا من خلايا تي التن 25. آثار تي ريج أو خلايا تي التحويل على الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية أو خلايا القاتل الطبيعي يمكن تقييم من خلال تغيير الظروف التجريبية.
جزيئات مثل CD103 35، LAG-3 36، بروتين سكري والتكرار تسود 37، CD43 38، CD11a 38 أو 1 38 استخدمت الخلايا القاتلة مثل كتين مستقبلات فصيلة عضوا G كعلامات الخلايا ريج T تفعيلها في أمراض معينة. في هذا البروتوكول، وكنا PD-1 كمؤشر لتحديد تنشيط خلايا T ريج خلال عدوى فيروس المزمن. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لتحليلات متعددة الأوجه (المظهري وظيفية) من خلايا تي ريج في ظل ظروف محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | |
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Cell strainer, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Cell strainer, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml | Gibco | 10378-016 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0.5 M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
