Abstract
Regulatoire T (T reg) cellen, die Foxp3 expressie als een transcriptiefactor, zijn subsets van CD4 + T-cellen. T reg cellen spelen een cruciale rol bij immuun tolerantie en homeostase onderhoud door het reguleren van de immuunrespons. De primaire rol van T reg cellen de proliferatie van effector T (T eff) cellen en de productie van cytokinen zoals IFN-γ, TNF-α en IL-2 te onderdrukken. Het is aangetoond dat het vermogen van T-cellen reg om de functie van T-cellen te remmen eff wordt versterkt bij persistente pathogeeninfectie en kankerontwikkeling. Om de functie van T-cellen reg grond rusten of ontstoken, kunnen er diverse in vitro onderdrukking assays met muis of humane T-cellen reg bedacht verduidelijken. Het belangrijkste doel van deze studie is om een methode om de verschillen in fenotype en onderdrukkende functie tussen rustende en geactiveerde T-reg te vergelijken ontwikkelencellen. Aan geactiveerde T-cellen reg isoleren, werden de muizen geïnfecteerd met lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV) kloon 13 (CL13), een chronische stam van LCMV. Reg T cellen geisoleerd uit de milt van LCMV CL13-geïnfecteerde muizen vertoonden zowel de geactiveerde fenotype en verbeterde onderdrukkende activiteit in vergelijking met rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen. Hier beschrijven we de basisprotocol voor ex vivo fenotype analyse geactiveerde T-cellen reg onderscheiden van rustende T-cellen reg. Verder beschrijven we een protocol voor het meten van de onderdrukkende activiteit van volledig geactiveerde T-cellen reg.
Introduction
Regulatoire T (T reg) cellen brengen forkhead box P3 (Foxp3) als een transcriptiefactor voor hun ontwikkeling en werking 1. Bovendien T reg cellen brengen verschillende andere moleculen zoals CD25 2, lymfocyt-activering gen 3 (LAG-3) 3, glucocorticosteroïde tumor necrosis factor receptor 4 en cytotoxische-T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA-4) 5 op hun oppervlak of intracellulaire gebied. Tijdens chronische infectie met verschillende soorten ziekteverwekkers zoals virussen 6,7, 8,9 bacteriën en parasieten 10-12 of tijdens kankerontwikkeling 13,14, raken T reg cellen gedifferentieerd in geactiveerde cellen en vertoont verbeterde onderdrukkende functie targeting effector CD4 + en CD8 + T-cellen. Een aantal artikelen hebben gesuggereerd dat uitgebreid en geactiveerde T-cellen reg bijdragen tot verminderde CD8 + T cel response tijdens vriend retrovirus (FV) infectie 15-17. FV-geïnduceerde T reg cellen te remmen IFN-γ of granzyme B expressie en reactiviteit van cytotoxische CD8 + T-cellen 15-17. Bovendien, in een herpes simplex virus-model, werd gemeld dat depletie van CD4 + CD25 + T cellen reg resulteerde in het vergroten van virus-specifieke CD8 + T-cellen en ernstige weefselschade door infiltratie van immunopathogene CD4 + T-cellen 18-20.
Muizen chronisch geïnfecteerd met het kloon 13 stam van lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV CL13) 21-24 zijn op grote schaal gebruikt om het fenotype en de functie van effector T-cellen (T eff) en T cellen reg karakteriseren tijdens chronische virusinfectie. Tijdens aanhoudende LCMV infectie, virus-specifieke T eff cellen geleidelijk verliezen hun effector functie en uitgeput raken T (T EXH) cellen. Anderzijds, Treg cellen versterken hun vermogen om virus-specifieke T-cel respons 25 te onderdrukken. De afname van de werkcapaciteit van de T eff cellen kunnen worden verklaard door verschillende factoren zoals verhoogde expressie van remmende receptoren op T eff cellen veranderde functie van antigeenpresenterende cellen, productie van immunoregulerende cytokinen en verhoogde frequentie of verbeterde functie van T reg 26 cellen. Tussen de bij T-cel suppressie factoren, geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) tot expressie brengen T exh-cellen en T-cellen reg zijn algemeen beschouwd als kenmerken antigeen persistentie en onderdrukkende omgeving. Recentelijk werd gemeld dat blokkade van de PD-1 pathway en verwijdering van T-cellen reg leiden tot verhoogde T cel functie en verminderde viral load bij LCMV chronische infectie 27. Bovendien worden T-cellen geactiveerd reg tijdens chronische infectie van muizen met LCMV 23,25 25. PD-1 wordt sterk tot expressie gebracht op T-cellen reg en exh T-cellen en het niveau van PD-1 door T reg cellen tot expressie correleert met de kracht van de onderdrukkende functie om T-celproliferatie 25 remmen.
We beschrijven een werkwijze om de eigenschappen van geactiveerde T-cellen reg geïsoleerd uit muizen geïnfecteerd met LCMV CL13 en rustende T cellen reg geïsoleerd uit naïeve muizen te vergelijken. Verder leggen wij een reeks processen om geactiveerde T-cellen reg scheiden en onderzoeken hun ex vivo fenotype, en meten hun onderdrukkende activiteit in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In dit onderzoek werden muizen in een specifieke pathogeenvrije faciliteit van de Yonsei Laboratory Animal Research Center van de Yonsei University onderhouden. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Korean Food and Drug Administration richtlijnen met behulp van protocollen door de International Animal Care en gebruik Comite van de Yonsei Laboratory Animal Research Center aan de Yonsei University goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de Solutions
- Bereid 2% RPMI media door verdunning foetaal runderserum (FBS) tot 2% en penicilline-streptomycine tot 1% in RPMI
- Bereid volledig RPMI media. Om RPMI media voeg 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 1% L-glutamine en 50 pM 2-mercaptoethanol.
- Bereid fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) buffer. Hiertoe, supplement fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% FBS.
- Bereid T cel isolatiebuffer. Hiervoor PBS aangevuld met 2% FBS en 2 mM ethylenediaminetetraaCETIC zuur.
2. Isolatie van milt lymfocyten
- Verwijder de milten uit naïeve of LCMV CL13-geïnfecteerde muizen zoals eerder beschreven 19 en weer in 60 mm x 15 mm platen met 10 ml 2% RPMI media.
LET OP: In deze studie experimenten, 5 tot 6 weken oude C57B1L / 6J vrouwelijke muizen kregen 2 x 10 6-plaque-vormende eenheden (pfu) van LCMV CL13 door middel van intraveneuze injectie via de staartader. Offer de muizen op dag 16 na infectie (16 d pi) 25. Analyseer ge-gematched naïeve muizen op dezelfde dag. - Plaats een cel zeef in een 50 ml buis en spoelen met 2 ml 2% RPMI media. Plaats de milt op de 70 urn cel zeef en maal met de plunjer van een injectiespuit. Spoel de cel zeef met 2 ml 2% RPMI media en haal hem uit de 50 ml buis.
- Vul de buis met 2% RPMI medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer decelpellet in 1 ml ACK lysisbuffer. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur (KT) gedurende 5 min.
Opmerking: Het volume van ACK lyserende buffer hierboven aangegeven is één milt. Opschalen het volume dienovereenkomstig voor gepoolde milt monsters. - Vul de buis met 2% RPMI medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml in volledig RPMI media.
LET OP: Voor live cell tellen, vlek cellen met trypan blauw en tellen alleen levende cellen die niet zijn gekleurd met behulp van hemocytometer.
3. fenotypering van Milt Conventionele T (T conv) cellen en T-cellen reg
OPMERKING: Voordat T reg cel isolatie, onderzoekt het fenotype van milt lymfocyten geïsoleerd uit naïeve of geïnfecteerde muizen door kleuring van de cellen met verschillende antilichamen en analyseren van hen door middel van flowcytometrie.
- Transfer 50 pi van de cellen(5 x 10 5 cellen) onder totale milt lymfocyten in elk putje van een nieuwe U-bodem 96-well plaat en voeg 150 gl FACS buffer per putje. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant. Schud de celpellet en voeg 200 gl FACS buffer per putje. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C (2 keer).
- Bereid het antilichaam cocktail voor kleuring celoppervlak markers in 50 ui FACS-buffer per putje met de volgende antilichamen en reagentia. Anti-CD4 violette kleurstof, anti-CD25 groene kleurstof, anti-PD-1 violette kleurstof, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 kleurstof en cellevensvatbaarheid detectiereagens nabij-infrarood (IR) fluorescente reactieve kleurstof.
OPMERKING: Om het fenotype van geactiveerde T-cellen reg verder te analyseren, kunnen anti-CD103 23,25 worden toegevoegd voor het celoppervlak-marker kleuring. - Resuspendeer de celpellet met 50 ui antilichaam cocktail per putje. Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C. Was de cellen tweemaal metFACS-buffer door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Na de laatste wasstap, decanteer het supernatant en vast de cellen gedurende 20 min in het donker bij 4 ° C met 100 gl fixatie buffer bereid volgens het protocol van de fabrikant.
- Was de cellen tweemaal met permeabilisatie wasbuffer (bereid volgens het protocol van de fabrikant) door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Bereid de antilichaamoplossing voor intracellulaire kleuring Foxp3 en resuspendeer de celpellet met 50 pl anti-Foxp3 antilichaamoplossing.
LET OP: Om verder analyseren van de fenotypes van T conv en T-cellen reg, anti-CTLA kan bij deze stap worden toegevoegd. - Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C en herhaal stap 3,6. Na de laatste wasstap, resuspendeer de celpellet in 200 ui FACS-buffer en onderzoekt het fenotype van de cellen door flowcytometer 25.
- De Poort van de levende cellen populatie. Om het fenotype van T-cellen tijdens conv LCMV CL13 infectie analyseren onderzoekt de frequentie van Foxp3 - PD-1 + cellen onder CD4 + of CD8 + T-cellen.
OPMERKING: Op basis van experimentele resultaten, het percentage Foxp3 - PD-1 + meer dan 50% in zowel CD4 + en CD8 + T-celpopulaties op 16 d pi met LCMV CL13.- De frequentie en fenotypen van T cellen reg analyseren onderzoekt de frequenties van Foxp3 + of Foxp3 + PD-1 + cellen onder CD4 + T-cellen.
OPMERKING: Op basis van experimentele resultaten, het percentage Foxp3 + of Foxp3 + PD-1 + cellen meer dan 20% van CD4 + T-celpopulatie, respectievelijk.
- De frequentie en fenotypen van T cellen reg analyseren onderzoekt de frequenties van Foxp3 + of Foxp3 + PD-1 + cellen onder CD4 + T-cellen.
4. Isolatie van CD4 + CD25 + T-cellen reg
OPMERKING: De inhoud van alle reagentia hieronder aangegeven zijn voor eenstart het aantal cellen van 1 x 10 7 totaal splenocyten.
- Bereid de cellen zoals beschreven in hoofdstuk 2 met behulp van naïeve en LCMV chronisch geïnfecteerde muizen. Was de cellen door toevoeging van 10 ml van T cel isolatiebuffer. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de volledig celpellet in 40 gl buffer.
- Voor CD4 + T-cel verrijking via het magnetische celscheiding systeem, voeg 10 ul van biotine-antilichaam cocktail en meng goed. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 30 ul buffer, 20 pl anti-biotine microkorrels voor labeling van niet-CD4 + T-cellen en 10 ul CD25-PE antilichaam voor fluorescente labeling van CD25 + cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker.
- Voeg 2 ml buffer en laat de cellen door een 40 um cel zeef in een nieuwe 50 ml buis celresten te verwijderen. Was de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.Verwijder het supernatant en resuspendeer de volledig celpellet in 500 ui buffer met een dichtheid van maximaal 1,25 x 10 8 cellen.
- Breng de cellen op de kolom en verzamel de ongelabelde cellen die door de kolom passeren. Was de kolom door toevoeging van 2 ml buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de volledig geïsoleerde CD4 + T-cellen in 90 ui buffer.
- Voor magnetische kenmerken van CD25 + cellen, voeg 10 ul anti-PE microbolletjes, meng en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Voeg 2 ml buffer en was de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de volledig celpellet in 500 ui buffer met een dichtheid van ten hoogste 1 x 10 8 cellen.
- Om de CD4 + CD25 + T-cellen reg te verrijken, gelden de cellen op de kolom voor positieve selectie, en was de column door toevoeging van 2 ml buffer. Herhaal het wassen drie keer.
- Wanneer de kolom leeg na de laatste wasstap, voeg 1 ml van buffer op de kolom en spoel de magnetisch gelabelde CD4 + CD25 + cellen met behulp van de zuiger.
- Herhaal stap 4,8-4,9 om de zuiverheid van de geïsoleerde CD4 + CD25 + T cellen reg verbeteren. Was de cellen met FACS-buffer door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de geïsoleerde CD4 + CD25 + T reg cellen bij een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml in volledig RPMI media.
- Om de zuiverheid van de geïsoleerde CD4 + CD25 + T cellen reg controleren in 2 x 10 5 cellen door gehele geïsoleerde CD4 + CD25 + T cellen reg. Vlekken op de cellen met 50 pi FACS buffer die anti-CD4-FITC en cellevensvatbaarheid detectiereagens nabij-infrarood fluorescerende reactieve kleurstof.
OPMERKING: CD25 reeds gemerkt met PE in isolatie. - Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C. Was de cellen met FACS-buffer door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Na wassen, resuspendeer de celpellet in 100 ui FACS-buffer en laat de zuiverheid van flowcytometrie.
- De Poort van de live-cell bevolking. De zuiverheid van T-cellen reg analyse bevestigt het percentage CD4 + CD25 + cellen.
OPMERKING: Op basis van experimentele resultaten, het percentage van CD4 + CD25 + cellen onder gezuiverde cellen dan ongeveer 80%.
5. Isolatie van CD8 + T-cellen en etikettering van CD8 + T-cellen
LET OP: De volumes van alle reagentia hieronder aangegeven zijn voor een beginnend cel aantal van 1 x 10 7 totaal splenocyten.
- Bereid cellen zoals beschreven in hoofdstuk 2 met behulp van naïeve muizen. Was de cellen door toevoeging van 10 ml van T cel isolatie buffER. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant volledig en resuspendeer de celpellet in 40 gl buffer.
- Voor CD8 + T-cellen geïsoleerd met behulp van de magnetische celscheiding systeem, voeg 10 ul van biotine-antilichaam cocktail van niet-CD8 + T cel labeling en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 30 pl buffer en 20 pl anti-biotine microbolletjes. Goed mengen en incuberen gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Breng de cellen op de kolom en verzamel de ongelabelde cellen die door de kolom passeren. Was de kolom door toevoeging van 2 ml buffer driemaal.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de volledig geïsoleerde CD8 + T-cellen in 2 ml buffer.
- Om de zuiverheid van de geïsoleerde cellen controleren, bereid 50 gl antilichaamoplossing in FACS buffer. Resuspendeer de 2 x 10 5 cellen onder geïsoleerde CD8 + T cells in 50 gl antilichaamoplossing.
OPMERKING: Om antilichaam te bereiden, voeg anti-CD8 FITC, en de levensvatbaarheid van de cellen detectie reagens (nabij-infrarood fluorescerende reactieve kleurstof) in FACS buffer. - Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C. Was de cellen met FACS-buffer door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Na wassen, resuspendeer de celpellet in 100 ui FACS-buffer, en controleer de zuiverheid van de cellen door flowcytometrie.
- De Poort van de live-cell bevolking. De zuiverheid van CD8 + T-cellen controleren, bevestigen het percentage van CD8 + T-cellen.
OPMERKING: Op basis van experimentele resultaten, het percentage CD8 + cellen gezuiverd onder cellen dan ongeveer 90%. - Voeg PBS om de geïsoleerde CD8 + T-cellen. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de geïsoleerde CD8 + T-cellen bij een concentratie van 1 x 10 7 cellen / ml in PBS.
- Om de CD8 + T CE-labellls voor de in vitro assay onderdrukking verdund celproliferatie volgen violette kleurstof in PBS tot een concentratie van 5 urn bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De geschatte excitatie en emissie pieken van de celproliferatie volgen violette kleurstof gebruikt in de studie zijn 405 en 450 nm, respectievelijk. - Meng goed gelijke volumes celproliferatie volgen violette kleurstof (5 uM) en celsuspensie (1 x 10 7 cellen / ml CD8 + T-cellen) in een 15 ml buis en incubeer 20 minuten bij 37 ° C. Vortex de buis om de 10 min.
- Vul de buis met koude RPMI volledige media, en laat de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant volledig en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml met voorverwarmd RPMI volledige media. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
6. Instellen van de In Vitro Onderdrukking test met behulp van CD4 + CD25 + T <sub> reg en CD8 + T-cellen
- Anti-CD3 / CD28 beklede parels te bereiden, breng de juiste hoeveelheid magnetische korrels aan een 15 ml buis (2,5 gl / 1 x 10 5 cellen). Voeg een gelijk volume PBS en meng. Wassen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C en werp de supernatant. Verdun de magnetische kralen in compleet medium (50 gl / putje).
- Aliquot 50 ul van CD4 + CD25 + T reg cellen per well U-bodem 96-well plaat (1 x 10 5 cellen / putje). Voeg 50 ul van CD8 + T-cellen als responder T (T resp) cellen per putje (1 x 10 5 cellen / putje). Voeg 50 ul verdund anti-CD3 / CD28 beklede parels in per putje.
Opmerking: In deze stap label en stel controleputjes als volgt: "uitsluitend gestimuleerde CD8 + T-cel", zonder anti-CD3 / CD28 beklede parels; "Alleen CD8 + T cel" met anti-CD3 / CD28 beklede parels; Alleen "CD8 + T cel"Met anti-CD3 / CD28 beklede parels;". T reg cel alleen "met anti-CD3 / CD28 beklede parels T reg cellen kunnen worden verdund met compleet medium en co-gekweekt met T resp cellen in een andere verhouding van T resp cellen: T-cellen reg (1: 0,25-1: 1). - Voeg 50 ul of geschikt volume medium in alle wells totaal volume van 200 pl. Bedek de plaat met folie en incubeer in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 72 uur.
7. Analyse van CD8 + T-cel proliferatie en cytokineproductie uit CD8 + T-cellen
- Voor de cytokineproductie analyse na 3 dagen kweken, scheiden de supernatant van elk putje in een plaat en uitvoeren enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA).
Opmerking: Het supernatans worden in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -70 ° C. In dit experiment werd anti-muizen-IFN-γ-antilichaam beklede plaat gebruikt om IFN-γ productie accord detecterening het protocol van de fabrikant s. IFN-γ productie van prolifererende CD8 + -T-cellen op een enkele cel te bepalen, kan intracellulaire cytokine kleuring uitgevoerd. - Na scheiden van de supernatant uit elk putje, was de plaat die de cellen met FACS buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C (3 keer).
- Na het wassen, gooi het supernatant. Resuspendeer de celpellet met 50 ui antilichaam cocktail voor kleuring geprolifereerde CD8 + T-cellen. Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
OPMERKING: Om antilichaam cocktail bereiden, voeg anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 en levensvatbaarheid van de cellen detectie reagens (nabij-infrarood fluorescerende reactieve kleurstof) in FACS buffer.
OPMERKING: Antilichamen tegen verschillende merkers zoals CD44 of CD69 kan worden gecombineerd met andere antilichamen activatie van CD8 + T-cellen te bevestigen. Anders, CD8 + T-cellen zijn reeds voorzien van celproliferatie volgen violet kleurstof bij stap 5,10. - Was tweemaal door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Na de laatste wasstap, gooi het supernatant en vast de cellen gedurende 20 min in het donker bij 4 ° C met 100 gl fixatie buffer.
- Was tweemaal door centrifugatie bij 300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen met 200 pi FACS-buffer en meet de proliferatie van celproliferatie volgen violet kleurstof gelabelde CD8 + T cellen door flowcytometrie.
- Poort de CD8 + T-celpopulatie onder de levende cellen. Meet de percentages van verdeelde ongedeelde cellen volgens de verdunning van de celproliferatie volgen violette kleurstof en CD8 + T cel verdunning volgens de volgende vergelijking. % Remming = [(% geprolifereerde CD8 + T-cellen in de afwezigheid van T-cellen reg -% geprolifereerde CD8 + T cellen in de aanwezigheid van T-cellen reg) / (% geprolifereerde CD8 + T-cellen inAangezien T-cellen reg)] x 100. Verdere analyse van de gegevens met behulp van flowcytometrie software 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gegenereerd muizen met hardnekkige virus infectie door het injecteren van hen met 2 x 10 6 pfu van LCMV CL13 intraveneus. De fenotypische veranderingen in T-cellen en T reg conv cellen tijdens chronische virusinfectie te onderzoeken, werden milt-lymfocyten van naïeve en geïnfecteerde muizen gekleurd met verschillende antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. Bij 16 pi d, PD-1 werd opgereguleerd in beide Foxp3 - CD4 + T conv (Figuur 1A, bovenste paneel) en Foxp3 - CD8 + T conv (Figuur 1B, bovenste paneel) cellen. De frequentie van Foxp3 + CD4 + T cellen reg was twee keer hoger in de LCMV CL13-geïnfecteerde muizen dan bij de naïeve muizen (Figuur 1A). Vooral meeste Foxp3 + CD4 + T cellen reg getoonde geactiveerd fenotype, die hoge niveaus vanPD-1 op dit tijdstip (Figuur 1A).
Voor de in vitro assay onderdrukking, een aanzienlijk aantal CD8 + T conv cellen en CD4 + CD25 + T cellen reg nodig waren. Tot 1 x 10 7 celproliferatie volgen violet kleurstof gelabelde CD8 + T cellen te verkrijgen, werden splenocyten uit twee milt van naïeve muizen samengevoegd. Tot 2 x 10 6 of 3 x 10 6 van CD4 + CD25 + T reg cellen te verkrijgen, ten minste drie milt van naïeve en LCMV CL13-geïnfecteerde muizen, respectievelijk, werden samengevoegd. CD8 + T-cellen als T-cellen werden resp succes afgescheiden zonder significante verontreiniging met andere immune cellen (Figuur 2A). T reg cellen kunnen ook worden geïsoleerd, met een dominante populatie van CD25 + CD4 + T-cellen met meer dan 80% zuiverheid (figuur 2B).
Om de onderdrukkende functie van naïeve en chronische T cellen reg vergelijken, werden de geïsoleerde T reg en T resp cellen samen geïncubeerd onder stimulatie met anti-CD3 / CD28 beklede parels bij 37 ° C gedurende 3 dagen. % Remming van CD8 + T-cel proliferatie resp verhoogd in een T-cel reg dese-afhankelijke wijze (Figuur 3A). Wanneer CD8 + T resp cellen werden samen gekweekt met chronische T reg cellen in een verhouding van 1: 1, werden proliferatie van CD8 + T resp cellen remde (Figuur 3B). IFN-γ productie door CD8 + T-cellen resp waren ook significant geremd wanneer CD8 + T resp cellen werden samen gekweekt met geactiveerde T-cellen reg uit chronisch geïnfecteerde muizen plaats met rustende T reg cellen van naïeve muizen in een T reg (Figuur 3C).
Figuur 1: Fenotypes van CD4 + en CD8 + T-cellen in de milt van naïeve muizen of LCMV CL13-geïnfecteerde muizen 16 d pi (A) Expressie van PD-1 of CD25 op Foxp3 - CD4 + T conv en Foxp3 + CD4 + T-cellen reg. (B) Expressie van PD-1 of CD25 op Foxp3 - CD8 + T-cellen conv. Miltlymfocyten werden gekleurd met antilichamen tegen CD4, CD8, CD25, PD-1, en Foxp3. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Panel A is gewijzigd ten opzichte van 25 als referentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zuiverheden van resp T-cellen geïsoleerd uit naïeve muizen en T reg cellen geïsoleerd uit naïeve of LCMV CL13-geïnfecteerde muizen (A) percentage van CD8 + T-cellen na isolatie.. (B) Percentage-CD25 die CD4 + T-cellen reg na isolatie. Elk kwadrant in (B) werd bepaald door de expressie van CD4 en CD25. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Figuur 3: Effect van geactiveerde T-cellen reg op CD8 + T-celrespons (A)% inhibitie van CD8 + T-cellen co-gekweekt met T reg cellen in een T-cel reg dosisafhankelijke manier.. (B) Proliferatie van CD8 + T-cellen co-gekweekt met T reg cellen in 1: 1 verhouding. (C) IFN-γ productie van CD8 + T-cellen co-gekweekt met T reg cellen in een T-cel reg dosisafhankelijke wijze. Proliferatie van CD8 + T-cellen werd gemeten door verdunning van celproliferatie bijhouden violette kleurstof verspreid CD8 + T-cellen en IFN-γ secretie werd geëvalueerd met ELISA. Celproliferatie volgen violet kleurstof gelabelde CD8 + T-cellen werden gestimuleerd met anti-CD3 / CD28 beklede parels gedurende 3 dagen in afwezigheid of aanwezigheid van T
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel slechts een klein aantal T-cellen reg bestaan in muizen en mensen, is het belangrijk om de functie te begrijpen omdat zij een cruciale rol bij het reguleren van de immuunrespons en immuun tolerantie spelen. Het aantal en de onderdrukkende functie van T-cellen reg stijgt tijdens een chronische virusinfectie 15-20 evenals de progressie van kanker 13,14. Dit komt waarschijnlijk door aanhoudend antigeen stimulatie. De T cellen reg functioneren onder antigen en persistentie ziekteontwikkeling evalueren hun onderdrukkende activiteit moet worden gemeten.
We beschrijven hier een protocol bij de ex vivo fenotype van T reg cellen te analyseren en meten hun onderdrukkende activiteit via een in vitro co-kweeksysteem van CD8 + T-cellen en T-cellen reg. Kritische stappen in het huidige protocol zijn analyse en isolatie van T-cellen reg. Leef en vers geïsoleerde T
Om de onderdrukkende activiteit te onderzoeken, resp T-cellen en T cellen reg werden tezamen gekweekt bij een verhouding van 1 op 1. Co-kweek met T regcellen uit chronisch geïnfecteerde muizen significant verminderd CD8 + T cel proliferatie en IFN-γ uitscheiding in vergelijking met T reg cellen van naïeve muizen. Dit impliceert dat de proliferatie en cytokineproductie van CD8 + T-cellen co-gekweekt met T-cellen reg omgekeerd evenredig zijn aan de onderdrukkende functie van T-cellen reg. Hoewel dit protocol adviseert het gebruik van een magnetische celscheiding voor T reg celisolatie, verontreiniging met niet-T reg cellen kunnen niet worden uitgesloten. De T reg cellen verkregen van Foxp3-GFP reporter muizen 28-30 zijn betere kandidaten nauwkeurig onderzoeken van de functie van T-cellen reg dan magnetische celscheiding systeem, CD25 vaak tot overexpressie gebracht op geactiveerde CD4 + T conv en T cellen reg.
De onderdrukkende functie van T-cellen reg is beoordeeld door verschillende in vitroonderdrukking assays 16,28,31-34. Het voordeel van de in vitro assay onderdrukking is dat het evalueert de rechtstreekse werking van T reg cellen op de remming van de CD8 + T-celrespons, omdat alleen T resp cellen samen gekweekt met T-cellen reg. Naast het CD8 + T-cellen, de CD25 - kunnen CD4 + T-cellen worden gebruikt in plaats van T-cellen respectievelijk 25. De effecten van T reg of T conv cellen op immune cellen zoals dendritische cellen of NK-cellen kan worden geëvalueerd door het variëren van de experimentele omstandigheden.
Moleculen zoals de CD103 35, LAG-3 36, glycoproteïne A herhalingen overheerst 37, CD43 38, CD 11 38 of killer cel lectine-achtige receptor subfamilie G lid 1 38 werden gebruikt als merkers van geactiveerde T-cellen reg specifieke ziekten. In dit protocol, gebruikten we PD-1 alsindicator te identificeren geactiveerde T-cellen reg tijdens chronische virusinfectie. Dit protocol kan worden gebruikt voor veelzijdige analyses (fenotypische en functionele) T reg cellen onder specifieke omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | |
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Cell strainer, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Cell strainer, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml | Gibco | 10378-016 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0.5 M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
