Abstract
T רגולטוריים (T reg) תאים, המבטאים Foxp3 כגורם שעתוק, הם תת קבוצות של תאים מסוג CD4 + T. תאי רג T לשחק תפקידים מכריעים בסובלנות חיסונית ותחזוקה הומאוסטזיס על ידי ויסות התגובה החיסונית. התפקיד העיקרי של תאי T reg היא לדכא התפשטות של מפעיל T (EFF T) התאים ואת הייצור של ציטוקינים כגון IFN-γ, TNF-α, IL-2. הוכח כי היכולת של תאי רג T לעכב את תפקודם של תאי EFF T מוגברת במהלך זיהום הפתוגן מתמשך התפתחות הסרטן. כדי להבהיר את תפקודם של תאי רג T בתנאי מנוחה או מודלק, מגוון של מבחני דיכוי במבחנה באמצעות תאי reg עכבר או אדם T כבר המציא. המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה כדי להשוות את ההבדלים הפנוטיפ ותפקוד מדכא בין מנוחת רג T מופעלתאים. כדי לבודד תאי רג T מופעלים, עכברים נדבקו בנגיף choriomeningitis לימפוציטית (LCMV) השיבוט 13 (CL13), זן כרוני של LCMV. תאי רג T המבודדים מן הטחול של LCMV עכברי CL13 נגועים הציגו הוא הפנוטיפ מופעל ופעילות מדכאת משופרת בהשוואת נח תאי רג T מבודדים מעכברים נאיביים. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול הבסיסי לניתוח פנוטיפ vivo לשעבר להבחין בין תאי רג T מופעלים מתוך נח תאי רג T. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הפעילות המדכאת של תאי רג T יופעלו באופן מלא.
Introduction
T רגולטוריים (T reg) תאים להביע forkhead תיבת P3 (Foxp3) כגורם שעתוק להתפתחותם ותפקוד 1. בנוסף, תאים רג T לבטא מולקולות שונות אחרות כגון CD25 2, הלימפוציטים-הפעלת הגן 3 (LAG-3) 3, TNF-induced בסטרואידים קולטן 4, ו T ציטוטוקסיים לימפוציט הקשורים חלבון 4 (CTLA-4) 5 על פני השטח או באזור התאי שלהם. במהלך זיהום כרוני עם סוגים שונים של פתוגנים כמו וירוסים 6,7, חיידקים 8,9, וטפילי 10-12, או במהלך התפתחות סרטן 13,14, תאי רג T נעשים שונים לתאים מופעלים, מוצגים פונקציה מדכאת משופרת מיקוד מפעיל CD4 + ו- CD8 + T תאים. מספר העיתונים הציע כי תאי T reg מורחבים והופעלו לתרום respons תא CD8 + T לקוידואר במהלך רטרו-וירוס חבר (ע"ע) זיהום 15-17. FV-induced תאי רג T לעכב IFN-γ או ביטוי granzyme B תגובתיות ציטוטוקסיות של תאי CD8 + T 15-17. יתר על כן, במודל זיהום בנגיף הרפס סימפלקס, נמסר דלדול של תאי reg CD4 + CD25 + T הביא להרחבת תאים + T CD8 ספציפי וירוס ניזק לרקמות קשה על ידי חדירה של תאי immunopathogenic CD4 + T 18-20.
עכברים נגועים באופן כרוני עם זן שיבוט 13 של וירוס choriomeningitis לימפוציטית (LCMV CL13) 21-24 היה בשימוש נרחב כדי לאפיין את הפנוטיפ ותפקוד של תאי T המפעיל (EFF T) ותאי T reg במהלך זיהום בנגיף כרוני. במהלך זיהום LCMV מתמשך, תאי T eff-ספציפי וירוס בהדרגה לאבד פונקצית המפעיל שלהם ולהיות T מותש (exh T) תאים. מצד שני, Tתאים reg לחזק את יכולתם לדכא T בתגובה תאים ספציפיים וירוס 25. הירידה ביכולת התפקוד של תאי T EFF יכולה להיות מוסברת על ידי מספר גורמים כגון גברת ביטוי של קולטנים מעכבים על תאי EFF T, פונקציה שינתה של תאי מציגי אנטיגן, ייצור של ציטוקינים immunoregulatory, ותדירות מוגברת או פונקציה משופרת של רג T תאים 26. בין הגורמים המעורבים דיכוי של תאי T, מתוכנת בתא הנידונים למוות חלבון-1 (PD-1) תאי T exh -expressing ותאי רג T כבר נחשב בעיני רבים מסימני ההיכר של התמדה אנטיגן וסביבה מדכאים. לאחרונה, דווח כי מצור של המסלול PD-1 ו אבלציה של תאי רג T להוביל תפקוד תא T משופר וירידת עומס נגיפי במהלך הזיהום הכרוני LCMV 27. יתר על כן, תאי רג T מופעלים במהלך זיהום כרוני של עכברים עם LCMV 23,25 25. PD-1 מבוטא בכמות גבוהה בתאי רג T וכן תאי exh T, ורמת PD-1 הביע ידי תאי T reg בקורלציה עם עוצמת הפונקציה המדכאת שלהם לעכב T תא התפשטות 25.
כאן אנו מתארים שיטה כדי להשוות את המאפיינים של תאי T reg מופעלים מבודדים עכברים נגועים עם LCMV CL13 ותאי reg מנוחת T מבודד מעכברים נאיביים. יתר על כן, נסביר שורה של תהליכים להפריד תאי רג T מופעלים ולבחון vivo לשעבר הפנוטיפ שלהם, כמו גם למדוד את הפעילות המדכאת שלהם במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר זה, העכברים היו מתוחזקים במתקן הפתוגן ללא ספציפי של המרכז לחקר בעלי חיים Yonsei מעבדה של Yonsei האוניברסיטה. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות אוכל קוריאני והתרופות באמצעות הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים הבינלאומי ושימוש של המרכז לחקר בעלי חיים במעבדות בעמותת Yonsei Yonsei האוניברסיטה.
1. הכנת פתרונות
- הכן 2% RPMI התקשורת על ידי דילול בסרום שור העובר (FBS) ל -2% ו פניצילין, סטרפטומיצין עד 1% ב RPMI
- כן תקשורת RPMI להשלים. כדי RPMI התקשורת להוסיף 10% FBS, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 1% של L- גלוטמין, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol.
- כן מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) חיץ. כדי לעשות זאת, תוספת פוספט שנאגר מלוח (PBS) עם 2% FBS.
- הכן חיץ בידוד תא T. לשם כך, להשלים PBS עם 2% FBS ו 2 מ"מ ethylenediaminetetraaחומצת cetic.
בידוד 2. של הטחול לימפוציטים
- הסר את הטחול מעכברים נאיבי או LCMV CL13 נגועים כפי שתואר לעיל 19 ומניחים אותם 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי המכילות 10 מ"ל של 2% RPMI התקשורת.
הערה: בניסויים במחקר זה, 5 עד 6 שבועות בן C57B1L / 6J נקבה עכברים קיבלו 2 x 10 6 פלאק יוצרי יחידות (pfu) של LCMV CL13 באמצעות הזרקה תוך ורידית דרך וריד הזנב. להקריב את העכברים ביום 16 לאחר הפגיעה (16 pi ד) 25. לנתח ge בהתאמה עכברים נאיביים היו באותו היום. - מניחים מסננת תא לתוך צינור 50 מ"ל ולשטוף אותו עם 2 מ"ל של 2% RPMI התקשורת. מניחים את הטחול על מסננת תא 70 מיקרומטר ו לטחון באמצעות הבוכנה של מזרק. יש לשטוף את מסננת תא עם 2 מ"ל של 2% RPMI התקשורת ולהסיר אותו מהצינור 50 מ"ל.
- מלאו את הצינור עם 2% RPMI התקשורת צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspendהתא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ lysing ACK. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
הערה: הנפח של חיץ lysing ACK שצוין לעיל הוא בטחול אחד. הסולם את נפח בהתאם לדוגמאות הטחול נקווה. - מלאו את הצינור עם 2% RPMI התקשורת צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant ו resuspend התאים בצפיפות של 1 x 10 מ"ל 7 תאים / מדיה RPMI מלאה.
הערה: לקבלת ספירת תא חי, תאים כתם עם trypan כחול ולספור רק לחיות תאים שאינם מוכתמים באמצעות hemocytometer.
3. phenotyping של הטחול הקונבנציונלי T (מרת T) תאי תאי רג T
הערה: לפני T reg לצינוק, לבחון את הפנוטיפ של לימפוציטים טחול מבודדים מעכברים נאיביים או נגועים מכתים את התאים עם נוגדנים שונים וניתוחם על ידי cytometry זרימה.
- העבר 50 μl של תאים(5 x 10 5 תאים) בין לימפוציטים טחול הכוללים לבאר כל צלחת 96-באר חדשה u-תחתון ולהוסיף 150 μl של חיץ FACS לכל טוב. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 °.
- בטל supernatant. להתסיס את התא גלולה ולהוסיף 200 μl של חיץ FACS לכל טוב. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C (2 פעמים).
- הכן את הקוקטייל של נוגדני סמנים פני תא מכתימים ב 50 μl של חיץ FACS לכל טוב עם הנוגדנים ריאגנטים הבאים. צבע סגול אנטי CD4, צבע ירוק Anti-CD25, לצבוע סגול אנטי-PD-1, אנטי CD8 PerCP-Cy5.5 מגיב זיהוי הכדאיות לצבוע ותא קרוב אינפרא אדום (IR) צבע תגובתי פלורסנט.
הערה: כדי להמשיך לנתח את הפנוטיפ של תאי T reg מופעל, אנטי-CD103 23,25 ניתן להוסיף עבור מכתים משטח-סמן תא. - Resuspend תא גלול עם 50 μl של קוקטייל של נוגדנים לכל טוב. דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.. שוטפים את התאים פעמיים עםחיץ על ידי צנטריפוגה XG ב 300 FACS עבור 2 דקות ב 4 ° C.
- לאחר שלב הכביסה הסופי, למזוג supernatant ולתקן את התאים במשך 20 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עם 100 μl של חיץ קיבעון הערוכים לפי הפרוטוקול של היצרן.
- שוטפים את התאים פעמיים עם חיץ לשטוף permeabilization (הערוכים על פי פרוטוקול של היצרן) על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C.
- הכן את פתרון נוגדן מכתים Foxp3 תאי, ו resuspend התא גלול עם 50 μl של פתרון נוגדן אנטי-Foxp3.
הערה: נוסף על מנת לנתח את פנוטיפים של המרה T ותאי רג T, אנטי CTLA ניתן להוסיף בשלב זה. - דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C וחזור על שלב 3.6. לאחר שלב הכביסה הסופי, resuspend התא הגלול ב 200 μl של חיץ FACS ולבחון את הפנוטיפ של תאים על ידי זרימת cytometer 25.
- שער popula התא החיtion. כדי לנתח את פנוטיפים של תאים המרה T במהלך ההדבקה LCMV CL13, לבחון את תדירות Foxp3 - PD-1 + תאים בין CD4 + או CD8 + T תאים.
הערה: בהתבסס על תוצאות הניסוי, אחוז Foxp3 - PD-1 + הוא יותר מ -50% בשני CD4 + ו- CD8 + T אוכלוסיות תאים ב 16 pi ד עם LCMV CL13.- כדי לנתח את התדירות ואת פנוטיפים של תאים רג T, לבחון את התדרים של Foxp3 + או Foxp3 + PD-1 + תאים בין CD4 + T תאים.
הערה: בהתבסס על תוצאות הניסוי, אחוז Foxp3 + או Foxp3 + PD-1 + תאים הוא יותר מ -20% ב CD4 + T תא האוכלוסייה, בהתאמה.
- כדי לנתח את התדירות ואת פנוטיפים של תאים רג T, לבחון את התדרים של Foxp3 + או Foxp3 + PD-1 + תאים בין CD4 + T תאים.
4. בידוד של תאים reg CD4 + CD25 + T
הערה: הכרכים של כל ריאגנטים המובאות בטבלה זו הנה עבורהחל מספר הסלולרי של 1 x 10 7 splenocytes הכולל.
- להכין את התאים כמתואר בסעיף 2 באמצעות עכברים נגועים כרוני נאיבי LCMV. שוטפים את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ בידוד תא T. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant לחלוטין resuspend התא גלולה ב 40 μl של חיץ.
- להעשרת תא CD4 + T באמצעות מערכת הפרדת תא המגנטית, להוסיף 10 μl של קוקטייל ביוטין-נוגדן ומערבב היטב. דגירה של 10 דקות ב 4 ° C..
- הוסף 30 μl של חיץ, 20 μl של חרוזים מיקרו אנטי ביוטין תיוג של תאים שאינם CD4 + T ו -10 μl של נוגדן CD25-PE עבור תיוג פלורסנט של תאים CD25 +. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ להעביר את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ"ל להסיר פסולת התא. שוטפים את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C.בטל supernatant לחלוטין resuspend התא גלולה במאגר 500 μl בצפיפות של עד 1.25 x 10 8 תאים.
- החל את התאים על הטור לאסוף את התאים ללא תווית עוברות הטור. לשטוף את העמודה על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant לחלוטין resuspend תאי CD4 + T המבודדים 90 μl של חיץ.
- תיוג מגנטי של CD25 + תאים, להוסיף 10 μl של microbeads אנטי-PE, לערבב היטב, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant לחלוטין resuspend התא גלולה ב 500 μl של חיץ בצפיפות של עד 1 x 10 8 תאים.
- כדי להעשיר את התאים reg CD4 + CD25 + T, להחיל את התאים על הטור עבור סלקציה חיובית, ולשטוף את קולוםn על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ. חזור על לשטוף שלוש פעמים.
- כאשר העמודה ריקה לאחר שלב הכביסה הסופי, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ על הטור, ולשטוף את התא המגנטי שכותרתו CD4 + CD25 + באמצעות הבוכנה.
- חזור על שלבי 4.8-4.9 כדי לשפר את הטוהר של תאי CD4 + CD25 + T reg המבודדים. שוטפים את התאים עם חיץ FACS על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend תאי CD4 + CD25 + T reg המבודדים בריכוז של 2 x 10 מיליליטר 6 תאים / מדיה RPMI מלאה.
- כדי לבדוק את הטוהר של תאי reg המבודד-CD4 + CD25 + T, להשתמש 2 x 10 5 תאי מתאי reg הכוללים מבודד-CD4 + CD25 + T. הכתם התאים עם 50 μl של חיץ FACS המכיל FITC אנטי CD4 ו כדאיות התא גילוי מגיב כמעט IR צבע תגובתי פלורסנט.
הערה: CD25 כבר סומן עם PE במהלך הבידוד. - דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.. שוטפים את התאים עם חיץ FACS על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C. לאחר כביסה, resuspend התא הגלול ב 100 μl של חיץ FACS ולבדוק את הטוהר על ידי cytometry זרימה.
- שער האוכלוסייה לחיות תאים. כדי לנתח את הטוהר של תאים רג T, לאשר את אחוז CD4 + CD25 + תאים.
הערה: בהתבסס על תוצאות הניסוי, אחוז CD4 + CD25 + תאים בין התאים מטוהרים נגמר כ -80%.
בידוד 5. של CD8 + T תאים ו תיוג של תאי CD8 + T
הערה: כרכים של כל ריאגנטים המובאות בטבלה זו הינן עבור מספר התא החל מיום 1 x 10 7 splenocytes הכולל.
- כן תאים כמתוארים בסעיף 2 באמצעות עכברים נאיביים. שוטפים את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של חובב בידוד תא Tאה. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant לחלוטין, ו resuspend התא גלולה ב 40 μl של חיץ.
- עבור בידוד תא CD8 + T באמצעות מערכת ההפרדה תא מגנטי, להוסיף 10 μl של קוקטייל נוגדן ביוטין תיוג התאים הלא-CD8 + T ומערבבים היטב. דגירה במשך 5 דקות ב 4 ° C..
- הוסף 30 μl של חיץ 20 μl של microbeads אנטי ביוטין. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- החל את התאים על הטור לאסוף את התאים ללא תווית עוברות הטור. לשטוף את העמודה על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ שלוש פעמים.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant לחלוטין resuspend תאי CD8 + T המבודדים 2 מיליליטר של חיץ.
- כדי לבדוק את הטוהר של התאים המבודדים, להכין 50 μl של פתרון נוגדן במאגר FACS. Resuspend את 2 x 10 5 תאים בין cel CD8 + T מבודדls ב 50 μl של פתרון נוגדן.
הערה: כדי להכין פתרון נוגדן, להוסיף אנטי CD8 FITC, ו מגיב זיהוי כדאיות התא (כמעט IR פלורסנט לצבוע תגובתי) למאגר FACS. - דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.. שוטפים את התאים עם חיץ FACS על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C. לאחר הכביסה, resuspend התא גלולה ב 100 μl של חיץ FACS, ולבדוק את הטוהר של התאים על ידי cytometry הזרימה.
- שער האוכלוסייה לחיות תאים. כדי לבדוק את הטוהר של תאי CD8 + T, לאשר את אחוז תאי CD8 + T.
הערה: בהתבסס על תוצאות הניסוי, אחוז CD8 + תאים בין התאים מטוהרים נגמר כ -90%. - הוסף PBS אל תאי CD8 + T המבודדים. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 °. בטל supernatant. Resuspend תאי CD8 + T המבודד בריכוז של 1 x 10 מיליליטר 7 תאים / PBS.
- כדי לתייג את ce CD8 + Tlls עבור assay דיכוי במבחנה, לדלל צבע סגול מעקב תא התפשטות ב PBS כדי להשיג ריכוז של 5 מיקרומטר ב RT.
הערה: העירור ופליטה המשוערת פסגות של הצבע הסגול מעקב תא ההתפשטות השתמש במחקר הם 405 ו -450 ננומטר, בהתאמה. - מערבבים היטב כמויות שוות של צבע סגול מעקב תא התפשטות (5 מיקרומטר) ו ההשעיה תא (1 x 10 7 תאים / מ"ל של תאי CD8 + T) בצינור 15 מ"ל, ו לדגור על 20 דקות בשעה 37 ° C. וורטקס הצינור כל 10 דקות.
- מלא את הצינור עם תקשורת קרה RPMI להשלים, ולהשאיר את הצינור במשך 10 דקות ב RT. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב RT. בטל supernatant לחלוטין, ו resuspend התאים בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל עם התקשורת מראש חימם RPMI להשלים. דגירת התאים במשך 15 דקות ב RT.
6. הגדרת Assay דיכוי חוץ-גופית בשיטת CD4 + CD25 + T <sub> reg ו CD8 + T תאים
- כדי להכין אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28, להעביר את נפח מתאים של חרוזים מגנטיים על 15 מ"ל של צינור (2.5 μl / 1 x 10 5 תאים). הוסף נפח שווה של PBS ומערבבים. לשטוף על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. לדלל את החרוזים המגנטיים ב מדיה מלאה (50 μl / טוב).
- Aliquot 50 μl של תאי reg CD4 + CD25 + T לכל טוב של צלחת גם 96-u-תחתון (1 x 10 5 תאים / טוב). הוסף 50 μl של תאי CD8 + T כמו מגיב T (שו"ת T) תאים לכל טוב (1 x 10 5 תאים / טוב). הוסף 50 μl של בדילול אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28 לתוך לכל טוב.
הערה: בשלב זה, התווית ולהקים בארות שליטה כדלקמן: "תא CD8 + T unstimulated רק" ללא אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28; "תא CD8 + T רק" עם אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28; "תא CD8 + T בלבד"עם אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28;". תא רג T רק "עם חרוזים אנטי CD3 / מצופה CD28 תאים רג T ניתן למהול מדיה מלאה ושיתוף תרבותי עם תאים שו"ת T על יחס שונה של T תאי שו"ת: תאי T reg (1: 0.25-1: 1). - הוסף 50 μl או נפח מתאים של מדיה לתוך כל בארות נפח כולל של 200 μl. מכסים את הצלחת עם רדיד דגירה של CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
7. ניתוח של CD8 + T תא ייצור הפצה & ציטוקין מ CD8 + T תאים
- לניתוח ייצור ציטוקינים, לאחר 3 ימים של תרבות, להפריד את supernatant של כל טוב לתוך צלחת אחר ולבצע assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA).
הערה: supernatant ניתן aliquoted ומאוחסנים ב -70 ° C. בניסוי זה, אנטי עכבר IFN-γ צלחת נוגדן מצופה הייתה המשמשת לאיתור הסכם ייצור IFN-γing לפרוטוקול של היצרן. כדי לקבוע ייצור IFN-γ של מתרבים תאי CD8 + T ברמה של תא בודד, מכתים ציטוקינים תאיים יכול להתבצע. - לאחר הפרדת supernatant מבאר כל, לשטוף את הצלחת המכיל את התאים עם חיץ צנטריפוגות FACS XG ב 300 דקות 2 ב 4 ° C (3 פעמים).
- לאחר הכביסה, לבטל את supernatant. Resuspend תא גלול עם 50 μl של קוקטייל של נוגדנים עבור צביעת תאי CD8 + T התרבו. דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C..
הערה: כדי להכין קוקטייל של נוגדנים, להוסיף FITC אנטי CD4, אנטי CD8 PerCP-Cy5.5, ו מגיב זיהוי כדאיות התא (כמעט IR פלורסנט לצבוע תגובתי) למאגר FACS.
הערה: נוגדנים כנגד סמנים שונים כגון CD44 או CD69 ניתן לשלב עם נוגדנים אחרים כדי לאשר הפעלה של תאי CD8 + T. זכור כי תאי CD8 + T כבר שכותרתו עם נ מעקב התפשטות תאיםלצבוע iolet בשלב 5.10. - שטפו פעמיים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C. לאחר שלב הכביסה הסופי, לבטל את supernatant, ולתקן את התאים במשך 20 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עם 100 μl של חיץ קיבעון.
- שטפו פעמיים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות ב 4 ° C. Resuspend התאים עם 200 μl של חיץ FACS ולמדוד את התרבות התאים + T CD8 שכותרתו לצבוע סגול מעקב תא התפשטות ידי cytometry הזרימה.
- שער אוכלוסיית תאי CD8 + T בין תאי חיים. מדוד את האחוזים של תאים מחולקים ובלתי מחולקים על פי הדילול של הצבע הסגול מעקב תא התפשטות דילול תא CD8 + T על פי המשוואה הבאה. עיכוב% = [(% מתאי CD8 + T התרבו בהעדר תאי רג T -% של תאי CD8 + T התרבו בנוכחות תאי רג T) / (% מתאי CD8 + T התרבובהעדר תאים רג T)] x 100. בהמשך לנתח את הנתונים באמצעות זרימת cytometry תוכנה 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יצרנו עכברים עם זיהום בנגיף מתמשך על ידי הזרקת אותם עם 2 x 10 6 pfu של LCMV CL13 לווריד. כדי לחקור את השינויים פנוטיפי בתאי T reg ותאי מרת T במהלך זיהום בנגיף כרוני, הלימפוציטים טחול שהתקבלו בעכברים נאיביים נגועים הוכתמו נוגדנים שונים ונותחו על ידי cytometry זרימה. בגיל 16 pi ד, PD-1 היה upregulated בשני Foxp3 - מרת CD4 + T (איור 1 א, פנל עליון) ואת Foxp3 - מרת CD8 + T (איור 1B, פנל עליון) תאים. התדירות של תאי reg Foxp3 + CD4 + T הייתה גבוהה פי שניים בעכברים הנגועים CL13 LCMV מאשר העכברים הנאיביים (איור 1 א). בפרט, רוב התאים reg Foxp3 + CD4 + T מוצג הפנוטיפ מופעל, להביע רמות גבוהות שלPD-1 בנקודה זו בזמן (איור 1 א).
עבור assay הדיכוי במבחנה, מספר לא מבוטל של תאי מרת CD8 + T מסוג CD4 + CD25 + T תאי reg נדרש. כדי להשיג 1 x 10 7 תאים מעקב התפשטות סגול שכותרתו לצבוע תאים CD8 + T, splenocytes משני spleens של עכברים תמימים היו נקווה. כדי להשיג 2 x 10 6 או 3 x 10 6 תאים reg CD4 + CD25 + T, לפחות שלושה spleens מעכברים נאיבי LCMV CL13 נגועים, בהתאמה, היו נקווה. CD8 + T תאים כמו תאי סי 'T הופרדו בהצלחה ללא זיהום משמעותי עם תאים אחרים של מערכת החיסון (איור 2 א). בתאי T reg יכולים גם להיות מבודדים, עם אוכלוסייה דומיננטית של תאי CD25 + CD4 + T עם יותר מ -80% טוהרים (איור 2 ב).
כדי להשוות את הפונקציה המדכאת של תאי רג T נאיביים וכרוניים, רג T המבודד תאי שו"ת T הודגרו יחד תחת גירוי עם אנטי CD3 / חרוזי מצופי CD28 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. עיכוב% של התפשטות תאי שו"ת CD8 + T הוגדל בתא T reg dese התלוי באופן (איור 3 א). כאשר תאי שו"ת CD8 + T היו שיתוף תרבותיים עם תאי רג T כרוניים על יחס של 1: 1, תרבות תאי שו"ת CD8 + T עוכבה באופן משמעותי (איור 3 ב). ייצור IFN-γ על ידי תאי שו"ת CD8 + T היה גם עכבות משמעותיות כאשר תאי שו"ת CD8 + T היו שיתוף תרבותיים עם תאי רג T מופעלים מעכברים נגועים כרוני ולא עם נח תאי רג T מעכברים נאיביים רג T (איור 3 ג).
איור 1: פנוטיפים של CD4 + ו- CD8 + T תאים בטחול של עכברים נאיבי או LCMV עכברים CL13 נגועים ב 16 pi ד (א) הביטוי של PD-1 או CD25 על Foxp3 - המרה CD4 + T ו Foxp3 + CD4 + תאי רג T. (ב) ביטוי של PD-1 או CD25 על Foxp3 - תאי מרת CD8 + T. לימפוציטים הטחול הוכתמו נוגדנים נגד CD4, CD8, CD25, PD-1, ו Foxp3. נתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. לוח א 'יש הבדל בין 25 כהפניה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: purities של תאי סי 'T מבודד מעכברים נאיביים ותאי T reg מבודדים מעכברים נאיביים או LCMV CL13 נגוע (א) אחוז תאי CD8 + T לאחר בידוד.. (B) אחוז להביע CD25 CD4 + T reg תאים לאחר בידוד. כל רביע (ב ') נקבע על פי רמות הביטוי של CD4 ו CD25. נתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
les / ftp_upload / 54,138 / 54138fig3.jpg "/>
איור 3: השפעת תאי רג T מופעלים על תגובת תא CD8 + T (A)% עיכוב של תאי CD8 + T שיתוף תרבותיים עם תאי רג T באופן תלוי מינון תא T reg.. (ב) תרבות תאי CD8 + T שיתוף תרבותיים עם תאי רג T ב 1: 1. (C) IFN-γ ייצור תאי CD8 + T שיתוף תרבותי עם תאים רג T באופן תלוי מינון תא T reg. תרבות תאי CD8 + T נמדדה על ידי דילול של צבע סגול מעקב תא התפשטות תאי CD8 + T התרבו הפרשת IFN-γ הוערך על ידי ELISA. סגול מעקב סלולרי התפשטות שכותרתו לצבוע תאים CD8 + T היו מגורה עם אנטי CD3 / חרוזים מצופים CD28 במשך 3 ימים, בהעדר או בנוכחות T
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אמנם רק מספר קטן של תאי רג T קיים בעכברים ובבני אדם, חשוב להבין את תפקידם כפי שהם ממלאים תפקיד מכריע בויסות התגובה החיסונית ושמירת סובלנות חיסונית. מספר הפונקציות מדכאות של T רג עליות תאים במהלך זיהום בנגיף כרוני 15-20 וכן התקדמות סרטן 13,14. זהו ככל הנראה עקב גירוי אנטיגן המשיך. כדי להעריך את T reg תאים לתפקד תחת התמדת אנטיגן ופיתוח מחלה, הפעילות המדכאת שלהם צריכה להימדד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הפנוטיפ vivo לשעבר של תאים רג T ולמדוד פעילות מדכאים שלהם באמצעות במבחנה שיתוף תרבות מערכת של תאים CD8 + T ותאי רג T. צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי הם ניתוח ובידוד של תאי רג T. T Live טרי המבודד
על מנת לחקור את הפעילות המדכאת, תאי שו"ת T ותאי רג T היו שיתוף תרבותיים ביחס של 1 ל -1 משותף תרבות עם רג Tתאים מעכברים נגועים כרוני מופחת משמעותי התפשטות תאי CD8 + T ו- IFN-γ הפרשה בהשוואה לתאי רג T מעכברים נאיביים. משמעות הדבר הוא כי ייצור ההתפשטות ציטוקינים של תאי CD8 + T שיתוף תרבותיים עם תאי רג T הופכים קשור הפונקציה המדכאת של תאי רג T. למרות בפרוטוקול זה ממליץ על השימוש במערכת הפרדת תא מגנטית עבור בידוד תא רג T, זיהום עם תאי reg הלא-T לא ניתן לשלול. תאי רג T שהתקבלו בעכברי כתב Foxp3-GFP 28-30 הם מועמדים טובים יותר במדויק כדי לחקור את תפקודם של תאי רג T מ מערכת הפרדת תא מגנטית, כמו CD25 מבוטא ביתר לעתים קרובות על המרה מופעלים CD4 + T וכן תאי רג T.
הפונקציה המדכאת של תאי רג T נבדקה ע"י שונה במבחנהמבחני דיכוי 16,28,31-34. היתרון של assay הדיכוי חוץ גופייה הוא שזה מעריך את ההשפעה הישירה של תאי T reg על העיכוב של תגובת תא CD8 + T, כי רק תאי שו"ת T הם שיתוף תרבותיים עם תאי רג T. בנוסף לתאי CD8 + T, CD25 - תאים מסוג CD4 + T ניתן להשתמש במקום תאים שו"ת T 25. ההשפעות של רג T או תאי T המרה על תאי מערכת החיסון כגון תאים דנדריטים או תאי הרג טבעיים ניתן להעריך על ידי שינוי תנאי הניסוי.
מולקולות כגון 35 CD103, LAG-3 36, גליקופרוטאין חזרות מכריעות 37, CD43 38, CD11a 38, או תא רוצח subfamily קולטן דמוי לקטינים חבר G 1 38 שמש כסמנים של תאי רג T מופעלים במחלות ספציפיות. בפרוטוקול זה, השתמשנו PD-1 כקובץמחוון לזהות מופעל תאי T reg במהלך זיהום בנגיף כרוני. פרוטוקול זה יכול לשמש עבור ניתוחים רבים (פנוטיפי ופונקציונלי) של תאי T reg בתנאים מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | |
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Cell strainer, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Cell strainer, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml | Gibco | 10378-016 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0.5 M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
