Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fenotypisk og funksjonell analyse av Aktivert regulatoriske T-celler isolert fra kronisk lymfatisk choriomeningittvirus-infiserte mus

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54138
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

Abstract

Regulatoriske T (T reg) celler som uttrykker foxp3 som en transkripsjonsfaktor, er undergrupper av CD4 + T-celler. T reg-celler spiller avgjørende roller i immuntoleranse og homeostase vedlikehold ved å regulere immunresponsen. Den primære rolle av T-reg-celler, er å undertrykke proliferasjon av effektor-T-T (eff) celler, og produksjon av cytokiner så som IFN-γ, TNF-α, og IL-2. Det har blitt vist at T reg-cellenes evne til å hemme funksjonen av T-celler eff er forbedret i løpet av vedvarende patogen infeksjon og kreftutvikling. For å klargjøre funksjon av T-reg celler under hvile eller betente forhold, en rekke in vitro undertrykkelse analyser ved hjelp av mus eller humane T reg celler har blitt utviklet. Hovedformålet med denne studien er å utvikle en metode for å sammenligne forskjeller i fenotype og undertrykkende funksjon mellom hvile og aktiverte T regceller. For å isolere aktiverte T-reg celler, ble mus infisert med lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk belastning av LCMV. T reg-celler isolert fra milten av LCMV CL13-infiserte mus oppviste både den aktiverte fenotype og forbedret undertrykkende aktivitet i forhold til hvilende T-reg-celler isolert fra naive mus. Her beskriver vi grunnleggende protokollen for ex vivo fenotype analyse for å skille aktiverte T-reg celler fra hvilende T reg celler. Videre beskriver vi en protokoll for måling av den undertrykkende aktivitet av fullt aktiverte T-reg-celler.

Introduction

Regulatoriske T (T reg) celler uttrykker gaffelhode boksen P3 (foxp3) som en transkripsjonsfaktor for deres utvikling og funksjon 1. I tillegg T-reg-celler uttrykker forskjellige andre molekyler slik som CD25 2, lymfocytt-aktivering gen 3 (LAG-3) 3, glukokortikoid-indusert tumor nekrose faktor reseptor 4, og cytotoksisk T-lymfocytt-assosiert protein 4 (CTLA-4) 5- på sin overflate eller intracellulær region. Under kronisk infeksjon med ulike typer patogener som virus 6,7, bakterier 8,9 og parasitter 10-12, eller i løpet av kreftutvikling 13,14, blir T reg celler differensiert i aktiverte celler, viser forbedret undertrykkende funksjon målretting effektor CD4 + og CD8 + T-celler. En rekke aviser har antydet at utvidet og aktiverte T-reg celler bidra til svekket CD8 + T-celle response under venn retrovirus (FV) infeksjon 15-17. FV-induserte T reg celler hemme IFN-γ eller granzyme B uttrykk og cytotoksiske reaktivitet av CD8 + T-celler 15-17. Videre, i en herpes simplex virus-infeksjon-modellen, ble det rapportert at utarming av CD4 + CD25 + -T-reg-celler resulterte i utvidelse av virus-spesifikke CD8 + T-celler og alvorlige skader vev ved infiltrasjon av immunopathogenic CD4 + T-celler 18-20.

Mus smittet kronisk med klone 13 stamme av lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV CL13) 21-24 har vært mye brukt for å karakterisere fenotype og funksjon av effektor T-celler (T EFF) og T-reg cellene under kronisk virusinfeksjon. Under vedvarende LCMV infeksjon, virus-spesifikke T-eff celler gradvis mister sin effektor funksjon og bli utmattet T (T exh) celler. På den annen side, Treg celler styrke sin evne til å undertrykke virus-spesifikke T-celle respons 25. Nedgangen i den fungerende kapasiteten av T eff-celler kan forklares av flere faktorer slik som oppregulering av inhibitoriske reseptorer på T eff-celler, endret funksjon av antigen-presenterende celler, produksjon av immunoregulatoriske cytokiner, og økt frekvens eller forsterket funksjon av T reg celler 26. Blant de som er involvert i T-celle undertrykkelse faktorer, programmert celledød protein-1 (PD-1) -expressing T exh celler og T-reg celler har blitt ansett som kjennetegnene ved antigen utholdenhet og undertrykkende miljø. Nylig ble det rapportert at blokade av PD-1 reaksjonsvei og ablasjon av T-reg-celler fører til økt T-cellefunksjonen og nedsatt virusbelastningen i løpet av LCMV kronisk infeksjon 27. Videre er T reg cellene aktiveres under kronisk infeksjon av mus med LCMV 23,25 25. PD-1 er sterkt uttrykt på T reg-celler, så vel som T-celler exh, og nivået av PD-1 uttrykkes av T-reg-celler korrelerer med styrken av sin undertrykkende funksjon for å inhibere T-celleproliferasjon 25.

Her beskriver vi en metode for å sammenligne egenskapene til aktiverte T-reg celler isolert fra mus infisert med LCMV CL13 og hvile T reg celler isolert fra naive mus. Videre forklarer vi en rekke prosesser for å skille aktiverte T-celler og reg undersøke deres ex vivo fenotype, samt måle deres undertrykkende aktivitet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne studien ble musene holdt i en bestemt patogen fritt anlegg av Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Korean Food and Drug Administration retningslinjer som bruker protokoller godkjent av International Animal Care og bruk komité Yonsei Laboratory Animal Research Center ved Yonsei University.

1. Utarbeidelse av Solutions

  1. Fremstille 2% RPMI media ved å fortynne føtalt bovint serum (FBS) til 2% og penicillin-streptomycin til 1% i RPMI
  2. Forbered komplett RPMI media. Til RPMI-medier tilsett 10% av FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamin, og 50 uM 2-merkaptoetanol.
  3. Forbered fluorescens aktivert celle sortering (FACS) buffer. For å gjøre dette, supplement fosfat-bufret saltvann (PBS) med 2% av FBS.
  4. Forbered T-celle isolasjon buffer. For å gjøre dette, supplere PBS med 2% av FBS og 2 mM ethylenediaminetetraaCETIC syre.

2. Isolering av miltlymfocytter

  1. Fjern milten fra naive eller LCMV CL13-infiserte mus som beskrevet tidligere 19 og plassere dem i 60 mm x 15 mm petriskåler som inneholder 10 ml 2% RPMI media.
    MERK: I denne studien eksperimenter, 5-6 uker gamle C57B1L / 6J hunnmus fikk 2 x 10 6 plakkdannende enheter (PFU) av LCMV CL13 gjennom intravenøs injeksjon via halevenen. Offer musene på dag 16 etter infeksjon (16 d pi) 25. Analyser ge-matchet naive mus var på samme dag.
  2. Plasser en celle sil inn i en 50 ml tube og skyll den med 2 ml 2% RPMI media. Plasser milt på 70 mikrometer celle sil og male ved hjelp av stempelet i en sprøyte. Skyll celle sil med 2 ml 2% RPMI media og fjerne det fra 50 ml tube.
  3. Fyll opp røret med 2% RPMI-medium og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspenderCellepelleten i 1 ml lysebuffer ACK. Inkuber prøvene ved romtemperatur (RT) i 5 min.
    MERK: Volumet av ACK Lysing buffer angitt ovenfor er for en milt. Skalere opp volumet tilsvarende for sammenslåtte milt prøver.
  4. Fyll opp røret med 2% RPMI-medium og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i en tetthet på 1 x 10 7 celler / ml i komplett RPMI-medium.
    MERK: For levende celle telling, beis celler med trypanblått og telle bare leve celler som ikke er farget ved hjelp hemocytometer.

3. fenotyping av milt Konvensjonell T (T conv) celler og T-reg celler

MERK: Før T reg celleisolasjon, undersøke fenotypen av milt-lymfocytter isolert fra naive eller infiserte mus ved farging av cellene med forskjellige antistoffer og analysere dem ved strømningscytometri.

  1. Overfør 50 ul av cellene(5 x 10 5 celler) blant de totale miltlymfocytter i hver brønn av en ny U-bunn 96-brønns plate og tilsett 150 ul FACS-buffer per brønn. Sentrifuger ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C.
  2. Kast supernatanten. Omrør cellepelleten og tilsett 200 ul FACS-buffer per brønn. Sentrifuger ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C (2 ganger).
  3. Klargjør antistoff cocktail for flekker celleoverflatemarkører i 50 ul FACS buffer per brønn med følgende antistoffer og reagenser. Anti-CD4 fiolett fargestoff, Anti-CD25 grønt fargestoff, Anti-PD-1 fiolett fargestoff, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 fargestoff og celleviabilitet deteksjonsreagensen nær-infrarødt (IR) fluorescerende reaktive fargestoff.
    MERK: For ytterligere å analysere fenotype av aktiverte T-reg celler, kan anti-CD103 23,25 legges for celleoverflaten-markør flekker.
  4. Resuspender cellepelleten med 50 ul av antistoff cocktail per brønn. Inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellene to ganger medFACS-buffer ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C.
  5. Etter den siste vasketrinnet, dekanter supernatanten og fiksere cellene i 20 minutter i mørke ved 4 ° C med 100 ul buffer fiksering fremstilt i henhold til produsentens protokoll.
  6. Vask cellene to ganger med permeabiliseringen vaskebuffer (fremstilt i henhold til produsentens protokoll) ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C.
  7. Klargjør antistoffløsning for intracellulær foxp3 farging, og cellepelleten suspenderes med 50 ul anti-foxp3 antistoffoppløsning.
    MERK: For ytterligere å analysere fenotyper av T conv og T-reg celler, anti-CTLA kan legges på dette trinnet.
  8. Inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C og gjenta trinn 3.6. Etter den siste vasketrinnet, cellepelleten suspenderes i 200 ul FACS-buffer og undersøke fenotypen av cellene ved strømningscytometer 25.
  9. Gate levende celle populæsjon. For å analysere fenotyper av T conv celler under LCMV CL13 infeksjon, undersøke hyppigheten av foxp3 - PD-1 + celler blant CD4 + eller CD8 + T-celler.
    MERK: Ut fra forsøksresultater, prosentandelen av foxp3 - er PD-1 + mer enn 50% i både CD4 + og CD8 + T-cellepopulasjoner ved 16 d pi med LCMV CL13.
    1. Å analysere frekvens og fenotyper av T-reg celler, undersøke frekvenser av foxp3 + eller foxp3 + PD-1 + celler blant CD4 + T-celler.
      MERK: Ut fra forsøksresultater, er prosentandelen av foxp3 + eller foxp3 + PD-1 + celler mer enn 20% i CD4 + T-cellepopulasjon, henholdsvis.

4. Isolering av CD4 + CD25 + T reg celler

MERK: Volumene av alle reagenser angitt nedenfor er for enstarter celle nummer av 1 x 10 7 totale splenocytes.

  1. Forbered cellene som beskrevet i kapittel 2 ved hjelp av naive og LCMV kronisk infiserte mus. Vask cellene ved tilsetning av 10 ml av T-celle-isolasjon buffer. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten helt og cellepelleten suspenderes i 40 ul buffer.
  2. For CD4 + T-celle berikelse hjelp av magnetiske cellen separasjon system, tilsett 10 ul biotin-antistoff cocktail og bland godt. Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Tilsett 30 ul buffer, 20 ul av anti-biotin mikroperler for merking av ikke-CD4 + T-celler og 10 pl CD25-PE-antistoff for fluorescerende merking av CD25 + -celler. Bland godt og inkuber i 15 min i mørket.
  4. Tilsett 2 ml buffer og passerer cellene gjennom et 40 um celle sil inn i en ny 50 ml tube for å fjerne celleavfall. Vask cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.Kast supernatanten helt og cellepelleten suspenderes i 500 ul buffer ved en densitet på opp til 1,25 x 10 8 celler.
  5. Anvende cellene i kolonnen og samle de umerkede celler som passerer gjennom kolonnen. Vask kolonnen ved tilsetning av 2 ml buffer og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender fullstendig de isolerte CD4 + -T-celler i 90 pl buffer.
  6. For magnetisk merking av CD25 + celler, tilsett 10 ul av anti-PE-mikroperler, bland godt, og inkuber i 15 minutter i mørke ved 4 ° C.
  7. Tilsett 2 ml buffer og vaske cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten helt og cellepelleten suspenderes i 500 ul av buffer ved en densitet på opp til 1 x 10 8 celler.
  8. For å berike CD4 + CD25 + T reg celler, gjelder cellene i kolonnen for positiv seleksjon, og vaske column ved å tilsette 2 ml buffer. Gjenta vask tre ganger.
  9. Når kolonnen er tom etter det siste vasketrinnet, tilsett 1 ml av buffer til kolonnen, og tømme ut det magnetisk merkede CD4 + CD25 + celler ved hjelp av stempelet.
  10. Gjenta trinn 4.8 til 4.9 for å forbedre renheten av de isolerte CD4 + CD25 + -T-celler reg. Vask cellene med FACS-buffer ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender isolerte CD4 + CD25 + -T-reg-celler ved en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml i komplett RPMI-medium.
  11. For å kontrollere renheten av det isolerte-CD4 + CD25 + -T-reg-celler ved å bruke 2 x 10 5 celler fra de totale isolert-CD4 + CD25 + -T-celler reg. Flekk av cellene med 50 ul FACS-buffer inneholdende anti-CD4-FITC og celleviabilitet detektere reagens nær-IR fluorescerende reaktive fargestoff.
    MERK: CD25 var allerede merket med PE under isolasjon.
  12. Inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellene med FACS-buffer ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C. Etter vasking, cellepelleten suspenderes i 100 ul FACS-buffer og kontrollere renheten ved strømningscytometri.
  13. Gate live-cellepopulasjon. Å analysere renheten av T-reg celler, bekrefter prosentandelen av CD4 + CD25 + celler.
    MERK: Ut fra forsøksresultater, er prosentandelen av CD4 + CD25 + celler blant rensede celler over ca 80%.

5. Isolering av CD8 + T-celler og Merking av CD8 + T-celler

MERK: Volumene av alle reagenser angitt nedenfor er for en start celle nummer av 1 x 10 7 totale splenocytes.

  1. Forbered celler som beskrevet i kapittel 2 ved hjelp av naive mus. Vask cellene ved tilsetning av 10 ml av T-celle-isolasjon buffer. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten helt, og cellepelleten suspenderes i 40 ul buffer.
  2. For CD8 + T-celler isolert ved hjelp av magnetcelleseparasjonssystem, tilsett 10 ul biotin-antistoff-cocktail for non-CD8 + T-celle-merking og bland godt. Inkuber i 5 min ved 4 ° C.
  3. Tilsett 30 ul buffer og 20 ul av anti-biotin mikroperler. Bland godt og inkuber i 10 min ved 4 ° C.
  4. Anvende cellene i kolonnen og samle de umerkede celler som passerer gjennom kolonnen. Vask kolonnen ved tilsetning av 2 ml buffer tre ganger.
  5. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender fullstendig de isolerte CD8 + -T-celler i 2 ml buffer.
  6. For å kontrollere renheten av de isolerte celler, fremstille 50 ul antistoffoppløsning i FACS-buffer. Resuspender 2 x 10 5 celler blant isolert CD8 + T cells i 50 ul antistoffoppløsning.
    MERK: For å forberede antistoff løsning, legge til anti-CD8 FITC, og celleviabilitet deteksjonsreagensen (nær-IR fluorescerende reaktive fargestoff) i FACS buffer.
  7. Inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellene med FACS-buffer ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C. Etter vasking, cellepelleten suspenderes i 100 ul FACS-buffer og kontrollere renheten til cellene ved strømningscytometri.
  8. Gate live-cellepopulasjon. For å kontrollere renheten av CD8 + -T-celler, bekrefter den prosentandel av CD8 + T-celler.
    MERK: Ut fra forsøksresultater, er prosentandelen av CD8 + celler blant rensede celler over ca 90%.
  9. Legg PBS til de isolerte CD8 + T-celler. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten. Resuspender isolerte CD8 + T-celler ved en konsentrasjon på 1 x 10 7 celler / ml i PBS.
  10. Å merke CD8 + T cells for in vitro assay undertrykkelse, fortynne celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff i PBS for å oppnå en konsentrasjon på 5 uM ved RT.
    Merk: En omtrentlig eksitasjon og utslipps toppene i celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff som brukes i studien er 405 og 450 nm, henholdsvis.
  11. Bland godt like volumer av celleformering sporings fiolett fargestoff (5 uM) og cellesuspensjon (1 x 10 7 celler / ml av CD8 + T-celler) i et 15 ml rør, og inkuber ved 20 minutter ved 37 ° C. Vortex røret hvert 10 min.
  12. Fyll opp røret med kald RPMI komplett medium, og forlater røret i 10 minutter ved RT. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT. Kast supernatanten helt, og resuspender cellene i en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml med forhåndsvarmes fullstendig RPMI-medium. Cellene inkuberes i 15 min ved RT.

6. Sette opp In Vitro Suppression Assay Bruke CD4 + CD25 + T <sub> reg og CD8 + T-celler

  1. For å fremstille anti-CD3 / CD28-belagte kuler, overføre passende volum av magnetiske kuler til et 15 ml rør (2,5 pl / 1 x 10 5 celler). Legge til et likt volum PBS og bland. Vask ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C og kast supernatanten. Fortynne magnetiske kuler i fullstendig media (50 ul / brønn).
  2. Alikvote 50 ul av CD4 + CD25 + -T-reg celler per brønn av U-bunn 96-brønns plate (1 x 10 5 celler / brønn). Tilsett 50 pl av CD8 + T-celler som responder T (T resp) celler per brønn (1 x 10 5 celler / brønn). Tilsett 50 ul fortynnet anti-CD3 / CD28-belagte perler inn per brønn.
    MERK: I dette trinnet, etiketten og sette opp kontrollbrønner som følger: "unstimulated CD8 + T-celle bare" uten anti-CD3 / CD28-belagte perler; "Bare CD8 + T-celle" med anti-CD3 / CD28-belagt perler; Bare "CD8 + T-celle-"Med anti-CD3 / CD28-belagt perler;". T reg celle bare "med anti-CD3 / CD28-kuler T reg celler kan bli utvannet av komplette media og co-dyrket med T hhv celler i et annet forhold av T resp celler: T reg-celler (1: 0.25-1: 1).
  3. Tilsett 50 mL eller passende volum av media i alle brønner til totalvolum på 200 ul. Dekk med folie plate og inkuberes i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 72 timer.

7. Analyse av CD8 + T-celleformering og cytokin produksjon av CD8 + -T-celler

  1. For cytokinproduksjon analyse, etter 3 dagers dyrking, separere supernatanten fra hver brønn inn i en annen plate og utføre enzymbundet immunosorbent assay (ELISA).
    MERK: supernatant kan alikvotert og lagret ved -70 ° C. I dette eksperimentet, ble anti-muse IFN-γ antistoff-belagt plate som brukes for å påvise IFN-γ produksjon samsvaring til produsenten s protokollen. For å bestemme IFN-γ produksjon av prolifererende CD8 + T-celler på en celle-nivå, kan intracellulær cytokin farging utføres.
  2. Etter separering av supernatanten fra hver brønn, platen vaskes inneholdende cellene med FACS-buffer og sentrifuger ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C (3 ganger).
  3. Etter vask, kast supernatanten. Resuspender cellepelleten med 50 ul av antistoff-cocktail for farging av prolifererte CD8 + T-celler. Inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
    MERK: For å forberede antistoff cocktail, legge til anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5, og celleviabilitet deteksjonsreagensen (nær-IR fluorescerende reaktive fargestoff) i FACS buffer.
    MERK: Antistoffer mot forskjellige markører slik som CD44 og CD69 kan kombineres med andre antistoffer for å bekrefte aktivering av CD8 + T-celler. Husk at CD8 + T-celler har allerede blitt merket med celleproliferasjon sporing vLilla farge på Step 5.10.
  4. Vask to ganger ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C. Etter den siste vasketrinnet, kast supernatanten, og fikser cellene i 20 minutter i mørke ved 4 ° C med 100 ul buffer fiksering.
  5. Vask to ganger ved sentrifugering ved 300 x g i 2 min ved 4 ° C. Resuspender cellene med 200 ul FACS-buffer og måle proliferasjon av celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff-merket CD8 + -T-celler ved flow cytometri.
    1. Gate CD8 + -T-cellepopulasjonen av de levende celler. Måle prosentandelen av oppdelte og udelte celler ifølge fortynningen av celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff og CD8 + T-celle-fortynning i henhold til følgende ligning. % Inhibering = [(% av prolifererte CD8 + -T-celler i fravær av T-reg-celler -% av prolifererte CD8 + -T-celler i nærvær av T reg celler) / (% av prolifererte CD8 + -T-celler ifravær av T-celler reg)] x 100. Ytterligere analysere dataene ved hjelp av strømningscytometri programvaren 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi generert mus med vedvarende virusinfeksjon ved å injisere dem med 2 x 10 6 pfu av LCMV CL13 intravenøst. For å undersøke de fenotypiske endringer i T-reg celler og T-conv celler under kronisk virusinfeksjon, ble miltlymfocytter hentet fra naive og infiserte mus farget med forskjellige antistoffer og analysert ved flowcytometri. På 16 d pi, ble PD-1 oppregulert i både foxp3 - CD4 + T conv (figur 1A, øvre panel) og foxp3 - CD8 + T conv (figur 1B, øvre panel) celler. Hyppigheten av foxp3 + CD4 + T-reg cellene var to ganger høyere i LCMV CL13-infiserte mus enn i de naive mus (figur 1A). Spesielt er de fleste av de foxp3 + CD4 + T-reg-celler vises det aktiverte fenotype, og uttrykker høye nivåer avPD-1 på dette tidspunkt (figur 1A).

For in vitro suppresjon assay ble pålagt et betydelig antall CD8 + T-konv-celler og CD4 + CD25 + -T-celler reg. For å få en x 10 7 celle sporing spredning fiolett fargestoff-merket CD8 + T-celler, ble splenocytter fra to spleens av naive mus sammenslått. For å oppnå 2 x 10 til 6 eller 3 x 10 6 av CD4 + CD25 + -T-reg-celler, i det minste tre milter fra naive og LCMV CL13-infiserte mus, henholdsvis, ble slått sammen. CD8 + T-celler som T-celler resp ble separert med hell uten vesentlig forurensning med andre immunceller (figur 2A). T-reg-celler kan også bli isolert, med en dominerende populasjon av CD25 + CD4 + -T-celler med mer enn 80% renhet (figur 2B).

For å sammenligne den undertrykkende funksjon av naive og kroniske T reg-celler, ble det isolerte T reg og T resp cellene inkubert sammen under stimulering med anti-CD3 / CD28-belagte kuler ved 37 ° C i 3 dager. % Inhibering av CD8 + T resp celleproliferasjon ble økt i en T-celle reg Dese avhengig måte (figur 3A). Når CD8 + T-resp celler ble ko-dyrket med kroniske T reg-celler i et forhold på 1: 1, proliferasjon av CD8 + T-resp celler ble hemmet signifikant (figur 3B). IFN-γ produksjon av CD8 + T-celler resp var også signifikant inhibert når CD8 + -T-celler resp ble ko-dyrket med aktiverte T-celler reg fra kronisk infiserte mus i stedet for med hvilende T-reg-celler fra naive mus i en T reg (figur 3C).

Figur 1
Figur 1: fenotyper av CD4 + og CD8 + T-celler i milten av naive mus eller LCMV CL13-infiserte mus ved 16 d pi (A) Uttrykk for PD-1 eller CD25 på foxp3 - CD4 + T conv og foxp3 + CD4 + T reg celler. (B) Uttrykk for PD-1 eller CD25 på foxp3 - CD8 + T conv celler. Miltlymfocytter ble farget med antistoffer mot CD4, CD8, CD25, PD-1, og foxp3. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Panel A har blitt forandret fra 25 som en referanse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: renhet av T hhv celler isolert fra naive mus og T reg celler isolert fra naive eller LCMV CL13-infiserte mus (A) Prosent av CD8 + T-celler etter isolasjon.. (B) Prosent av CD25-uttrykke CD4 + T-reg celler etter isolasjon. Hver kvadrant i (B) ble bestemt ved uttrykket nivåer av CD4 og CD25. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Figur 3: Effekt av aktiverte T-celler reg for CD8 + T-cellerespons (A)% hemming av CD8 + T-celler ko-dyrket med T reg celler i en T-celle reg doseavhengig måte.. (B) proliferasjon av CD8 + T-celler ko-dyrket med T-reg-celler i forholdet 1: 1. (C) IFN-γ produksjon av CD8 + T-celler ko-dyrket med T reg celler i en T-celle reg doseavhengig måte. Spredning av CD8 + T-celler ble målt ved fortynning av celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff i prolifererte CD8 + T-celler og IFN-γ sekresjon ble evaluert ved hjelp av ELISA. Celleproliferasjon sporing fiolett fargestoff-merket CD8 + T-celler ble stimulert med anti-CD3 / CD28-belagte kuler i 3 dager i fravær eller nærvær av T + T-celler ko-dyrket med og uten T reg-celler, respektivt. Fylt grå toppene i histogrammet indikerer spredning av CD8 + T-celler co-dyrkede uten T reg celler. Hver gruppe ble utformet i tre paralleller. Stolpene representerer bety + SEM. Dette tallet har blitt forandret fra 25 som en referanse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om bare et lite antall av T-reg-celler eksisterer i mus og mennesker, er det viktig å forstå deres funksjon som de spiller en viktig rolle i reguleringen av immunrespons og opprettholdelse av immuntoleranse. Antall og undertrykkende funksjoner av T reg cellene øker i løpet av en kronisk virusinfeksjon 15-20 samt kreft progresjon 13,14. Dette er trolig på grunn av fort antigen stimulering. For å evaluere T-celler reg arbeide under antigen persistens og sykdomsutvikling, må deres undertrykkende aktivitet skal måles.

Her beskriver vi en protokoll for å analysere den ex vivo-fenotypen av T-reg-celler og måle deres undertrykkende aktivitet ved anvendelse av en in vitro-ko-kultursystem av CD8 + T-celler og T-celler reg. Kritiske trinn i den gjeldende protokollen er analyse og isolering av T reg celler. Live og ferskt isolert T in vitro. Vi har også undersøkt fenotyper av T conv og T-reg cellene under en kronisk virusinfeksjon. T-konv-celler, dvs. foxp3 - CD4 + og CD8 + T-celler viste en reduksjon i cellulær aktivitet etter kronisk virusinfeksjon (figur 1). PD-1 uttrykk ble oppregulert i både T conv cellepopulasjoner. Økning i T reg celle nummer og oppregulering av PD-1 uttrykk er kjennemerkene til immunrespons i løpet av en kronisk virusinfeksjon. I tillegg kan anti-organer for andre inhibitoriske reseptorer så som TIM-3 og CTLA-4 brukes i kombinasjon med PD-1 for å undersøke T-celle-fenotype ved hjelp av FACS etter choric virusinfeksjon.

For å undersøke den undertrykkende aktivitet, T- resp celler og T-reg-celler ble ko-dyrket i et forhold på 1 til 1. Co-kultur med T regceller fra kronisk infiserte mus signifikant redusert CD8 + T-celle-proliferasjon og IFN-γ sekresjon i forhold til T-reg-celler fra naive mus. Dette innebærer at proliferasjon og cytokinproduksjon av CD8 + T-celler ko-dyrket med T-celler reg i omvendt forhold til den undertrykkende funksjon av T-reg-celler. Selv om denne protokollen anbefaler bruk av en magnetisk celleseparasjonssystem for T reg celle isolasjon, forurensning med ikke-T reg celler kan ikke utelukkes. De T reg celler oppnådd fra foxp3-GFP rapportør mus 28-30 er bedre kandidater for nøyaktig å undersøke funksjonen av T-celler enn reg magnetisk celleseparasjonssystem, som CD25 ofte er overuttrykt på aktiverte CD4 + -T-konv, så vel som T-celler reg.

Den undertrykkende funksjon av T-reg cellene har blitt evaluert av forskjellige in vitroundertrykkelse analyser 16,28,31-34. Fordelen med in vitro suppresjon analysen er at det evaluerer den direkte virkning av T-reg-celler på hemming av CD8 + T-cellerespons, fordi bare T resp celler ko-dyrket med T reg-celler. I tillegg til CD8 + T-celler, CD25 - kan CD4 + T-celler bli benyttet i stedet for T-celler hhv 25. Virkningene av T reg eller T-konv-celler i immunceller slik som dendritiske celler eller naturlige dreperceller kan evalueres ved å variere forsøksbetingelsene.

Molekyler som CD103 35, LAG-3 36, glykoprotein A repetisjoner dominerende 37, CD43 38, CD11 a 38, eller killer cell lectin-lignende reseptor-underfamilien G medlem en 38 har blitt brukt som markører for aktiverte T-reg-celler i spesifikke sykdommer. I denne protokollen, brukte vi PD-1 som enindikator for å identifisere aktiverte T reg cellene under kronisk virusinfeksjon. Denne protokollen kan brukes for mangefasetterte analyser (fenotypiske og funksjonelle) av T-reg cellene under bestemte vilkår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Tags

Immunologi undertrykkende funksjon, regulatoriske T-celler CD8 kronisk infeksjon lymfatisk choriomeningittvirus
Fenotypisk og funksjonell analyse av Aktivert regulatoriske T-celler isolert fra kronisk lymfatisk choriomeningittvirus-infiserte mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J.… More

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter