Introduction
Антитела изотипа IgM демонстрируют большой терапевтический потенциал для лечения различных заболеваний , в том числе рака и заболеваний ЦНС 1-7. Группа The Vollmers "выявили многочисленные антител у больных раком для возможного использования в качестве специфичных к опухоли биомаркеров или активных терапевтических средств , которые способны убивать раковые клетки путем индукции апоптоза путей 4,8,9. Интересно, что все выявленные антитела с терапевтическим потенциалом являются изотип IgM и принадлежат к группе "естественных аутоантител" (NABS).
Кроме того, группа Родригес идентифицировала мышь и человеческие антитела, которые стимулируют ремиелинизацию при хроническом демиелинизированных поражения спинного мозга в моделях рассеянного склероза (РС). Идентичный антител с противораковым действием, все ремиелинизации стимулирующие антитела являются NABS и изотип IgM 1,6,7,10. Точные антигены для большинства выявленных IgMs все еще undetermined включая человеческий ремиелинизацию-продвижение антитела rHIgM22, в настоящее время в фазе I клинических испытаний для пациентов с рассеянным склерозом 11. Несмотря на неоднократные усилия специалистов в области липидного и углеводного исследований как в академических кругах , так и в партнерстве с промышленностью 11, предпринимается попытка выявить антиген rHIgM22, не были успешными. Провал стандартных методов, используемых для выявления антигенов IgG антител к работе с IgM антител определяет критическую необходимость уточнения методов, специфичных для этих антител, которые наиболее вероятной мишенью углеводные или липидные антигены.
В центре внимания этой рукописи является человеческое антитело регенеративная HIgM12 и экспериментальные процедуры, используемые для идентификации его антиген. Антитело HIgM12 был идентифицирован у пациентов с макроглобулинемией Вальденстрема, стимулирует рост невритов в пробирке 12-14 и цели полисиаловая кислоты (PSA) , прикрепленную к нейронной молекулы клеточной адгезии (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 продлевает срок службы в модели мыши БАС 17 и улучшает функциональные результаты в мышиной энцефаломиелит вируса Theiler ( в TMEV) -infected мышей. В частности, HIgM12 стимулирует спонтанную горизонтальной и вертикальной двигательной активности в хронически демиелинизированных мышей и увеличивает числа малого и среднего диаметра спинного мозга аксонов через восемь недель после того, как один, низкая доза внутрибрюшинного вводили антитела 18.
Нервный молекула клеточной адгезии (NCAM) представляет собой гликопротеин иммуноглобулина (Ig) суперсемейства экспрессируется на поверхности клеток нейронов, глии, скелетных мышцах, и естественных клеток - киллеров 19-25. Три основных NCAM изоформы называются NCAM180, NCAM140 и NCAM120, альтернативные варианты сплайсинга первичного транскрипта, которые различаются только в своем цитоплазматическом домене. В ЦНС, NCAM является основной Полисиалилированный молекулы (> 95%) с длинными, отрицательно заряженные гомополимеров сиаловой кислоты. полисиаловаячид с п> 10 называется PSA, но существуют более короткие олигомерные структуры, которые также являются биологически значимым. Другие Полисиалилированный белки , выраженные в ЦНС являются SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 и субъединица натриевых каналов 25 (для обзора см 29).
Методы , описанные здесь , позволяют идентифицировать антиген для иммуноглобулинов человека и мыши , содержащих специфические каппа (Vκ) легкие цепи (VκI, VκIII или VκIV легкие цепи для антител человека и VκI легких цепей антител мыши) независимо от того, изотип антитела (например, IgG, IgM , IgA, IgD или IgE). Это ограничение основано на использовании белка L агарозы для иммунопреципитации с антителами изотипа IgM. Альтернативные стратегии могут включать маннозы-связывающие лектины и вторичные антитела IgG анти-IgM, ковалентно связанные с агарозном шарики, которые могут расширить применимость этого метода к большему количеству антител класса IgM в т.ч.ЛУДИНГ те с лямбда (λ) легкой цепей (обсуждение см). Соотношение сывороточных легких цепей IgM Vκ по сравнению с IGM Х легких цепей , полученных от здоровых людей составляет 1,5: 1 30.
На основе хроматографического методологии , используемой здесь , чтобы разделить, обогатить и иммунологически обнаруживать определенные молекулы 31, все антигены должны включать , по меньшей мере , один небольшой домен белка. Специфического связывания с антителом эпитоп может находиться в пределах или за пределами домена белка (например, в гликопротеины, липопротеины). Первоначальные биохимические шаги, используемые для идентификации специфического антигена для HIgM12, соответствующий, чтобы сузить список потенциальных кандидатов, являются наиболее важными шагами в этом методе. типа клеток специфических препаратов и морфологии клеток на основе характеризации описаны для глиальных клеток, но эта методика может быть экстраполированы, чтобы приспособить другие типы клеток внутри или за пределами центральной нервной системы.
Существует настоятельнаянеобходимо разработать новые или измененные методы, применяемые для увеличения количества IgM антител с терапевтическим потенциалом для различных заболеваний у человека и особенно в тех случаях, (большинство антигенов IgM), где антитело цели являются углеводные или липидные структуры.
Protocol
протоколы и процедуры на животных были проведены в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов и одобрены институциональными по уходу за животными и использование комитетов клиники Майо (Mayo IACUC номер протокола # A51912).
Подготовка ткани 1. Общие ЦНС
- Сформировать NCAM дефицитный (KO) мышей на C57 / НД6 фоне (любезно предоставленные доктором Линн Landmesser, Case Western Reserve University, Кливленд, Огайо), гетерозиготных мышей NCAM и дикого типа (WT) однопометные (C57 / НД6) путем скрещивания гетерозигот. Генотипирование NCAM KO мышей была описана ранее 32-34 и не будет объяснено более подробно.
Примечание: Шаги 1.2 - 1.6 являются необязательными.
- До операции администрирования пентобарбитала раствора (Наличие на складе: 25 мг / мл; 50/100 мкл пентобарбитала для ранних послеродовых соответствующих взрослых стадий) посредством внутрибрюшинной инъекции (27 иглы калибра и 1 млшприц).
- Подождите в течение 2 мин или пока животное не достигнет хирургической плоскости анестезии. Администрировать дополнительные анестетика по мере необходимости в ходе каждой операции для поддержания хирургической плоскости анестезии. Используйте схождения метод пинч-ответа для определения глубины анестезии. Животные должны быть отвечать на запросы, прежде чем продолжить.
- Сделать 0,5 - 1 см боковой разрез через покровы и брюшной стенки чуть ниже грудной клетки. Тщательно отделить печень от диафрагмы. Сделайте небольшой разрез в диафрагме, используя изогнутые ножницы с тупыми. Продолжить диафрагму надрез по всей длине грудной клетки подвергать плевральной полости.
- Поместите изогнутые, тупые ножницы вдоль одной стороны грудной клетки, тщательно вытесняя легкие, и сделать разрез через грудную клетку до ключицы. Сделать подобный разрез на противоположной стороне. Подъем грудины в сторону, аккуратно обрежьте любую ткань, подключая его к сердцу.
- Сделайте надрез животному'S правое предсердие, используя ирис ножницы, чтобы создать как можно большой выход, как это возможно. Медленно вводят 10 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) в левый желудочек животного (светло-красный; скорость потока: 1 мл / мин), используя 10 мл шприц, снабженный иглой 27G. Не увеличивать / PBS давления потока во время перфузии, чтобы избежать разрушения тканей.
- Обезглавьте новорожденных мышей с помощью хирургических ножниц.
- Удалите мозг, захватывая глазницы с пинцетом и вставляя небольшие ножницы в позвоночник. Вырезать череп в сторону передней панели на уровне ушей. Отогните череп и осторожно поместить мозг в 60 мм чашки Петри , наполненную 10 мл охлажденного на льду рассекает среды на льду (таблица 1). Поместите каждый мозг в микроцентрифужных трубки 1,5 мл и сразу же хранить на сухом льду (-79 ° С).
- Надрезать мозжечка и ствола мозга из замороженного состояния мозга с помощью чистой лезвие бритвы на льду. Работают быстро, чтобы избежать оттаивание ткани.
- Вейзамороженные головной мозг, положить в 15 мл пробирку на льду и добавить ледяной буфер для лизиса (таблица 1) до конечной концентрации 150 мкг ткани мозга в мкл буфера для лизиса. Повторите для остальных Cerebra. Держите мозги на льду в любое время для шагов 1.9 - 1.11.
- Однородный мозги в буфере для лизиса растиранием через кончик пипетки 1 мл (в 10 раз) с последующим растиранием с помощью 5 мл шприц, снабженный иглой 27G (в 10 раз). Выдержите лизатов мозга еще в течение 30 мин на льду для обеспечения полного лизиса ткани.
- Удалить детергентом нерастворимый материал и мозговые липиды через последовательный центрифугирования (четыре раунда при 19000 х г в течение 10 мин при 4 ° С). Отбросить (белый) миелина и остатки клеток, содержащих гранулы, но сохраняют супернатант после каждого шага центрифугирования. Алиготе лизаты мозга и хранить при температуре -80 ° С.
2. иммунопреципитации с использованием человеческих IgMs (HIgM12 и изотипа управления IgM) в качестве "ниспадающем" Агент от Cerebraл Лизаты WT и KO мышей NCAM
- Белок L Агарозном из бисера Приготовление 9,35,36
- Приготовьте 200 мл буфера IP включая БСА (таблица 1). Подготовить еще 200 мл того же самого буфера IP без ВСА.
- Per иммунопреципитации реакции переноса 100 мкл белка L агарозном суспензии с использованием 200 мкл пипетки в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Не вихревое белка L агарозном бисером! Добавьте 1 мл буфера IP (см таблицу 1) в каждую пробирку. Смешайте протеин L агарозы и IP-буфер вручную с помощью инверсии (в пять раз).
- Вымойте белок L агарозные гранулы в четыре раза путем центрифугирования в центрифуге (стендовых 1000 XG, 2 мин, 25 ° С). Снимают супернатант, используя 200 мкл пипетки, не нарушая агарозы осадок. Повторите промывание шаги 2.1.2 2.1.3 три раза.
- Равновесие белка L агарозы в 1 мл свеже добавленного буфера IP на валике в течение ночи при 4 ° С.
- Антитело-антиген-агарозой L Комплексное формирование и обнаружение антигена в западных Кляксы
- Инкубируют 30 мг лизированных ткани мозга (~ 200 мкл лизата) в 1 мл буфера IP ледяным с 20 мкг IgM антитела (HIgM12) в микроцентрифужных трубки 1,5 мл в течение ночи на валике при температуре 4 ° С.
- Спин вниз белок L агарозном бисером (со стадии 2.1.4) в лабораторной центрифуге в течение 2 мин при 1000 мкг, 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, используя 200 мкл пипеткой, не нарушая агарозы гранулы. Добавить охлажденный раствор антитела-мозговую лизата (со стадии 2.2.1) с белком L агарозы с использованием 1 мл пипетки.
- Инкубируйте антитело-антиген-белок L агарозном суспензии в течение 2 ч на валике при температуре 4 ° С. Промыть комплекс антитело-антиген, присоединенный к агарозном L центрифугированием при 1000 х г в течение 2 мин, 4 ° С. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул и прибавляют 1 мл охлажденного льдом буфера IP, содержащего 0,2% БСА.
- Повторите на стадии промывки еще один раз с использованием IP-буфера ледяным, содержащий 0,2% БСА и еще два раза, используя буфер IP прохладительных без ВСА.
- Спин вниз комплекс антитело-антиген, присоединенный к агарозном L при 1000 мкг в течение 2 мин, 4 ° С. Удалите супернатант полностью сначала не используя 200 мкл пипеткой до ~ 50 мкл раствора оставляют на верхней части белка L агарозы гранулы с последующим 10-мкл пипеткой. Хранить образцы на льду.
- Добавьте 40 мкл буфера для элюции IP (см таблицу 1) за 1,5 мл микропробирок, палец Флик трубы 6 раз и тепла в течение 5 мин при 95 ° С . Поместите образцы на льду в течение 2 мин и спин вниз в течение 30 сек при 13000 х г, 4 ° С.
- Перенести супернатант с использованием 10 мкл пипетки (~ 35 мкл всего) в свежую 1,5 мл микроцентрифужных трубки, не нарушая гранул. Подтвердить отсутствие белка L агарозном бусин путем ополаскивания вниз небольшое количество элюированного образца на внутренней стенке трубки.
Примечание: "Гранулированный"Белок L агарозные гранулы хорошо видны, если присутствуют. - Если белок L агарозные гранулы присутствуют, спином вниз образец еще в течение 30 сек при 13000 XG и передать супернатант чистую пробирку. Повторите шаг, пока не агарозном шарики не могут быть обнаружены.
- Нагрузка 10 - 20 мкл элюированных образцов на лунку на ДСН-полиакриламидном геле в буферной системе Tris / глицин / SDS (таблица 1).
Примечание: Используйте 7,5% или 4 - 20% градиентные гели с 50 мкл объема нагрузки на лунку для выявления PSA-NCAM или NCAM изоформ (размеры геля (Ш х Д х толщина: 8,6 х 6,7 х 0,1 см). - Запуск гели для ~ 1 ч при 100 В (1,74 В / см 2) на стендовых испытаний . Дополнительное охлаждение не требуется для этого шага 37,38.
- Перенос белков на PVDF (поливинилиденфторид) мембрану (размер пор 0,45 мкм) в течение 2,5 ч в холодном помещении при 100 В (1,74 В / см 2) с использованием холодного буфера переноса (5 - 10 ° C) (таблица 1).
- Блок мембраны шIth 10% (вес / объем) сухого молока в PBS-T в течение 1 ч при 25 ° С на настольном орбитальном шейкере, моют мембраны дважды в течение 10 минут с PBS-T и зондом в течение ночи с первичным антителом в 5% BSA в PBS- Т на орбитальном шейкере в холодном помещении.
- На следующее утро мыть мембраны один раз на короткое время с избытком PBS-T при 25 ° С (включают крышка и сосуд), а затем 3 промывок PBS-T в течение 10 мин каждый на орбитальном шейкере (80 оборотов в минуту) (все стадии промывки проводят при 25 ºC).
- Добавьте вторичное антитело (пероксидаза хрена (HRP) анти-IgM антитела против человеческого (для HIgM12) (разведение 1: 30000) в 5% порошка сухого молока в PBS-T в течение 1 часа при 25 ° С на орбитальном шейкере (70 оборотов в минуту ).
- Wash мембраны широко один раз на короткое время с избытком PBS-T при 25 ° С (включают крышка и сосуд), а затем 3 промывок PBS-T в течение 10 мин каждый на орбитальном шейкере (80 оборотов в минуту) (все стадии промывки проводят при температуре 25 ° C) ,
- Смешайте 1 мл охлажденной повышенной chemiluminescenCE ПХ компонент подложку (улучшенный реагент люминола) с 1 мл компонента В (окислителем) (на мини-блот) при 25 ° С.
- Используйте пластиковые щипцы для переноса мембраны на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость (держать их у самых краев). Сухие контейнеры с бумажным полотенцем и положить мембраны обратно в контейнеры (по одному для каждой мембраны). Немедленно добавьте 2 мл предварительно смешанного усиленной хемилюминесценции HRP субстратом (соединение А + В) (этап 2.2.16.) К каждой мембраны и инкубировать в течение 2 мин при 25 ° С на орбитальном шейкере (90 оборотов в минуту). Убедитесь, что средства мембраны равномерно смачивается реагентом хемилюминесценции.
- Передача мембраны в прозрачный пластиковый рукав и удалить лишнюю жидкость и пузырьки воздуха с бумажными полотенцами. Поместите мембраны в пластмассовой втулки в кассете пленки и в конечном итоге лента пластиковую втулку в кассету. Закройте кассету.
- Возьмите кассету, фильм, таймер и ножницы в фотолаборатории. Отрежьте верхний правый угол от каждого филм для целей ориентации, выставить (разные) фильмы для различных периодов времени (10 сек, 1 мин, 10 мин) и разработать фильмы в качестве разработчика фильма.
3. Endoneuraminidase-NF Переваривание PSA Прикрепленный к NCAM 39
- Дайджест ткани мозга лизировали с постнатальный день (P) 7 мышей дикого типа и мышей Р7 NCAM KO (полученного из стадии 1.12) в течение 2 ч на льду с использованием endoneuraminidase-NF (эндо-NF) , как показано в таблице 2 , 39.
- Добавьте 5 мкл 4х Laemmli буфера для образцов в каждую пробирку (1 - 6) , полученного на стадии 3.1 (таблица 2).
- Образцы Нагрузка на 4 - 20% градиент SDS-полиакриламидном геле и повторите шаги 2.2.10 до 2.2.19. Probe мембраны с HIgM12 (1 мкг / мл), коммерчески доступный анти-PSA мАт (клон 2-2b) (1 мкг / мл) и бета-актин антител (контроль нагрузки) (1 мкг / мл) в 5% BSA в PBS -Т.
4. Подготовка крыс и мышей культур ЦНС
- Acid-Wash 25 мм покровные стекла в 1 М HCl при 50 - 60 ° С в течение 4 - 16 часов в вытяжном шкафу, используя стеклянный контейнер. Перемешайте покровные иногда через нежный закрученной.
- Промыть покровные стекла широко в дистиллированной воде (3 раза). Убедитесь в том, чтобы смыть кислоту между сложенных покровные.
- Промыть покровные в 100% этаноле и высушить их на Parafilm в капот культуре клеток. Однажды перед использованием, прогреть покровные стекла в течение 24 часов в стеклянной посуде с крышкой при температуре 100 ° С в печи.
- Помещенный покровные стекла в 6-луночного блюдо и пальто с 3 мл 40 мкг / мл поли-D-лизином в стерильной воде в течение 1 часа при температуре 37 ° С.
- Промыть два раза стерильной водой, полностью высушить под капот культуре клеток и применять УФ-светом в течение 20 мин.
- Пальто 60 мм чашки для культивирования клеток или 75 см колбах культуры тканей 2 с 3мл или 10 мл, соответственно, 40 мкг / мл поли-D-лизином в стерильной воде в течение 1 часа при температуре 37 ° С.
- Промыть два раза водой, полностью высушить под капот культуре клеток и применять УФ-светом в течение 20 мин.
- Обезболить новорожденных крыс в IACUC одобренных грызуна эвтаназии камеру с CO 2 подачи газа (полностью автоматизированном). Используйте схождения метод пинч-ответа для определения невосприимчивость животного. Обезглавьте неонатальной Sprague Dawley крыс (P0P1) (6 - 10 щенков одновременно).
- Удалите мозг, захватывая глазницы с пинцетом и вставляя небольшие ножницы в позвоночник. Вырезать череп в сторону передней панели на уровне ушей. Отогните череп и осторожно положите мозг в 60 мм чашке Петри заполнены 10 мл ледяной рассекает среды на льду (см таблицу 1).
- Повторите для остальных крыс щенков (6 - 10 бельков). Держите ткани на льду в течение шаги 4.3.2 - 4.3.7. Разделить головной мозг по средней линии на два больших полушарий головного мозга, а затем отрезали обонятельные луковицы, базальных ганглиев ниже коры головного мозга и гиппокамп с Дюмон щипцов. Поместите изолированный кору головного мозга в чистую чашку Петри, содержащую рассечения среду на льду.
- Возьмите одну кору головного мозга. Удалите мозговые оболочки с пинцетом с мелкими наконечниками под рассечение микроскопом.
- Повторите с остальными кортикальных. Поместите все Оболочек свободные в одну кору чистую чашку Петри на льду.
- Объединить корковых полушарий от всех щенков в 60 мм чашку Петри и использовать стерильную лезвие бритвы, чтобы кости мозговой ткани в 1 мм рублеными штук.
- Передача измельченной ткани мозга с помощью 10 мл пипетки в стерильный, без покрытия стеклянную колбу объемом 500 мл и добавляют 10 мл охлажденного на льду рассекает среды в головном мозге крыс. Аккуратно водоворот колбу при добавлении 1 мл раствора трипсина в HBSS (Hank сбалансированный солевой раствор) (5 мг / мл трипсина) в 9 мл HBSS в головном мозге крыс. Добавить 2% От общего объема в ДНКазы I раствор (1 мг / мл) и 2% от общего объема в растворе MgSO 4 (3,82% MgSO 4 в HBSS (вес / объем)) к суспензии ткани головного мозга и вихревой нежно.
- Trypsinize ткани при осторожном встряхивании на ротационной мешалке в течение 30 мин при 37 ° С. Убедитесь, что кусочки ткани плывут в течение этого шага и не оседают на дно. Увеличение скорости вращения, если это необходимо.
- Добавьте фетальной бычьей сыворотки (FBS) до конечной концентрации 10% (об / об) и перемешивают с помощью закрученной в колбу в 10 раз в течение 10 сек. Охладить суспензии ткани в воде со льдом в течение 15 мин. Swirl колбу осторожно пять раз каждую секунду мин.
- Аккуратно перенести суспензии ткани в стерильные 50-мл пробирки по 25 мл или 50 мл пипетки и центрифуги в течение 5 мин при 200g, 4 ° С.
- Удалите супернатант и осторожно ресуспендируют переваренной ткани центральной нервной системы в 15 мл охлажденного на льду рассекает среде , дополненной 5 мл фетальной бычьей сыворотки, 0,4 мл раствора MgSO 4 (3,82%MgSO 4 в HBSS) и 1,6 мл ДНКазы I (1 мг / мл).
- Разделение суспензии ткани на две равные части стерильные 15 мл пробирки (~ 10 мл каждый раз) и медленно растирают с помощью 10 мл пипетки (в 10 раз), пока суспензия не становится мутным / молочного цвета. Хранить суспендированные клетки на льду во время обработки следующей трубки. Подождите в течение 3 мин до тех пор, оставаясь переваривается ЦНС не тканей осадок на дне пробирки. Передача супернатант для очистки 50 мл трубки, не нарушая гранул фракции.
- Необязательно, проходят через мутные супернатантов клеточный фильтр 40 микрон и объединить полученную клеточную суспензию в стерильные 50 мл пробирки на льду.
- Спин суспензии клеток в течение 5 мин при 200g, 4 ° С.
- Осторожно удалите супернатант с помощью 10 мл пипетки до ~ 2 мл рассечение среды не остается на верхней части осадка клеток.
- Finger гранулы Флик клеток в 50 мл пробирки (~ 10 раз). Медленно добавляют 5 мл теплой ростовой среды (таблица 1) к клеточной суспензии при осторожномрука закрученной трубки.
- При желании, повторить шаг ДНКазы 4.3.12 в течение еще 10 мин на льду с свежим раствором ДНКазы I и MgSO 4 в случае -ного раствора кластеров видимых тканей или сгустки ДНК. Вихревые трубки вручную 5 раз каждую секунду мин.
- Пластина 50000 клеток на 25 мм покровным стеклом в луже 400 мкл ростовой среды в чашке 6-ну и пусть клетки прикрепляться в течение 30 мин в культуре клеток инкубаторе (5% СО 2, 37 ° C).
- Для конфлюэнтного ( в течение 24 - 48 ч после нанесения покрытия) 60 мм чашки для культивирования клеток и 75 см 2 ткани культуры колб, пластины 500000 клеток (60 мм блюдо) или 2 миллиона клеток (75 см 2 колбах).
- Аккуратно добавьте 2 мл (на лунку, 25 мм покровные стекла в 6-луночного блюдо), 3 мл (60 мм чашки) или 10 мл (75 см 2 колбах) теплой ростовой среды в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи и изменить среда полностью на следующее утро. Затем измените средний любой другой день (день 3, 5 -й день, 7 дней и т.д.).
Нетт.е: Rat смешанные глиальные культуры готовы к использованию для иммуногистохимии или биохимии 24 - 48 ч после посева.
- Идентичный рассечения неонатальной мозга крыс , описанных в разделах 4.3.1 до 4.3.6, обезглавить P0 новорожденных мышей WT и NCAM KO с C57 / НД6 фон, удалить мозги и поместить их в ледяной рассекает среде (таблица 1). Хранить ткани на льду во все времена.
- Разделить головной мозг по средней линии на два больших полушарий головного мозга, а затем отрезали обонятельные луковицы, базальных ганглиев ниже коры головного мозга и гиппокамп с Дюмон щипцов. Поместите изолированный кору головного мозга в чистую чашку Петри, содержащую HBSS на льду.
- Возьмите одну кору головного мозга. Удалите мозговые оболочки с пинцетом с мелкими наконечниками под рассечение микроскопом. Повторите с остальными кортикальных. Поместите все Оболочек свободные в одну кору чистую чашку Петри на льду.
- Передача корковой hemispheРез с 1 мл пипеткой из каждой мыши на отдельные, стерильные 15 мл пробирки. Добавить 1,2 мл ледяной рассекает среды для каждого мозга и механически разрушают ткани мозга с помощью пипетки его 2 раза вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл.
- Добавьте 150 мкл раствора папаин (10 мг / мл в PBS), 100 мкл раствора ДНКазы I (1 мг / мл в HBSS) и 50 мкл MgSO 4 (3,82% в HBSS) для каждого мозга и перемешать с помощью пальцев стряхивая.
- Выдержите суспензии мозга в течение 30 мин при 37 ° С в водяной бане и смешайте головного мозга суспензий каждую вторую минуту пальцем стряхивая. Добавьте 1 мл FBS на пробирку, перемешать и охладить суспензию ткани в течение 10 минут на льду.
- Спин вниз мозговой ткани в течение 4 мин при 200g, 4 ° С и ресуспендируют осадок ткани в 1 мл охлажденного льдом буфера рассекает , дополненной 70 мкл ДНКазы I раствора (1 мг / мл в HBSS) и 30 мкл MgSO 4 раствор (3,82% в HBSS).
- Растирают ткани мозга с использованием FBS покрытием 1 мл наконечник пипетки(~ 5 раз) до тех пор, пока супернатант мутнеет. Пропускают супернатанта через клеточный фильтр 40 мкм и переносят в чистую пробирку на льду.
- Гранул смешанные глиальные клетки путем центрифугирования в течение 5 мин при 200g, 4 ° С. Отберите супернатант до ~ 100 мкл среды оставлены на верхней части осадка клеток. Ресуспендируют осадок клеток с помощью пальца стряхивая (~ 5 раз) и добавляют 1 мл теплой среды роста мыши (таблица 1).
- Необязательно, растворите видимые кластеры клеток и лизированных клеток / осажденного ДНК, осторожно пипеткой клеточной суспензии вверх и вниз (в пять раз).
- Тарелка мыши смешанные глиальные клетки на PDL покрытием покровные стекла или 60 мм чашки, как описано в пунктах 4.3.19 - 4.3.21. Вымойте клеток на следующее утро с теплой средой роста мыши и впоследствии любой другой день. Мышь смешанная глии готова к использованию для иммуноцитохимию 48 - 72 ч после посева.
- Культура крысы смешанныйглии в 75 см 2 флаконах для культуры ткани в среде роста (таблица 1) в течение 10 дней. Стряхните микроглии кластеры клеток из смешанных глиальных культур на ротационной качалке внутри клеточной культуры инкубатор (5% СО 2, 37 ° С ) при 140 оборотах в минуту в течение 1 часа.
- Снимают микроглии содержащих супернатант из смешанных глиальных культур, пропустить через сито 40 ячейки микрон и держать суспензии клеток в стерильные 50 мл пробирки.
Примечание: микроглии культуры, как правило,> 95% чистоты после этого шага с несколькими загрязняющими OPCs и очень мало астроцитов. - При желании, заменить среду для роста на смешанных глиальных культур для будущих микроглии встр-офф. Как правило, выполнить несколько микроглии встряска офф (один раз в неделю) из смешанных глиальных культур.
- По желанию, чтобы получить более высокую степень чистоты 95% пластина 10 мл микроглии, содержащего супернатанта (этап 4.5.2) на 100 мм чашках Петри и инкубировать в культуре клеток инкубаторе в течение 30 мин при 37 ° С. только microglАнджелес будет приложить к чашке Петри, в то время как астроциты и OPCs остаются в супернатанте.
- Слегка встряхните чашки Петри по часовой стрелке и против часовой стрелки (в пять раз каждый) в капот культуре клеток. Отберите среда для культивирования клеток полностью и заменить 10 мл ростовой среды. Полученные в результате микроглии культуры являются> 98%.
- Культура микроглии в течение до 7 дней в среде DMEM с добавлением 1% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Для получения сильно обогащены OPC культуры стряхнуть клетки микроглии сначала из 10 - дневных смешанных глиальных культур , выращенных в 75 см 2 колбы на ротационной качалке в культуре клеток инкубаторе (5% СО 2, 37 ° С ) при 140 оборотах в минуту в течение 1 часа. Откажитесь микроглии только-содержащий супернатант или использовать для микроглии конкретных экспериментов (см шаг 5.5).
- Заменить микроглии содержащего супернатанта с ростовой среды 10 мл и стряхните смешанных глиальных культур дляеще 18 ч на ротационной качалке при 200 оборотах в минуту (5% СО 2, 37 ° C).
- Собирают microglia- и OPC-содержащий супернатант из смешанных культур глии и пропускают через сито 40 клеток микрон. Сбор суспензии клеток в стерильные 50 мл пробирки.
- При желании, заменить среду для роста на смешанных глиальных культур для будущих OPC встр-офф.
Примечание: OPCs продолжают разрастаться на астроцитарных слоев фидерных и может быть поколеблено-офф второй и третий раз (один раз в неделю), хотя и с более низкими выходами. - Пластина 10 мл microglia- и ОРС-содержащий супернатант в 100 мм чашках Петри и инкубировать в культуре клеток инкубаторе в течение 30 мин при 37 ° С. Микроглия будет прикрепляться к чашках Петри, в то время как OPCs и астроциты остаются в супернатанте.
- Слегка встряхните чашки Петри по часовой стрелке и против часовой стрелки, в культуре клеток капюшоном (5 раз каждый). Вынимают только несколько блюд Петри в то время, из клеточной культуры инкубатора (микроглии начнет вытеснять из Petри блюда, когда энергично встряхивают в прохладную среде).
- Сбор и объединить ОРС-содержащий супернатант в 50 мл пробирки. При желании можно добавить в питательную среду чашки Петри для использования в микроглии конкретных экспериментах.
- По желанию, для дальнейшего повышения чистоты OPC культур повторяют шаги 5.6.5 и 5.6.6 один раз свежей чашках Петри, чтобы снизить степень микроглии в ОРС препаратов.
- Спин вниз обогащенную OPC-содержащий супернатант в центрифуге в течение 5 мин при 250 мкг, 4 ° С. Аккуратно аспирата супернатант, не нарушая клеточный осадок. Оставьте 3 мл надосадочной жидкости на верхней части осадком и начинают ресуспендируя OPCs пальцем стряхивая (в 10 раз).
- Аккуратно растирать клеточные кластеры OPC с помощью 10 мл пипетки (5 - 10 раз).
- Граф клеток и пластины 50000 OPCs каждые 25 мм покровным стеклом (PDL покрытием) в лужицу ростовой среде 400 мкл в чашке 6-ну и пусть клетки прикрепляться в течение 30 мин в инкубаторе для клеточных культур (5% СО 2, 376; С). Осторожно добавьте 2 мл теплой среды пролиферации (см таблицу 1) в каждую лунку. Для PDL покрытием 60 мм чашках культура клеток, пластина 1 - 1,5 миллиона OPCS в 3 мл среды распространения.
- Тщательно заменить FBS-содержащий среду распространения свежей средой пролиферации 3 ч после того, как металлизации OPCs (убедитесь, что OPCs приложенные должным образом и не смещать во время смены среды). Обмен среда каждый второй день.
Примечание: Крыса OPC культуры получают с использованием этого протокола, как правило, 90% чистоты с микроглии в качестве основного типа загрязняющий клеток с последующим астроцитов.
5. Иммуноцитохимическая Использование HIgM12 в первичной глии
- Triple-этикетка иммунофлуоресценции с использованием HIgM12, анти-PSA МАБ и тип клеток специфических маркеров в первичной глиальные клетки из WT и KO мышей NCAM
- В условиях живой клетки, этикетка 60% сплошности мыши смешивают глиальных культур от мышей WT и NCAM KO, выращенных на PDL-покрытием25 мм покровные стекла с HIgM12 (10 мкг / мл) и анти-PSA мАт (клон 2-2b) (10 мкг / мл) в PBS с добавлением 10% FBS при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
- Мыть клетки три раза в течение 20 с каждый с охлажденным льдом PBS с добавлением 10% FBS и зафиксировать с помощью 4% параформальдегида в PBS, рН 7,4 в течение 15 мин при 25 ° С.
- Промыть Фиксированные клетки два раза в течение 1 мин каждый с PBS с добавлением 10% FBS и проницаемыми клеток с помощью 0,1% Triton-X100 в PBS, рН 7,4, в течение 2 мин при 25 ° С. Мыть клетки дважды в течение 1 мин и этикетка с глиальные маркерами GFAP (астроцитов) или IBA-1 (микроглии) (1 мкг / мл) в PBS с добавлением 10% FBS в течение ночи при 4 ° С в холодном помещении.
- Продолжайте стандартных условиях иммунофлюоресценции включая DAPI содержащих монтажа среду 31.
Примечание: Использование флуоресцентно меченных Fab 2 фрагмента в качестве вторичных антител для человека (HIgM12) и мыши (анти-PSA мАт, клон 2 - 2B) IgMs настоятельно рекомендуется. - Возьмите флuorescent изображения на 60X или 100X увеличении. Используйте те же настройки прибора для всех изображений и обработки изображений идентично.
- Иммунофлуоресценции Маркировку эндо-NF-обработанных WT глиальных клеток с использованием HIgM12 в качестве первичного антитела
- Культура WT мыши смешанные глии выращивали в течение 3-х дней в Neurobasal A с добавлением 10% FBS и B27 добавки (1:50) на PDL покрытием 25 мм покровные стекла. Добавить эндо-NF (30 мкг / мл) в 1 мл культуральной среды и инкубируют в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С, 5% СО 2).
- Этикетка клетки живут в холоде с HIgM12 и внутренним астроцитов GFAP маркером после фиксации и проницаемости, как описано в пунктах 5.1.1 5.1.5. Возьмите флуоресцентные изображения на 60X или 100X увеличении. Используйте те же настройки прибора для всех изображений и обрабатывать одинаково.
Representative Results
В этом разделе представлены примеры результатов, которые могут быть получены путем изучения человеческих IgM-специфических PSA-антигенов в ЦНС. Использование антител класса IgM человека, содержащих специфические легкие цепи Vκ в биохимических параметрах и флуоресцентной иммуногистохимии показано.
HIgM12 иммуноосажденными его антиген из коры головного мозга лизатов и выступает в качестве детектирующего агента (первичного антитела) в вестерн-блоттинга. Ни контрольного изотипа антитела , ни агарозы L шарики иммунопреципитации подобный антиген, который демонстрирует специфичность ниспадающего (рисунок 1). Вестерн - блоттинг с использованием лизатов ЦНС от мышей дикого типа и NCAM KO демонстрации специфичности HIgM12-связывания с PSA , содержащей NCAM (фиг.2А). Ферментативное переваривание ткани ЦНС от мышей WT с использованием эндо-NF идентифицирует PSA , прикрепленную к NCAM в качестве специфического связывания эпитопа для HIgM12 (рис 2B). С помощью метода , описанного в настоящем документе, МБА-1-позитивных крыс микроглии культуры высокой чистоты получают (рисунок 3). Коммерчески доступные антитела анти-PSA (клон 2-2b) не маркировать поверхности клеток или внутренние бассейны PSA в фиксированной и проницаемыми МБА-1-позитивных клеток микроглии с помощью флуоресцентной микроскопии. В соответствии с ранее опубликованной литературы, которая не сообщает никакого выражения клеточной поверхности PSA-NCAM в микроглии 16,41 HIgM12 не маркировать антигены на поверхности клеток микроглии в очищенных крыс. Интересно, что HIgM12 маркировка фиксированных и проницаемыми результатов микроглии в внутриклеточным, перинуклеарном шаблон , который не ограничивается конкретными органелл (рисунок 3). Результаты представлены в отличие от тех , полученные с использованием антитела анти-PSA IgG (клон 735) 26, которая ориентирована на PSA-SynCAM в микроглии на уровне Гольджи 41.
В отличие от микроглии, HIgM12и мишень A2B5 антигенов клеточной поверхности в сильно обогащенных крысы OPC культур в условиях живых клеток (рисунок 4). OPC культуры содержат ~ 5% загрязняющего клеток микроглии. Фиг.5 иллюстрирует практически идентичную поверхности клеток шаблон окрашивания между HIgM12 и анти-PSA мАт (клон 2-2b) в GFAP-позитивных астроцитов (рис 5А). Иммунофлуоресцентного маркировка эндо-NF-переваренной астроцитов WT по сравнению с буфером контрольных обработанных WT астроцитов с использованием HIgM12 демонстрирует наличие астроцитов PSA (Фиг.5В). Присутствие PSA-позитивных астроцитов в естественных условиях все еще должно быть подтверждено.
Рисунок 1: HIgM12 действует как "ниспадающем" Агент в иммунопреципитации иммунопреципитации от общего лизата мозга трех-месячных мышей с использованием HIgM12, контроль изотипа человек HIgM.126 или агарозы L бусинки только как "минусу" агентов. Элюированные белки работают в Вестерн-блоттинга с мембранами зондировали против HIgM12. Молекулярные массы, элюированных белков из бисера HIgM12 Покрытые в диапазоне 160 - 200 кДа в дополнение к IgMs тяжелой цепи (~ 65 - 73 кДа). Эта цифра была изменена из J. Neurochem. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: HIgM12 Цели полисиаловой кислоты (PSA) фрагменту на NCAM. A. Мозг гомогенатах из Р7, Р13, P16 и P27 NCAM всего KO мышей и гетерозиготные управления однопометница запускались в Вестерн - блоттинга с мембранами зондировали против HIgM12, PSA и бета-актина в качестве контроля нагрузки.
Рисунок 3: Отсутствие PSA на Rat микроглии дублируется отсутствием HIgM12 Маркировки Крыса микроглии культивировали в течение 48 часов на поли-D-лизин покрытием покровные стекла и либо маркированы в прямом эфире на льду с HIgM12 или после фиксации с HIgM12 или анти. -PSA моноклональное антитело (клон 2-2b). Клетки тriple помечены микроглии маркером IBA-1 (зеленый), HIgM12 / PSA (красный) и DAPI (синий цвет). Изображения показывают отсутствие микроглии клеточной поверхности связывания с использованием HIgM12 (верхний ряд) и отсутствие анти-PSA связывания (клон 2-2b) к клеточной поверхности и внутренних запасов в первичных микроглии крыс (нижняя строка). На основе биполярной морфологии и отсутствие МБА-1 окрашивания, небольшой PSA-позитивных клеток (нижний ряд) было предложено, чтобы быть OPC. В фиксированных клетках, HIgM12 окрашивание приводит к пятнистый, перинуклеарном шаблон , который не ограничивается конкретными органелл и считался неспецифического связывания (средний ряд). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: HIgM12 Цели клеточной поверхности PSA-NCAM на Крыса Крыса OPCs OPCs и микроглии были cultu.красный в течение 4 дней в среде распространения на поли-D-лизин стекла с покрытием покровные и тройной меченных в прямом эфире на льду с HIgM12 или A2B5 (зеленый), внутренний макрофаг / моноцитов маркера CD68 (клон ED-1) (красный) и DAPI (синий) , Изображения показывают клеточные популяции главно положительным для маркера OPC A2B5 (верхний ряд) и HIgM12 (нижний ряд) с небольшим количеством CD68-положительных микроглии (~ 5%). Фазовый контраст и DAPI изображения были добавлены , чтобы выявить целостность клеток и количество клеток для каждой группы населения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: HIgM12 и анти-PSA мАт совместно пометить астроцитов субпопуляции в смешанной мыши глии. А. Мышиные смешанные глиальные клетки из WT и NCAM всего KO животных , содержащие астроциты, олигодендроциты-клональные клетки и микрогрLia культивировали в течение 3-х дней и маркированы в прямом эфире на льду с HIgM12 (зеленый), анти-PSA мАт (клон 2-2b) (красный), а затем для астроцитов GFAP маркером (фиолетовый) и DAPI (синий). HIgM12 и анти-PSA показывают виртуальную картину, идентичную окрашивания на GFAP-позитивных астроцитов WT, но не имеют привязки к культивируемых астроцитов от мышей NCAM KO. Эта цифра была изменена из J. Neurochem. 15. В. Смешанные глии культивировали одинаково , как описано в разделе А. и обрабатывали в течение ночи с endoneuraminidase-NF (любезно предоставленные доктором Мартиной Muehlenhoff) или контроля PBS. Клетки метили в прямом эфире на льду с HIgM12 (зеленый), а затем окрашивали для внутренних маркеров GFAP (красный) и DAPI (синий). HIgM12 цели антигенов клеточной поверхности на PBS-контроль лечение смешанных глиальных культур, но не endoneuraminidase-NF обрабатывали смешанным глии. Эта цифра была изменена из JNSCI 16. Plоблегчить нажмите здесь, чтобы увидеть большую версию этой фигуры.
Все снимки были сделаны при 60X увеличении, используя те же настройки прибора и обрабатываются одинаково.
Таблица 1:. Буфер и решение Рецепты Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.
| ткани ЦНС | Эндо-NF / PBS | буфер для лизиса | Общий объем | |
| 1. WT мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | 2 мкл (12 мкг) эндо-NF | 7,55 мкл | 10 мкл |
| 2. WT мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | 2 мкл PBS | 7,55 мкл | 10 мкл |
| 3. WT мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | нет PBS или эндо-NF | 9,55 мкл | 10 мкл |
| 4. NCAM KO мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | 2 мкл (12 мкг) эндо-NF | 7,55 мкл | 10 мкл |
| 5. NCAM KO мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | 2 мкл PBS | 7,55 мкл | 10 мкл |
| 6. NCAM KO мыши | 67 мкг (0,45 мкл) | нет PBS или эндо-NF | 9,55 мкл | 10 мкл |
Таблица 2: эндо-NF переваривание ткани ЦНС у мышей P7 WT и NCAM KO.
Discussion
Человеческие естественные аутоантитела класса IgM являются привлекательными кандидатами на иммунотерапии и продемонстрировали терапевтический потенциал для лечения различных заболеваний , в том числе рака и заболеваний ЦНС 1-7. Предпочтительно, чтобы эти антитела не будут вызывать иммунный ответ, в котором генерирование нейтрализующих антител существенно снижает эффективную терапевтическую дозу и эффективность. Важно то , что все антитела с терапевтическим потенциалом были изотип IgM и принадлежат к репертуара NAB 3-5,8,9,37,40,42-45. Главным препятствием для потенциального клинического применения IgM антител является идентификация их антигенов, которые неопределенных во многих случаях. Стандартные методы, используемые для IgG антител, часто не применяется для выявления антигена в IGM не давал.
Этот протокол описывает идентификацию PSA-NCAM в качестве антигена для регенеративной человеческого антитела IgM HIgM12, эффективное в животных моделяхРС и БАС 15-18. Методология, используемая применимую для всех человеческих антител со специфическими Vκ легких цепей VκI, VκIII и VκIV и мышиных антител с легкими цепями VκI, независимо от того, изотип антитела.
Самым важным шагом в этом протоколе является использование антител класса IgM в сродства применения хроматографии. Более конкретно, успешные антитела должны действовать в качестве ниспадающих агентов в иммунопреципитации, чтобы изолировать или обогатить антиген из сложных ткане или клеточных культур лизатов. Обогащенные фракции антигена можно сравнить с иммунопреципитации из-под контроля изотипа антител и затем анализировали на различия масс-спектрометрией. Одним из важнейших требований или ограничений данного шага является наличие антител правильно Vκ легкой цепи и хозяина (человека, мыши), чтобы позволить связывание с белком L агарозы антитела. Использование маннан-связывающего белка, связанного с агарозой (также Каллеd манноза-связывающий лектин) вместо белка L агарозы является потенциальной альтернативой иммунопреципитации IgMs без конкретных легких цепей Vκ. Тем не менее, как заявил Арнольд и др. , 35, антиген-связанный IgM антитела не связываются с маннан-связывающего белка, как и появляются мишени Гликан стать недоступными , как только IgM , связала со своим антигеном. На основании этих данных маннан-связывающего белка , не может быть использован в качестве связующей матрицы для иммунопреципитации антиген загруженным IgM - молекулы 35. Другие потенциальные альтернативы могут быть использование вторичных агарозном переплете анти-IgM , IgG антител 46,47 или использованием поверхностно-активированных магнитных гранул 48. IgG-антитела, направленные против IgMs могут быть химически сшиты агарозном или агарозном G, с тем чтобы уменьшить степень элюированного антитела вместе с представляющим интерес антигеном. Правильное сравнение между различными вариантами IgM иммунопреципитации относительно успешно выявленных антигенов яS трудно, потому что большинство иммунопреципитации были выполнены, чтобы изолировать или истощить IgMs без дальнейшего интереса к их антигенов. Кроме того, иммунопреципитации с использованием IgMs в основном использовались для подтверждения уже известных или предполагаемых одного антигена с воздействием антитела к очищенных антигенов 49. Недостатком агарозном связью IgGs направлено против человеческого IgMs является очень низкий выход (10 - 15%) от иммуноосажденного сыворотки молекул IgM, по сравнению с исходным материалом 50. В противоположность этому , поверхностно-активированный магнитные шарики были успешно применены к антител различных изотипов , включая IgM к иммунопреципитации скрепи-ассоциированных фибрилл 48. Этот метод не ограничивается конкретной каппа (Vκ) или лямбда (λ) цепей или конкретного хозяина и может существенно расширить спектр IgM антител, используемых в иммунопреципитации.
Еще одним важным шагом в протоколе является способность антитела функционировать как DETантитела (выполнения над каждым первичным антителом) в Вестерн-блоттинга или других скрининговых платформ. Успешные антитела должны быть направлены на их антиген с достаточно высокой степенью сродства, чтобы позволить связывания антигена в присутствии неионных или, возможно, ионных детергентов. Высокоаффинных антител распространены среди аффинно созрела IgG антител, но менее распространены среди антител изотипа IgM, которая является одной из причин, почему существует относительно небольшое число коммерчески доступных антител IgM в качестве детектирующего агентов в биохимических параметрах. Высокое сродство связывания антител является обязательным требованием для иммунопреципитации молекулярных антигенов и для вестерн-блоттинга. Снижение концентрации моющего средства или полное отсутствие моющих средств в буферах IP и лизиса буферов позволяет антиген Таргетинг по низким сродством антител с помощью своей области Fab. В противоположность этому, способность антитела к белку-мишени L агарозы с помощью своей части Fc не существенно влияет среди элементов управления изотипных в диапазоне различных концентра моющих средствнистрации. Тем не менее, низкая концентрация детергента в буфере для лизиса и буфер IP предотвращает разрушение клеточных мембран и выделение специфических молекул. Аналогичным образом , при низкой концентрации моющего средства в Вестерн - блот - моечных буферами (например, PBS-T) позволяет связывания антигена из низкоаффинных антител , но в то же время увеличивает неспецифическое связывание и поэтому не вариант.
Присутствие корового антигена белка является еще одним требованием для этого метода. Белки с посттрансляционных модификаций (например, гликопротеины, липопротеины) и немодифицированных белков, но не единственными липидов или углеводов, могут быть обнаружены в Вестерн - блоттинга. Это не представляется возможным иммунопреципитации липиды (например, сфинголипидов) из ткани или клеточных лизатов в присутствии или в отсутствие моющих средств. Физико-химические свойства моющих средств и липидов слишком похожи, чтобы позволить селективные липидные-антитело взаимодействий, в то время как в то же самое время, моющие средства имеют важное значение для разрушенияМембраны для того, чтобы обеспечить селективное выделение специфических молекул. Насколько нам известно, иммунопреципитации исключительно состоящих из углеводов, в отсутствие белкового ядра, не сообщалось ранее. Это становится особенно актуально, так как IgM-антител часто целевых углеводы и гликолипиды, которые не обязательно связаны с блоком белка. Другие хроматографические методы, необходимые для разделения и иммунологической идентификации липидов и углеводов в отсутствие белкового ядра. Например, при тонкослойной хроматографии (ТСХ) , клеточных липидов с последующим детектированием антителом на ТСХ пластине (иммуно-ТСХ) может быть реализовано 51,52.
Другие антитела анти-PSA были описаны в предыдущих исследованиях и результаты по сравнению с HIgM12, а также коммерчески доступного анти-PSA IgM (клон 2-2b). Наиболее часто используемым антителом в области PSA представляет собой IgG-антитела (клон 735) доступны в качестве monoc мышиlonal или поликлональное антитело кролика 53. Это антитело анти-PSA IgG обнаруживает PSA на SynCAM и NCAM на различных типах клеток , включая ЦНС клеток микроглии 41. В отличие от антител анти-ПСА IgG, антитела IgM человека HIgM12, HIgM42 и анти-мышиных IgM-PSA (клон 2-2b) не могут предназначаться PSA на SynCAM (но на NCAM) в различных эмбриональных и раннего постнатального стадии у мышей , в то время как не-Полисиалилированный SynCAM легко обнаруживается 15. Антитела класса IgM используются также не в состоянии обнаружить PSA на клетках микроглии (рис 3 + 4). Возможное объяснение различий наблюдается между изотипов антител могут быть низкие уровни PSA-SynCAM по сравнению с уровнями PSA-NCAM в сочетании с потенциально более низким сродством связывания IgM антител по сравнению с анти-PSA IgG. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели иммунопреципитации в NCAM KO животных на эмбриональной стадии E17 с огромным количеством SynCAM настоящее время и используется HIgM12 как "спускающее агент" <SUP> 15. В E17 WT однопометница управляет HIgM12 иммуноосажденного PSA-NCAM до такой степени, что показали аналогичные интенсивности "разобрали" PSA-NCAM по сравнению с IgMs тяжелой цепи, обнаруженной с помощью денситометрии в последующем Вестерн-блоттинга с использованием элюированных антигенов. Этот результат предложил, по крайней мере достаточное сродство HIgM12 к целевой PSA. В отличие от WT однопометница управления HIgM12 не обнаружили PSA прикрепленный к SynCAM в NCAM KO животных. Идентичные результаты были получены в иммунопреципитации с использованием человеческого анти-PSA IgM HIgM42. HIgM12 и HIgM42, а также мышиное анти-ПСА IgM (клон 2-2b) не могли предназначаться PSA на SynCAM в Вестерн-блоттинга от WT и NCAM KO животных на эмбриональных и постнатальных стадиях развития. Учитывая низкое количество HIgM12 требуемого (0,1 мкг / мл) для специфического определения PSA , прикрепленную к NCAM в вестерн - блоттинга с использованием небольших количеств ткани ЦНС (0,1 мкг ЦНС ткани на лунку) 15 оно , как представляется, маловероятно , что только низкие аффинностиответственность за полное отсутствие обнаружения ПСА-SynCAM по HIgM12 в трех различных методов.
Мы пришли к выводу, что существуют значительные различия между анти-PSA антитела IgM и часто опубликованной анти-PSA IgG антитела (клон 735). Не ясно, почему коммерчески доступные антитела анти-PSA IgM не использовались чаще в прошлом, чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью antiPSA IgG антитела 735. Это особенно интересно, потому что HIgM12 уже доказала свою эффективность в различных моделях болезни. В то время как другие анти-PSA антитела IgM могут иметь сходные терапевтические эффекты, остается неясным, имеет ли анти-PSA IgG антитела (клон 735) аналогичный терапевтический результат в моделях MS и ALS.
Короче говоря, методы, описанные здесь, были использованы в первую очередь для определения антигена регенеративных HIgM12 человеческого антитела для поддержки потенциальных клинических испытаний для РС и, возможно, других нейродегенеративных заболеваний. Идентификация муравейigens для антител с биологической активностью как существенный шаг, чтобы понять их механизм действия. Это становится особенно актуальным в контексте многочисленных моноклональных антител в настоящее время тестируется на безопасность и эффективность в испытаниях на людях. В то время как число клинически протестированных IgM антител к настоящему времени мало, последние достижения в гибридомной технологии вместе с увеличением числа исследований , освещающих терапевтический потенциал этого класса антител 1-10,37,40,42-45 призывает разработку новых или модифицированные методы, применяемые для идентификации небелковых антигенов IgM.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (R01 GM092993, R01 NS048357 и R21 NS073684), Национальный научный фонд (премии КАРЬЕРА), премии Миннесота партнерства в области биотехнологии и медицинской геномики, Национальный общества рассеянного склероза (CA1060A) и Mayo Clinic Центр клинической и поступательной науки (CCATS). Авторы признают поддержку со стороны Эпплбаум, Hilton, Петерсон и Sanford Фундаменты, Луны и Мэрилин фонда Парк директорства и семьи McNeilus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. J Autoimmun. 29 (4), 295-302 (2007).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. N Biotechnol. 25 (5), 294-298 (2009).
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Acorda Therapeutics Inc. An Intravenous Infusion Study of rHIgM22 in Patients With Multiple Sclerosis (Clinical Trials Identifier - NCT01803867). , Available from: http://1.usa.gov/1N2gsHJ (2015).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O'Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, Suppl 1. S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3'-isoLM1 3',6'-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
