Introduction
的IgM同种型的抗体表现出对各种疾病的治疗包括癌症和CNS障碍1-7大的治疗潜力。该Vollmers“组确定癌症患者大量抗体作为肿瘤特异性标志物，或者能够通过诱导凋亡途径4,8,9杀死恶性细胞活跃疗法的潜在用途。有趣的是，具有治疗潜力的所有确定抗体是IgM同种型的和属于该组的“天然抗体”（NAb的）的。
同样地，罗德里格兹的组识别鼠标和在多发性硬化症（MS）的模型刺激髓鞘慢性脱髓鞘脊髓病变的人抗体。相同的具有抗癌作用的抗体，所有的髓鞘再生，促进抗体的NAb和IgM同种型1,6,7,10的。对于大多数鉴定的IgM精确的抗原仍然undetermined包括MS患者11 I期临床试验的人的髓鞘再生，促进抗体rHIgM22，目前在阶段。尽管在脂类和碳水化合物研究的无论是在学术环境中，并与工业11合伙领域的专家多次努力，试图确定rHIgM22的抗原都没有成功。的用于识别IgG抗体的抗原与IgM抗体工作的标准技术故障标识关键需要改进特异于这些抗体，最有可能的目标碳水化合物或脂质抗原的方法。
这份手稿的重点是人的再生抗体HIgM12以及用于识别其抗原的实验程序。抗体HIgM12从患者瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症鉴定，刺激体外 12-14神经突增生和目标连接到神经细胞粘附分子（PSA-NCA聚唾液酸（PSA）的M）15,16。 HIgM12延伸在ALS 17的小鼠模型中的寿命，并提高在Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV） -感染的小鼠的功能结果。具体地说，HIgM12刺激中小直径脊髓轴突8周慢性脱髓鞘小鼠和增加号码自发的水平和垂直运动活性后腹腔内的一个单一的，低剂量注射抗体18。
神经细胞粘附分子（NCAM）是免疫球蛋白（Ig）的神经元，神经胶质，骨骼肌，和自然杀伤细胞19-25的细胞表面上超家族表达的糖蛋白。三大NCAM亚型称为NCAM180，NCAM140和NCAM120，是一个主要的转录物的可变剪接变体，只有在其细胞质区域发生变化。内的中枢神经系统，NCAM是主要的唾液酸分子（> 95％），长的，带负电荷的唾液酸的均聚物。多聚一CID具有n> 10被称为PSA但较短的寡聚结构存在，同时也是生物相关。在中枢神经系统表达其他唾液酸蛋白SynCAM1 26，神经毡蛋白-2（NRP-2）和27,28钠通道亚基25（综述见29）。
这里所描述的方法允许含特定卡帕（Vκ）轻链（对于人抗体和VκI轻链为小鼠抗体VκI，VκIII或VκIV轻链）人和小鼠免疫球蛋白的抗原识别而不管抗体的同种型（ 例如，IgG抗体，IgM抗体的，IGA，IgD的或IgE）。这种限制是基于使用蛋白L琼脂糖的用于与IgM同种型的抗体免疫沉淀。替代策略可以包括甘露糖结合凝集素和共价连接到琼脂糖珠次级IgG抗IgM抗体，其可以扩大该方法的适用性更IgM抗体增量泸定那些拉姆达（λ）轻链（见讨论）。相比IgM抗体λ健康个体衍生轻链的IgM血清轻Vκ链的比率是1.5：1 30。
基于此处用来分离，富集和免疫检测特定分子31的色谱方法，都需要所有抗原包括至少一种小的蛋白质结构域。该抗体的特异性结合的表位可以是内部或蛋白质结构域（ 例如 ，在糖蛋白，脂蛋白）的外部。用于识别特定抗原HIgM12，各自以缩小潜在候选的列表中最初的生化步骤，是在该方法中最关键的步骤。细胞类型特异性制剂和基于细胞形态学-表征为神经胶质细胞被描述，但该方法可以外推到容纳内或中枢神经系统以外的其它类型的细胞。
目前迫切需要开发适用于数量的增加，其中所述抗体的目标是碳水化合物或脂质结构IgM抗体与特别是在这些情况下，对于不同的人类疾病的治疗潜力（多数的IgM抗原）的新的或修改的技术。
Protocol
动物方案和程序按照健康指南全国学院进行，由梅奥诊所的机构动物护理和使用委员会（IACUC梅奥协议号＃A51912）的批准。
1.一般CNS组织准备
- 生成C57 / BL6背景，杂NCAM小鼠和野生型（WT）同窝（C57 / BL6）通过横渡杂合子（好心林恩博士Landmesser，凯斯西储大学，美国俄亥俄州克里夫兰市提供）NCAM缺陷（KO）小鼠。 NCAM KO小鼠的基因分型先前描述32-34和将不进行更详细的说明。
注意：步骤1.2 - 1.6是可选的。
- 在手术之前，管理一个戊巴比妥溶液（股票：25毫克/毫升; 50/100微升巴比妥早期产后各成虫阶段），通过腹腔注射（27号针头和1ml注射器）。
- 等待2分钟，或直至动物达到麻醉的手术平面。管理每个操作过程中的其他麻醉剂作为必要维持麻醉的手术平面。用脚趾捏响应方法来确定麻醉深度。动物必须在继续之前停止响应。
- 制作0.5 - 通过体壁和腹壁只是肋骨下方1厘米外侧切口。仔细分离从隔膜肝脏。请使用弯曲，钝的剪刀隔膜一个小切口。继续沿肋骨的整个长度隔膜切口以暴露胸膜腔。
- 放置弯曲的，钝剪刀沿着肋笼的一侧上，小心地位移肺部，并穿过肋笼到锁骨的切口。就对侧类似的削减。提起胸骨而去，仔细地修剪其连接到心脏的组织。
- 做一个切口向动物的使用虹膜剪创造大的电源插座尽可能右心房。慢慢注入100毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）的入动物的左心室（淡红色;流速：1毫升/分钟）通过使用10毫升注射器装有27号针头。灌注过程中不要增加压力/流量PBS，避免组织破坏。
- 用手术剪刀斩首新生小鼠。
- 通过抓住与镊子眼窝并通过插入一个小剪刀到脊柱取出大脑。切向在耳朵的高度正面的头骨。剥离背面的头骨和大脑轻轻置于60毫米培养皿填充在冰上10毫升冰冷解剖培养基（ 表1）。将每个脑在1.5ml微量离心管中，并立即储存在干冰（-79℃）。
- 切割使用冰干净的刀片冷冻大脑，小脑和脑干。迅速开展工作，以避免解冻组织。
- 称量冷冻大脑，放在一个15毫升的管中在冰上并加入冰冷的裂解缓冲液（ 见表1）以每微升裂解缓冲液150微克脑组织的最终浓度。重复剩余的大脑。保持冰的大脑时刻为1.9的步骤 - 1.11。
- 通过随后研磨通过配有27号针头（10次）5毫升注射器1毫升枪头（10倍）通过研磨均质在裂解缓冲液的大脑。在冰上孵育30分钟脑裂解液，使完整的组织裂解。
- （以19,000rpm×g离心10分钟，在4℃四轮）除去通过串行离心不溶洗涤剂的材料和脑脂质。丢弃（白色）髓鞘和含有沉淀的细胞碎片，但保留每离心步骤后的上清液。分装脑裂解液和储存在-80ºC。
2.免疫沉淀，利用人体的IgM（HIgM12和同型IgM型控制），作为“下拉”，从天圆地方代理WT L的裂解液和NCAM KO小鼠
- 蛋白质L琼脂糖珠准备9,35,36
- 制备200毫升的IP缓冲液中包括的BSA（ 见表1）。准备另一200ml相同的IP缓冲液不含BSA。
- 每免疫反应转移100微升用200微升吸管到1.5 ml离心管蛋白L琼脂糖浆。不要旋涡L蛋白琼脂糖珠！加入1ml的IP缓冲液（ 见表1），以每管。混合蛋白L琼脂糖和手动IP缓冲通过反转（五次）。
- 洗涤蛋白L琼脂糖珠子离心四次在台式离心机（1000 xg离心，2分钟，25℃）。用200微升吸管，而不会干扰琼脂糖颗粒起飞上清。重复洗涤步骤2.1.2至2.1.3三个额外的时间。
- 在4ºC平衡蛋白L琼脂糖在1ml新鲜添加的IP缓冲液滚筒上过夜。
- 抗体-抗原-琼脂糖L个复形成和抗原检测在蛋白质印迹
- 在1ml冰冷的IP缓冲液在1.5ml微量离心管在辊4ºC孵育30毫克裂解的脑组织（〜200μl的裂解物）的用的IgM抗体（HIgM12）的20微克过夜。
- 降速蛋白L琼脂糖珠（从步骤2.1.4）在台式离心机2分钟在1000 XG，4ºC。丢弃用200μl移液管的上清液，而不会干扰琼脂糖颗粒。添加用1毫升吸移管冷冻抗体 - 脑裂解物溶液（来自步骤2.2.1）的蛋白L琼脂糖。
- 孵育在辊2小时的抗体 - 抗原 - 蛋白质L琼脂糖悬浮液在4ºC。洗附着在1000 xg离心通过离心琼脂糖责任限额2分钟，4ºC抗体 - 抗原复合物。小心弃去上清液而不扰乱颗粒和加入1毫升含有0.2％BSA的冰冷的IP缓冲液中。
- 使用含有0.2％BSA和使用冰冷的IP缓冲液不含BSA另外两次冰冷的IP缓冲液重复洗涤步骤一次。
- 降速附着在1000 xg离心琼脂糖责任限额2分钟，4ºC抗体 - 抗原复合物。完全首先利用200μl的移液管，直到〜的溶液50微升留在了蛋白L琼脂糖沉淀后跟一个10微升吸管顶端弃上清。保持冰样本。
- 添加40微升的IP洗脱缓冲液（ 见表1）每1.5ml微量管，手指轻弹管6倍并加热5分钟，在95°C下。雪藏样品2分钟，13,000 XG，4ºC降速，持续30秒。
- 使用10微升吸管（〜35微升总）上清转移到一个新的1.5 ml离心管，而不会干扰颗粒。确认通过在管内壁漂洗下来洗脱样品的少量缺失蛋白L琼脂糖珠。
注：“颗粒”L蛋白琼脂糖珠都清晰可见，如果存在。 - 如果L蛋白琼脂糖珠存在，降速样品另外的30秒13,000 XG和转让上清液清洗管道。重复步骤，直到没有琼脂糖珠检测。
- 负载10 - 20微升每孔的洗脱样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的Tris /甘氨酸/ SDS缓冲液系统（ 见表1）。
注： - ：8.6×6.7×0.1厘米）使用7.5％或4，每孔50微升装载量用于检测的PSA-NCAM或NCAM亚型（凝胶尺寸（宽×长×厚的20％梯度凝胶。 - 关于台式为在100V〜1小时运行凝胶（1.74伏/厘米2）。不需要此步骤37,38额外的冷却。
- 转移蛋白至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（孔径为0.45微米），用于在冷室，在100V用冷转移缓冲液2.5小时（1.74伏/厘米2）（5 - 10℃）（ 见表1）。
- 块膜W¯¯第i个10％（重量/体积）在PBS-T中的干奶粉在25ºC1小时在工作台上轨振荡器，与初级抗体洗膜两次，每次10分钟，用PBS-T和探针过夜，在5％BSA的PBS- T于在冷室轨道摇床。
- 在25ºC第二天早上洗膜一次短暂用过量的PBS-T（包括盖子和容器），随后洗涤3次用PBS-T持续10分钟，每次在轨道摇床（每分钟80转）（所有的洗涤步骤都在25进行的ºC）。
- 添加第二抗体（辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人抗IgM抗体（对于HIgM12）（稀释1：30,000）在PBS-T中的5％干奶粉1小时，在25ºC在轨道摇床（70rpm下）。
- 洗膜广泛在25ºC一次短暂用过量的PBS-T（包括盖子和容器），随后洗涤3次用PBS-T持续10分钟，每次在轨道摇床（每分钟80转）（所有的洗涤步骤都在25ºC执行） 。
- 混合1毫升冷冻增强chemiluminescen的CE HRP底物成分A（增强型鲁米诺试剂）在25ºC1毫升成分B（氧化剂）（每小印迹）的。
- 用塑料镊子转移在纸巾膜，去除多余的液体（最拿住其边缘）。用纸巾和把膜放回容器干燥容器（每个膜）。立即加入2毫升预混合增强的化学发光HRP底物（化合物A + B）（步骤2.2.16。）以各膜中，并在25ºC孵育2分钟在定轨振荡器（90转）。确保膜通过化学发光试剂均匀地润湿。
- 转印膜进入一个透明的塑料套筒和除去过量的液体和气泡用纸巾。把膜在塑料套在胶卷盒，并最终用胶带将塑料套进纸盒。关闭录像带。
- 以磁带，胶片，定时器和剪刀进入暗室。从每个网络连接切断右上角流明为取向的目的，暴露于不同的时间段（不同的）的膜（10秒，1分钟，10分钟）和发展的膜显影剂薄膜。
PSA的3 Endoneuraminidase-NF消化附NCAM 39
- 如表2中39所示，从出生后（P）的7 WT小鼠和P7 NCAM KO小鼠消化裂解脑组织用于使用endoneuraminidase-NF（ENDO-NF）在冰上2小时（从步骤1.12的方法制备）。
- 添加5μl的4倍Laemmli样品缓冲液中向每个管（1 - 6）将来自步骤3.1（ 表2）。
- 在4负载的样品 - 20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶，并重复步骤2.2.10到2.2.19。在PBS中的5％BSA的探针膜与HIgM12（1微克/毫升），可商购的抗PSA单克隆抗体（克隆2-2B）（1微克/毫升）和β肌动蛋白抗体（负载对照）（1微克/毫升） -T。
4.大鼠和小鼠CNS文化的制备
- 60ºC为4 - - 中的1M HCl在50酸洗涤25毫米盖玻片在通风橱中16小时使用的玻璃容器。偶尔通过轻轻旋转摇动盖玻片。
- 洗涤玻璃盖玻片广泛在蒸馏水（3×）。确保堆叠盖玻片之间洗出的酸。
- 冲洗盖玻片在100％乙醇，并在细胞培养罩晾干上封口膜。使用前一天，加热玻璃盖玻片在烘箱中在100ºC在玻璃容器中24小时用盖子。
- 放盖玻片在6孔皿和外套用3ml 40微克/毫升多聚-D-赖氨酸的无菌水中1小时，在37ºC。
- 用无菌水洗涤两次，在细胞培养罩完全干燥并应用UV光20分钟。
- 大衣60毫米细胞培养皿或75厘米，3 2组织培养瓶中毫升或10毫升，分别为40微克/毫升多聚-D-赖氨酸无菌水中在37ºC1小时。
- 用水洗涤两次，在细胞培养罩完全干燥并应用UV光20分钟。
- 麻醉新生大鼠在IACUC批准了二氧化碳气源（完全automatized）啮齿动物安乐死室。用脚趾捏响应方法来确定动物的反应迟钝。新生斩首只SD大鼠（P0P1）（6 - 一次10幼崽）。
- 通过抓住与镊子眼窝并通过插入一个小剪刀到脊柱取出大脑。切向在耳朵的高度正面的头骨。剥离背面的头骨和大脑轻轻置于60毫米培养皿填充用10毫升冰冰冷解剖培养基（ 见表1）。
- 重复剩余幼鼠（6 - 10幼崽）。保持冰的步骤4.3.2组织 - 4.3.7。 分沿中线大脑成两个大脑半球，并随后切断嗅球，大脑皮质下面基底节和杜蒙钳海马。将含冰解剖介质清洁的培养皿孤立的大脑皮层。
- 采取一皮层。用解剖显微镜下精提示镊子取出脑膜。
- 用剩下的皮质重复。将所有无脑膜，皮层成冰，干净漂亮的培养皿。
- 所有幼仔60毫米的培养皿结合皮质半球并用无菌刀片给裸片脑组织切碎成片1毫米。
- 传送用10毫升吸管的剁碎的脑组织成无菌的，无涂层的500ml玻璃烧瓶中，并加入10毫升，每鼠脑冰冷解剖培养基。轻轻摇动烧瓶，同时每大鼠脑加入1毫升胰蛋白酶溶液在HBSS（Hank氏平衡盐溶液）（5毫克/ ml胰蛋白酶）到9毫升的HBSS。添加2在DNA酶I溶液（1毫克/毫升），并在MgSO 4上溶液总体积的2％总体积的％（在HBSS中3.82％ 硫酸镁 （重量/体积））的脑组织悬浮液，并轻轻摇动。
- 下温和Trypsinize组织在37ºC在旋转摇床上振摇30分钟。确保组织片在此步骤中浮动，并且不沉淀至底部。若有必要可升高转速。
- 胎牛血清（FBS）添加到10％（V / V）的最终浓度，并通过旋动烧瓶10次10秒混合。冷却组织悬浮液在冰水中15分钟。漩涡烧瓶轻轻五次每秒分钟。
- 轻轻在200 xg离心，4ºC传送用25 ml或50毫升移液器和离心机将组织悬浮到无菌的50ml试管5分钟。
- 弃上清液并轻轻在15ml补充用5毫升胎牛血清的冰冷解剖介质的悬浮消化CNS组织加入0.4ml 硫酸镁溶液（3.82％硫酸镁在HBSS）和1.6 DNA酶I（1毫克/毫升）的溶液中。
- 分裂组织悬液同样成两个无菌的15毫升管（〜各10ml），并缓慢地磨碎，用10毫升吸管（10次），直至悬浮液变得混浊/乳白色。保持悬浮的细胞在冰上在处理下一个管。等待3分钟，直到剩余消化的中枢神经系统组织中沉积到管的底部。转移上清液清洗50ml管中，而不会干扰沉淀级分。
- 任选地，通过40微米的细胞过滤网通过浑浊的上清液，将所得的单细胞悬浮液合并成无菌50ml试管在冰上。
- 在200 XG，4ºC自旋细胞浆液5分钟。
- 直到约2ml解剖介质被留在细胞沉淀的顶部轻轻取出，用10毫升吸管上清液。
- 手指轻弹细胞沉淀在50ml试管（〜10倍）。慢慢加入5毫升温生长培养基（ 见表1）向细胞悬浮液，同时轻轻手旋管。
- 任选地，重复DNA酶步骤4.3.12在冰上额外10分钟用新鲜的DNA酶I溶液和用MgSO 4 -solution在可见组织簇或DNA团块情况。旋流管手动5次每秒分钟。
- 板每25mm玻璃盖玻片50,000个细胞于400μl生长培养基中在6孔皿水坑，并让细胞在细胞培养孵育箱（5％CO 2，37℃）附加30分钟。
- 对于融合（在24 -电镀后48小时）60毫米细胞培养皿和75 cm 2的组织培养瓶，板500,000细胞（60毫米的菜）或2亿个细胞（75 平方厘米瓶）。
- 轻轻加入2毫升（每孔，在6孔皿25毫米盖玻片），将3ml（60毫米培养皿）或10毫升（75cm 2的培养瓶中）温暖生长培养基到每个孔中。孵育细胞过夜，第二天早晨改变介质完全。然后更换培养基隔日（3天，5天，7天等 ）。
没有TE：鼠混合胶质文化准备24用于免疫细胞化学或生化 - 电镀后的48小时。
- 相同于第4.3.1至4.3.6描述新生大鼠大脑的解剖，斩首与C57 / BL6背景P0新生儿WT和NCAM KO小鼠，取出大脑并把他们在冰冷的解剖中（ 见表1）。置于冰上组织在任何时候。
- 分沿中线大脑成两个大脑半球，并随后切断嗅球，大脑皮质下面基底节和杜蒙钳海马。将含有冰的HBSS一个干净的培养皿中分离出大脑皮层。
- 采取一皮层。用解剖显微镜下精提示镊子取出脑膜。用剩下的皮质重复。将所有无脑膜，皮层成冰，干净漂亮的培养皿。
- 转移皮质hemisphe资源用1毫升吸管从每个鼠标变成独立的，无菌的15毫升管。 1.2毫升冰冷解剖培养基添加到每个脑和吹打其2倍上下用1毫升枪头机械破坏脑组织。
- 添加150微升的木瓜蛋白酶溶液（在PBS中的10毫克/毫升），加入100μlDNA酶I溶液（1毫克/毫升在HBSS）和50微升用MgSO 4（在HBSS 3.82％），以每脑和由手指轻弹混合。
- 温育30分钟的脑悬浮液在37ºC水浴并混合大脑混悬液通过手指轻弹每个第二分钟。加入1 ml FBS每个管，混合和降温组织悬液在冰上10分钟。
- 降速脑组织为4分钟，在200 xg离心，4ºC并在1毫升冰冷的解剖缓冲液补充有的DNA酶I溶液70微升（1毫克/毫升在HBSS）和30微升悬浮组织沉淀硫酸镁溶液（在HBSS 3.82％）。
- 涂覆FBS磨碎使用脑组织1毫升枪头（〜5次），直至上清液变得混浊。通过40微米的细胞过滤网通过上清液并转移到一个干净的试管在冰上。
- 通过离心颗粒混合神经胶质细胞5分钟，在200 XG，4ºC。吸去上清液直至〜100μl的培养基中留在细胞沉淀的顶部。通过手指轻弹（〜5倍），并添加1毫升温小鼠生长培养基悬浮细胞沉淀（ 见表1）。
- 或者，可见溶解细胞簇和裂解细胞轻轻吹打细胞悬液上下（五次）/沉淀DNA。
- 4.3.21 - 按照步骤4.3.19中描述的PDL涂层的盖玻片或60毫米培养皿板鼠标混合神经胶质细胞。洗涤细胞，第二天早上用温水鼠标生长培养基，随后每隔一天。鼠标混合神经胶质准备用于免疫48 - 电镀后72小时。
- 文化鼠混合神经胶质细胞在生长培养基中75cm 2的组织培养瓶（ 见表1）为10天。抖落从混合胶质细胞培养物的小神经胶质细胞簇上以140rpm 1小时细胞培养孵育箱（5％CO 2，37℃）内的旋转振动筛。
- 从混合胶质细胞培养物脱去含胶质的上清液，通过它通过一个40微米的细胞过滤网，并保持细胞悬浮在无菌50ml试管。
注：小胶质细胞培养通常> 95％纯度这一步骤少污染的OPC很少星形胶质细胞。 - 或者，对混合神经胶质细胞培养为未来的小胶质细胞摇取舍更换生长培养基。通常从混合胶质细胞培养进行多次小胶质换血权衡（每周一次）。
- 任选地，获得纯度较高的95％板10毫升每100mm培养皿中含小胶质细胞的上清液（步骤4.5.2）中，并在37ºC在细胞培养培养箱温育30分钟。只有microgl执行机构将附加到培养皿中，而星形胶质细胞和OPCs的留在上清液中。
- 轻轻顺时针和逆时针方向摇动培养皿中在细胞培养罩（各5次）。抽吸细胞培养基完全并用10毫升生长培养基替换。导致小胶质细胞培养物> 98％。
- 长达7天的DMEM培养小胶质细胞补充有1％FBS和1％青霉素/链霉素。
- 以获得高度富集的OPC培养物在75cm 2的培养瓶中生长在以140rpm 1小时细胞培养孵育箱（5％CO 2，37℃）内的旋转摇床10天旧混合胶质细胞培养第一抖落小神经胶质细胞。丢弃的小胶质细胞只含有上清或使用特定的小胶质细胞实验（见步骤5.5）。
- 更换用10毫升生长培养基含有小胶质细胞上清抖落混合胶质细胞培养另一个18小时上以200rpm（5％CO 2，37℃）的旋转振动筛。
- 收集从混合胶质培养物中microglia-和含有OPC的上清液并通过一个40微米的细胞滤网。收集在无菌的50ml试管中的细胞悬浮液。
- 或者，对混合神经胶质细胞培养为未来的OPC换血取舍更换生长培养基。
注意：OPCs的继续增殖上星形细胞饲养层，并且可以摇动区切换的第二和第三次（每周一次），尽管具有较低的产率。 - 板10毫升microglia-和含有OPC-上清液入100 25mm培养皿中并在37ºC在细胞培养培养箱温育30分钟的。小胶质细胞将附着在培养皿中，同时OPCs的和星形胶质细胞留在上清液中。
- 轻轻顺时针和逆时针方向摇动培养皿中在细胞培养罩（各5次）。从细胞培养孵化时间拿出仅有少数培养皿（小神经胶质细胞将开始从宠物撞出当冷却器中剧烈摇动里的菜）。
- 收集并在50毫升试管结合含OPC-上清液。或者，培养基添加到培养皿在特定小胶质细胞实验。
- 任选地，进一步增加OPC培养物的纯度，重复步骤5.6.5和5.6.6一旦用新鲜的培养皿，以降低在OPC制剂小胶质细胞的程度。
- 降速离心机中含有丰富OPC-上清液5分钟，在250 XG，4ºC。轻轻吸出上清液，而不会干扰细胞沉淀。离开3毫升上沉淀顶部的上清液，并开始重新悬浮通过手指轻弹（10次）的OPCs。
- （ - 10次5）通过使用一个10毫升吸管轻轻磨碎的OPC细胞簇。
- 计数细胞并在6孔培养皿中400微升生长培养基的水坑板每25mm玻璃盖玻片（PDL被覆）50,000 OPCs的，并让细胞在细胞培养孵化器连接30分钟（5％CO 2，376; C）。轻轻加入2毫升温增殖培养基（ 见表1）至各孔。对于PDL涂层60毫米细胞培养皿，板1 - 150万的OPC 3毫升增殖培养基中。
- 仔细替换包含FBS-增殖培养基用新鲜增殖培养基3小时电镀后的OPC（附做出正确确定的OPC，换液时不会移位）。交换介质每隔一天。
注：鼠OPC培养使用该协议通常是纯小胶质细胞与作为主要污染类型的细胞，其次是星形胶质细胞90％的准备。
5.免疫细胞化学原发性神经胶质细胞使用HIgM12
- 使用HIgM12，抗PSA单克隆抗体，以及细胞类型来自WT和NCAM KO小鼠在原发性胶质细胞特异标记三重标签免疫
- 在活细胞的条件下，标签60％汇合鼠标混合胶质细胞培养从生长在PDL涂层WT和NCAM KO小鼠与HIgM12（10微克/ ml）和抗PSA单克隆抗体（克隆2-2B）（10微克/毫升）的PBS25毫米盖玻片补充有10％FBS的在4ºC30分钟。
- 洗涤细胞三次，持续20秒各用冰 - 冷PBS补充有10％FBS和用在PBS中的4％多聚甲醛，pH 7.4的固定在25ºC15分钟。
- 洗固定细胞两次，持续1分钟每用PBS补充有10％FBS和25ºC透用0.1％的Triton-X100的PBS，pH 7.4的细胞2分钟。洗涤细胞两次，持续1分钟，并与神经胶质标记物GFAP（胶质细胞）或在PBS中的IBA-1（小胶质细胞）（1微克/毫升）的标签在冷室补充有10％FBS的过夜，在4ºC。
- 与标准的免疫状况，包括含DAPI安装媒体31进行。
注意：使用荧光标记的Fab 2片段作为人类第二抗体（HIgM12）和鼠标（抗PSA单克隆抗体，克隆2 - 2B）的IgM强烈推荐。 - 以佛罗里达州在60X或放大100倍的图像uorescent。请对所有图像和处理图像相同的同一台仪器的设置。
- 使用HIgM12作为一次抗体ENDO-NF处理的WT神经胶质细胞的免疫荧光标记
- 在的Neurobasal一个生长3天培养的WT小鼠混合胶质细胞补充有上涂覆PDL25毫米盖玻片10％FBS和B27添加物（1:50）。 ENDO-NF（30微克/毫升）添加到1ml培养基，并在细胞培养培养箱孵育过夜（37℃，5％CO 2）。
- 标签细胞生活在寒冷HIgM12和固定和透后内部星形细胞标志物GFAP如步骤5.1.1 5.1.5。在60X或放大100倍的取荧光图像。使用相同的仪器设置为所有图像和相同处理。
Representative Results
此部分示出了可以通过在中枢神经系统研究人类IgM特异性的PSA抗原而获得的结果的例子。使用含有生化设置，并通过荧光免疫细胞化学具体Vκ轻链人IgM的抗体的被示出。
HIgM12从脑脑裂解物免疫沉淀的抗原，并在Western印迹用作检测试剂（初级抗体）。既不同种型对照抗体也不琼脂糖大号珠免疫沉淀的类似抗原，这表明拉下（ 图1）的特异性。使用来自WT和NCAM KO小鼠的CNS裂解物的Western印迹证明的HIgM12结合到NCAM含有的PSA（ 图2A）的特异性。使用ENDO-NF来自WT小鼠的CNS组织的酶消化标识连接到NCAM作为HIgM12该特异性结合的表位（ 图2B的PSA）。使用本文概述的方法，获得高纯度的IBA-1阳性的大鼠小胶质细胞培养物（ 图3）。市售抗PSA抗体（克隆2-2B）不标记细胞表面或内部的PSA池在固定和荧光显微镜透IBA-1-阳性神经胶质细胞。与先前公布的文献，它报告PSA-NCAM的小胶质细胞16,41无细胞表面表达HIgM12不标注在纯化的大鼠小胶质细胞表面抗原是一致的。有趣的是，固定和透化的小胶质细胞的结果在胞内，核周图案不限于特定的细胞器（ 图3）HIgM12标签。结果是在对比用抗PSA IgG抗体（克隆735）26，它在高尔基41的水平定位的PSA SynCAM在小胶质细胞获得的那些。
在对比小胶质细胞，HIgM12并在活细胞条件下（ 图4）根据高度浓缩的大鼠OPC文化A2B5靶细胞表面抗原。 OPC培养物含有〜5％的污染小神经胶质细胞。 图5示出了几乎相同的细胞表面染色HIgM12和抗PSA单克隆抗体（克隆2-2B）之间在GFAP阳性的星形胶质细胞图案（ 图5A）。 ENDO-NF-消化WT星形胶质细胞的免疫荧光标记相比使用HIgM12演示星形细胞的PSA（ 图5B）的存在下进行缓冲控制处理的WT星形胶质细胞。 体内的PSA阳性的星形胶质细胞的存在下仍有待证实。
图1：HIgM12作为“下拉”使用HIgM12从三个月大的老鼠的大脑总裂解剂免疫沉淀在免疫沉淀，人同种型控制HIgM。126或琼脂糖珠大号只为“下拉”代理商。洗脱的蛋白质在蛋白质印迹与探测针对HIgM12膜运行。从HIgM12包被的珠子洗脱蛋白的分子量为160的范围 - 200 kDa的除的IgM重链（〜65 - 73 kDa）的。这个数字已经从J.修改神经化学 15。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：HIgM12目标聚唾液酸（PSA）模块上的NCAM。从P7，P13，P16和P27 NCAM A.脑组织匀浆总KO小鼠和杂同窝对照西方印迹探测与对抗HIgM12，PSA和β-actin为内参膜运行。
图3：粘合剂对大鼠小胶质细胞的缺失是由HIgM12标记的缺失镜像大鼠小胶质细胞培养48小时的聚-D-赖氨酸涂覆的玻璃盖玻片上，要么标记活在冰上用HIgM12或HIgM12或抗固定后。 -Psa单抗（克隆2-2B）。细胞ŧriple标有小胶质细胞标记IBA-1（绿色），HIgM12 / PSA（红色）和DAPI（蓝色）。图像显示缺乏小胶质细胞表面用HIgM12（上部行）的结合和缺乏抗PSA的（克隆2-2B）结合在大鼠原代小神经胶质细胞（下排）的细胞表面和内部的商店。根据双极形态学和不存在的IBA-1染色的，小的PSA阳性细胞（下排）中的建议是一个OPC。在固定细胞，HIgM12染色导致，这不是仅限于特定的细胞器，被认为是非特异性结合（中间行）一个punctated，核周格局。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：HIgM12 瞄准细胞表面PSA-NCAM对大鼠的OPC鼠的OPC和小胶质细胞文化前进。红4天中增殖培养基上的聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片和三活标记在冰上用HIgM12或A2B5（绿色），内部的巨噬细胞/单核细胞标记物CD68（克隆ED-1）（红色）和DAPI（蓝色） 。图像显示细胞群体对于OPC标记A2B5（上部行）和HIgM12（下排）很少的CD68阳性的小胶质细胞（〜5％）majorly阳性。加入相衬图像DAPI揭示每个群细胞的完整性和手机号码。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：HIgM12 和抗PSA单克隆抗体共标记小鼠混合胶质的星形细胞亚群。从WT和NCAM A.鼠标混合神经胶质细胞含有总星形胶质细胞，少突胶质细胞系细胞和微克KO动物LIA分别培养3天，用HIgM12（绿色），抗PSA单克隆抗体（克隆2-2B）（红色），并随后对星形细胞标志物GFAP（紫色）和DAPI（蓝色）活标记在冰上。 HIgM12和抗PSA揭示GFAP阳性星形胶质细胞WT虚拟相同的染色模式，但缺乏约束力，从NCAM KO小鼠星形胶质细胞。这个数字已经从J.修改答：根据描述，并与endoneuraminidase-NF（由玛蒂娜Muehlenhoff博士友情提供）或PBS对照处理过夜神经化学杂志 15。B.混合胶质细胞进行培养相同。细胞活标记在冰上用HIgM12（绿色），随后染色内部标记物GFAP（红色）和DAPI（蓝色）。 HIgM12目标在PBS控制细胞表面抗原处理混合胶质细胞培养而不是endoneuraminidase-NF处理混合胶质。这个数字已经从16 JNSCI修改。 PL轻松点击此处查看该图的放大版本。
所有图像都使用相同的仪器设置在60倍和采取相同的处理。
表1：缓冲和解决方案食谱 ，请点击此处下载此表。
| CNS组织 | ENDO-NF / PBS | 裂解缓冲液 | 总成交量 | |
| 1.鼠标WT | 67微克（0.45微升） | 2微升（12微克）ENDO-NF | 7.55微升 | 10微升 |
| 2. WT鼠标 | 67微克（0.45微升） | 2微升PBS | 7.55微升 | 10微升 |
| 3. WT鼠标 | 67微克（0.45微升） | 没有PBS或ENDO-NF | 9.55微升 | 10微升 |
| 4. NCAM KO鼠标 | 67微克（0.45微升） | 2微升（12微克）ENDO-NF | 7.55微升 | 10微升 |
| 5. NCAM KO鼠标 | 67微克（0.45微升） | 2微升PBS | 7.55微升 | 10微升 |
| 6. NCAM KO鼠标 | 67微克（0.45微升） | 没有PBS或ENDO-NF | 9.55微升 | 10微升 |
表2：P7 WT和NCAM KO小鼠中枢神经系统组织的ENDO-NF消化。
Discussion
人天然IgM抗体正在呼吁免疫疗法的候选人，并已显示出对各种疾病的治疗包括癌症和中枢神经系统疾病1-7治疗潜力。有利的是，这些抗体不会引起免疫反应，其中的中和抗体的产生显着减少的有效治疗剂量和疗效。重要的是，具有治疗潜力的所有抗体一直是IgM同种型的并且属于NAB剧目3-5,8,9,37,40,42-45。为潜在的临床应用的IgM抗体的一个主要障碍是其抗原，它们在许多情况下，未确定的识别。对于IgG抗体采用标准技术通常并不适用于识别的IgM的抗原。
这个协议描述PSA-NCAM的识别作为抗原的再生人IgM抗体HIgM12，有效的动物模型MS的和ALS 15-18。所采用的方法主要适用于特定Vκ轻链VκI，VκIII和VκIV和鼠标与抗体轻VκI所有连锁人类抗体，而不论该抗体的同种型。
在这个协议中最关键的一步是在亲和层析应用中使用IgM抗体。更具体地，需要成功的抗体作为下拉剂免疫沉淀来分离或富集抗原出复杂的组织或细胞培养裂解物。富集抗原馏分可以进行比较，以从同种型对照抗体免疫沉淀，并随后分析通过质谱法的差异。一个基本要求或该步骤的限制是正确的抗体Vκ轻链和主机（人，小鼠）的存在下，使抗体结合到蛋白L琼脂糖。结合到琼脂糖甘露聚糖结合蛋白的用途（也卡勒Ð甘露糖结合凝集素），而不是蛋白质L琼脂糖是免疫沉淀的IgM没有具体Vκ轻链的潜在替代。然而，如由阿诺德等人 35所述，结合抗原的IgM抗体不结合甘露聚糖结合蛋白，作为目标聚糖似乎变得不可访问一旦IgM抗体已结合至其抗原。基于这些发现甘露聚糖结合蛋白，不能使用作为结合基质免疫沉淀负载抗原的IgM的分子35。其他潜在的替代品可能是利用二次琼脂糖结合的抗IgM IgG抗体46,47或使用表面活化磁珠48。针对的IgM IgG抗体可能是化学交联琼脂糖A或琼脂糖的G以与感兴趣的抗原一起减少洗脱抗体的程度。 IgM抗体免疫沉淀的不同种类之间的适当的比较就成功识别抗原的我因为大多数免疫沉淀进行隔离或耗尽的IgM没有在他们的抗原进一步加息很难。此外，使用的IgM免疫沉淀主要用来确认用抗体暴露于纯化的抗原49的已知的或预期的单一抗原。相比于原料50时免疫沉淀血清的IgM分子- （15％10）针对人的IgM琼脂糖偶联的IgG的一个缺点是一个非常低的产率。与此相反，表面活化磁珠成功地应用于不同的同种型包括IgM免疫沉淀瘙痒相关纤维48的抗体。此方法并不限于特定卡伯（Vκ）或lambda（λ）链或特定宿主，并且可以基本上扩大在免疫沉淀中使用IgM抗体的频谱。
在协议中的另一个重要步骤是该抗体的以用作DET能力阿拉斯在Western印迹或其他筛选平台抗体（初级抗体）。成功的抗体必须定位它们的抗原以足够高的亲和力，以允许抗原在非离子型或可能离子洗涤剂的存在下的结合。高亲和力抗体是亲和熟化IgG抗体中常见，但在IgM同种型，这就是为什么有相对少的市售IgM抗体作为生化设置检测剂的原因之一的抗体中不常见的。高亲和力抗体的结合是对分子的抗原的免疫沉淀反应和Western印迹的一个要求。降低洗涤剂浓度或完全不存在于IP缓冲液和裂解缓冲液的洗涤剂允许抗原通过其的Fab结构域由低亲和力抗体定位。相反，抗体的经由其Fc部分靶向蛋白L琼脂糖能力基本上不同种型对照中受影响的范围内不同的洗涤剂concen的trations。然而，在裂解缓冲液和IP缓冲器低洗涤剂浓度防止细胞膜破坏和特定分子的分离。同样地，在Western印迹洗涤缓冲液低洗涤剂浓度（ 例如，PBS-T）允许抗原低亲和力抗体的结合，但在同一时间增加的非特异性结合，因此不是一种选择。
抗原蛋白质核的存在是该方法的另一要求。用翻译后修饰（ 例如 ，糖蛋白，脂蛋白）和未修饰的蛋白质，但并非唯一的脂质或碳水化合物的蛋白质，是在Western印迹检测到。这是不可能的，以免疫沉淀从组织或细胞裂解物的脂质（ 例如，鞘脂）在洗涤剂中的存在或不存在。洗涤剂和脂质的物理化学性质是太相似，以允许选择性脂质 - 抗体相互作用，而在同一时间清净剂是必不可少的扰乱为了膜可以允许特定分子的选择性分离。据我们所知，免疫沉淀仅仅包括碳水化合物，在不存在的蛋白质核心的，还没有被报道。因为IgM抗体频繁目标碳水化合物和糖脂，这是没有必然联系的蛋白质单元这一点变得尤其重要。其他色谱技术都需要分离和免疫学鉴定脂质和碳水化合物在没有蛋白质核的。例如，在TLC板（免疫TLC）与随后抗体检测细胞脂质的薄层色谱法（TLC）可以实现51,52。
其他抗PSA抗体已在以往的研究和结果进行了描述比较了HIgM12以及市售抗PSA的IgM（克隆2-2B）。在PSA领域中最常用的抗体可作为小鼠monoc IgG抗体（克隆735）lonal或兔多克隆抗体53。此抗PSA IgG抗体检测的PSA上SynCAM和NCAM上不同的CNS细胞类型，包括小胶质细胞41。与此相反的抗PSA IgG抗体，人IgM抗体HIgM12，HIgM42和抗PSA小鼠IgM（克隆2-2B）无法定位到SynCAM PSA（但NCAM）在小鼠各种胚胎和出生后早期阶段，非唾液酸SynCAM是容易检测15。所使用的IgM抗体也不能检测在小神经胶质细胞（ 图3 + 4）的PSA。相比具有潜在的较低的亲和力相比，抗PSA抗体的IgM抗体的结合组合PSA-NCAM水平抗体同种型之间观察到的差异的可能解释可以是低的PSA SynCAM水平。为了检验这一假设，我们与大量SynCAM目前的执行中NCAM KO动物免疫沉淀在胚胎阶段E17和使用HIgM12作为“下拉代理”<SUP> 15。在E17 WT同窝控件HIgM12免疫沉淀PSA-NCAM到的程度，即显示出的“拉下”PSA-NCAM相比通过使用洗脱抗原随后印迹光密度检测出的的IgM重链相似的强度。这一结果表明，至少HIgM12有足够的亲和力，它的目标PSA。在对比WT同窝控制HIgM12没有检测附着到SynCAM在NCAM KO动物的PSA。相同的结果是使用人类抗PSA的IgM HIgM42在免疫沉淀得到的。 HIgM12和HIgM42，以及小鼠抗 - PSA IgM抗体（克隆2-2B）无法定位在胚胎和出生后的发育阶段从WT和NCAM KO动物印迹上SynCAM粘合剂。定所需HIgM12的低量（0.1微克/毫升），以特异性检测附着到NCAM在使用少量CNS组织（每孔0.1微克CNS组织）的Western印迹的PSA 15这似乎是不可能的，低亲和力单独是负责三种不同的方法完全缺乏PSA-SynCAM检测由HIgM12。
我们的结论是有抗PSA IgM抗体和频频发布抗PSA IgG抗体（克隆735）之间的显著差异。为什么市售抗PSA IgM抗体未在过去更频繁地使用，以确认与antiPSA IgG抗体735所获得的结果，因为HIgM12已经在不同的疾病模型已经证明效力，这是特别有趣的，目前尚不清楚。而其它抗PSA IgM抗体可以具有类似的治疗效果仍然不清楚的抗PSA IgG抗体（克隆735）是否具有在MS和ALS模型类似的治疗效果。
简言之，此处所描述的方法主要被用于识别再生人抗体HIgM12的抗原，以支持用于MS的潜在的临床试验和其他可能的神经变性疾病。蚁的识别为具有生物活性的抗体igens是了解其作用机理是必不可少的步骤。这成为在目前正在为在人体试验安全性和有效性进行测试大量的单克隆抗体的情况下特别相关。而临床测试IgM抗体迄今为止的数目是小的，最近在杂交瘤技术，越来越多的研究突出该抗体类1-10,37,40,42-45的治疗潜力一起进步促使新的或开发改性方法适用于鉴定非蛋白质的IgM抗原。
Acknowledgments
这项工作是由卫生（R01 GM092993，R01 NS048357和R21 NS073684）全国学院的资金支持，美国国家科学基金会（CAREER奖），明尼苏达州合作奖的生物技术和医学基因组学，国家多发性硬化症协会（CA1060A）和梅奥诊所中心的临床和转化科学（CCATS）。作者承认从阿普尔鲍姆，希尔顿，彼得森和桑福德基金会，月球和玛丽莲公园出任董事基金和McNeilus家人的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
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