Introduction
Antistoffer af IgM-isotypen demonstrere stort terapeutisk potentiale til behandling af forskellige sygdomme, herunder cancer og CNS-lidelser 1-7. Den Vollmers 'gruppe identificeret talrige antistoffer i cancerpatienter til potentiel anvendelse som tumorspecifikke biomarkører eller aktive terapeutiske midler, der er i stand til at dræbe maligne celler ved at inducere apoptotiske veje 4,8,9. Interessant, alle identificerede antistoffer med terapeutisk potentiale er af IgM-isotypen og tilhører gruppen af "naturlige autoantistoffer" (NABS).
Tilsvarende Rodriguez gruppe identificeret muse og humane antistoffer, der stimulerer remyelinering i kronisk demyeliniserede rygmarvslæsioner i modeller for dissemineret sklerose (MS). Identisk med antistoffer med anti-cancer effekt, alle remyelinering-fremmende antistoffer er NABS og IgM-isotypen 1,6,7,10. De præcise antigener til de fleste identificerede IgM'er stadig undetermined herunder den menneskelige remyelinisering-fremmende antistof rHIgM22, i øjeblikket i kliniske fase I forsøg for MS-patienter 11. Trods gentagne bestræbelser fra eksperter på området af lipid og kulhydrat forskning både i akademisk miljø og i partnerskab med industrien 11, forsøger at identificere rHIgM22 s antigen har ikke været en succes. Den manglende af standard teknikker, der anvendes til at identificere antigener af IgG antistoffer til at arbejde med IgM-antistoffer identificerer et kritisk behov for at forfine metoder er specifikke for disse antistoffer at de fleste sandsynligvis mål kulhydrat eller lipid antigener.
Fokus i dette manuskript er den menneskelige regenerativ antistof HIgM12 og de eksperimentelle procedurer, der anvendes til at identificere sin antigen. Antistof HIgM12 blev identificeret fra patienter med Waldenströms makroglobulinæmi, stimulerer neuritudvækst in vitro 12-14 og henvender polysialic syre (PSA) er fastgjort til den neurale celleadhæsionsmolekyle (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 forlænger levetid i en musemodel af ALS 17 og forbedrer funktionelt udfald i Theiler s murine encephalomyelitis virus (TMEV) -inficerede mus. Konkret HIgM12 stimulerer spontan horisontal og vertikal motorisk aktivitet i kronisk demyeliniserede mus og øger antallet af små og mellemstore diameter rygmarv axoner otte uger efter en enkelt, lav dosis af intraperitoneal injicerede antistof 18.
Det neurale celleadhæsionsmolekyle (NCAM) er et glycoprotein af immunglobulin (Ig) superfamilien udtrykkes på celleoverfladen af neuroner, glia, skeletmuskel, og naturlige dræberceller 19-25. De tre store NCAM isoformer betegnes NCAM180, NCAM140, og NCAM120, er alternative splejsning varianter af en primær afskrift, der varierer kun i deres cytoplasmatiske domæne. I CNS, NCAM er den største polysialylated molekyle (> 95%) med lange, negativt ladede sialinsyrereceptorer homopolymerer. Polysialic encid med n> 10 betegnes PSA men findes kortere oligomere strukturer, der også er biologisk relevant. Andre polysialylated proteiner udtrykt i CNS er SynCAM1 26, neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 og en natriumkanal-subunit 25 (for en oversigt se 29).
De her beskrevne metoder tillader antigen identifikation for humane og murine immunglobuliner indeholder bestemte kappa (VK) lette kæder (VκI, VκIII eller VκIV lette kæder for humane antistoffer og VκI lette kæder til muse-antistoffer) uanset antistof isotype (fx IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denne begrænsning er baseret på anvendelse af protein L-agarose for immunfældninger med antistoffer af IgM-isotypen. Alternative strategier kan omfatte mannose-bindende lectiner og sekundære IgG-anti-IgM-antistoffer kovalent bundet til agaroseperler, som kan udvide anvendeligheden af denne fremgangsmåde til flere IgM-antistoffer including dem med lambda (λ) lette kæder (se diskussionen). Forhold mellem serum IgM VK lette kæder sammenlignet med IgM λ lette kæder afledt fra raske personer er 1,5: 1 30.
Baseret på den kromatografiske metode bruges her til at adskille, berige og immunologisk påviser visse molekyler 31, er alle antigener skal omfatte mindst én lille proteindomæne. Antistoffets specifikke binding epitop kan være inden for eller uden for proteinet domæne (f.eks, i glycoproteiner, lipoproteiner). Indledende biokemiske trin, der anvendes til at identificere det specifikke antigen til HIgM12, respektive at indsnævre listen over potentielle kandidater, er de mest afgørende skridt i denne metode. Cell typespecifikke præparater og cellemorfologi-baserede karakteriseringer er beskrevet for gliaceller, men denne metode kan ekstrapoleres til at rumme andre celletyper inden for eller uden for CNS.
Der er et presserendenødt til at udvikle nye eller ændrede teknikker, der gælder for det stigende antal IgM-antistoffer med terapeutisk potentiale for forskellige menneskelige lidelser især i de tilfælde (de fleste af IgM antigener), hvor antistof mål er kulhydrat eller lipid strukturer.
Protocol
Animal protokoller og procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og godkendt af Mayo Clinic institutionelle dyr pleje og brug udvalg (Mayo IACUC protokol nummer # A51912).
1. Generelt CNS Tissue Forberedelse
- Generere NCAM deficient (KO) mus på C57 / BL6 baggrund (venligst tilvejebragt af Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygote NCAM mus og vildtype (WT) kuld (C57 / BL6) ved at krydse heterozygoter. Genotypebestemmelse af NCAM KO mus er tidligere blevet beskrevet 32-34 og vil ikke blive forklaret nærmere.
Bemærk: Trin 1,2-1,6 er valgfrie.
- Forud for operationen, administrere en pentobarbital løsning (Lager: 25 mg / ml; 50/100 pi pentobarbital for tidlige postnatale respektive voksne stadier) via intraperitoneal injektion (27 gauge nål og 1 mlsprøjte).
- Vent i 2 min, eller indtil dyret har nået et kirurgisk plan anæstesi. Administrer yderligere bedøvelse som nødvendigt i løbet af hver operation for at opretholde en kirurgisk plan anæstesi. Brug toe pinch-respons metode til at bestemme dybden af bedøvelse. Dyrene skal være afvisende, før du fortsætter.
- Lav en 0,5 - 1 cm lateral incision gennem integument og bugvæggen lige under brystkassen. Omhyggeligt adskille leveren fra mellemgulvet. Lave et lille snit i membranen ved hjælp af en buet, stump saks. Fortsæt mellemgulvet snit langs hele længden af ribben bur for at blotlægge pleurahulen.
- Placer buede, stumpe saks langs den ene side af brystkassen, omhyggeligt forskyde lungerne, og lave et snit gennem brystkassen op til kravebenet. Lave en lignende snit på den kontralaterale side. Løft brystbenet væk, omhyggeligt trimme enhver væv tilslutte den til hjertet.
- Lave et snit til dyret'S højre atrium ved hjælp iris saks til at skabe så stor en stikkontakt som muligt. Injicer langsomt 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS) ind i dyrets venstre ventrikel (lys rød; strømningshastighed: 1 ml / min) ved anvendelse af en 10 ml sprøjte udstyret med 27-gauge nål. Må ikke øge presset / PBS flow under perfusion at undgå ødelagt væv.
- Halshugge neonatale mus ved anvendelse af kirurgiske sakse.
- Fjern hjernen ved at tage fat øjenhulerne med en pincet og ved at indsætte en lille saks i rygsøjlen. Skær kraniet mod fronten i ørehøjde. Peel tilbage kraniet og anbring forsigtigt hjernen til en 60 mm petriskål fyldes med 10 ml iskold dissekere medium på is (tabel 1). Placer hver hjerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og straks gemme på tøris (-79 ºC).
- Incise cerebellum og hjernestamme fra frosne hjerner under anvendelse af en ren barberblad på is. Arbejde hurtigt for at undgå optøning af vævet.
- Vejfrosne cerebrum, sat i et 15 ml rør på is, og der tilsættes iskold lysepuffer (se tabel 1) til en slutkoncentration på 150 ug hjernevæv pr pi lysisbuffer. Gentag for resterende cerebra. Hold hjerner på is på alle tidspunkter for trin 1.9 - 1.11.
- Homogenisere hjerner i lysepuffer ved triturering gennem en 1 ml pipettespids (10 gange) efterfulgt af triturering gennem en 5 ml sprøjte udstyret med 27-gauge nål (10 gange). Inkuber hjerne lysater i yderligere 30 minutter på is for at tillade fuldstændig væv lysis.
- Fjern detergent-uopløseligt materiale og hjemelipider via seriel centrifugering (fire runder på 19.000 xg i 10 min ved 4 ° C). Discard (hvid) myelin og cellerester indeholdende pellet men bevarer supernatanten efter hvert centrifugeringstrin. Alikvote hjerne lysater og opbevares ved -80 ºC.
2. Immunopræcipitationer Brug Menneskelig IgM'er (HIgM12 og isotypekontrol IgM) som en "Pull-down" Agent fra Cerebral Lysater af WT og NCAM KO-mus
- Protein L agaroseperle Fremstilling 9,35,36
- Forbered 200 ml IP puffer herunder BSA (se tabel 1). Forbered yderligere 200 ml af det samme IP uden BSA.
- Pr immunoprecipitation reaktion transfer 100 pi Protein L Agarose opslæmning under anvendelse af en 200 pi pipette til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Må ikke vortex protein L agaroseperler! Der tilsættes 1 ml IP puffer (se tabel 1) til hvert rør. Bland Protein L-agarose og IP puffer manuelt gennem inversion (fem gange).
- Vask protein L agaroseperler fire gange ved centrifugering i en bordcentrifuge (1000 xg 2 min, 25 ºC). Tag supernatant ved hjælp af en 200 pi pipette uden at forstyrre agarose pellet. Gentag vask trin 2.1.2 til 2.1.3 yderligere tre gange.
- Ækvilibrering protein L agarose i 1 ml frisk tilsat IP puffer på en valse natten over ved 4 * C.
- Antistof-antigen-agarose L Complex Dannelse og Antigen Detection i Western blots
- Inkuber 30 mg lyseret hjernevæv (~ 200 pi lysat) i 1 ml iskold IP buffer med 20 ug IgM antistof (HIgM12) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør natten over på en rulle ved 4 * C.
- Spin ned Protein L agaroseperler (fra trin 2.1.4) i en bordcentrifuge i 2 minutter ved 1.000 xg, 4 * C. Supernatanten kasseres under anvendelse af en 200 pi pipette uden at forstyrre agarose pellet. Tilsæt kølet antistof-hjerne lysat-opløsning (fra trin 2.2.1) til proteinet L agarose anvendelse af en 1 ml pipette.
- Inkubér antistof-antigen-protein L-agarose suspension i 2 timer på en rulle ved 4 * C. Vask antistof-antigen-komplekset bundet til agarose L gennem centrifugering ved 1.000 x g i 2 min, 4 ° C. kassere forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet og tilsættes 1 ml iskold IP buffer indeholdende 0,2% BSA.
- Gentag vasketrinet endnu en gang ved hjælp af iskold IP puffer indeholdende 0,2% BSA og yderligere to gange ved anvendelse iskold IP uden BSA.
- Spin ned antistof-antigen-kompleks bundet til agarose L ved 1.000 xg i 2 min, 4 ° C. Supernatanten kasseres helt først under anvendelse af en 200 pi pipette indtil ~ 50 pi opløsning efterlades på toppen af proteinet L agarose pellet efterfulgt af en 10 pi pipette. Hold prøver på is.
- Tilsæt 40 pi IP elueringspuffer (se tabel 1) pr 1,5 ml mikrocentrifugerør, finger flick rør 6 gange og der opvarmes i 5 minutter ved 95 ºC. Sæt prøver på is i 2 min og spin ned i 30 sek ved 13.000 xg, 4 ºC.
- Overfør supernatanten under anvendelse af en 10 pi pipette (~ 35 pi alt) i et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør uden at forstyrre pelleten. Bekræft fravær af Protein L agaroseperler ved at skylle ned en lille mængde eluerede prøve på rørets indervæg.
Bemærk: "Kornet"Protein L agaroseperler er klart synlige, hvis til stede. - Hvis protein L agaroseperler er til stede, spin ned prøve i yderligere 30 sekunder ved 13.000 xg og overføre supernatanten til at rense røret. Gentag trin, indtil der ikke agaroseperler er påviselige.
- Load 10 - 20 pi eluerede prøver per brønd på SDS-polyacrylamidgel i en Tris / glycin / SDS buffersystem (se tabel 1).
Bemærk: Brug 7,5% eller 4 - 20% gradient geler med 50 pi lastning volumen per brønd til påvisning af PSA-NCAM eller NCAM isoformer (gel dimensioner (B x L x tykkelse: 8.6 x 6.7 x 0.1 cm). - Kør geler til ~ 1 time ved 100 V (1,74 V / cm2) på benchtop. Yderligere køling er ikke påkrævet for dette trin 37,38.
- Overfør proteiner til PVDF (polyvinylidenfluorid) membran (porestørrelse 0,45 um) i 2,5 timer i kølerum ved 100 V (1,74 V / cm 2) under anvendelse af kold transfer buffer (5 - 10 ºC) (se tabel 1).
- Bloker membraner wed 10% (vægt / volumen) tørt mælkepulver i PBS-T i 1 time ved 25 * C på et benchtop orbitalryster, vaske membraner to gange i 10 minutter med PBS-T og proben natten over med primært antistof i 5% BSA i PBS T på en orbitalryster i det kolde rum.
- Den næste morgen vask membraner én gang kortvarigt med overskydende PBS-T ved 25 ºC (omfatter låg og beholder) efterfulgt af 3 vaske med PBS-T i 10 minutter hver på en orbitalryster (80 rpm) (alle vasketrin udføres ved 25 ºC).
- Tilføj sekundært antistof (peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-human anti-IgM-antistof (for HIgM12) (fortynding 1: 30.000) i 5% tørt mælkepulver i PBS-T i 1 time ved 25 ºC på en orbitalryster (70 rpm ).
- Vask membraner udførligt én gang kortvarigt med overskydende PBS-T ved 25 ºC (omfatter låg og beholder) efterfulgt af 3 vaske med PBS-T i 10 minutter hver på en orbitalryster (80 rpm) (alle vasketrin udføres ved 25 ºC) .
- Bland 1 ml afkølet forbedret chemiluminescence HRP substrat komponent A (udvidet luminol reagens) med 1 ml komponent B (Oxiderende reagens) (per mini blot) ved 25 ºC.
- Brug plastik pincet til at overføre membranerne på et stykke køkkenrulle for at fjerne overskydende væske (hold dem på selve kanterne). Tørre beholdere med papirservietter og sætte membraner tilbage i beholdere (én for hver membran). Umiddelbart tilsættes 2 ml af den forblandede forøget kemiluminescens HRP substrat (forbindelse A + B) (trin 2.2.16.) Til hver membran og inkuberes i 2 minutter ved 25 ºC på en orbitalryster (90 rpm). Sørg membraner er ensartet fugtet af kemiluminescens reagens.
- Overførsel membraner i en gennemsigtig plastik ærme og fjerne overskydende væske og luftbobler med køkkenrulle. Put membraner i plast muffe i en film kassette og til sidst tape plasthylster i kassetten. Luk kassetten.
- Tag kassetten, film, timer og saks i mørkekammeret. Skær øverste højre hjørne af hver film til orientering formål, udsætte (forskellige) film til forskellige perioder (10 sek, 1 min, 10 min) og udvikler film i en film udvikler.
3. Endoneuraminidase-NF Fordøjelse af PSA Vedhæftet NCAM 39
- Digest lyseret hjernevæv fra postnatal dag (P) 7 vægt mus og P7 NCAM KO-mus (fremstillet fra trin 1,12) i 2 timer på is under anvendelse endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) som illustreret i tabel 2 39.
- Tilsæt 5 pi 4x Laemmli prøvebuffer til hvert rør (1 - 6) fra trin 3.1 (tabel 2).
- Load prøver på en 4 - 20% gradient SDS-polyacrylamid gel og gentag trin 2.2.10 til 2.2.19. Probe-membraner med HIgM12 (1 ug / ml), kommercielt tilgængelig anti-PSA-mAb (klon 2-2b) (1 ug / ml) og β-actin-antistof (loading control) (1 ug / ml) i 5% BSA i PBS -T.
4. Fremstilling af rotte og mus CNS Cultures
- Syre-vask 25 mm dækglas i 1 M HCI ved 50 - 60 ° C i 4 - 16 timer i et stinkskab under anvendelse af en glasbeholder. Agitere dækglas lejlighedsvis gennem blid hvirvlende.
- Wash dækglas udførligt i destilleret vand (3x). Sørg for at vaske ud syren mellem stablede dækglas.
- Skyl dækglas i 100% ethanol og tør dem på Parafilm i en cellekultur hætte. En dag før brug, opvarmes dækglas i 24 timer i en glasbeholder med låg ved 100 * C i en ovn.
- Sætte dækglas i 6-brønds skål og pels med 3 ml 40 ug / ml poly-D-lysin i sterilt vand i 1 time ved 37 * C.
- Vask to gange med sterilt vand, tørre helt under celledyrkning hætte og anvende UV-lys i 20 min.
- Coat 60 mm cellekultur retter eller 75 cm2 vævskulturkolber med 3ml eller 10 ml af henholdsvis 40 ug / ml poly-D-lysin i sterilt vand i 1 time ved 37 * C.
- Vask to gange med vand, tørre helt under celledyrkning hætte og anvende UV-lys i 20 min.
- Bedøver neonatale rotter i IACUC godkendte gnaver eutanasi kammer med CO 2 gasforsyning (fuldt automatiseret). Brug toe pinch-respons metode til at bestemme dyrets passivitet. Halshugge neonatal Sprague Dawley rotte (P0P1) (6 - 10 unger ad gangen).
- Fjern hjernen ved at tage fat øjenhulerne med en pincet og ved at indsætte en lille saks i rygsøjlen. Skær kraniet mod fronten i ørehøjde. Peel tilbage kraniet og anbring forsigtigt hjernen til en 60 mm petriskål fyldes med 10 ml iskold dissekere medium på is (se tabel 1).
- Gentag for resterende rotteunger (6 - 10 PUP). Hold væv på is i trin 4.3.2 - 4.3.7. Opdel cerebrum langs midterlinien i to hjernehalvdele og efterfølgende afskåret olfaktoriske pærer, basalganglierne under hjernebarken og hippocampus med Dumont pincet. Placer isolerede cerebrale cortex i en ren petriskål indeholdende dissekere medium på is.
- Tag en cortex. Fjern meninges med pincet med fine tips under en dissektion mikroskop.
- Gentag med de resterende cortex. Læg alle meninges-fri cortex i en ren petriskål på is.
- Kombiner corticale hemisfærer fra alle hvalpe i en 60 mm petriskål og bruge en steril barberblad til tern hjernevæv i 1 mm hakket stykker.
- Overfør det hakkede hjernevæv under anvendelse af en 10 ml pipette i en steril, ikke belagt 500 ml glaskolbe og der tilsættes 10 ml iskold dissekere medium pr rottehjerne. Rotér forsigtigt kolben under tilsætning 1 ml trypsin-opløsning i HBSS (Hanks balancerede saltopløsning) (5 mg / ml trypsin) til 9 ml HBSS pr rottehjerne. Tilføj 2% Af det samlede volumen i DNase I-opløsning (1 mg / ml) og 2% af det samlede volumen i MgSO4-opløsning (3,82% MgSO4 i HBSS (vægt / volumen)) til hjernevæv suspension og bland forsigtigt.
- Trypsinisér væv under forsigtig rystning på en roterende ryster i 30 minutter ved 37 * C. Sørg vævsstykker er flydende under dette trin og sedimenterer ikke til bunden. Øge rotationshastigheden om nødvendigt.
- Tilføj føtalt bovint serum (FBS) til en slutkoncentration på 10% (v / v) og blandes ved omrystning af kolben 10 gange i 10 sek. Afkøle vævssuspension i isvand i 15 minutter. Swirl kolbe forsigtigt fem gange hver anden minut.
- overføre forsigtigt vævet suspensionen i sterile 50 ml rør anvendelse af 25 ml eller 50 ml pipetter og centrifugeres i 5 minutter ved 200 xg, 4 * C.
- Supernatanten kasseres og forsigtigt resuspender fordøjet CNS-væv i 15 ml iskold dissekere medium suppleret med 5 ml føtalt bovint serum, 0,4 ml MgSO4-opløsning (3,82%MgSO4 i HBSS) og 1,6 ml DNase I (1 mg / ml).
- Split vævssuspension ligeligt i to sterile 15 ml rør (~ 10 ml hver) og langsomt udriv anvendelse af en 10 ml pipette (10 gange), indtil suspensionen bliver uklar / mælkehvidt. Hold suspenderede celler på is under behandling af det næste rør. Vent i 3 min til resterende fordøjede CNS væv sediment på bunden af røret. Overfør supernatanten til at rense 50 ml rør uden at forstyrre pellet fraktion.
- Eventuelt passere uklare supernatanter gennem 40-mikrometer cellefilter og kombinere den resulterende enkelt cellesuspension i sterile 50 ml rør på is.
- Spin celleopslæmning i 5 minutter ved 200 xg, 4 * C.
- Fjern forsigtigt supernatanten under anvendelse af en 10 ml pipette, indtil ~ 2 ml dissekere medium efterlades på toppen af cellepelleten.
- Finger svirp cellepellets i 50 ml rør (~ 10 gange). Tilsæt langsomt 5 ml varmt vækstmedium (se tabel 1) til cellesuspensionen under forsigtighånd hvirvlende røret.
- Eventuelt gentage DNase trin 4.3.12 i yderligere 10 minutter på is med frisk DNase I-opløsningen og MgSO4-opløsning i tilfælde af synlige væv klynger eller DNA klumper. Swirl rør manuelt 5 gange hver anden minut.
- Plade 50.000 celler pr 25 mm dækglas i en pøl af 400 pi vækstmedium i en 6-brønds skål og lad celler binde i 30 minutter i en cellekultur inkubator (5% CO2, 37 ºC).
- For sammenflydende (i løbet af 24 - 48 timer efter udpladning) 60 mm celle dyrkningsskåle og 75 cm2 vævskulturkolber, plade 500.000 celler (60 mm skål) eller 2 millioner celler (75 cm2 kolber).
- Forsigtigt tilsættes 2 ml (per brønd, 25 mm dækglas i 6-brønds skål), 3 ml (60 mm skåle) eller 10 ml (75 cm2 kolber) af varm vækstmedium til hver brønd. Cellerne inkuberes natten over og ændre medium fuldstændigt næste morgen. Derefter ændre medium hver anden dag (dag 3, dag 5, dag 7, etc.).
Ingente: Rotte blandet glia kulturer er klar til brug til immuncytokemi eller biokemi 24-48 timer efter plating.
- Identisk med dissektion af neonatale rotter hjerner, der er beskrevet i afsnit 4.3.1 til 4.3.6, halshugge P0 neonatal WT og NCAM KO mus med C57 / BL6 baggrund, fjerne hjerner og sætte dem i iskoldt dissekere medium (se tabel 1). Holde væv på is hele tiden.
- Opdel cerebrum langs midterlinien i to hjernehalvdele og efterfølgende afskåret olfaktoriske pærer, basalganglierne under hjernebarken og hippocampus med Dumont pincet. Placer isolerede cerebrale cortex i en ren petriskål indeholdende HBSS på is.
- Tag en cortex. Fjern meninges med pincet med fine tips under en dissektion mikroskop. Gentag med de resterende cortex. Læg alle meninges-fri cortex i en ren petriskål på is.
- Overfør kortikal hemispheres med en ml pipette fra hver mus i separate, sterile 15 ml rør. Tilsæt 1,2 ml iskold dissekere medium til hver hjerne og mekanisk forstyrre hjernevæv ved pipettering det 2 gange op og ned med en 1 ml pipettespids.
- Tilsæt 150 pi papain-opløsning (10 mg / ml i PBS), 100 pi DNase I-opløsning (1 mg / ml i HBSS) og 50 pi MgSO4 (3,82% i HBSS) til hver hjerne og bland ved finger flicking.
- Inkubér hjernen suspensionen i 30 minutter ved 37 ºC i et vandbad og blandes hjerne suspensioner hvert andet minut ved finger flicking. Der tilsættes 1 ml FBS pr rør, blandes og køle ned vævssuspensionen i 10 minutter på is.
- Spin ned hjernevævet i 4 minutter ved 200 xg, 4 ºC og resuspender vævspellet i 1 ml iskold dissekere puffer suppleret med 70 pi DNase I-opløsning (1 mg / ml i HBSS) og 30 pi MgSO4-opløsning (3,82% i HBSS).
- Udriv hjernevæv under anvendelse af et FBS-coatet 1 ml pipettespids(~ 5 gange), indtil bundfaldet bliver uklar. Passere supernatanten gennem en 40-mikron cellefilter og overføres til et rent rør på is.
- Pelleter blandede gliaceller gennem centrifugering i 5 minutter ved 200 xg, 4 * C. Aspirer supernatanten indtil ~ 100 pi medium efterlades på toppen af cellepelleten. Resuspender cellepelleten ved finger flicking (~ 5 gange) og tilsæt 1 ml varm muse vækstmedium (se tabel 1).
- Eventuelt opløses synlige celleklynger og lyserede celler / præcipiteret DNA ved forsigtigt at pipettere cellesuspensionen op og ned (fem gange).
- Plate mus blandede gliaceller på PDL-belagt dækglas eller 60 mm skåle som beskrevet i trin 4.3.19 - 4.3.21. Vask cellerne næste morgen med varm mus vækstmedium og derefter hver anden dag. Mus blandet glia er klar til brug til immunocytokemi 48, - 72 timer efter udpladning.
- Kultur rotte blandetglia i 75 cm2 vævskulturkolber i vækstmedium (se tabel 1) i 10 dage. Ryst microgliale celleklynger fra blandede gliaceller kulturer efter tur rysteapparat i en cellekultur inkubator (5% CO2, 37 ºC) ved 140 rpm i 1 time.
- Tag mikroglia-holdige supernatant fra blandet glia kulturer, ledes gennem en 40-mikron cellefilter og holde cellesuspensionen i sterile 50 ml rør.
Bemærk: microgliale kulturer er typisk> 95% rent efter dette trin med få kontaminerende OPCs og meget få astrocytter. - Eventuelt udskifte vækstmedium på blandede glia kulturer til fremtidige microgliale shake-offs. Typisk udfør flere microgliale ryste-offs (en gang om ugen) fra blandede glial kulturer.
- Eventuelt at få renheder højere 95% plade 10 ml af mikroglia-holdige supernatant (trin 4.5.2) pr 100 mm petriskåle og inkuberes i en cellekultur inkubator i 30 minutter ved 37 * C. Kun microglIA vil tillægge petriskåle, mens astrocytter og OPCs forbliver i supernatanten.
- Ryst Petriskåle med og mod uret (fem gange hver) i cellekulturen hætte. Aspirer cellekulturmedium fuldstændigt og erstatte med 10 ml vækstmedium. Resulterende microglia kulturer er> 98% rent.
- Kultur mikroglia i op til 7 dage i DMEM suppleret med 1% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- At opnå højt beriget OPC kulturer ryste mikrogliaceller først fra 10 dage gamle blandede gliaceller kulturer dyrket i 75 cm2 kolber efter tur rysteapparat i en cellekultur inkubator (5% CO2, 37 ºC) ved 140 rpm i 1 time. Kassér mikroglia kun indeholdende supernatant eller brug for mikroglia-specifikke eksperimenter (se trin 5.5).
- Udskift mikroglial-holdige supernatant med 10 ml vækstmedium og ryste blandede gliale kulturer tilen anden 18 timer på en roterende ryster ved 200 rpm (5% CO2, 37 ºC).
- Saml microglia- og OPC-holdige supernatant fra blandede glia kulturer og passere gennem en 40-mikron celle si. Saml cellesuspensionen i sterile 50 ml rør.
- Eventuelt udskifte vækstmedium på blandede glia kulturer til fremtidige OPC shake-offs.
Bemærk: OPCs fortsat proliferere på astrocytiske fødelag og kan rystes-off en anden og tredje gang (en gang om ugen), om end med lavere udbytter. - Plade 10 ml af microglia- og OPC-holdige supernatant med 100 mm petriskåle og inkuberes i cellekultur inkubator i 30 minutter ved 37 * C. Mikroglia vil tillægge petriskålene, mens OPCs og astrocytter forbliver i supernatanten.
- Ryst Petriskåle med og mod uret (5 gange hver) i en cellekultur hætte. Tag kun få petriskåle ad gangen fra cellekultur inkubator (mikroglia vil begynde at løsne fra Petri retter når rystet kraftigt i køligere medium).
- Samle OPC-holdige supernatant i 50 ml rør. Eventuelt tilsættes dyrkningsmedium til petriskåle til anvendelse i mikroglia-specifikke eksperimenter.
- Eventuelt yderligere at øge renheden af OPC kulturer gentage trin 5.6.5 og 5.6.6 en gang med friske petriskåle at sænke omfanget af mikroglia i OPC præparater.
- Spin ned beriget OPC-holdige supernatant i centrifuge i 5 minutter ved 250 xg, 4 ºC. aspireres forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Efterlad 3 ml af supernatanten på toppen af pellet og begynde resuspendering OPCs efter finger flicking (10 gange).
- Forsigtigt Mal OPC celleklynger ved anvendelse af en 10 ml pipette (5 - 10 gange).
- Tæl celler og pladen 50.000 OPCs pr 25 mm dækglas (PDL-coatet) i en pyt af 400 pi vækstmedium i en 6-brønds skål og lad celler binde i 30 minutter i en cellekultur inkubator (5% CO2, 376; C). Forsigtigt tilsættes 2 ml varmt proliferation medium (se tabel 1) til hver brønd. For PDL-overtrukne 60 mm cellekulturskåle, varmeplader 1 - 1,5 millioner OPCs i 3 ml proliferationsmedium.
- Sæt forsigtigt FBS-holdigt spredning medium med frisk spredning medium 3 timer efter udpladning af OPCs (sørg OPCs knyttet ordentligt og ikke løsne under medium forandring). Udskiftningsmedium hver anden dag.
Bemærk: Rotte OPC-kulturer fremstillet ved hjælp af denne protokol er typisk 90% ren med mikroglia er den vigtigste kontaminerende celletype efterfulgt af astrocytter.
5. immuncytokemi ved anvendelse HIgM12 i Primary glialceller
- Triple-label Immunofluorescens hjælp HIgM12, anti-PSA mAb, og celletypespecifikke Markers i Primary gliaceller fra WT og NCAM KO mus
- Under levende celle betingelser, etiket 60% sammenflydende mus blandet glia kulturer fra WT og NCAM KO-mus dyrket på PDL-overtrukne25 mm dækglas med HIgM12 (10 ug / ml) og anti-PSA-mAb (klon 2-2b) (10 ug / ml) i PBS suppleret med 10% FBS ved 4 * C i 30 minutter.
- Vask cellerne tre gange i 20 sekunder hver med iskold PBS suppleret med 10% FBS og fastgøres med 4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4 i 15 minutter ved 25 * C.
- Vask fikserede celler to gange i 1 minut hver med PBS suppleret med 10% FBS og permeabilisere celler med 0,1% Triton-X100 i PBS, pH 7,4 i 2 minutter ved 25 ºC. Vask cellerne to gange i 1 minut og etiketten med gliale markører GFAP (astrocytter) eller IBA-1 (microglia) (1 ug / ml) i PBS suppleret med 10% FBS natten over ved 4 * C i det kolde rum.
- Fortsæt med standard immunofluorescens tilstande, herunder DAPI-holdige montering medium 31.
Bemærk: Anvendelse af fluorescens-mærket Fab 2 fragmenter som sekundære antistoffer til human (HIgM12) og mus (anti-PSA mAb, klon 2 - 2B) IgM'er anbefales kraftigt. - Tag fluorescent billeder ved 60X eller 100X forstørrelse. Brug de samme indstillinger instrument for alle billeder og procesbilleder identisk.
- Immunofluorescens Mærkning af endo-NF-behandlede WT gliaceller hjælp HIgM12 som et primært antistof
- Kultur WT mus blandet glia dyrket i 3 dage i Neurobasal A suppleret med 10% FBS og B27 supplement (1:50) på PDL-overtrukne 25 mm dækglas. Tilføj ENDO-NF (30 ug / ml) til 1 ml dyrkningsmedium og inkuberes natten over i en cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Label celler lever i kulden med HIgM12 og intern astrocytisk markør GFAP efter fiksering og permeabilisering som beskrevet i trin 5.1.1 til 5.1.5. Læs fluorescerende billeder på 60X eller 100X forstørrelse. Brug de samme instrumentindstillinger for alle billeder og behandle ens.
Representative Results
Dette afsnit viser eksempler på resultater, der kan opnås ved at studere humane IgM-specifikke PSA-antigener i CNS. Brugen af humane IgM-antistoffer, der indeholder bestemte VK lette kæder i biokemiske indstillinger og ved fluorescerende immunocytokemi vises.
HIgM12 immunpræcipiterer sit antigen fra cerebrale hjerne lysater og virker som en påvisning af middel (primært antistof) i Western blots. Hverken isotypekontrolantistof heller agarose L perler immunoudfælde et lignende antigen, hvilket viser specificiteten af pull down (Figur 1). Western blots under anvendelse af CNS-lysater fra WT og NCAM KO-mus demonstrerer specificiteten af HIgM12-binding til PSA-holdige NCAM (figur 2A). Enzymatisk fordøjelse af CNS-væv fra WT-mus under anvendelse af endo-NF identificerer PSA bundet til NCAM som den specifikke binding epitop for HIgM12 (figur 2B). Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri, opnås IBA-1-positive rotte microgliale kulturer af høj renhed (figur 3). Kommercielt tilgængelige anti-PSA antistof (klon 2-2b) ikke mærke celleoverfladen eller indre PSA pools i faste og permeabiliseres IBA-1-positive mikrogliaceller ved fluorescerende mikroskopi. I overensstemmelse med tidligere publicerede litteratur, som rapporterer ingen celleoverfladeekspression af PSA-NCAM i mikroglia 16,41 HIgM12 ikke mærke celleoverfladeantigener i oprensede rotte mikroglia. Interessant HIgM12 mærkning af faste og permeabiliserede microglia resulterer i et intracellulært, perinukleære mønster, der ikke er begrænset til specifikke organeller (figur 3). Resultater er i modsætning til de, der opnås ved anvendelse af et anti-PSA IgG-antistof (klon 735) 26, der er rettet mod PSA-SynCAM i mikroglia på niveau med Golgi 41.
I modsætning til mikroglia, HIgM12og A2B5 target celleoverfladeantigener i højt beriget rotte OPC kulturer under levende celle betingelser (figur 4). OPC kulturer indeholder ~ 5% kontaminerende mikrogliaceller. Figur 5 viser en næsten identisk celle-overflade farvningsmønster mellem HIgM12 og anti-PSA-mAb (klon 2-2b) i GFAP-positive astrocytter (figur 5A). Immunfluorescerende mærkning af endo-NF-fordøjede WT astrocytter sammenlignet med bufferkontrol-behandlede WT astrocytter hjælp HIgM12 viser tilstedeværelsen af astrocytisk PSA (figur 5B). Tilstedeværelsen af PSA-positive astrocytter in vivo er endnu ikke bekræftet.
Figur 1: HIgM12 fungerer som en "pull-down" Agent i Immunopræcipitationer Immunopræcipitationer fra total hjerne lysat af tre måneder gamle mus ved hjælp HIgM12, menneskelig isotypekontrol HIgM.126 eller agarose L perler kun som "pull ned" agenter. Eluerede proteiner blev kørt i Western blots med membraner probet mod HIgM12. Molekylvægte af eluerede proteiner fra HIgM12-belagte kugler var i intervallet på 160 - 200 kDa foruden den IgM'er tung kæde (~ 65-73 kDa). Dette tal er blevet ændret fra J. Neurochem. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HIgM12 Mål den Polysialic Acid (PSA) -delen på NCAM. A. Hjernehomogenater fra P7, P13, P16 og P27 NCAM alt KO mus og heterozygote kuld kontroller blev kørt i Western blots med membraner sonderet mod HIgM12, PSA og β-actin som lastning kontrol.
Figur 3: Fravær af PSA på Rat Mikroglia afspejles af en mangel på HIgM12 Mærkning Rotte mikroglia blev dyrket i 48 timer på poly-D-lysin belagt dækglas og enten mærket live på is med HIgM12 eller efter fiksering med HIgM12 eller anti. -PSA mAb (klon 2-2b). Celler blev triple mærket med mikroglia markør IBA-1 (grøn), HIgM12 / PSA (rød) og DAPI (blå). Billeder viser manglende mikroglial celleoverfladen binding under anvendelse HIgM12 (øvre række) og mangel på anti-PSA-binding (klon 2-2b) til celleoverfladen og interne lagre i primære rotte mikroglia (nederste række). Baseret på bipolare morfologi og fraværet af IBA-1-farvning blev den lille PSA-positive celle (nedre række) foreslået at være en OPC. I faste celler, HIgM12 farvning resulterede i en punctated, perinukleær mønster, der ikke var begrænset til bestemte organeller og blev betragtet som ikke-specifik binding (midterste række). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HIgM12 Mål Cell Surface PSA-NCAM på Rat OPCs Rat OPCs og microglia var cultu.rød i 4 dage i proliferationsmedium på poly-D-lysin belagte dækglas og tredobbelt mærkede levende på is med HIgM12 eller A2B5 (grøn), intern makrofag / monocyt CD68 (klon ED-1) (rød) og DAPI (blå) . Billeder viser cellepopulationer majorly positive for OPC markør A2B5 (øverste række) og HIgM12 (nedre række) med få CD68-positive mikroglia (~ 5%). Fase kontrast og DAPI billeder blev sat til at afsløre celle integritet og celle numre for hver population. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: HIgM12 og anti-PSA mAb co-mærke et astrocytisk delpopulation i Mouse Mixed Glia. A. Mouse blandede gliaceller fra WT og NCAM alt KO dyr indeholdende astrocytter, oligodendrocyt-afstamningsceller og mikroglia blev dyrket i 3 dage og mærket direkte på is med HIgM12 (grøn), anti-PSA-mAb (klon 2-2b) (rød) og efterfølgende til astrocytisk markør GFAP (lilla) og DAPI (blå). HIgM12 og anti-PSA afslører en virtuel identisk farvningsmønster på GFAP-positive WT astrocytter men mangler binding til dyrkede astrocytter fra NCAM KO-mus. Dette tal er blevet ændret fra J. Neurochem. 15. B. Mixed glia blev dyrket på samme måde som beskrevet under A. og behandlet natten over med endoneuraminidase-NF (venligst stillet til rådighed af Dr. Martina Muehlenhoff) eller PBS-kontrol. Celler blev mærket live på is med HIgM12 (grøn) og efterfølgende farvet til intern markører GFAP (rød) og DAPI (blå). HIgM12 henvender celleoverfladeantigener på PBS-kontrol behandlede blandede gliale kulturer, men ikke endoneuraminidase-NF behandlede blandet glia. Dette tal har været ændret siden JNSCI 16. Pllethed klik her for at se en større version af dette tal.
Alle billeder blev taget ved 60X forstørrelse med anvendelse af de samme instrumentindstillinger og behandles ens.
Tabel 1:. Buffer og Solution Opskrifter Klik her for at downloade denne tabel.
| CNS-væv | ENDO-NF / PBS | lyseringsbuffer | totalvolumen | |
| 1. WT mus | 67 ug (0,45 pi) | 2 pi (12 ug) ENDO-NF | 7,55 pi | 10 pi |
| 2. WT mus | 67 ug (0,45 pi) | 2 pi PBS | 7,55 pi | 10 pi |
| 3. WT mus | 67 ug (0,45 pi) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 pi | 10 pi |
| 4. NCAM KO mus | 67 ug (0,45 pi) | 2 pi (12 ug) ENDO-NF | 7,55 pi | 10 pi |
| 5. NCAM KO mus | 67 ug (0,45 pi) | 2 pi PBS | 7,55 pi | 10 pi |
| 6. NCAM KO mus | 67 ug (0,45 pi) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 pi | 10 pi |
Tabel 2: ENDO-NF fordøjelse af CNS-væv fra P7 WT og NCAM KO-mus.
Discussion
Humane naturlige IgM-autoantistoffer er tiltalende kandidater til immunoterapi og har vist terapeutisk potentiale til behandling af forskellige sygdomme, herunder cancer og CNS-lidelser 1-7. Fordelagtigt vil disse antistoffer ikke fremkalde et immunrespons, hvor frembringelsen af neutraliserende antistoffer reducerer den effektive terapeutiske dosis og effekt væsentligt. Vigtigere, har alle antistoffer med terapeutisk potentiale været af den IgM isotypen og tilhører NAB repertoire 3-5,8,9,37,40,42-45. En væsentlig forhindring for den potentielle kliniske anvendelse af IgM-antistoffer er identifikationen af deres antigener, som er ubestemt i mange tilfælde. Standardteknikker anvendes til IgG antistoffer er ofte ikke umiddelbart at identificere et IgM s antigen.
Denne protokol beskriver identifikation af PSA-NCAM som antigen for regenerativ humant IgM-antistof HIgM12, effektive i dyremodellerMS og ALS 15-18. Den anvendte metode er primært gældende for alle humane antistoffer med specifikke VK lette kæder VκI, VκIII og VκIV og mus antistoffer med VκI lette kæder, uanset antistof isotype.
Det mest kritiske trin i denne protokol er anvendelsen af IgM-antistoffer i kromatografiapplikationer affinitet. Mere specifikt er succesfulde antistoffer skal fungere som pull-down midler i immunoudfældninger at isolere eller at berige et antigen ud af komplekse vævs- eller celle-kultur lysater. Berigede antigen fraktioner kan sammenlignes med immunopræcipitation isotypekontrolantistoffer og efterfølgende analyseret for forskelle ved massespektrometri. Et væsentligt krav eller begrænsning af dette trin er det tilstedeværelsen af det korrekte antistof VK let kæde og vært (menneske, mus) for at muliggøre antistofbinding til protein L-agarose. Anvendelse af mannan-bindende protein bundet til agarose (også called mannose-bindende lectin) i stedet for protein L-agarose er et potentielt alternativ til immunpræcipitere IgM'er uden specifikke VK lette kæder. Men som nævnt af Arnold et al. 35, antigen-bundne IgM-antistoffer ikke binder til mannan-bindende protein, som target glycan synes at blive utilgængelige, når IgM har bundet til dets antigen. Baseret på disse resultater mannan-bindende protein kan ikke bruges som en bindende matrix til at immunpræcipitere antigen-loaded IgM-molekyler 35. Andre potentielle alternativer kan skyldes anvendelsen af sekundære agarose-bundet anti-IgM IgG-antistoffer 46,47 eller brug af overfladeaktive aktiverede magnetiske perler 48. IgG antistoffer rettet mod IgM'er kunne være kemisk tværbundet til agarose A eller agarose G for at reducere omfanget af elueret antistof sammen med antigenet af interesse. En ordentlig sammenligning mellem forskellige varianter af IgM immunopræcipitation med hensyn til succes identificerede antigener is vanskeligt, fordi de fleste immunopræcipitationer blev udført for at isolere eller nedbryder IgM'er uden yderligere interesse i deres antigener. Desuden blev immunopræcipitationer ved hjælp IgM'er hovedsageligt anvendt til at bekræfte en allerede kendte eller forventede enkelt antigen med antistof udsættelse for oprensede antigener 49. En ulempe ved agarose-koblede IgG'er rettet mod humant IgM'er er et meget lavt udbytte (10 - 15%) af immunopræcipiteret serum IgM-molekyler sammenlignet med udgangsmaterialet 50. I modsætning hertil blev overfladeaktive aktiveret magnetiske perler udmærket anvendes på antistoffer af forskellige isotyper, herunder IgM at immunpræcipitere scrapie-associerede fibriller 48. Denne metode er ikke begrænset til specifikke kappa (VK) eller lambda (λ) kæder eller en bestemt vært, og kan i det væsentlige udvide spektret af IgM-antistoffer anvendes i immunfældninger.
Et andet vigtigt skridt i protokollen er antistoffet evne til at fungere som en itecting antistof (primært antistof) i Western blots eller andre screening platforme. Succesfulde antistoffer skal målrette deres antigen med tilstrækkelig høj affinitet til at tillade antigen binding i nærvær af ikke-ioniske eller eventuelt ioniske detergenter. Højaffinitetsantistoffer er udbredt blandt affinitets-modnet IgG-antistoffer, men mindre udbredt blandt antistoffer af IgM-isotypen, som er en af grundene til, at der er relativt få kommercielt tilgængelige IgM antistoffer som detektering midler i biokemiske indstillinger. Højaffinitetsbinding af antistoffer er et krav for immunopræcipitationer af molekylære antigener og for Western blotting. Sænkning vaskemiddel koncentrationer eller den fuldstændige mangel på detergenter i IP buffere og lysis buffere tillader antigen målretning af lav-affinitet antistoffer via sit Fab domæne. I modsætning hertil er antistoffets evne til at målrette protein L-agarose via dets Fc-del ikke påvirket væsentligt blandt isotypekontroller over et område af forskellige detergent koncentioner. Men koncentrationen lav rengøringsmiddel i lysisbuffer og IP buffer forhindrer cellemembranen forstyrrelser og isolering af specifikke molekyler. Tilsvarende vil en lav koncentration detergent i Western blot vaskebuffere (f.eks PBS-T) muliggør antigenbinding af lav-affinitet-antistoffer, men på samme tid øger ikke-specifik binding og derfor ikke en mulighed.
Tilstedeværelsen af et antigen-protein kerne er et andet krav til denne metode. Proteiner med posttranslationelle modifikationer (f.eks glycoproteiner, lipoproteiner) og umodificerede proteiner, men ikke eneste lipider eller carbohydrater, kan påvises i Western blots. Det er ikke muligt at immunpræcipitere lipider (f.eks sphingolipider) fra væv eller cellelysater i nærvær eller fravær af detergenter. De fysisk-kemiske egenskaber af detergenter og lipider er for ens til at tillade selektiv lipid-antistof-interaktioner, mens på samme tid detergenter er afgørende for at forstyrremembraner med henblik på at tillade selektiv isolering af specifikke molekyler. Til vores bedste viden, immunbundfældninger udelukkende består af kulhydrater, i mangel af et protein kerne, ikke tidligere er blevet rapporteret. Dette bliver især relevant, fordi IgM-antistoffer ofte målrette kulhydrater og glycolipider, som ikke nødvendigvis er knyttet til et protein enhed. Andre chromatografiske metoder er nødvendige for separation og immunologisk identifikation af lipider og kulhydrater i fravær af et protein kerne. For eksempel kan tyndtlagskromatografi (TLC) af cellulære lipider med efterfølgende antistofpåvisning på TLC-pladen (immuno-TLC) gennemføres 51,52.
Andre anti-PSA-antistoffer er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser og resultater i forhold til HIgM12 samt det kommercielt tilgængelige anti-PSA IgM (klon 2-2b). Den mest almindeligt anvendte antistof på PSA er et IgG-antistof (klon 735) tilgængelig som muse monoclonal eller kanin polyklonalt antistof 53. Denne anti-PSA IgG-antistof detekterer PSA på SynCAM og NCAM på forskellige CNS-celletyper, herunder mikrogliaceller 41. I modsætning til anti-PSA IgG-antistof, humane IgM-antistoffer HIgM12, HIgM42 og anti-PSA muse-IgM (klon 2-2b) er ude af stand til at målrette PSA på SynCAM (men på NCAM) ved forskellige embryonale og tidlige postnatale faser i mus , mens ikke-polysialylated SynCAM er let detekterbar 15. De IgM-antistoffer anvendes, er heller ikke i stand til at detektere PSA på mikrogliaceller (figur 3 + 4). En mulig forklaring på forskelle observeret mellem antistofisotyper kan være lav PSA-SynCAM niveau sammenlignet med niveauer af PSA-NCAM kombineret med potentielt lavere affinitet binding af IgM-antistoffer i forhold til den anti-PSA IgG. For at teste denne hypotese, vi udførte immunopræcipitationer i NCAM KO dyr på fosterstadiet E17 med enorme mængder af SynCAM nuværende og brugte HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kuld styrer HIgM12 immunopræcipiteret PSA-NCAM i et omfang, viste lignende intensiteter af "trukket ned" PSA-NCAM sammenlignet med IgM'er tunge kæde som detekteret ved densitometri i efterfølgende Western blot under anvendelse eluerede antigener. Dette resultat foreslog mindst en tilstrækkelig affinitet HIgM12 til sit mål PSA. I modsætning til WT kuldsøster styrer HIgM12 ikke afsløre PSA tilknyttet SynCAM i NCAM KO dyr. Identiske resultater blev opnået i immunopræcipitationer anvendelse af den humane anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 og HIgM42, samt muse-anti-PSA IgM (klon 2-2b) var ude af stand til at målrette PSA på SynCAM i Western blots fra WT og NCAM KO dyr ved embryonale og postnatale udviklingsstadier. I betragtning af den lave mængde HIgM12 påkrævet (0,1 ug / ml) til specifikt at detektere PSA bundet til NCAM i Western blots under anvendelse af små mængder af CNS-væv (0,1 ug CNS væv pr brønd) 15 synes det at være usandsynligt, at lave affiniteter alene eransvarlig for fuldstændig mangel på PSA-SynCAM detektion ved HIgM12 i tre forskellige metoder.
Vi konkluderer, at der er betydelige forskelle mellem anti-PSA IgM antistoffer og ofte offentliggjorte anti-PSA IgG-antistof (klon 735). Det er ikke klart, hvorfor kommercielt tilgængelige anti-PSA IgM-antistoffer ikke blev brugt oftere i fortiden for at bekræfte resultater opnået med antiPSA IgG-antistof 735. Dette er særlig interessant, fordi HIgM12 allerede har vist effekt i forskellige sygdomsmodeller. Mens andre anti-PSA IgM-antistoffer kan have lignende terapeutiske virkninger er det fortsat uklart, om anti-PSA IgG-antistof (klon 735) har en lignende terapeutisk resultat i modeller for MS og ALS.
Kort fortalt, blev fremgangsmåderne beskrevet her anvendes primært til at identificere antigen af regenerative humane antistof HIgM12 at støtte potentielle kliniske forsøg for MS og muligvis andre neurodegenerative sygdomme. Identifikationen af antigens for antistoffer med biologisk aktivitet er så vigtigt skridt for at forstå deres virkningsmekanisme. Dette bliver særlig relevant i forbindelse med en lang række monoklonale antistoffer i øjeblikket testet for sikkerhed og effekt i humane forsøg. Mens antallet af klinisk testede IgM-antistoffer til dato er lille, seneste fremskridt inden hybridomteknologi sammen med et stigende antal undersøgelser, der fremhæver det terapeutiske potentiale af denne antistofklasse 1-10,37,40,42-45 opfordrer udvikling af nye eller modificerede metoder gælder at identificere ikke-protein-IgM-antigener.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 og R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIERE Award), Minnesota Partnerskab Award for Bioteknologi og Medicinsk Genomics, National Scleroseforeningen (CA1060A) og Mayo Clinic center for Klinisk og Translational Science (CCaTS). Forfatterne anerkender støtte fra Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Fonde, Månen og Marilyn Park Ledelseshverv Fund og McNeilus familien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. J Autoimmun. 29 (4), 295-302 (2007).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. N Biotechnol. 25 (5), 294-298 (2009).
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Acorda Therapeutics Inc. An Intravenous Infusion Study of rHIgM22 in Patients With Multiple Sclerosis (Clinical Trials Identifier - NCT01803867). , Available from: http://1.usa.gov/1N2gsHJ (2015).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O'Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, Suppl 1. S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3'-isoLM1 3',6'-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
