Introduction
Antikörper vom IgM - Isotyp zeigen großes therapeutisches Potential für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten , einschließlich Krebs und Erkrankungen des ZNS 1-7. Die Vollmers 'Gruppe zahlreiche Antikörper bei Krebspatienten für mögliche Verwendung als tumorspezifische Biomarker oder aktiven Therapeutika identifiziert die in der Lage sind bösartige Zellen zu töten , indem sie apoptotische Wege 4,8,9 induzieren. Interessanterweise alle identifizierten Antikörper mit therapeutischem Potential sind der IgM-Isotyp und gehören zur Gruppe der "natürlichen Autoantikörper" (NAbs).
In ähnlicher Weise identifiziert die Rodriguez Gruppe von Maus und Mensch-Antikörper, die Remyelinisierung in chronisch demyelinierten Läsionen des Rückenmarks bei den Modellen der Multiplen Sklerose (MS) zu stimulieren. Identisch mit Antikörpern mit Anti-Krebs - Wirkung, alle Remyelinisierung fördernder Antikörper sind NAbs und der IgM - Isotyp 1,6,7,10. Die genauen Antigene für die meisten identifiziert IgMs sind noch undetermined einschließlich des menschlichen Remyelinisierung fördernden Antikörper rHIgM22, die derzeit in klinischen Phase - I - Studien für MS - Patienten 11. Trotz wiederholter Bemühungen von Experten auf dem Gebiet der Lipid- und Kohlenhydratforschung sowohl im akademischen Umfeld und in Partnerschaft mit der Industrie 11, versucht rHIgM22 das Antigen zu identifizieren , waren nicht erfolgreich. Das Versagen von Standardtechniken verwendeten Antigene von IgG-Antikörpern zu identifizieren, mit IgM-Antikörpern zu arbeiten identifiziert eine kritische Notwendigkeit Methoden zu verfeinern, spezifisch für diesen Antikörper, die wahrscheinlichste Ziel Kohlenhydrat oder Lipid-Antigene.
Der Schwerpunkt dieses Manuskript ist der menschliche regenerative Antikörper HIgM12 und die experimentellen Verfahren verwendet, sein Antigen zu identifizieren. Antikörper HIgM12 wurde von Patienten mit Morbus Waldenström identifiziert, stimuliert das Neuritenwachstum in vitro 12-14 und Ziele Polysialsäure (PSA) , die an das neuronale Zelladhäsionsmolekül (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 verlängert Lebensdauer in einem Mausmodell der ALS 17 und verbessert die funktionelle Ergebnis in Theiler murine Enzephalomyelitis Virus (TMEV) infiziertem Mäuse. Insbesondere stimuliert HIgM12 spontane horizontale und vertikale Bewegungsaktivität in chronisch demyelinierten Mäuse und erhöht Zahl von kleinen und mittleren Durchmesser des Rückenmarks Axone acht Wochen nach einer einzigen, niedrigen Dosis von intraperitoneale 18 Antikörper injiziert.
Das neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) ist ein Glycoprotein der Immunglobulin (Ig) -Superfamilie auf der Zelloberfläche von Neuronen exprimiert, Glia, Skelettmuskel, und natürliche Killerzellen 19-25. Die drei großen NCAM-Isoformen genannt NCAM180, NCAM140 und NCAM120 sind alternative Splice-Varianten eines primären Transkripts, die nur in ihrer zytoplasmatischen Domäne variieren. Im ZNS ist NCAM die Haupt polysialylierte Molekül (> 95%) mit langen, negativ geladene Sialinsäure-Homopolymere. Polysialinsäuren eincid mit n> 10 wird als PSA aber kürzere oligomere Strukturen existieren, die auch biologisch relevant sind. Andere polysialylierte Proteine im ZNS exprimiert sind SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 und ein Natriumkanal - Untereinheit 25 (für einen Überblick siehe 29).
Die hier beschriebenen Methoden erlauben Antigen Identifikation für die Human- und Maus - Immunglobulinen , die spezifische kappa (V & kgr;) Leichtketten (VκI, VκIII oder VκIV leichten Ketten für menschliche Antikörper und VκI leichten Ketten für Maus - Antikörper) , unabhängig von der Isotyp des Antikörpers (zB IgG, IgM , IgA, IgD oder IgE). Diese Beschränkung beruht auf der Verwendung von Protein L-Agarose für Immunpräzipitationen mit Antikörpern des IgM-Isotyps. Alternative Strategien können Mannose-bindende Lektine und sekundären IgG anti-IgM-Antikörper kovalent an Agarose-Kügelchen, umfassen, die die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf mehr IgM Antikörper erweitern kann incdie mit Lambda (λ) Leichtketten Luding (siehe Diskussion). Die Verhältnisse von Serum V & kgr; leichten Ketten IgM im Vergleich zu leichten Ketten λ IgM von gesunden Individuen abgeleitet sind 1,5: 1 30.
Basierend auf dem chromatographischen Methodik hier verwendet zur Trennung, Anreicherung und immunologisch bestimmte Moleküle 31 erfassen, werden alle Antigene erforderlich , mindestens eine kleine Proteindomäne umfassen. Die spezifische Bindung Epitop des Antikörpers kann (in Glykoproteine, Lipoproteine zB) innerhalb oder außerhalb des Proteindomäne sein. Erste biochemische Schritte verwendet, um das spezifische Antigen für HIgM12, jeweils die Liste der potentiellen Kandidaten einzuengen zu identifizieren, sind die wichtigsten Schritte in diesem Verfahren. Zelltyp-spezifische Präparate und Zellmorphologie Basis Charakterisierungen sind für Gliazellen beschrieben, aber diese Methode extrapoliert werden kann andere Zelltypen innerhalb oder außerhalb des ZNS anzupassen.
Es besteht ein dringendermüssen neue oder modifizierte Techniken anwendbar für die zunehmende Anzahl von IgM-Antikörpern mit therapeutischem Potential für verschiedene menschliche Erkrankungen insbesondere in den Fällen (die meisten IgM-Antigene) entwickeln, in denen die Antikörper-Targets sind Kohlenhydrat- oder Lipidstrukturen.
Protocol
Tier Protokolle und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Mayo-Klinik institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse (Mayo IACUC Protokollnummer # A51912) durchgeführt.
1. Allgemeine CNS Gewebepräparation
- Generieren NCAM defizienten (KO) Mäuse auf C57 / Bl6 Hintergrund (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Lynn Landmesser, der Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygot NCAM Mäuse und Wildtyp (WT) littermates (C57 / Bl6) von Heterozygoten kreuzen. Genotypisierung von NCAM KO - Mäusen wurde zuvor 32-34 beschrieben und wird hier nicht näher erläutert werden.
Hinweis: Die Schritte 1,2-1,6 Optional sind.
- Vor der Operation, Administration einer Pentobarbital-Lösung (Lager: 25 mg / ml; 50/100 ul Pentobarbital für frühen postnatalen jeweiligen adulte Stadien) über intraperitoneale Injektion (27-Gauge-Nadel und 1 mlSpritze).
- Warten Sie 2 Minuten oder bis das Tier hat eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht. Administrieren zusätzlichen Anästhetikum bei Bedarf während des Verlaufs jeder Operation ein Operationsebene Anästhesie aufrechtzuerhalten. Verwenden toe pinch-Response-Verfahren Narkosetiefe zu bestimmen. Die Tiere müssen vor dem Fortfahren nicht mehr reagiert.
- Machen Sie eine 0,5-1 cm seitlichen Schnitt durch die Hülle und Bauchwand direkt unter dem Brustkorb. Trennen Sie vorsichtig die Leber von der Membran. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran eine gekrümmte, stumpfe Schere. Weiterhin den Membran Inzision entlang der gesamten Länge des Brustkorbs der Pleurahöhle zu belichten.
- Platzieren Sie gebogen, stumpf Schere entlang einer Seite des Brustkorbs, sorgfältig in die Lunge verdrängt, und machen einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite. Das Anheben des Brustbeins entfernt, trimmen sorgfältig jedes Gewebe es zum Herzen zu verbinden.
- Einen Einschnitt für das Tier'S rechten Vorhof Iris Schere so groß einen Auslass wie möglich zu gestalten. injizieren langsam 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in den linken Ventrikel des Tieres (hellrot; Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min) unter Verwendung einer 10 ml-Spritze mit einem 27-Gauge-Nadel ausgestattet war. Sie nicht den Druck / PBS Fluss während der Perfusion erhöhen Gewebezerstörung zu vermeiden.
- Enthaupten neugeborenen Mäusen durch chirurgische Schere.
- Entfernen Sie das Gehirn durch die Augenhöhlen mit einer Pinzette greifen und durch eine kleine Schere in die Wirbelsäule eingesetzt wird. Schneiden Sie den Schädel in Richtung der Vorderseite auf Ohrhöhe. Ziehen Sie den Schädel zurück und sanft das Gehirn in eine 60 mm Petrischale mit 10 ml eiskaltem Sezieren Medium auf Eis (Tabelle 1) gefüllt sind . Legen Sie jedes Gehirn in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und sofort lagern auf Trockeneis (-79 ° C).
- Inzision des Kleinhirns und des Hirnstamms aus gefrorenen Gehirne einen sauberen Rasierklinge auf Eis verwenden. Arbeiten Sie schnell zu vermeiden, um das Gewebe aufgetaut.
- Wiegen Sie diegefroren Gehirn-, in einem 15 - ml - Röhrchen auf Eis gelegt und eiskaltem Lysepuffer (siehe Tabelle 1) bis zu einer Endkonzentration von 150 & mgr; g Hirngewebe pro ul Lysepuffer hinzufügen. Wiederholen Sie für verbleibende cerebra. Halten Sie Gehirne auf Eis zu allen Zeiten für die Schritte 1,9-1,11.
- Homogenisieren Gehirne in Lysepuffer durch Verreiben durch eine 1 ml Pipettenspitze (10 mal), gefolgt von Verreiben durch eine 5-ml-Spritze mit 27-Gauge-Nadel (10-mal). Inkubieren Gehirn Lysaten für weitere 30 Minuten auf Eis vollständige Gewebe Lyse zu ermöglichen.
- Entfernen Waschmittel unlösliche Material und Hirnlipiden durch serielle Zentrifugation (vier Runden bei 19.000 × g für 10 min bei 4 ° C). Discard (white) Myelin und Zelldebris Pellet, das aber den Überstand nach jeder Zentrifugation Schritt halten. Aliquotieren Gehirn-Lysaten und bei -80 ºC.
2. Immunpräzipitationen unter Einsatz von menschlichem IgM (HIgM12 und Isotypkontrollreagenzien IgM) als "Pull-down" Agent von Cerebral Lysate von WT und NCAM KO Mäuse
- Protein L Agarosekugel Vorbereitung 9,35,36
- Bereiten Sie 200 ml IP - Puffer mit BSA (siehe Tabelle 1). Bereiten Sie weitere 200 ml des gleichen IP-Puffer ohne BSA.
- Pro Immunpräzipitationsreaktion Übertragungs 100 ul Protein L-Agarose-Aufschlämmung mit einer 200 ul-Pipette in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von. Nicht mit dem Vortex-Protein L Agarosekügelchen! 1 ml IP - Puffer (siehe Tabelle 1) zu jedem Röhrchen. Mischen Sie Protein L Agarose und IP-Puffer manuell durch Inversion (fünf Mal).
- Wash Protein L Agarose-Kügelchen viermal durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (1000 × g, 2 min, 25 ° C). Take off Überstand mit einer 200 ul-Pipette ohne das Agarose-Pellet zu stören. Wiederholen Sie die Schritte Waschen 2.1.2 bis 2.1.3 drei weitere Male.
- Protein L-Agarose in 1 ml frisch zugegebenem IP-Puffer auf einer Walze über Nacht bei 4 ºC äquilibrieren.
- Antikörper-Antigen-Agarose L Komplexbildung und Antigennachweis in Western Blots
- Inkubiere 30 mg lysiert Hirngewebe (~ 200 & mgr; l Lysat) in 1 ml eiskaltem IP-Puffer mit 20 ug IgM-Antikörper (HIgM12) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht auf einer Walze bei 4 ºC.
- Spin down Protein L Agarosekügelchen (aus Schritt 2.1.4) in einer Tischzentrifuge für 2 min bei 1000 × g, 4 ° C. Überstand verwerfen eine 200 ul-Pipette ohne das Agarose-Pellet zu stören. Fügen Sie den gekühlten Antikörper-Hirn-Lysat-Lösung (aus Schritt 2.2.1) an das Protein L Agarose einer 1 ml Pipette.
- Inkubieren des Antikörper-Antigen-Protein L-Agarose-Suspension für 2 h auf einer Walze bei 4 ºC. Waschen Sie die Antikörper-Antigen-Komplex gebunden L durch Zentrifugation bei 1000 × g für 2 min, 4 ° C bis Agarose. verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören und 1 ml eiskaltem IP-Puffer 0,2% BSA enthält.
- Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal mit eiskaltem IP-Puffer 0,2% BSA und zwei weitere Male mit eiskaltem IP-Puffer ohne BSA enthält.
- Spin down Antikörper-Antigen-Komplex an L bei 1000 × g für 2 min, 4 ºC Agarose. Überstand verwerfen vollständig zuerst eine 200 ul-Pipette bis ~ 50 & mgr; l-Lösung links oben auf dem Protein L Agarose-Pellet mit einer 10 & mgr; l Pipette gefolgt. Halten Sie Proben auf Eis.
- In 40 ul IP Elutionspuffer (siehe Tabelle 1) pro 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, finger flick Rohre 6 mal und Wärme für 5 min bei 95 ° C. Legen Sie Proben auf Eis für 2 min und Spin-down für 30 Sekunden bei 13.000 × g, 4 ° C.
- Den Überstand unter Verwendung einer 10 & mgr; l-Pipette (~ 35 & mgr; l gesamt) in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, ohne das Pellet zu stören. Bestätigen Abwesenheit von Protein L-Agarose-Perlen durch Spülen an der Rohrinnenwand eine geringe Menge an eluierten Probe nach unten.
Hinweis: "Granular"Protein L Agarose-Kügelchen sind deutlich sichtbar, falls vorhanden. - Wenn Protein L Agarosekügelchen vorhanden sind, Spin-down-Probe für weitere 30 s bei 13.000 xg und übertragen Überstand Rohr zu reinigen. Wiederholen Sie Schritt, bis keine Agarosekügelchen nachweisbar sind.
- Last 10 - 20 & mgr; l der eluierten Proben pro Vertiefung auf SDS-Polyacrylamid - Gel in einem Tris / Glycine / SDS Puffer - System (siehe Tabelle 1).
Hinweis: Die Verwendung von 7,5% oder 4 - 20% Gradientgelen mit 50 & mgr; l Ladevolumen pro Vertiefung für den Nachweis von PSA-NCAM oder NCAM-Isoformen (Gel Abmessungen (B x L x Dicke: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). - Führen Sie Gele für ~ 1 Stunde bei 100 V (1,74 V / cm 2) auf Benchtop. Eine zusätzliche Kühlung ist für diesen Schritt 37,38 erforderlich.
- Transferproteine zu PVDF (Polyvinylidenfluorid) Membran (Porengröße 0,45 um) für 2,5 Stunden im Kühlraum bei 100 V (1,74 V / cm 2) unter Verwendung von Kalttransferpuffer (von 5 bis 10 ° C) (siehe Tabelle 1).
- Block-Membranen with 10% (w / v) Trockenmilchpulver in PBS-T für 1 Stunde bei 25 ° C auf einem Benchtop Orbitalschüttler, waschen Membranen zweimal für 10 min mit PBS-T und Sonde über Nacht mit dem primären Antikörper in 5% BSA in PBS- T auf einem Orbitalschüttler in einem kalten Raum.
- Am nächsten Morgen wash Membranen einmal kurz mit überschüssigem PBS-T bei 25 ºC (einschließlich Deckel und Behälter), gefolgt von 3 Waschungen mit PBS-T für jeweils 10 Minuten auf einem Rundschüttler (80 rpm) (alle Waschschritte werden bei 25 durchgeführt, ºC).
- Hinzufügen Sekundärantikörper (Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem anti-human anti-IgM-Antikörper (für HIgM12) (Verdünnung 1: 30.000) in 5% Trockenmilchpulver in PBS-T für 1 Stunde bei 25 ºC auf einem Rundschüttler (70 rpm ).
- Waschmembranen extensiv einmal kurz mit überschüssigem PBS-T bei 25 ºC (einschließlich Deckel und Behälter), gefolgt von 3 Waschungen mit PBS-T für jeweils 10 Minuten auf einem Rundschüttler (80 rpm) (alle Waschschritte werden bei 25 ºC durchgeführt) .
- Mischen Sie 1 ml gekühltes verstärkt chemiluminescence HRP Substratkomponente A (enhanced Luminolreagens) mit 1 ml der Komponente B (Oxidationsreagenz) (pro Mini-Blot) bei 25 ºC.
- Verwenden Sie Kunststoff-Pinzette, die Membranen auf einem Papiertuch zu übertragen überschüssige Flüssigkeit zu entfernen (halten sie an den äußersten Rand). Trockenbehälter mit Papiertüchern und stellen Membranen zurück in die Behälter (eine für jede Membran). Ab sofort 2 ml der vorgemischten verstärkte Chemilumineszenz HRP-Substrat (Verbindung A + B) (Schritt 2.2.16.) Zu jeder Membran und Inkubation für 2 min bei 25 ° C auf einem Orbitalschüttler (90 rpm). Stellen Sie sicher sind Membranen, die durch das Chemilumineszenzreagenz gleichmäßig befeuchtet.
- Transfermembranen in eine transparente Kunststoffhülle und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen mit Papiertüchern. Setzen Membranen in Kunststoffhülse in einer Filmkassette und kleben Sie schließlich die Kunststoffhülse in die Kassette. Schließen Sie die Kassette.
- Nehmen Sie die Kassette, Film, Timer und Schere in der Dunkelkammer. Schneiden Sie oben rechts von jedem film zur Orientierung, belichten (unterschiedlichen) Filme für verschiedene Zeiträume (10 sec, 1 min, 10 min) und entwickeln Filme in einem Filmentwickler.
3. Endoneuraminidase-NF Spaltung von PSA An NCAM 39
- Digest lysiert Hirngewebe von postnatalen Tag (P) 7 WT - Mäusen und P7 NCAM KO - Mäuse (von Schritt 1.12) hergestellten 2 h auf Eis unter Verwendung endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) , wie in Tabelle 2 39 veranschaulicht.
- Werden 5 & mgr; l 4x Laemmli - Probenpuffer zu jedem Röhrchen (1 - 6) aus Schritt 3.1 (Tabelle 2).
- Laden Sie die Proben auf einem 4 - 20% Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Gel und wiederholen Sie die Schritte 2.2.10 bis 2.2.19. Sondenmembranen mit HIgM12 (1 ug / ml), im Handel erhältliche Anti-PSA-mAb (Klon 2-2B) (1 & mgr; g / ml) und β-Actin-Antikörper (Beladungskontrolle) (1 & mgr; g / ml) in 5% BSA in PBS -T.
4. Herstellung von Ratten- und Mäuse CNS Kulturen
- Säurewäsche 25 mm Glasplättchen in 1 M HCl bei 50 bis 60 ° C für 4 - 16 Stunden in einem Abzug eines Glasbehälters mit. Rühre Deck gelegentlich durch leichtes Schütteln.
- Wash Deckgläser ausgiebig in destilliertem Wasser (3x). Achten Sie darauf, um die Säure zwischen den gestapelten Deckgläser auszuwaschen.
- Spülen Sie Deckgläser in 100% Ethanol und trocknen Sie sie auf Parafilm in einer Zellkultur Kapuze. Einen Tag vor Gebrauch erwärmen sich die Deckgläser für 24 Stunden in einem Glasbehälter mit Deckel bei 100 ºC in einem Ofen.
- Setzen Glasplättchen in 6-Well-Platte und Mantel mit 3 ml von 40 ug / ml Poly-D-Lysin in sterilem Wasser für 1 Stunde bei 37 ºC.
- Waschen Sie zweimal mit sterilem Wasser, vollständig trocknen unter Zellkulturhaube und gelten für 20 Minuten UV-Licht.
- Mantel 60 mm Zellkulturschalen oder 75 cm 2 Gewebekulturflaschen mit 3ml oder 10 ml, bzw. von 40 & mgr; g / ml Poly-D-Lysin in sterilem Wasser für 1 Stunde bei 37 ºC.
- Zweimal waschen mit Wasser, trocknen vollständig unter Zellkulturhaube und gelten für 20 Minuten UV-Licht.
- Anesthetize neugeborenen Ratten in IACUC mit CO 2 Gasversorgung Nagetier Euthanasie Kammer genehmigt (vollautomatische). Verwenden Sie Zehe Prise-Response-Verfahren auf die Unempfindlichkeit des Tieres bestimmen. Köpfen neonatalen Sprague Dawley Ratten (P0P1) (6 bis 10 Welpen zu einem Zeitpunkt).
- Entfernen Sie das Gehirn durch die Augenhöhlen mit einer Pinzette greifen und durch eine kleine Schere in die Wirbelsäule eingesetzt wird. Schneiden Sie den Schädel in Richtung der Vorderseite auf Ohrhöhe. Ziehen Sie den Schädel zurück und sanft das Gehirn in eine 60 mm Petrischale mit 10 ml eiskaltem Sezieren Medium auf Eis (siehe Tabelle 1) gefüllt sind .
- Wiederholen Sie für verbleibende Rattenjungen (6 bis 10 Welpen). Halten Sie Gewebe auf Eis Schritte 4.3.2 - 4.3.7. Teilen Sie die Gehirn- entlang der Mittellinie in zwei Gehirnhälften und anschließend abgeschnitten Riechkolben, Basalganglien unter der Hirnrinde und der Hippocampus mit Dumont Pinzette. Legen Sie die isolierte Hirnrinde in einer sauberen Petrischale mit Medium Sezieren auf Eis.
- Nehmen Sie eine Hirnrinde. Entfernen Sie die Meningen mit einer Pinzette mit feinen Spitzen unter einem Präpariermikroskop.
- Wiederholen Sie mit den restlichen Rinden. Legen Sie alle Hirnhaut frei Rinden in eine saubere Petrischale auf Eis.
- Kombinieren Sie kortikalen Hemisphären aus aller Welpen in einer 60 mm Petrischale und eine sterile Rasierklinge das Hirngewebe in 1 mm gehackten Stücke zu würfeln.
- Übertragen Sie die gehackten Hirngewebe eine 10 ml Pipette in einen sterilen, unbeschichtet 500 ml Glaskolben mit und 10 ml eiskaltem Sezieren Medium pro Rattenhirn. Sanft den Kolben verwirbeln while (Balanced Salt Solution Hanks) (5 mg / ml Trypsin) Zugabe von 1 ml Trypsin-Lösung in HBSS zu 9 ml HBSS pro Rattenhirn. In 2% Des Gesamtvolumens in DNase I - Lösung (1 mg / ml) und 2% des Gesamtvolumens in MgSO & sub4 ; -Lösung (3,82% MgSO 4 in HBSS (w / v)) zu der Suspension Hirngewebe und vorsichtig schwenken.
- Trypsinize Gewebe unter leichtem auf einem Rotationsschüttler bei 37 ° C für 30 min schütteln. Stellen Sie sicher, Gewebestücke werden während dieses Schrittes floating und sedimentieren nicht nach unten. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit dreht, wenn nötig.
- Hinzufügen fötalem Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von 10% (v / v) und Mischen durch Umschwenken der Kolben 10 mal für 10 sec. Das Abkühlen der Gewebesuspension in Eiswasser für 15 min. Swirl Kolben sanft fünf Mal pro Sekunde min.
- übertragen Sie vorsichtig die Gewebesuspension in sterile 50-ml-Röhrchen mit 25 ml oder 50 ml Pipetten und Zentrifugen für 5 Minuten bei 200 × g, 4 ° C.
- Überstand verwerfen und resuspendieren sanft verdaut ZNS - Gewebe in 15 ml eiskaltem Sezieren Medium mit 5 ml fötalem Rinderserum, 0,4 ml MgSO 4 -Lösung (3,82%MgSO 4 in HBSS) und 1,6 ml DNase I (1 mg / ml).
- Split Gewebesuspension gleichmäßig in zwei sterile 15-ml-Röhrchen (~ 10 ml jeweils) und langsam verreiben eine 10 ml-Pipette (10 mal), bis die Suspension trüb / milchig wird. Halten Sie suspendierten Zellen auf Eis, während das nächste Rohr zu verarbeiten. Warten für 3 min bis verbleibenden verdauten CNS Sediments zum Boden des Röhrchens Gewebe. Den Überstand zu reinigen 50-ml-Röhrchen, ohne dass die Pelletfraktion zu stören.
- Optional trübe Überstand durch 40-Mikron-Zelle Sieb passieren und die resultierende Einzelzellsuspension in sterile 50-ml-Röhrchen auf Eis kombinieren.
- Spin Zellaufschlämmung für 5 Minuten bei 200 × g, 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand einer 10 ml Pipette bis ~ 2 ml Medium Sezieren auf dem Zellpellet gelassen werden.
- Finger Flick Zellpellets in 50-ml-Röhrchen (~ 10-mal). Langsam 5 ml warmem Wachstumsmedium hinzufügen zu der Zellsuspension (siehe Tabelle 1) , während sanftHand wirbeln die Röhre.
- Optional DNase Schritt 4.3.12 für weitere 10 Minuten auf Eis mit frischen DNase I - Lösung und MgSO 4 -Lösung bei sichtbaren Gewebe Cluster oder DNA Klumpen wiederholen. Swirl Rohr manuell 5-mal pro Sekunde min.
- Platte 50.000 Zellen pro 25 mm Deckglas in einer Pfütze von 400 & mgr; l Wachstumsmedium in einer 6-Well - Platte und lassen Sie Zellen für 30 min in einer Zellkultur - Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) befestigen.
- Für konfluent (innerhalb 24 - 48 Stunden nach der Plattierung) 60 mm Zellkulturschalen und 75 cm 2 Gewebekulturflaschen, Platte 500.000 Zellen (60 - mm - Schale) oder 2 Millionen Zellen (75 cm 2 Kolben).
- Fügen Sie vorsichtig 2 ml (pro Well, 25 mm Glasplättchen in 6-Well - Platte), 3 ml (60 - mm - Schalen) oder 10 ml (75 cm 2 Kolben) des warmen Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung. Inkubieren Zellen über Nacht und Medium vollständig am nächsten Morgen ändern. Dann Medium jeden zweiten Tag ändern (Tag 3, Tag 5, Tag 7, etc.).
Neinte: Ratte gemischten Gliazellen Kulturen sind bereit für Immunzytochemie zu verwenden oder Biochemie von 24 bis 48 Stunden nach der Beschichtung.
- Identisch mit dem Sezieren von neugeborenen Ratten Gehirne in den Abschnitten 4.3.1 bis 4.3.6, enthaupten P0 Neugeborenen WT und NCAM KO - Mäusen mit C57 / Bl6 Hintergrund, entfernen Sie Gehirne und steckte sie in eiskaltes Sezieren Medium (siehe Tabelle 1). Halten Gewebe auf Eis zu allen Zeiten.
- Teilen Sie die Gehirn- entlang der Mittellinie in zwei Gehirnhälften und anschließend abgeschnitten Riechkolben, Basalganglien unter der Hirnrinde und der Hippocampus mit Dumont Pinzette. Legen Sie die isolierte Hirnrinde in einer sauberen Petrischale mit HBSS auf Eis.
- Nehmen Sie eine Hirnrinde. Entfernen Sie die Meningen mit einer Pinzette mit feinen Spitzen unter einem Präpariermikroskop. Wiederholen Sie mit den restlichen Rinden. Legen Sie alle Hirnhaut frei Rinden in eine saubere Petrischale auf Eis.
- Übertragen Sie kortikalen hemispheres mit 1 ml Pipette aus jeder Maus in getrennten, sterilen 15-ml-Röhrchen. In 1,2 ml eiskaltem Sezieren Medium zu jedem Gehirn und stören mechanisch das Hirngewebe durch Pipettieren es 2-mal nach oben und unten eine 1 ml Pipettenspitze.
- Zugabe von 150 & mgr; l Papain - Lösung (10 mg / ml in PBS), 100 & mgr; l DNase I - Lösung (1 mg / ml in HBSS) und 50 & mgr; l MgSO 4 (3,82% in HBSS) zu jedem Gehirn und mischen durch Finger Schnippen.
- Inkubieren Sie die Gehirnsuspension für 30 Minuten bei 37 ° C in einem Wasserbad und mischen jede Sekunde Minute durch Finger Schnippen Gehirn Suspensionen. 1 ml FBS pro Röhrchen, mischen und die Gewebesuspension auf Eis für 10 Minuten abkühlen lassen.
- Spin down das Hirngewebe für 4 min bei 200 × g, 4 ° C und resuspendieren Gewebepellet in 1 ml eiskaltem Sezieren Puffer , ergänzt mit 70 & mgr; l DNase I - Lösung (1 mg / ml in HBSS) und 30 & mgr; l MgSO 4 -Lösung (3,82% in HBSS).
- Man reibt das Hirngewebe mit einem FBS-beschichteten 1 ml Pipettenspitze(~ 5 mal), bis der Überstand trüb wird. Führen Sie den Überstand durch ein 40-Mikron-Zelle Sieb und Transfer in ein sauberes Röhrchen auf Eis.
- Pelletierung gemischt Gliazellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 xg, 4 ºC. Überstand wird abgesaugt, bis ~ 100 & mgr; l Medium werden auf der Oberseite der Zellpellet gelassen. Resuspendieren Zellpellet mit dem Finger schnippen (~ 5 - mal) und 1 ml warme Maus - Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1).
- Optional sichtbare Zellclustern und lysierten Zellen auflösen / gefällte DNA durch sanft die Zellsuspension bis Pipettieren und nach unten (fünf Mal).
- 4.3.21 - Plate Maus gemischten Gliazellen auf PDL-beschichteten Glasplättchen oder 60-mm-Schalen wie in den Schritten 4.3.19 beschrieben. Wash-Zellen am nächsten Morgen mit warmem Maus Wachstumsmedium und anschließend jeden zweiten Tag. Maus gemischten Glia ist bereit für Immunzytochemie 48 zu verwenden - 72 Stunden nach der Plattierung.
- Kultur Ratte gemischtGlia in 75 cm 2 Gewebekulturflaschen in Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1) für 10 Tage. Schütteln Mikroglia Zellcluster von gemischten Gliakulturen auf einem Rotationsschüttler in einem Zellkultur - Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) bei 140 rpm für 1 Stunde ab.
- Nehmen Sie die Mikroglia-haltige Überstand aus gemischt Glia-Kulturen ab, passieren sie durch ein 40-Mikron-Sieb Zelle und halten Sie die Zellsuspension in sterile 50-ml-Röhrchen.
Hinweis: Mikroglia-Kulturen nach diesem Schritt mit wenigen verunreinigenden OPCs und nur sehr wenige Astrozyten typischerweise> 95% rein sind. - Optional Wachstumsmedium auf gemischten Gliazellen Kulturen für zukünftige Mikroglia-Shake-offs zu ersetzen. Typischerweise führen mehrere Mikroglia-Shake-offs (einmal pro Woche) aus gemischten Glia-Kulturen.
- Optional zu Reinheiten größer 95% Platte 10 ml der Mikroglia-haltigen Überstand (Schritt 4.5.2) pro 100 mm Petrischalen erhalten und für 30 min bei 37 ºC in einem Zellkulturbrutschrank inkubieren. Nur microglia wird auf Petrischalen befestigen, während Astrozyten und OPCs im Überstand verbleiben.
- Schütteln Sie Petrischalen im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn (fünf Mal pro Stück) in der Zellkultur Kapuze. Aspirat Zellkulturmedium vollständig und mit 10 ml Wachstumsmedium ersetzt. Resultierende Mikroglia Kulturen> 98% rein.
- Kultur Mikroglia für bis zu 7 Tage in DMEM, ergänzt mit 1% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Zu erhalten hochangereicherten OPC Kulturen Mikroglia - Zellen zuerst aus 10 Tage alten Misch in 75 cm 2 Kolben auf einem Rotationsschüttler in einem Zellkultur - Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) bei 140 rpm für 1 h gezüchtet Gliakulturen abzuschütteln. Entsorgen Sie Mikroglia nur haltige Überstand oder Verwendung für Mikroglia-spezifische Experimente (siehe Schritt 5.5).
- Ersetzen Sie die Mikroglia-enthaltende Überstand mit 10 ml Wachstumsmedium und abschütteln gemischten Glia-Kulturenweitere 18 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 200 Upm (5% CO 2, 37 ° C).
- Sammeln Sie die microglia- und OPC-haltige Überstand aus gemischten Gliazellen Kulturen und durch ein 40-Mikron-Zelle Sieb. Sammeln Sie die Zellsuspension in sterile 50-ml-Röhrchen.
- Optional Wachstumsmedium auf gemischten Glia-Kulturen für zukünftige OPC-Shake-offs zu ersetzen.
Hinweis: OPCs weiterhin auf astrozytären Feeder-Schichten zu vermehren und geschüttelt-off ein zweites und drittes Mal werden kann (einmal pro Woche), wenn auch mit geringeren Erträgen. - Platte 10 ml des microglia- und OPC-haltige Überstand in 100 mm Petrischalen und für 30 min bei 37 ºC in Zellkulturbrutschrank inkubieren. Mikrogliazellen werden in die Petrischalen befestigen, während OPCs und Astrozyten im Überstand verbleiben.
- Schütteln Sie Petrischalen und gegen den Uhrzeigersinn (5-mal pro Stück) in einer Zellkultur Kapuze. Nehmen Sie nur ein paar Petrischalen in einer Zeit von Zellkultur-Inkubator (Mikroglia startet von Pet Verdrängenri Gerichte, wenn sie in kühleren Medium kräftig geschüttelt).
- Sammeln und kombinieren, um die OPC-haltige Überstand in 50-ml-Röhrchen. Optional Kulturmedium zu Petrischalen für den Einsatz in Mikroglia-spezifische Experimente hinzufügen.
- Optional, um die Reinheit von OPC Kulturen erhöhen einmal wiederholen Sie die Schritte 5.6.5 und 5.6.6 mit frischen Gerichten Petri das Ausmaß der Mikroglia in OPC-Präparaten zu senken.
- Spin down angereicherte OPC-haltige Überstand in Zentrifuge für 5 Minuten bei 250 × g, 4 ° C. aspirieren Den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören. Verlassen 3 ml des Überstandes auf der Oberseite des Pellets und starten OPCs durch Finger Schnippen Resuspendieren (10 mal).
- Sanft triturate OPC Zellcluster durch eine 10 ml-Pipette (von 5 bis 10 mal).
- Zählen von Zellen und die Platte 50.000 OPCs pro 25 mm Deckglas (PDL-coated) in einer Pfütze von 400 & mgr; l Wachstumsmedium in einer 6-Well - Platte und lassen Zellen für 30 min in einem Zellkulturbrutschrank attach (5% CO 2, 376; C). Fügen Sie vorsichtig 2 ml warmem Proliferationsmedium zu jeder Vertiefung (siehe Tabelle 1). Für 60 mm Zellkulturschalen PDL beschichtet, Platte 1-1500000 OPCs in 3 ml Proliferationsmedium.
- Sorgfältig ersetzen nach Proliferationsmedium mit frischem Proliferationsmedium 3 hr-FBS die OPCs Plattierung (stellen Sie sicher, richtig angebracht OPCs und nicht während der Mediumwechsel entfernen). Austauschmedium jeden zweiten Tag.
Hinweis: Ratte OPC Kulturen mit diesem Protokoll vorbereitet sind in der Regel 90% rein mit Mikroglia als Haupt verunreinigenden Zelltyp, gefolgt von Astrozyten.
5. Immunzytochemie Mit HIgM12 in primären Gliazellen
- Dreifach-label Immunofluoreszenz mit HIgM12, Anti-PSA - mAb und Zelltyp spezifischen Markern in Primary Gliazellen von WT und NCAM KO Mäuse
- Unter lebenden Zellen Bedingungen Etikett Maus 60% konfluent gemischt Glia-Kulturen von WT und NCAM KO-Mäuse auf PDL-beschichteten gewachsen25 mm Glasdeckgläsern mit HIgM12 (10 ug / ml) und anti-PSA mAb (Klon 2-2B) (10 ug / ml) in PBS, supplementiert mit 10% FBS bei 4 ºC für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen dreimal für 20 Sekunden jeweils mit eiskaltem PBS mit 10% FBS und fixieren mit 4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, für 15 Minuten bei 25 ° C.
- Waschen fixierten Zellen zweimal für jeweils 1 min mit PBS mit 10% FBS ergänzt und permeabilisieren Zellen mit 0,1% Triton-X100 in PBS, pH 7,4 für 2 min bei 25 ºC. Waschen Sie die Zellen zweimal für 1 min und Etikett mit Glia Marker GFAP (Astrozyten) oder IBA-1 (Mikroglia) (1 ug / ml) in PBS, ergänzt mit 10% FBS über Nacht bei 4 ° C im Kühlraum.
- Fahren Sie mit dem Standard Immunofluoreszenz Bedingungen einschließlich DAPI-haltiges Medium Montage 31.
Hinweis: Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Fab 2 - Fragmente als Sekundärantikörper für den menschlichen (HIgM12) und Maus (Anti-PSA - mAb, Klon 2 - 2B) IgMs wird dringend empfohlen. - Nehmen Sie fluorescent Bilder bei 60X oder 100-facher Vergrößerung. Verwenden Sie die gleichen Geräteeinstellungen für alle Bilder und Prozessbilder identisch.
- Immunofluoreszenz - Markierung von ENDO-NF-behandelten Zellen WT Glia HIgM12 als primärer Antikörper verwendet
- Kultur WT Maus gemischt Glia für 3 Tage in Neurobasal A gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS und B27 Supplement (1:50) auf PDL-beschichtete 25 mm Glasplättchen. Hinzufügen ENDO-NF (30 & mgr; g / ml) zu 1 ml Kulturmedium und Inkubation über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
- Label-Zellen leben in der Kälte mit HIgM12 und interne astrozytären Marker GFAP nach der Fixierung und Permeabilisierung wie in den Schritten 5.1.1 bis 5.1.5 beschrieben. Nehmen Fluoreszenzbilder bei 60X oder 100-facher Vergrößerung. Verwenden Sie die gleichen Geräteeinstellungen für alle Bilder und identisch verarbeiten.
Representative Results
Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele von Ergebnissen, die durch das Studium menschlicher IgM-spezifischen PSA-Antigene im ZNS erhalten werden kann. Die Verwendung von menschlichen IgM-Antikörpern mit spezifischen Leichtketten V & kgr; in biochemisch-Einstellungen und durch Fluoreszenz Immunzytochemie gezeigt.
HIgM12 immunopräzipitiert sein Antigen von zerebralen Hirn Lysaten und fungiert als Agent (primärer Antikörper) in Western-Blots nachzuweisen. Weder Isotypkontrollantikörper noch Agarose L Perlen Immunpräzipitation ein ähnliches Antigen, das die Spezifität des Pull - Down (Abbildung 1) zeigt. Western - Blots unter Verwendung von CNS Lysaten von WT und NCAM KO - Mäusen zeigen die Spezifität von HIgM12-Bindung an PSA-NCAM enthält (2A). Die enzymatische Verdauung von ZNS - Gewebe von WT - Mäusen mit ENDO-NF identifiziert PSA an NCAM als die spezifische Bindung Epitop für HIgM12 (2B). Unter Verwendung des Verfahrens , die hier beschrieben, IBA-1-positive Ratte Mikroglia - Kulturen von hoher Reinheit erhalten (Abbildung 3). Im Handel erhältliche Anti-PSA-Antikörper (Klon 2-2B) beschriften nicht Zelloberfläche oder interne PSA-Pools in fixiert und permeabilisiert IBA-1-positive Mikroglia-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie. In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Literatur, die berichtet , keine Zelloberflächenexpression von PSA-NCAM in Mikroglia 16,41 HIgM12 nicht Zelloberflächenantigene in gereinigter Ratten - Mikroglia nicht beschriften. Interessanterweise HIgM12 Kennzeichnung fixiert und permeabilisiert Mikroglia führt zu einer intrazellulären, perinukleären Muster , das nicht auf spezifische Organellen beschränkt ist (Abbildung 3). Ergebnisse sind im Gegensatz zu denen ein Anti-PSA - IgG - Antikörper , erhalten unter Verwendung (Klon 735) 26, die auf der Ebene des Golgi - 41 PSA-SynCAM in Mikroglia abzielt.
Im Gegensatz zu Mikrogliazellen, HIgM12und A2B5 Zielzellenoberflächenantigene in hoch angereicherter Ratte OPC Kulturen unter Lebendzellbedingungen (Abbildung 4). OPC - Kulturen enthalten ~ 5% Mikroglia - Zellen kontaminiert. 5 veranschaulicht eine nahezu identische Zelloberflächenfärbungsmuster zwischen HIgM12 und anti-PSA mAb (Klon 2-2B) in GFAP-positive Astrozyten (5A). Immunofluoreszenz - Markierung von ENDO-NF-verdaute WT Astrozyten verglichen mit Kontrolle behandelten WT Astrozyten zwischenzuspeichern Verwendung HIgM12 das Vorhandensein von Astrozyten PSA (5B) zeigt. Das Vorhandensein von PSA-positive Astrozyten in vivo muss noch bestätigt werden.
Abbildung 1: HIgM12 fungiert als "Pull-down" Agent in Immunpräzipitationen Immunpräzipitationen von insgesamt Gehirn Lysat von drei Monate alten Mäusen mit HIgM12, menschliche Isotypenkontrolle HIgM.126 oder Agarose L Perlen nur als "pull down" Agenten. Die eluierten Proteine wurden in Western-Blots mit Membranen sondiert gegen HIgM12 laufen. Molekulargewichte von eluierten Proteine aus HIgM12 beschichteten Kügelchen waren im Bereich von 160-200 kDa zusätzlich zu der IgMs schweren Kette (~ 65-73 kDa). Diese Zahl wurde von J. geändert Neurochem. 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: HIgM12 Ziele der Polysialinsäure (PSA) -Einheit auf NCAM. A. Hirnhomogenate von P7, P13, P16 und P27 NCAM insgesamt KO - Mäuse und heterozygote littermate Kontrollen wurden in Western - Blots mit Membranen gegen HIgM12, PSA und β-Aktin als Ladekontrolle sondiert laufen.
Abbildung 3: Die Abwesenheit von PSA auf Ratten - Mikroglia wird durch einen Mangel an HIgM12 Labeling Gespiegelte Ratte Mikroglia für 48 Stunden auf Poly-D-Lysin beschichtete Glasplättchen und entweder markiert live auf Eis mit HIgM12 oder nach der Fixierung mit HIgM12 oder anti kultiviert. -PSA mAb (Klon 2-2B). Zellen wurden triple mit Mikroglia Marker IBA-1 (grün) markiert, HIgM12 / PSA (rot) und DAPI (blau). Bilder zeigen Mangel an Mikroglia-Zelloberfläche mit HIgM12 (obere Reihe) und das Fehlen von anti-PSA-Bindung (Klon 2-2B) auf der Zelloberfläche und internen Speicher in primären Ratten-Mikroglia (untere Reihe) verbindlich. Basierend auf bipolare Morphologie und das Fehlen von IBA-1-Färbung, die kleine PSA-positive Zelle (untere Reihe) wurde vorgeschlagen, ein OPC zu sein. In fixierten Zellen führte HIgM12 Färbung in einem punktualisierte, perinukleären Muster , das nicht auf bestimmte Organellen beschränkt wurde und unspezifische Bindung (mittlere Reihe) betrachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: HIgM12 Targets Zelloberfläche PSA-NCAM auf Rat OPCs Rat OPCs und Mikroglia waren cultu.rot für 4 Tage in Proliferationsmedium auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasplättchen und dreifach live auf Eis mit HIgM12 oder A2B5 (grün), interne Makrophagen / Monozyten-Marker CD68 (Klon ED-1) (rot) und DAPI (blau) gekennzeichnet . Bilder zeigen Zellpopulationen majorly positiv für OPC-Marker A2B5 (obere Reihe) und HIgM12 (untere Reihe) mit wenigen CD68-positive Mikroglia (~ 5%). Phasenkontrast und DAPI Bilder wurden hinzugefügt , um die Integrität der Zelle und Zellzahlen für jede Population zeigen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: HIgM12 und Anti-PSA - mAb eine Astrozytäre Subpopulation in Maus Mixed Glia Co-beschriften. A. Maus gemischten Gliazellen von WT und NCAM insgesamt KO Tiere Astrozyten, Oligodendrozyten-Linie Zellen und microg enthältlia waren für 3 Tage kultiviert und live auf Eis mit HIgM12 (grün), Anti-PSA-mAb (Klon 2-2B) (rot) und anschließend für astrozytären Marker GFAP (lila) und DAPI (blau) markiert. HIgM12 und anti-PSA zeigen eine virtuelle identische Färbemuster auf GFAP-positive Astrozyten WT aber an kultivierte Astrozyten von NCAM KO-Mäusen ermangeln Bindung. Diese Zahl wurde von J. geändert Neurochem. 15. B. Misch Gliazellen wurden identisch kultiviert wie unter A. beschrieben und über Nacht mit endoneuraminidase-NF (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Martina Muehlenhoff) oder PBS - Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden live auf Eis mit HIgM12 (grün) und anschließend gefärbt für interne Marker GFAP (rot) und DAPI (blau) markiert. HIgM12 zielt auf Zelloberflächenantigene auf PBS-Kontrolle gemischten Glia-Kulturen behandelt, aber nicht endoneuraminidase-NF gemischten Glia behandelt. Diese Zahl wurde von JNSCI modifiziert 16. Plerleichtern klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Alle Bilder wurden mit 60facher Vergrößerung unter Verwendung der gleichen Geräteeinstellungen und verarbeitet identisch übernommen.
Tabelle 1:. Buffer und Lösung Rezepte Bitte hier klicken , um diese Tabelle zu laden.
| ZNS - Gewebe | ENDO-NF / PBS | Lysepuffer | Volle Lautstärke | |
| 1. WT Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | 2 ul (12 ug) ENDO-NF | 7,55 ul | 10 ul |
| 2. WT Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | 2 & mgr; l PBS | 7,55 ul | 10 ul |
| 3. WT Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | kein PBS oder ENDO-NF | 9,55 ul | 10 ul |
| 4. NCAM KO Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | 2 ul (12 ug) ENDO-NF | 7,55 ul | 10 ul |
| 5. NCAM KO Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | 2 & mgr; l PBS | 7,55 ul | 10 ul |
| 6. NCAM KO Maus | 67 & mgr; g (0,45 & mgr; l) | kein PBS oder ENDO-NF | 9,55 ul | 10 ul |
Tabelle 2: ENDO-NF Verdauung von ZNS - Gewebe von P7 WT und NCAM KO - Mäuse.
Discussion
Natürliche menschliche IgM - Autoantikörper sind ansprechend Kandidaten für Immuntherapien und haben sich für die Behandlung verschiedener Krankheiten einschließlich Krebs und Erkrankungen des ZNS 1-7 therapeutisches Potential nachgewiesen. Vorteilhafterweise werden diese Antikörper keine Immunantwort in dem die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern reduziert wesentlich die wirksame therapeutische Dosis und Wirksamkeit hervorzurufen. Wichtig ist , dass alle Antikörper mit therapeutischem Potential des Isotyps IgM gewesen und gehören zu den NKV Repertoire 3-5,8,9,37,40,42-45. Eine große Hürde für die potentielle klinische Anwendung von IgM-Antikörpern ist die Identifizierung der Antigene, die in vielen Fällen nicht bestimmt werden. Standardtechniken für die IgG-Antikörper eingesetzt werden, sind oft nicht anwendbar, ein IgM des Antigens zu identifizieren.
Dieses Protokoll beschreibt die Identifizierung von PSA-NCAM als Antigen für die regenerative menschlichen IgM-Antikörper HIgM12, wirksam in Tiermodellenvon MS und ALS 15-18. Die angewandte Methodik ist prinzipiell für alle humanen Antikörpern mit spezifischen V & kgr; leichten Ketten VκI, VκIII und VκIV und Maus-Antikörper mit VκI leichten Ketten, unabhängig von der Isotyp des Antikörpers.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von IgM-Antikörpern bei der Affinitätschromatographie-Anwendungen. Genauer gesagt sind erfolgreiche Antikörper erforderlich als Pull-down-Mittel in Immunpräzipitationen handeln ein Antigen aus komplexen Gewebe- oder Zellkultur-Lysaten zu isolieren oder anzureichern. Angereichert Antigenfraktionen können zu Immunpräzipitationen von Isotypenkontrolle Antikörpern und anschließend analysiert, um Unterschiede durch Massenspektrometrie verglichen werden. Eine wesentliche Anforderung oder die Begrenzung dieses Schrittes ist die Gegenwart des korrekten Antikörpers V & kgr; leichte Kette und Wirt (Mensch, Maus) Antikörperbindung an Protein L-Agarose zu ermöglichen. Die Verwendung von Mannan-bindendes Protein an Agarose gebunden (auch called Mannose-bindendes Lektin) anstelle von Protein L Agarose ist eine mögliche Alternative IgMs ohne spezifische V & kgr; leichten Ketten zu Immunpräzipitation. Jedoch ist , wie von Arnold et al angegeben. 35, Antigen-gebundenen IgM - Antikörper binden nicht an Mannan-bindendes Protein, wie es die Ziel Glykan unzugänglich zu werden scheinen , sobald das IgM an sein Antigen gebunden hat. Basierend auf diesen Ergebnissen Protein Mannan-binding kann nicht als Bindematrix eingesetzt werden IgM zu immunpräzipitieren Antigen-beladenen 35 Molekülen. Andere mögliche Alternativen könnte die Verwendung von sekundären Agarose-gebundenen anti-IgM - Antikörper IgG 46,47 oder die Verwendung von oberflächenaktivierte magnetische Kügelchen 48 sein. IgG-Antikörper gegen IgM konnte chemisch vernetzt werden, um eine oder Agarose G, um an Agarose, das Ausmaß der eluierten Antikörper zusammen mit dem Antigen von Interesse zu reduzieren. Eine richtige Vergleich zwischen verschiedenen Varianten von IgM-Immunpräzipitation in Bezug auf i erfolgreich identifizierten Antigenes schwierig, weil die meisten Immunpräzipitationen durchgeführt wurden, zu isolieren oder IgMs ohne weiteres Interesse an ihre Antigene erschöpfen. Zusätzlich wurden Immunpräzipitationen unter Verwendung IgMs hauptsächlich 49 eine bereits bekannte oder erwartete einzelnes Antigen mit Antikörper Exposition gegenüber gereinigter Antigene zu bestätigen. Nachteilig an Agarose-gekoppelter IgGs gegen menschliche IgMs gerichtet ist , eine sehr geringe Ausbeute (10 bis 15%) der immunpräzipitierten Serummoleküle IgM , wenn dem Ausgangsmaterial 50 verglichen. Im Gegensatz dazu oberflächenaktivierte magnetische Kügelchen wurden erfolgreich an Antikörper verschiedener Isotypen angewendet einschließlich IgM 48 Scrapie-assoziierten Fibrillen Immunpräzipitation. Dieses Verfahren ist nicht auf bestimmte kappa (V & kappa;) oder Lambda (λ) -Ketten oder einen bestimmten Host beschränkt und kann im Wesentlichen das Spektrum der IgM Antikörper in Immunpräzipitationen verwendet verbreitern.
Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist die Fähigkeit des Antikörpers als det zu funktionierenektierender Antikörper (primärer Antikörper) in Western-Blots oder anderen Screening-Plattformen. Erfolgreiche Antikörper müssen ihre Antigen mit ausreichend hoher Affinität Zielantigenbindung in Gegenwart von nichtionischen oder möglicherweise ionische Detergenzien zu ermöglichen. Antikörper mit hoher Affinität sind häufig bei Affinitäts-gereifte IgG-Antikörpern, aber weniger häufig bei Antikörpern vom IgM-Isotyp, der einer der Gründe ist, warum es gibt relativ wenige kommerziell erhältlichen IgM Antikörper als Mittel in biochemischen Einstellungen erfassen. Hochaffine Bindung von Antikörpern ist eine Voraussetzung für Immunpräzipitationen von molekularen Antigenen und zum Western-Blotting. Absenken Detergenzkonzentrationen oder vollständiger Abwesenheit von Detergentien in IP-Puffer und Lysepuffer ermöglicht Antigen durch niederaffinen Antikörpern über ihre Fab-Domäne Targeting. Im Gegensatz dazu wird der Antikörper die Fähigkeit Protein L-Agarose über seinen Fc-Teil zum Ziel nicht wesentlich unter Isotypkontrollen über einen Bereich verschiedener Waschmittel Konzen betroffentrationen. Jedoch Puffer niedriger Waschmittelkonzentration in Lysepuffer und IP verhindert Zellmembran Unterbrechung und Isolierung von spezifischen Molekülen. In ähnlicher Weise eine geringe Detergenskonzentration in Western - Blot - Wasch - Puffer (zB PBS-T) erlaubt Antigenbindung von niederaffinen Antikörpern , aber zur gleichen Zeit erhöht unspezifische Bindung und ist daher nicht in Frage .
Die Anwesenheit eines Antigens Proteinkern ist eine weitere Voraussetzung für diese Methode. Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen (zB Glykoproteine, Lipoproteine) und unmodifizierten Proteine, aber nicht alleinige Lipiden oder Kohlenhydraten, sind nachweisbar in Western Blots. Es ist nicht möglich , Lipide zu immunpräzipitieren (beispielsweise um Sphingolipide) aus Gewebe oder Zell - Lysaten in der Gegenwart oder Abwesenheit von Detergenzien. Die physikochemischen Eigenschaften von Detergenzien und Lipide sind zu ähnlich selektive lipid-Antikörper-Wechselwirkungen zu ermöglichen, während gleichzeitig die Detergenzien sind wesentlich zu störenMembranen, um selektive Isolierung von spezifischen Molekülen zu ermöglichen. Nach unserem besten Wissen, Immunpräzipitationen ausschließlich aus Kohlenhydraten besteht, in Abwesenheit eines Proteinkern, sind bisher nicht berichtet worden. Dies wird besonders relevant, da IgM-Antikörper häufig Kohlenhydrate und Glycolipiden Target, die nicht notwendigerweise auf eine Proteineinheit verbunden. Andere chromatographische Techniken sind für die Trennung und immunologische Identifizierung von Lipiden und Kohlenhydraten in Abwesenheit eines Proteinkern erforderlich. Zum Beispiel Dünnschichtchromatographie (TLC) der zellulären Lipiden mit anschließender Antikörper - Nachweis auf der DC - Platte (immuno-TLC) können 51,52 realisiert werden.
Andere anti-PSA-Antikörper wurden in früheren Studien und Ergebnisse im Vergleich mit HIgM12 sowie die im Handel erhältlichen anti-PSA IgM (Klon 2-2B) beschrieben worden. Die am häufigsten verwendeten Antikörper auf dem Gebiet der PSA ist ein IgG-Antikörper (Klon 735), erhältlich als Maus-Mono-Clonal oder Kaninchen polyklonalen Antikörper 53. Diese Anti-PSA - IgG - Antikörper erkennt PSA auf SynCAM und NCAM auf verschiedenen ZNS - Zelltypen , einschließlich Mikroglia - Zellen 41. Im Gegensatz zu dem Antikörper anti-PSA-IgG, Human-IgM-Antikörper HIgM12, HIgM42 und die anti-PSA-Maus IgM (Klon 2-2B) sind nicht in der Lage PSA auf SynCAM Ziel (aber auf NCAM) bei verschiedenen embryonalen und frühen postnatalen Stadien in Mäusen , während nicht-polysialylierte SynCAM ist leicht nachweisbar 15. Die IgM - Antikörper verwendet werden , sind auch nicht in der Lage PSA auf Mikroglia - Zellen nachzuweisen (Figuren 3 + 4). Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den beobachteten Antikörper-Isotypen können geringe PSA-SynCAM Ebenen im Vergleich zu Mengen an PSA-NCAM mit der potentiell geringere Affinität kombiniert Bindung von IgM-Antikörpern im Vergleich zu dem Anti-PSA-IgG. Um diese Hypothese zu testen, führten wir Immunpräzipitationen in NCAM KO Tiere an embryonalen Stadium E17 mit großen Mengen an SynCAM vorhanden und verwendet HIgM12 als "Pull-Down-Agenten" <sup> 15. In E17 WT littermate steuert HIgM12 immunpräzipitiert PSA-NCAM in einem Ausmaß, die ähnliche Intensitäten von "heruntergezogen" PSA-NCAM zeigte im Vergleich zum IgMs schweren Kette, wie durch Densitometrie in nachfolgenden Western-Blot unter Verwendung von eluierten Antigene nachgewiesen. Dieses Ergebnis schlug mindestens eine ausreichende Affinität von HIgM12 an seine Ziel PSA. Im Gegensatz zu WT littermate steuert HIgM12 nicht PSA SynCAM in NCAM KO Tieren angebracht erkannt hat. Identische Ergebnisse wurden in Immunpräzipitationen unter Verwendung des menschlichen Anti-PSA IgM HIgM42 erhalten. HIgM12 und HIgM42 sowie die Maus-Anti-PSA-IgM (Klon 2-2B) waren nicht in der Lage PSA auf SynCAM in Western-Blots an embryonalen und postnatalen Entwicklungsstadien von WT und NCAM KO Tiere zu zielen. In Anbetracht der geringen Menge an HIgM12 erforderlich (0,1 ug / ml) , um speziell PSA erkennen an NCAM in Western - Blots unter Verwendung von geringen Mengen von ZNS - Gewebe (0,1 ug ZNS - Gewebe pro Vertiefung) 15 scheint es unwahrscheinlich zu sein , dass niedrige Affinitäten alleinverantwortlich für völlige Fehlen von PSA-SynCAM Erkennung von HIgM12 in drei verschiedenen Methoden.
Wir schließen daraus, dass es signifikante Unterschiede zwischen den Anti-PSA-IgM-Antikörper und der häufig veröffentlicht anti-PSA-IgG-Antikörper (Klon 735). Es ist nicht klar, warum handelsüblichen anti-PSA-IgM-Antikörper nicht häufiger in der Vergangenheit verwendet wurden Ergebnisse mit Antikörper antiPSA IgG 735. Dies ist besonders interessant, erhalten, um zu bestätigen, weil HIgM12 bereits Wirksamkeit in verschiedenen Krankheitsmodellen erwiesen hat. Während andere Anti-PSA-IgM-Antikörper ähnliche therapeutische Wirkungen haben können bleibt unklar, ob die Anti-PSA-IgG-Antikörper (Klon 735) eine ähnliche therapeutische Ergebnis in Modellen der MS und ALS hat.
Kurz gesagt, wurden hier in erster Linie zu identifizieren, die das Antigen des Regenerativ-menschlichen Antikörpers HIgM12 unterstützen potentielle klinische Studien für MS und möglicherweise andere neurodegenerative Erkrankungen beschriebenen Verfahren verwendet. Die Identifizierung der Ameiseigens für Antikörper mit der biologischen Aktivität ist, als wesentlichen Schritt ihres Wirkmechanismus zu verstehen. Dies wird besonders relevant im Zusammenhang mit zahlreichen monoklonalen Antikörpern zur Zeit für die Sicherheit und Wirksamkeit in Studien am Menschen getestet. Während die Anzahl der klinisch getestet IgM Antikörper bisher klein ist, die jüngsten Fortschritte in Hybridom - Technologie zusammen mit einer steigenden Anzahl von Studien , die die therapeutische Potential dieses Antikörperklasse Hervorhebung 1-10,37,40,42-45 fordert die Entwicklung neuer oder modifizierte Methoden anwendbar nicht-Protein-IgM-Antigene zu identifizieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 und R21 NS073684) unterstützt wurde, der National Science Foundation (Career Award), die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics, der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) und der Mayo-Klinik Zentrum für Klinische und Translational Science (CCATS). Die Autoren erkennen an Unterstützung von den Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Foundations, dem Mond und Marilyn Park Directorship Fonds und der McNeilus Familie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
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