Introduction
Anticorpi di isotipo IgM dimostrano grande potenziale terapeutico per il trattamento di varie malattie compresi il cancro e disturbi del SNC 1-7. Il gruppo Vollmers 'identificato numerosi anticorpi nei pazienti affetti da cancro per l'uso potenziale come biomarcatori specifici tumorali o terapie attivi che sono in grado di uccidere le cellule maligne inducendo percorsi apoptotici 4,8,9. È interessante notare che tutti gli anticorpi identificati con potenziale terapeutico sono di isotipo IgM e appartengono al gruppo di "anticorpi naturali" (BA).
Allo stesso modo, il gruppo del Rodriguez identificato mouse e anticorpi umani che stimolano la rimielinizzazione nelle lesioni del midollo spinale cronica demielinizzati in modelli di sclerosi multipla (SM). Identico al anticorpi con effetti anti-cancro, tutti gli anticorpi rimielinizzazione di promozione sono NAbs e di isotipo IgM 1,6,7,10. Gli antigeni precise per IgM più identificati sono ancora undetermined compreso l'anticorpo remyelination di promozione umana rHIgM22, attualmente in fase I di sperimentazione clinica per i pazienti affetti da SM 11. Nonostante i ripetuti sforzi da parte di esperti in materia di lipidi e carboidrati di ricerca sia in ambito accademico e in collaborazione con l'industria 11, i tentativi di individuare l'antigene di rHIgM22 non hanno avuto successo. Il fallimento delle tecniche standard utilizzati per identificare gli antigeni di anticorpi IgG a lavorare con anticorpi IgM identifica una necessità critica per affinare metodi specifici per questi anticorpi che molto probabilmente carboidrati di destinazione o lipidi antigeni.
Il focus di questo manoscritto è l'anticorpo umano rigenerativa HIgM12 e le procedure sperimentali utilizzate per identificare il suo antigene. Anticorpo HIgM12 è stata identificata da pazienti con macroglobulinemia di Waldenstrom, stimola la crescita dei neuriti in vitro 12-14 e si rivolge acido polysialic (PSA) attaccato alla molecola di adesione delle cellule neurali (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 estende la durata della vita in un modello murino di SLA 17 e migliora risultato funzionale nel virus murino encefalomielite di Theiler (TMEV) topi -infected. In particolare, HIgM12 stimola l'attività del motore orizzontale e verticale spontanea nei topi e aumenta cronicamente demielinizzati numero di diametro piccole e medie assoni del midollo spinale otto settimane dopo una singola, a basso dosaggio di intraperitoneale iniettato anticorpi 18.
La molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM) è una glicoproteina di immunoglobuline (Ig) superfamiglia espresso sulla superficie cellulare dei neuroni, glia, muscolo scheletrico e cellule natural killer 19-25. I tre principali isoforme NCAM chiamati NCAM180, NCAM140 e NCAM120, sono varianti di splicing alternativo di un trascritto primario che variano solo nella loro dominio citoplasmatico. All'interno del CNS, NCAM è la principale molecola polysialylated (> 95%) con lunghe omopolimeri carica negativa acido sialico. Polysialic uncid con n> 10 è definito PSA ma le strutture oligomeriche più brevi esistono, che sono anche biologicamente rilevanti. Altre proteine polysialylated espresse nel SNC sono SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 e una subunità del canale del sodio 25 (per una rassegna vedi 29).
I metodi descritti qui consentire l'identificazione antigene per immunoglobuline umane e di topo contenenti (catene leggere VκI, VκIII o VκIV per anticorpi umani e catene leggere VκI per gli anticorpi di topo) specifici kappa (Vκ) catene leggere indipendentemente isotipo del anticorpi (ad esempio, IgG, IgM , IgA, IgD o IgE). Questa limitazione si basa sull'uso di proteine L agarosio per immunoprecipitazione con anticorpi di isotipo IgM. Strategie alternative possono includere lectine mannosio vincolante e secondarie anticorpi IgG anti-IgM covalentemente legati alla agarosio perline, che possono ampliare l'applicabilità di questo metodo per più anticorpi IgM incLuding quelli con catene leggere lambda (λ) (vedi la discussione). Rapporti di catene leggere IgM Vκ siero rispetto alle catene leggere IgM λ derivati da individui sani sono 1,5: 1 30.
In base al metodo cromatografico qui utilizzato per separare, arricchire, e immunologicamente rilevare alcune molecole 31, tutti gli antigeni devono includere almeno un dominio proteina piccola. Specifico epitopo di legame del anticorpo può essere all'interno o all'esterno del dominio di proteine (per esempio, in glicoproteine, lipoproteine). passaggi biochimici iniziale utilizzato per identificare l'antigene specifico per HIgM12, rispettivamente per restringere l'elenco di potenziali candidati, sono i passi più importanti in questo metodo. preparati specifici tipo di cellula e caratterizzazioni morfologia a base di cellule sono descritti per le cellule gliali, ma questa metodologia possono essere estrapolati per accogliere altri tipi di cellule all'interno o al di fuori del sistema nervoso centrale.
Vi è un urgentenecessità di sviluppare nuove o modificate le tecniche applicabili per il crescente numero di anticorpi IgM con un potenziale terapeutico per diverse malattie umane in particolare in quei casi (la maggior parte degli antigeni IgM), dove i bersagli degli anticorpi sono strutture di carboidrati o lipidi.
Protocol
protocolli e le procedure di animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvate dalla cura degli animali e sull'uso di comitati istituzionali della Mayo Clinic (Mayo IACUC numero di protocollo # A51912).
1. Generale CNS Preparazione del tessuto
- Genera NCAM carente (KO) topi su C57 / BL6 sfondo (gentilmente fornito dal Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), i topi eterozigoti NCAM e wild-type (WT) fratellini (C57 / BL6) attraversando eterozigoti. La genotipizzazione dei topi NCAM KO è stato descritto in precedenza 32-34 e non verrà spiegato in ulteriore dettaglio.
Nota: i passaggi 1,2-1,6 sono opzionali.
- Prima dell'intervento, somministrare una soluzione di pentobarbital (immagine: 25 mg / ml; 50/100 ml di pentobarbital per rispettivi stadi adulti postnatale precoce) tramite iniezione intraperitoneale (ago calibro 27 e 1 mlsiringa).
- Attendere per 2 minuti o fino a quando l'animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia. Somministrare anestesia aggiuntiva necessaria nel corso di ogni operazione di mantenere un piano chirurgica di anestesia. Utilizzare punta metodo pinch-risposta per determinare la profondità dell'anestesia. Gli animali devono essere non rispondere prima di continuare.
- Fare un 0,5 - incisione laterale 1 centimetro attraverso il tegumento e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. separare con cura il fegato dal diaframma. Fai una piccola incisione nel diaframma utilizzando una curva, forbici spuntate. Continuare l'incisione membrana lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.
- Posizionare curvi, forbici smussate lungo un lato della gabbia toracica, spostando attentamente i polmoni, e fare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fare un taglio simile sul lato controlaterale. Sollevamento sterno via, tagliare con cura qualsiasi tessuto collegandolo al cuore.
- Fare un'incisione all'animaleE 'per atrio destro usando forbici iris per creare più grande uno sbocco possibile. Iniettare lentamente 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) nel ventricolo sinistro dell'animale (luce rossa; portata: 1 ml / min) utilizzando una siringa da 10 ml dotato di ago calibro 27. Non aumentare il flusso / PBS pressione durante la perfusione per evitare la distruzione dei tessuti.
- Decapitare topi neonati utilizzando forbici chirurgiche.
- Rimuovere il cervello afferrando le orbite con una pinza e con l'inserimento di una piccola forbice nella colonna vertebrale. Tagliare il cranio verso la parte anteriore a livello dell'orecchio. Staccare il cranio e delicatamente mettere il cervello in un piatto 60 millimetri Petri riempite con 10 ml di terreno dissezione ghiacciata su ghiaccio (Tabella 1). Luogo ogni cervello in una provetta da 1,5 ml e subito memorizzare sul ghiaccio secco (-79 ° C).
- Incidere il gambo cervelletto e cervello dai cervelli congelati utilizzando una lama di rasoio pulito sul ghiaccio. Lavorare velocemente per evitare lo scongelamento del tessuto.
- pesare ilcervello congelato, messo in un tubo da 15 ml su ghiaccio e aggiungere tampone di lisi ghiacciata (vedi Tabella 1) ad una concentrazione finale di 150 mg di tessuto cerebrale per microlitri tampone di lisi. Ripetere l'operazione per cerebra rimanente. Mantenere il cervello su ghiaccio in ogni momento per misure 1.9 - 1.11.
- Omogeneizzare cervelli in tampone di lisi da triturazione attraverso un puntale 1 ml (10 volte), seguita da triturazione attraverso una siringa da 5 ml equipaggiato con ago calibro 27 (10 volte). Incubare lisati cerebrali per ulteriori 30 min in ghiaccio per permettere la lisi del tessuto completo.
- Rimuovere il materiale e il cervello lipidi detergente-insolubili attraverso centrifugazione di serie (quattro turni a 19.000 xg per 10 min a 4 ° C). Scartare (bianco) mielina e detriti cellulari contenenti pellet, ma mantenere il surnatante dopo ogni fase di centrifugazione. lisati cervello aliquote e conservare a -80 ° C.
2. Utilizzo immunoprecipitazione IgM umana (HIgM12 e Isotipo controllo IgM) come un "pull-down" Agent dal Cerebral lisati di WT e NCAM KO Mice
- Proteine L Agarosio Bead Preparazione 9,35,36
- Preparare 200 ml di tampone IP tra cui BSA (vedi tabella 1). Preparare altri 200 ml dello stesso tampone IP senza BSA.
- Per immunoprecipitazione trasferimento reazione 100 ml di proteine L agarosio liquame con una pipetta 200 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Non proteine vortice perline L agarosio! Aggiungere 1 ml di tampone IP (vedi Tabella 1) ad ogni provetta. Mescolare Proteine L agarosio e tampone IP manualmente tramite inversione (cinque volte).
- Lavare proteina L agarosio perline quattro volte per centrifugazione in una centrifuga da banco (1000 XG, 2 min, 25 ° C). Togliere il surnatante con una pipetta 200 microlitri senza disturbare il pellet agarosio. Ripetere i passaggi da lavaggio 2.1.2 a 2.1.3 altre tre volte.
- Equilibrare proteina L agarosio in 1 ml di tampone IP appena aggiunto un rullo notte a 4 ° C.
- Antigene-anticorpo-Agarose L formazione del complesso e Antigen Detection in Western Blot
- Incubare 30 mg di tessuto cerebrale lisate (~ 200 microlitri lisato) in 1 ml di tampone IP ghiacciato con 20 mg di anticorpo IgM (HIgM12) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga notte su un rullo a 4 ° C.
- Spin down perline agarosio proteina L (dal punto 2.1.4) in una centrifuga da banco per 2 min a 1000 xg, 4 ° C. Eliminare il surnatante con una pipetta 200 microlitri senza disturbare il pellet agarosio. Aggiungere la soluzione raffreddata anticorpi cervello lisato (dal punto 2.2.1) alla proteina L agarosio usando una pipetta 1 ml.
- Incubare la antigene-anticorpo-proteina sospensione L agarosio per 2 ore su un rullo a 4 ° C. Lavare il complesso antigene-anticorpo attaccato alla agarosio L tramite centrifugazione a 1.000 xg per 2 minuti, 4 ° C. Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 ml di tampone IP ghiacciata contenente 0,2% di BSA.
- Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta utilizzando IP Buffer ghiacciata contenente 0,2% di BSA e altre due volte con tampone IP gelida, senza BSA.
- Spin down complesso antigene-anticorpo attaccato al agarosio L a 1.000 xg per 2 minuti, 4 ° C. Scartare il surnatante completamente prima con una pipetta 200 microlitri fino ~ 50 ml di soluzione vengono lasciati in cima al pellet agarosio proteina L seguita da una pipetta 10 microlitri. I campioni in ghiaccio.
- Aggiungere 40 ml di tampone di eluizione IP (vedi Tabella 1) per provette da 1,5 ml microcentrifuga, tubi flick dita 6 volte e calore per 5 minuti a 95 ° C. Mettere i campioni in ghiaccio per 2 minuti e spin down per 30 sec a 13.000 xg, 4 ° C.
- Trasferire il surnatante con una pipetta 10 ml (~ 35 microlitri totale) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga fresco senza disturbare il pellet. Conferma assenza di perline Protein L agarosio risciacquando giù una piccola quantità del campione eluito alla parete interna del tubo.
Nota: "granulare"proteina L perline agarosio sono chiaramente visibili se presente. - Se perline proteina L agarosio sono presenti, spin down di esempio per altri 30 secondi a 13.000 xg e trasferire il surnatante per pulire il tubo. Ripetere il passaggio fino a quando non perline agarosio sono rilevabili.
- Carico 10 - 20 ml di campioni eluite per pozzetto su gel di SDS-poliacrilammide in un sistema tampone Tris / glicina / SDS (vedi Tabella 1).
Nota: Utilizzare 7,5% o 4 - 20% gel gradiente con 50 microlitri volume di carico per pozzetto per la rilevazione delle isoforme NCAM (dimensioni gel (L x L x spessore PSA-NCAM o: 8.6 x 6.7 x 0.1 cm). - Gel corsa per ~ 1 ora a 100 V (1,74 V / cm 2) sul banco. Ulteriori raffreddamento non è richiesto per questo passaggio 37,38.
- Proteine Trasferire PVDF (polivinilidenfluoruro) membrana (dimensione dei pori 0,45 micron) per 2,5 ore in cella a 100 V (1,74 V / cm 2) utilizzando buffer di trasferimento fredda (5 - 10 ° C) (vedi Tabella 1).
- membrane blocco with 10% (w / v) di latte in polvere secca in PBS-T per 1 ora a 25 ° C su un agitatore orbitale da banco, lavare le membrane due volte per 10 minuti con PBS-T e sonda overnight con anticorpo primario in 5% BSA in PBS- T in un agitatore orbitale a camera fredda.
- La mattina successiva membrane lavata una volta brevemente con eccesso di PBS-T a 25 ° C (includa coperchio e del contenitore) seguito da 3 lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno in un agitatore orbitale (80 rpm) (tutti i lavaggi vengono eseguiti a 25 ºC).
- Aggiungere anticorpo secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti- IgM-anticorpo anti-umano (per HIgM12) (diluizione 1: 30.000) in 5% di latte in polvere secca in PBS-T per 1 ora a 25 ° C su un agitatore orbitale (70 giri ).
- membrane Lavare estesamente una volta brevemente con eccesso di PBS-T a 25 ° C (includono coperchio e del contenitore) seguito da 3 lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno in un agitatore orbitale (80 rpm) (tutte le fasi di lavaggio sono eseguite a 25 ° C) .
- Mescolare 1 ml di freddo maggiore chemiluminescence HRP componente substrato A (enhanced reagente luminol) con 1 ml di componente B (reattivo ossidante) (per Mini macchia) a 25 ° C.
- Utilizzare pinze plastica per trasferire le membrane su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso (tenerli ai bordi molto). contenitori asciugare con carta assorbente e membrane rimettere in contenitori (uno per ogni membrana). Immediatamente aggiungere 2 ml della chemiluminescenza HRP substrato premiscelata (composto A + B) (step 2.2.16.) per ogni membrana e incubare per 2 minuti a 25 ° C su un agitatore orbitale (90 rpm). Assicurarsi che le membrane sono uniformemente inumidito con il reagente chemiluminescenza.
- Trasferimento membrane in un manicotto di plastica trasparente ed eliminare liquidi e l'aria in eccesso bolle con carta assorbente. Mettere membrane in manica di plastica in un rullino ed eventualmente il nastro il manicotto di plastica nella cassetta. Chiudere la cassetta.
- Prendere la cassetta, film, timer e forbici nella camera oscura. Tagliare in alto a destra di ogni film a fini di orientamento, esporre (diversi) film per diversi periodi di tempo (10 sec, 1 min, 10 min) e sviluppare film in uno sviluppatore film.
3. Endoneuraminidase-NF digestione di PSA Attaccato alla NCAM 39
- Digest tessuto cerebrale lisato dal primo giorno post-natale (P) 7 topi WT e topi P7 NCAM KO (preparato dal punto 1.12) per 2 ore su ghiaccio con endoneuraminidase-NF (endo-NF), come illustrato nella tabella 2 39.
- Aggiungere 5 ml di tampone campione 4x Laemmli ad ogni provetta (1 - 6) dal punto 3.1 (Tabella 2).
- Caricare i campioni su un 4 - gradiente di gel e ripetere SDS-poliacrilammide 20% passi 2.2.10 a 2.2.19. membrane sonda con HIgM12 (1 ug / ml), disponibile in commercio anti-PSA mAb (clone 2-2B) (1 ug / ml) e anticorpi (controllo del carico) β-actina (1 mg / ml) in 5% BSA in PBS -T.
4. Preparazione di Rat e Culture del mouse del sistema nervoso centrale
- Acid-lavaggio vetrini 25 mm in 1 M HCl a 50 - 60 ° C per 4-16 ore in una cappa aspirante con un contenitore di vetro. Agitare coprioggetto di tanto in tanto attraverso delicata vorticoso.
- Lavare vetro coprioggetto ampiamente in acqua distillata (3x). Assicurarsi di lavare l'acido tra le lamelle sovrapposte.
- Lavare coprioggetto in 100% di etanolo e asciugare su Parafilm in una cappa di coltura cellulare. Un giorno prima dell'uso, riscaldare i vetrini per 24 ore in un contenitore di vetro con coperchio a 100 ° C in un forno.
- Mettere coprioggetto di vetro in 6-ben piatto e cappotto con 3 ml di 40 mg / ml di poli-D-lisina in acqua sterile per 1 ora a 37 ° C.
- Lavare due volte con acqua sterile, asciugare completamente sotto il cofano coltura cellulare e applicare la luce UV per 20 min.
- Coat 60 mm piatti di coltura cellulare o 75 cm fiasche di coltura tissutale 2 con 3ml ml o 10, rispettivamente di 40 mg / ml di poli-D-lisina in acqua sterile per 1 ora a 37 ° C.
- Lavare due volte con acqua, asciugare completamente sotto il cofano coltura cellulare e applicare la luce UV per 20 min.
- Anestetizzare ratti neonati in IACUC approvato roditore camera di eutanasia con CO 2 di alimentazione del gas (completamente automatizzata). Utilizzare punta metodo pinch-risposta per determinare insensibilità dell'animale. Decapitare neonatale ratti Sprague Dawley (P0P1) (6 - 10 cuccioli alla volta).
- Rimuovere il cervello afferrando le orbite con una pinza e con l'inserimento di una piccola forbice nella colonna vertebrale. Tagliare il cranio verso la parte anteriore a livello dell'orecchio. Staccare il cranio e delicatamente mettere il cervello in un piatto 60 millimetri Petri riempite con 10 ml di terreno dissezione ghiacciata sul ghiaccio (vedi tabella 1).
- Ripetere l'operazione per i restanti cuccioli di ratto (6 - 10 cuccioli). Mantenere il tessuto in ghiaccio per gradini 4.3.2 - 4.3.7. Dividere il cervello lungo la linea mediana in due emisferi cerebrali e successivamente tagliare bulbi olfattivi, gangli della base al di sotto della corteccia cerebrale e nell'ippocampo con una pinza Dumont. Posizionare il isolato corteccia cerebrale in un piatto pulito Petri contenente dissezione media sul ghiaccio.
- Prendete una corteccia. Rimuovere le meningi con una pinza con punte sottili al microscopio dissezione.
- Ripetere con gli altri cortecce. Mettere tutte le cortecce-meningi libere in uno pulito capsula di Petri sul ghiaccio.
- Combinare gli emisferi corticali da tutti i cuccioli in 60 mm piastra di Petri e utilizzare una lama di rasoio sterile per dadi il tessuto cerebrale in 1 mm pezzi tritate.
- Trasferire il tessuto cerebrale tritato con una pipetta 10 ml in un pallone sterile, non patinata da 500 ml in vetro e aggiungere 10 ml di terreno dissezione ghiacciata per cervello di ratto. Agitare delicatamente il pallone mentre l'aggiunta di 1 ml di soluzione di tripsina in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) (5 mg / ml di tripsina) in 9 ml di HBSS per cervello di ratto. Aggiungere 2% Del volume totale in soluzione DNasi I (1 mg / ml) e 2% del volume totale di MgSO 4 soluzione (3,82% MgSO 4 in HBSS (w / v)) alla sospensione tessuto cerebrale e miscelare delicatamente.
- Trypsinize tessuto sotto blanda agitazione su un agitatore a rotazione per 30 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che i pezzi di tessuto sono galleggianti in questa fase e non sedimentare sul fondo. Aumentare la velocità di rotazione, se necessario.
- Aggiungere siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale del 10% (v / v) e miscelare agitando la muffola 10 volte per 10 sec. Raffreddare la sospensione dei tessuti in acqua ghiacciata per 15 minuti. Swirl boccetta delicatamente per cinque volte ogni secondo min.
- trasferire delicatamente la sospensione dei tessuti in sterili provette da 50 ml con 25 ml o 50 ml pipette e centrifugare per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente tessuto del SNC digerito in 15 ml di mezzo di dissezione ghiacciata supplementato con 5 ml di siero fetale bovino, 0,4 ml MgSO 4 soluzione (3,82%MgSO 4 in HBSS) e 1,6 ml di DNasi I (1 mg / ml).
- sospensione tessuto diviso equamente in due sterili provette da 15 ml (~ 10 ml ciascuna) e lentamente triturare con una pipetta 10 ml (10 volte) fino a quando la sospensione diventa torbida / lattiginosa. Mantenere cellule sospese in ghiaccio durante l'elaborazione del tubo successivo. Attendere 3 min fino restante digerito CNS tessuti sedimenti sul fondo della provetta. Trasferire il surnatante per pulire tubo da 50 ml senza disturbare la frazione pellet.
- Opzionalmente, passare surnatanti torbidi attraverso il filtro delle cellule di 40 micron e combinare la conseguente sospensione cellulare unico in sterili provette da 50 ml su ghiaccio.
- Spin liquami cella per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C.
- Rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta 10 ml fino ~ 2 ml di dissezione medie rimangono sopra il pellet cellulare.
- Finger pellet cellulari flick in provette da 50 ml (~ 10 volte). Lentamente aggiungere 5 ml di terreno di coltura caldo (vedi Tabella 1) alla sospensione cellulare mentre delicatamentemano agitando il tubo.
- Facoltativamente, ripetere DNase passo 4.3.12 per altri 10 min in ghiaccio con una soluzione di DNasi I fresca e MgSO 4 -solution in caso di cluster di tessuto visibili o grumi di DNA. tubo turbinio manualmente 5 volte al secondo min.
- Piastra 50.000 cellule per vetrino di vetro di 25 mm di una pozza di 400 microlitri terreno di coltura in un piatto 6-bene e lasciare le cellule attaccano per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C).
- Per confluenti (entro 24 - 48 ore dopo la placcatura) piatti di coltura cellulare di 60 mm e 75 cm 2 di tessuto cultura palloni, piastra di 500.000 cellule (60 mm) o piatto 2 milioni di cellule (75 cm 2 palloni).
- Delicatamente aggiungere 2 ml (per bene, vetrini 25 mm in 6-ben piatto), 3 ml (piatti 60 mm) o 10 ml (75 cm 2 flaconi) del mezzo di crescita caldo a ogni pozzetto. Incubare le cellule durante la notte e cambiare media completamente la mattina seguente. Poi cambiare mezzo di ogni altro giorno (giorno 3, 5, dal 7, ecc).
NoTE: Rat culture glia misto sono pronti per l'uso per immunocitochimica o biochimica 24-48 ore dopo la placcatura.
- Identica alla dissezione del cervello di ratto neonatale descritti nelle sezioni 4.3.1 a 4.3.6, decapitare neonatali topi WT P0 e NCAM KO con C57 / BL6 sfondo, rimuovere i cervelli e metterli in media dissezione ghiacciata (vedi Tabella 1). Mantenere tessuto su ghiaccio in ogni momento.
- Dividere il cervello lungo la linea mediana in due emisferi cerebrali e successivamente tagliare bulbi olfattivi, gangli della base al di sotto della corteccia cerebrale e nell'ippocampo con una pinza Dumont. Posizionare il isolato corteccia cerebrale in un piatto pulito Petri contenente HBSS sul ghiaccio.
- Prendete una corteccia. Rimuovere le meningi con una pinza con punte sottili al microscopio dissezione. Ripetere con gli altri cortecce. Mettere tutte le cortecce-meningi libere in uno pulito capsula di Petri sul ghiaccio.
- Trasferimento hemisphe corticaleres con 1 ml pipetta da ogni mouse in separate, sterili provette da 15 ml. Aggiungere 1,2 ml di mezzo di dissezione ghiacciata per ogni cervello e distruggere meccanicamente il tessuto cerebrale pipettando 2 volte su e giù con una punta della pipetta 1 ml.
- Aggiungere 150 microlitri soluzione papaina (10 mg / ml in PBS), 100 microlitri DNasi soluzione (1 mg / ml in HBSS) e 50 microlitri MgSO 4 (3,82% in HBSS) per ciascun cervello e mescolare muovendo dito.
- Incubare la sospensione del cervello per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua e mescolare sospensioni cervello ogni secondo minuto da sfogliando dito. Aggiungere 1 ml di FBS per provetta, mescolare e raffreddare la sospensione di tessuto per 10 min in ghiaccio.
- Spin giù il tessuto cerebrale per 4 min a 200 xg, 4 ° C e risospendere il precipitato di tessuto in 1 ml di tampone dissezione ghiacciato integrati con 70 ml di I soluzione di DNasi (1 mg / ml in HBSS) e 30 ml MgSO 4 soluzione (3,82% in HBSS).
- Triturare il tessuto cerebrale utilizzando un FBS rivestite punta della pipetta 1 ml(~ 5 volte) fino a quando il surnatante diventa torbido. Passare il surnatante attraverso un colino cella di 40 micron e trasferire in una provetta pulita sul ghiaccio.
- Agglomerare cellule gliali miste attraverso centrifugazione per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C. Aspirare il surnatante fino ~ 100 pl di mezzo sono lasciati sopra il pellet cellulare. Risospendere cellule pellet con le dita sfogliando (~ 5 volte) e aggiungere 1 ml di terreno di coltura del mouse caldo (vedi tabella 1).
- Opzionalmente, sciogliere gruppi di cellule visibili e cellule lisate / precipitato DNA pipettando delicatamente la sospensione cellulare su e giù (cinque volte).
- topo piatto misto cellule gliali su vetrini PDL rivestite o piatti da 60 mm, come descritto nei punti 4.3.19 - 4.3.21. Lavare le cellule la mattina seguente con mezzo di crescita del mouse caldo e successivamente ogni due giorni. Mouse glia misto è pronto per l'uso per immunocitochimica 48-72 ore dopo la placcatura.
- Cultura ratto mescolatoglia a 75 cm 2 di tessuto cultura palloni in mezzo di crescita (vedi tabella 1) per 10 giorni. Scrollarsi di dosso gruppi di cellule microgliali di culture gliali miste su un agitatore di rotazione all'interno di un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C) a 140 giri al minuto per 1 ora.
- Togliere il surnatante microglia contenenti da culture glia miste, passarlo attraverso un colino cella di 40 micron e mantenere la sospensione cellulare in sterili provette da 50 ml.
Nota: le culture microgliali sono tipicamente> 95% puro dopo questo passaggio con qualche OPC contaminanti e pochissimi astrociti. - Opzionalmente, sostituire terreno di crescita su colture gliali miste per i futuri shake-off della microglia. Tipicamente eseguire multipli shake-off della microglia (una volta alla settimana) da colture gliali miste.
- Facoltativamente, per ottenere purezze superiori piastra 95% 10 ml del surnatante microglia contenente (fase 4.5.2) per 100 mm piastre di Petri e incubare in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti a 37 ° C. solo microglia attribuirà a piastre di Petri, mentre astrociti e OPC rimangono nel surnatante.
- Agitare delicatamente piastre di Petri in senso orario e antiorario (cinque volte ciascuno) nel cofano coltura cellulare. Aspirare mezzo di coltura cellulare completamente e sostituire con 10 ml di mezzo di crescita. Risultanti culture microglia sono> 98%.
- Cultura microglia per un massimo di 7 giorni in DMEM integrato con 1% FBS e 1% di penicillina / streptomicina.
- Per ottenere colture OPC altamente arricchito scrollarsi di dosso cellule microgliali primo da vecchie culture gliali miste 10 giorni coltivate in 75 cm 2 palloni su un agitatore di rotazione all'interno di un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C) a 140 giri al minuto per 1 ora. Scartare microglia solo contenenti surnatante o utilizzare per esperimenti specifici microglia (vedi punto 5.5).
- Sostituire il surnatante microglial contenente con mezzo di crescita 10 ml e scrollarsi di dosso le culture gliali miste perun altro 18 ore su un agitatore di rotazione a 200 giri al minuto (5% di CO 2, 37 ° C).
- Raccogliere il microglia- e surnatante OPC contenenti da culture glia miste e passare attraverso un colino cella di 40 micron. Raccogliere la sospensione cellulare in sterili provette da 50 ml.
- Opzionalmente, sostituire terreno di crescita su colture gliali miste per i futuri OPC shake-off.
Nota: OPC continuano a proliferare in strati di alimentazione astrocitari e possono essere agitati-off una seconda e terza volta (una volta alla settimana), anche se con rese inferiori. - Piastra 10 ml di microglia- e OPC contenenti surnatante in 100 mm piastre di Petri e incubare in coltura incubatore cellulare per 30 minuti a 37 ° C. La microglia attribuirà alle piastre di Petri, mentre OPC e astrociti rimangono nel surnatante.
- Agitare delicatamente piastre di Petri in senso orario e antiorario (5 volte ciascuno) in una cappa di coltura cellulare. Estrarre solo un paio di piastre di Petri in un momento da colture cellulari incubatore (microglia inizieranno sloggiare da Petpiatti ri quando scosso vigorosamente in media più fresco).
- Raccogliere e combinare il surnatante OPC-contenente, in provette da 50 ml. Facoltativamente, aggiungere terreno di coltura per piastre di Petri per l'uso negli esperimenti specifici microglia.
- Facoltativamente, per aumentare ulteriormente la purezza delle culture OPC ripetere i punti 5.6.5 e 5.6.6 una volta con piatti freschi Petri per abbassare il punto di microglia in preparati OPC.
- Spin down arricchito surnatante OPC contenenti in centrifuga per 5 minuti a 250 xg, 4 ° C. Aspirare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet. Lasciare 3 ml del supernatante sopra il pellet e risospendere iniziare OPC sfogliando dito (10 volte).
- Delicatamente Triturare gruppi di cellule OPC utilizzando una pipetta 10 ml (5 - 10 volte).
- Contare le celle e piastra 50.000 OPC per 25 vetrino di vetro mm (PDL-rivestita) in una pozza di terreno di coltura 400 ml in un piatto da 6 pozzetti e lasciate cellule attaccano per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 376; C). Delicatamente aggiungere 2 ml di terreno di proliferazione caldo (vedi Tabella 1) in ogni pozzetto. Per PDL rivestite da 60 mm piatti di coltura cellulare, piatto 1 - 1,5 milioni di OPC in 3 ml di terreno di proliferazione.
- sostituire con attenzione FBS contenente medio proliferazione con il mezzo proliferazione fresco 3 ore dopo la placcatura le OPC (assicurarsi che OPC collegati correttamente e non sloggiare durante media cambia). fluido di scambio ogni secondo giorno.
Nota: culture Rat OPC preparate utilizzando questo protocollo sono in genere puro al 90% con la microglia come il tipo di cellula contaminante principale, seguito da astrociti.
5. Immunocitochimica Utilizzando HIgM12 in cellule primarie gliali
- Immunofluorescenza Triple-etichetta con HIgM12, anti-PSA mAb, e il tipo di cellule marcatori specifici in cellule primarie gliali da WT e NCAM KO Mice
- In condizioni di cellule vive, etichetta il 60% del mouse confluenti mescolato culture glia da topi WT e KO NCAM coltivate su PDL-rivestita25 coprioggetto mm vetro con HIgM12 (10 ug / ml) e anti-PSA mAb (clone 2-2B) (10 mg / ml) in PBS supplementato con 10% FBS a 4 ° C per 30 min.
- Lavare le cellule tre volte per 20 secondi ciascuno con PBS freddo supplementato con 10% FBS e fissare con 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4 per 15 minuti a 25 ° C.
- Lavare le cellule fissate due volte per 1 min ciascuno con PBS supplementato con 10% FBS e permeabilize cellule con 0,1% Triton-X100 in PBS, pH 7,4 per 2 minuti a 25 ° C. Lavare le cellule due volte per 1 min e l'etichetta con marcatori gliali GFAP (astrociti) o IBA-1 (microglia) (1 mg / ml) in PBS supplementato con 10% FBS notte a 4 ° C in cella.
- Procedere con condizioni di immunofluorescenza standard, tra cui media 31 montaggio DAPI contenenti.
Nota: l'uso di fluorescente Fab 2 frammenti come anticorpi secondari per l'uomo (HIgM12) e del mouse (anti-PSA monoclonale, clone 2 - 2B) IgM è fortemente raccomandato. - prendere flimmagini uorescenti a 60X o di ingrandimento 100X. Utilizzare le stesse impostazioni dello strumento per tutte le immagini e le immagini di processo in modo identico.
- Immunofluorescenza Etichettatura di endo-NF-trattati cellule WT Glia utilizzando HIgM12 come un anticorpo primario
- Cultura WT del mouse glia mescolato alla produzione di 3 giorni in Neurobasal Un integrato con il 10% FBS e supplemento B27 (1:50) su PDL rivestite coprioggetto 25 mm di vetro. Aggiungere ENDO-NF (30 ug / ml) di mezzo di coltura 1 ml e incubare durante la notte in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2).
- cellule Label vivono nel freddo con HIgM12 e interna GFAP marcatore astrociti dopo la fissazione e permeabilizzazione come descritto nei punti da 5.1.1 a 5.1.5. Prendere immagini fluorescenti a 60X o di ingrandimento 100X. Utilizzare le stesse impostazioni dello strumento per tutte le immagini ed elaborare in modo identico.
Representative Results
Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando IgM specifici PSA-antigeni umani nel SNC. viene mostrato l'uso di anticorpi IgM umani contenenti specifiche catene leggere Vκ in contesti biochimici e di immunocitochimica fluorescenti.
HIgM12 immunoprecipita suo antigene da lisati cerebrale cervello e agisce come un agente (anticorpo primario) di rilevamento in Western blot. Nessuno dei due anticorpi controllo isotipico né L perline agarosio immunoprecipitato un antigene simile, il che dimostra la specificità del tirare verso il basso (Figura 1). Western blot utilizzando SNC lisati da topi WT e KO NCAM dimostrano la specificità del HIgM12 vincolante per PSA contenenti NCAM (Figura 2A). Digestione enzimatica del sistema nervoso centrale del tessuto da topi WT utilizzando ENDO-NF identifica PSA attaccato al NCAM come specifico epitopo vincolante per HIgM12 (Figura 2B). Utilizzando il metodo descritto qui, ratto IBA-1-positive colture microgliali di elevata purezza sono ottenuti (Figura 3). Disponibile in commercio anticorpo anti-PSA (clone 2-2B) non etichetta superficie cellulare o piscine interne PSA nel fisso e permeabilizzate cellule microgliali IBA-1-positivi al microscopio a fluorescenza. In linea con la letteratura pubblicata in precedenza, che riporta nessuna espressione sulla superficie cellulare di PSA-NCAM nelle cellule microgliali 16,41 HIgM12 non etichettare antigeni di superficie delle cellule di microglia di ratto purificati. È interessante notare che l'etichettatura HIgM12 dei risultati microglia fisse e permeabilizzate in un intracellulare, modello perinucleare che non si limita a organelli specifici (Figura 3). I risultati sono in contrasto con quelli ottenuti usando un anticorpo anti-IgG PSA (clone 735) 26, che si rivolge PSA-SynCAM in microglia a livello del Golgi 41.
In contrasto con la microglia, HIgM12e antigeni di superficie delle cellule bersaglio A2B5 in culture di ratto OPC altamente arricchito in condizioni di cellule vive (Figura 4). Culture OPC contengono ~ 5% contaminare cellule microgliali. La Figura 5 illustra un modello praticamente identico superficie cellulare colorazione tra il HIgM12 e anti-PSA monoclonale (clone 2-2B) in GFAP-positivi astrociti (Figura 5A). Etichettatura immunofluorescenza degli astrociti WT ENDO-NF-digerito rispetto al buffer di controllo trattati con astrociti WT utilizzando HIgM12 dimostra la presenza di PSA astrociti (Figura 5B). La presenza degli astrociti PSA-positivi in vivo deve ancora essere confermata.
Figura 1: HIgM12 agisce come un "pull-down" Agente in immunoprecipitazione immunoprecipitazione dal lisato totale del cervello di tre mesi di età topi utilizzando HIgM12, controllo isotipico umana HIGM.126 o agarosio L perline solo come agenti "a tendina". proteine eluite sono state eseguite in Western blot con membrane esplorati contro HIgM12. pesi molecolari delle proteine eluite da perline HIgM12 rivestite erano nella gamma di 160 - 200 kDa oltre alla IgM catena pesante (~ 65 - 73 kDa). Questo dato è stato modificato da J. Neurochem. 15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Obiettivi HIgM12 l'acido Polysialic (PSA) Moiety su NCAM. A. omogenati di cervello da P7, P13, P16 e P27 NCAM totali topi KO e controlli littermate eterozigoti sono stati eseguiti in Western blot con membrane sondato contro HIgM12, PSA e β-actina come controllo di caricamento.
Figura 3: l'assenza di PSA su Rat microglia si riflette da una mancanza di HIgM12 Labeling microglia di ratto sono state coltivate per 48 ore in poli-D-lisina rivestite coprioggetto di vetro e sia etichettato in diretta su ghiaccio con HIgM12 o dopo la fissazione con HIgM12 o anti. -PSA mAb (clone 2-2B). Le cellule sono state triple etichettato con microglia marcatore IBA-1 (verde), HIgM12 / PSA (rosso) e DAPI (blu). Le immagini mostrano la mancanza di superficie delle cellule microgliali legame con HIgM12 (riga superiore) e la mancanza di anti-PSA vincolante (clone 2-2B) alla superficie delle cellule e negozi interni nel ratto primaria microglia (fila inferiore). Basata sulla morfologia bipolare e assenza di IBA-1 colorazione, piccola cella PSA-positivi (fila inferiore) è stato suggerito come un OPC. Nelle cellule fisse, HIgM12 colorazione determinato un punctated, modello perinucleare che non è stato limitato a organelli specifici ed è stato considerato vincolante non specifico (riga centrale). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: HIgM12 Obiettivi cellulari di superficie PSA-NCAM su Rat OPC OPC Rat e microglia erano cultu.rosso per 4 giorni in media proliferazione su vetrini rivestiti di poli-D-lisina e tripla etichettati in diretta su ghiaccio con HIgM12 o A2B5 (verde), indicatore interno macrofagi / monociti CD68 (clone ED-1) (rosso) e DAPI (blu) . Le immagini mostrano le popolazioni di cellule majorly positivo per l'indicatore OPC A2B5 (riga superiore) e HIgM12 (fila inferiore) con poche microglia CD68-positivo (~ 5%). Contrasto di fase e le immagini DAPI sono stati aggiunti per rivelare l'integrità delle cellule e il numero di cellule per ogni popolazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: HIgM12 e anti-PSA mAb co-label una sottopopolazione di astrociti in mouse misto Glia. A. mouse misti cellule gliali da WT e NCAM totali animali KO contenenti astrociti, cellule oligodendrociti-lignaggio e microglia sono state coltivate per 3 giorni ed etichettato in diretta su ghiaccio con HIgM12 (verde), anti-PSA monoclonale (clone 2-2B) (rosso) e, successivamente, per il marcatore astrociti GFAP (viola) e DAPI (blu). HIgM12 e anti-PSA rivelano un pattern di colorazione identica virtuale su astrociti GFAP WT-positivi, ma la mancanza di legame di astrociti in coltura provenienti da topi KO NCAM. Questo dato è stato modificato da J. Neurochem. 15. B. glia misti sono stati coltivati in modo identico come descritto al punto A. e trattati durante la notte con endoneuraminidase-NF (gentilmente fornito dal Dr. Martina Muehlenhoff) o il controllo PBS. Le cellule sono state etichettate in diretta su ghiaccio con HIgM12 (verde) e successivamente colorate per i marcatori GFAP interna (rosso) e DAPI (blu). HIgM12 obiettivi antigeni di superficie delle cellule in PBS-controllo trattati culture gliali miste, ma non endoneuraminidase-NF trattati glia misto. Questa cifra è stata modificata da JNSCI 16. Plfacilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tutte le immagini sono state prese a 60X di ingrandimento utilizzando le stesse impostazioni dello strumento e trattati in modo identico.
Tabella 1:. Tampone e soluzione Ricette Cliccate qui per scaricare questa tabella.
| il tessuto del sistema nervoso centrale | ENDO-NF / PBS | tampone di lisi | Volume totale | |
| 1. topo WT | 67 mg (0,45 ml) | 2 ml (12 mg) ENDO-NF | 7.55 ml | 10 microlitri |
| 2. topo WT | 67 mg (0,45 ml) | 2 l di PBS | 7.55 ml | 10 microlitri |
| 3. topo WT | 67 mg (0,45 ml) | nessun PBS o ENDO-NF | 9.55 ml | 10 microlitri |
| 4. NCAM KO topo | 67 mg (0,45 ml) | 2 ml (12 mg) ENDO-NF | 7.55 ml | 10 microlitri |
| 5. NCAM KO topo | 67 mg (0,45 ml) | 2 l di PBS | 7.55 ml | 10 microlitri |
| 6. NCAM KO topo | 67 mg (0,45 ml) | nessun PBS o ENDO-NF | 9.55 ml | 10 microlitri |
Tabella 2: ENDO-NF digestione del tessuto del sistema nervoso centrale da topi WT e P7 NCAM KO.
Discussion
Umani autoanticorpi naturali IgM sono interessanti candidati per immunoterapie e hanno dimostrato il potenziale terapeutico per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e disturbi del SNC 1-7. Vantaggiosamente, questi anticorpi non suscitare una risposta immunitaria in cui la generazione di anticorpi neutralizzanti riduce sostanzialmente la dose terapeutica efficace ed efficacia. È importante sottolineare che tutti gli anticorpi con potenziale terapeutico sono stati di isotipo IgM e appartengono al repertorio NAb 3-5,8,9,37,40,42-45. Un ostacolo importante per il potenziale applicazione clinica di anticorpi IgM è l'identificazione dei loro antigeni, che sono indeterminati in molti casi. tecniche standard impiegate per gli anticorpi IgG spesso non sono applicabili a individuare l'antigene di un IgM.
Questo protocollo descrive l'identificazione di PSA-NCAM come antigene per la rigenerazione IgM umane HIgM12, efficace in modelli animalidi MS e SLA 15-18. La metodologia utilizzata è principalmente applicabile a tutti gli anticorpi umani con specifiche catene Vκ luce VκI, VκIII e VκIV e anticorpi di topo con catene leggere VκI, indipendentemente isotipo del anticorpale.
La fase più critica in questo protocollo è l'uso di anticorpi IgM in applicazioni di cromatografia di affinità. Più in particolare, gli anticorpi di successo sono tenuti ad agire come agenti di pull-down in immunoprecipitazione per isolare o per arricchire un antigene di complessi tessuto- o cella-cultura lisati. frazioni antigene arricchite possono essere confrontati con immunoprecipitazione da anticorpi di controllo isotipo e successivamente analizzati per le differenze mediante spettrometria di massa. Un requisito essenziale o limitazione di questa fase è la presenza della corretta anticorpi Vκ catena leggera e dell'ospite (uomo, topo) per consentire di legame alle proteine L agarosio anticorpo. L'uso di proteine mannan vincolante legato a agarosio (anche callelectina d mannosio-binding) al posto di proteine L agarosio è un potenziale alternativa al immunoprecipitare IgM specifici senza catene leggere Vκ. Tuttavia, come affermato da Arnold et al. 35, antigene-bound anticorpi IgM non si legano alle proteine mannan vincolante, come i glicani bersaglio sembrano diventare inaccessibile una volta che il IgM ha legato al suo antigene. Sulla base di questi risultati mannan-binding protein non può essere utilizzato come matrice legame immunoprecipitare antigene-caricato IgM molecole 35. Altre alternative potenziali potrebbero essere l'uso di anticorpi anti-IgM IgG agarosio-bound secondari 46,47 o l'uso di perline magnetiche tensioattivi attivato 48. anticorpi IgG diretti contro IgM potrebbero essere chimicamente reticolato di agarosio A o G agarosio al fine di ridurre la portata di anticorpo eluite insieme con l'antigene di interesse. Un corretto confronto tra diverse varianti di IgM immunoprecipitazione rispetto ad antigeni identificati con successo is difficile perché la maggior parte immunoprecipitazione sono stati eseguiti per isolare o esaurire IgM senza ulteriore interesse per i loro antigeni. Inoltre, immunoprecipitazione utilizzando IgM sono stati utilizzati principalmente per confermare un già noto o previsto antigene singolo con l'esposizione di anticorpi ad antigeni purificati 49. Uno svantaggio di IgG agarosio accoppiamento diretto contro IgM umana è un basso rendimento (10 - 15%) del immunoprecipitato siero molecole IgM rispetto al materiale di partenza 50. Al contrario, sfere magnetiche superficie attiva sono state applicate con successo agli anticorpi di diversi isotipi tra IgM per immunoprecipitare scrapie associate fibrille 48. Questo metodo non è limitato a kappa specifica (Vκ) o catene lambda (λ) o un host particolare e può ampliare notevolmente lo spettro di anticorpi IgM utilizzati in immunoprecipitazione.
Un altro passo importante nel protocollo è la capacità del anticorpale a funzionare come un detantiriflesso anticorpo (anticorpo primario) in Western blot o altre piattaforme di screening. anticorpi successo deve indirizzare loro antigene con sufficientemente elevata affinità per consentire l'antigene vincolante in presenza di detergenti non ionici o possibilmente ionici. Alte anticorpi affinità sono comuni tra anticorpi IgG affinità-maturato, ma meno comune tra gli anticorpi IgM, che è uno dei motivi per cui ci sono relativamente pochi gli anticorpi IgM disponibili in commercio come agenti di rilevamento in ambienti biochimici. Alta affinità di legame degli anticorpi è un requisito per immunoprecipitazione di antigeni molecolari e per Western blotting. L'abbassamento delle concentrazioni detergente o la completa assenza di detergenti in buffer IP e buffer di lisi consente antigene targeting anticorpi a bassa affinità attraverso il suo dominio Fab. Al contrario, la capacità dell'anticorpo di indirizzare proteina L agarosio tramite la sua porzione Fc non è sostanzialmente influenzato tra i controlli isotipo su una gamma di diverse concen detergentistrazioni. Tuttavia, bassa concentrazione di detergente in tampone di lisi e tampone IP previene rottura della membrana cellulare e l'isolamento di molecole specifiche. Analogamente, una bassa concentrazione di detersivo nel buffer blot lavaggio occidentali (ad esempio, PBS-T) permette legame di anticorpi a bassa affinità antigene, ma allo stesso tempo aumenta il legame non specifico e quindi non è un'opzione.
La presenza di un nucleo proteina dell'antigene è un altro requisito per questo metodo. Proteine con modificazioni post-(ad esempio, glicoproteine, lipoproteine) e le proteine non modificate, ma non lipidi unico o carboidrati, sono rilevabili in Western blot. Non è possibile immunoprecipitare lipidi (ad esempio, sfingolipidi) da lisati tessuti o cellule in presenza o assenza di detergenti. Le proprietà fisico-chimiche di detergenti e lipidi sono troppo simili per consentire interazioni selettive lipidi-anticorpo, mentre allo stesso tempo detergenti sono essenziali per interromperemembrane per consentire isolamento selettivo di molecole specifiche. A nostra conoscenza, immunoprecipitazione e formato da soli carboidrati, in assenza di un nucleo proteine, non sono stati precedentemente riportati. Questo diventa particolarmente rilevante perché gli anticorpi IgM frequentemente bersaglio carboidrati e glicolipidi, che non sono necessariamente collegate ad una unità di proteine. Altre tecniche cromatografiche sono necessari per la separazione e immunologica identificazione dei lipidi e carboidrati in assenza di un nucleo proteine. Ad esempio, la cromatografia su strato (TLC) dei lipidi cellulari con conseguente rilevazione di anticorpi sulla piastra TLC (immuno-TLC) può essere implementato 51,52.
Altri anticorpi anti-PSA sono stati descritti in studi e risultati precedenti rispetto HIgM12 nonché la presenza di anticorpi anti-IgM PSA (clone 2-2B). L'anticorpo più comunemente usato nel settore della PSA è un anticorpo IgG (clone 735) disponibile come MONOC topolonal o policlonale di coniglio anticorpo 53. Questo anticorpo anti-PSA IgG rileva PSA su SynCAM e NCAM su diversi tipi di cellule del sistema nervoso centrale, tra cui cellule microgliali 41. In contrasto con l'anticorpo anti-PSA IgG, IgM umane HIgM12, HIgM42 e l'anti-PSA topo IgM (clone 2-2B) sono in grado di indirizzare PSA su SynCAM (ma su NCAM) in vari stadi postnatali embrionali precoci in topi , mentre SynCAM non polysialylated è facilmente rilevabile 15. Gli anticorpi IgM utilizzati non sono in grado di rilevare PSA sulle cellule microgliali (figure 3 + 4). Una possibile spiegazione per le differenze osservate tra isotipi di anticorpi può essere bassi livelli di PSA-SynCAM rispetto ai livelli di PSA-NCAM in combinazione con legame di anticorpi IgM contro l'anti-PSA IgG l'affinità potenzialmente inferiore. Per verificare questa ipotesi, abbiamo effettuato immunoprecipitazione negli animali NCAM KO in fase embrionale E17 con una grande quantità di SynCAM presente e usato HIgM12 come un "agente di pull-down" <sup> 15. In E17 WT littermate controlli HIgM12 immunoprecipitato PSA-NCAM in una misura che ha mostrato intensità simili di "tirato giù" PSA-NCAM rispetto al IgM catena pesante come rilevato da densitometria nella successiva Western Blot utilizzando antigeni eluiti. Questo risultato suggerisce almeno affinità sufficiente HIgM12 alla sua PSA bersaglio. In contrasto con WT littermate controlla HIgM12 non ha rilevato PSA attaccato al SynCAM negli animali NCAM KO. Identici risultati sono stati ottenuti in immunoprecipitazione utilizzando l'umana anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 e HIgM42, così come il topo anti-PSA IgM (clone 2-2B) sono stati in grado di indirizzare il PSA SynCAM in Western blot da WT e NCAM KO animali a stadi di sviluppo embrionale e postnatale. Data la bassa quantità di HIgM12 necessaria (0,1 mg / ml) per rilevare specificamente PSA collegato a NCAM in Western blot utilizzando piccole quantità di tessuto del sistema nervoso centrale (0,1 mcg CNS tessuto per pozzetto) 15 sembra essere improbabile che i bassi affinità da soli sonoresponsabile completa mancanza di rilevamento PSA-SynCAM da HIgM12 in tre diversi metodi.
Concludiamo che ci sono differenze significative tra anticorpi anti-PSA IgM e l'anticorpo anti-IgG PSA spesso pubblicato (clone 735). Non è chiaro il motivo per cui in commercio anticorpi anti-PSA IgM non sono stati utilizzati più di frequente in passato per confermare i risultati ottenuti con l'anticorpo IgG antiPSA 735. Questo è particolarmente interessante perché HIgM12 ha già dimostrato l'efficacia in diversi modelli di malattia. Mentre gli altri anticorpi anti-PSA IgM possono avere effetti terapeutici simili non è chiaro se l'anticorpo anti-IgG PSA (clone 735) ha un risultato terapeutico simile a modelli di MS e SLA.
In breve, i metodi descritti qui sono stati utilizzati principalmente per identificare l'antigene dei rigenerativi HIgM12 anticorpo umano per sostenere eventuali studi clinici per la SM e, eventualmente, altre malattie neurodegenerative. L'identificazione di formicaigens per anticorpi con attività biologica è passo essenziale per capire la loro meccanismo di azione. Questo diventa particolarmente rilevante nel contesto di numerosi anticorpi monoclonali attualmente in fase di sperimentazione per la sicurezza e l'efficacia in studi umani. Mentre il numero di anticorpi IgM clinicamente testati fino ad oggi è di piccole dimensioni, i recenti progressi nella IBRIDOMA insieme ad un crescente numero di studi che evidenziano il potenziale terapeutico di questa classe di anticorpi 1-10,37,40,42-45 sollecita lo sviluppo di nuove o metodi modificati applicabile per identificare non proteici antigeni IgM.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 e R21 NS073684), la National Science Foundation (premio alla carriera), il Premio Partnership Minnesota per la biotecnologia e medicina genomica, la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , e la Mayo Clinic center for clinica e traslazionale Scienza (CCATS). Gli autori riconoscono il sostegno delle Fondazioni Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford, la Luna e Marilyn Parco Fondo Directorship e la famiglia McNeilus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. J Autoimmun. 29 (4), 295-302 (2007).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. N Biotechnol. 25 (5), 294-298 (2009).
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Acorda Therapeutics Inc. An Intravenous Infusion Study of rHIgM22 in Patients With Multiple Sclerosis (Clinical Trials Identifier - NCT01803867). , Available from: http://1.usa.gov/1N2gsHJ (2015).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O'Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, Suppl 1. S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3'-isoLM1 3',6'-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
