We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, 1,2 e física de polímeros. 3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. 5 primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização 6 e confinamento nanochannel. 7 Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico.
No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. 8 No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. 9 Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. 10 Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%.
Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed 11 e corados com FP-PAD.
Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. 6 Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
1. DNA Biotinylation | |||
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
2. Functionalized Surface Derivatization | |||
2.1) Piranha Cleaning | |||
Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
Teflon rack | Custom Fabrication | ||
PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
2.3) PEGylation of the coverslip | |||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
3. Assembling a Flow Chamber | |||
Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
Quick-dry Epoxy | 3M | ||
Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
Microscope | Olympus | IX70 | |
EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
Alconox | Alconox Inc. |