Introduction
Den bananfluen (Drosophila melanogaster) sammensatte øje er en stor model system til at undersøge den funktionelle organisering af fotoreceptor og interneuron arrays til neurale billede prøvetagning og behandling, og for dyr vision. Systemet har den mest komplette eldiagram 1,2 og er venlig til genetiske manipulationer og nøjagtig neurale aktivitet overvågning (af højt signal-til-støj-forhold og tid-opløsning) 3-10.
Den Drosophila øje er modulopbygget, der indeholder ~ 750 tilsyneladende regelmæssige linse-udjævnede strukturer kaldet ommatidia, der tilsammen giver den flyver en panoramisk synsfelt, der dækker næsten alle retninger omkring hovedet. Øjets primære oplysninger prøveudtagning enheder er dens rhabdomeric fotoreceptorer 7,8,11. Hver ommatidium indeholder otte fotoreceptorceller (R1-R8), som deler samme facet linse, men er tilpasset til syv forskellige retninger. Mens de ydre fotoreceptorer R1-R6 are mest følsomme for blågrønt lys, spektrale følsomhed de indre celler R7 og R8, der ligger oven på hinanden og peger i samme retning, udviser tre markante undertyper: bleg, gul og dorsale randområde (DRA) 12- 15.
Figur 1. Funktionel Organisationen af Drosophila Eye. (A) De to første optik ganglier, nethinden og lamina, er fremhævet i gråt inde flyve øjet. Retina R1-R6 fotoreceptorer og lamina Store Monopolære celler (LMC'er: L1-L3) er let tilgængelige in vivo til konventionelle skarpe mikroelektrode optagelser. Den skematiske elektrode fremhæver den normale vej at optage fra R1-R6 i nethinden. En vej til at optage fra LMC'er i lamina er at flytte parallelt elektroden til venstre. (B) Lamina er en matrix af retinotopically organized patroner, som hver er fyldt med neuroner, der bearbejder information fra et bestemt lille område i det visuelle rum. På grund af neural superposition, seks fotoreceptorer fra forskellige nabolande ommatidia sender deres axoner (R1-R6) til samme lamina patron, der danner histaminerge output synapser til L1-L3 og et amacrine celle (Am). (C) Spredningen af neural information mellem R1-R6 axonterminaler og visuel interneuroner (herunder L4, L5, Lawf, C2, C3 og T1), inde i en lamina patron er kompleks. (D) R1-R6 fotoreceptor axoner modtager synaptiske feedbacks fra L2 og L4 monopolære celler. (B) og (C) modificeret fra Rivera-alba et al 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Drosophila øjet er af den neurale superposition type 16. Dette betyder that de neurale signaler af otte fotoreceptorer tilhører syv nabolandet ommatidia, der ser på det samme punkt i rummet, samles sammen på én neurale patron i de næste to neuropils: lamina og medulla. Mens de seks ydre fotoreceptorer R1-R6 projicere deres axonterminaler til neurale kolonner i hinden (figur 1), R7 og R8 celler omgå dette lag og gøre synaptiske kontakter med deres tilsvarende medulla kolonne 17-19. Netop disse ledninger frembringer den neurale substrat for retinotopisk kortlægning af flue tidlig vision, hvorefter hver lamina (figur 1A-C) og medulla søjle (patron) repræsenterer en enkelt punkt i rummet.
Direkte input fra R1-R6 fotoreceptorer modtages af de store Monopolære Cells (LMC'er: L1, L2 og L3) og amacrine Cell (Am) i hinden 1,2,20. Ud af disse, L1 og L2 er de største celler, formidler store informations veje (Figur 1D), which reagere på on- og off-bevægelige kanter, og dermed danne den beregningsmæssige grundlag af bevægelsessensoren 21,22. Adfærdsmæssige eksperimenter tyder på, at ved mellemliggende kontrast, de to veje letter bevægelse opfattelse af modsatte retninger: back-to-front i L1 og frem og tilbage i L2 celler 23,24. Connectivity indebærer endvidere, at L4 neuroner kan spille afgørende rolle i den laterale kommunikation mellem tilstødende patroner 25,26. Gensidige synapser blev fundet mellem L2 og L4 celler beliggende i samme og to tilstødende patroner. Downstream, hver L2 celle og dens tre tilknyttede L4 celler projicere deres axoner til et fælles mål, at den TM2 neuron i medulla, hvor input fra tilstødende patroner menes integreres til forarbejdning af front-to-back bevægelse 27. Selvom L1 neuroner modtager input fra samme patron L2s via både gap junctions og synapser, er de ikke direkte forbundet til L4s og dermed tilstødende lamina patroner.
Intracellulære spænding optagelser fra individuelle fotoreceptorer og visuelle interneuroner i næsten intakt Drosophila levere høj signal-til-støj ratio data sub-millisekund 3,5,7-10,29, som er nødvendig for at skabe mening af de hurtige neurale beregninger mellem de tilsluttede neuroner. Dette niveau af præcision er umulig af nuværende optiske billeddiagnostiske teknikker, som er betydeligt mere støjende og typisk opererer på 10-100 ms opløsning. På grund elektroderne har meget små og skarpe spidser, hvilken fremgangsmåde er ikke begrænset til cellelegemer, men kan give direkte optagelser fra små aktive neurale strukturer; såsom LMC'er 'dendritiske træer eller fotoreceptor axoner, som ikke kan tilgås af meget større tip af patch-clamp-elektroder. Vigtigt er det, metoden er også strukturelt mindre invasiv og skadelige end de fleste patch-clamp-applikationer, og så rammer mindre de undersøgte cellernes intracellulære miljø og information sampling. Således har traditionelle skarpe mikroelektrode teknikker bidraget, og holde på at bidrage, grundlæggende opdagelser og originale indsigt i neurale inforninger behandling på et passende tidspunkt skalaen; forbedre vores mekanistisk forståelse af synet 3-10.
Denne artikel forklarer, hvordan in vivo intracellulære optagelser fra Drosophila R1-R6 fotoreceptorer og LMC'er udføres i Juusola laboratoriet. Denne protokol vil beskrive, hvordan til at konstruere en passende elektrofysiologi rig, forberede fluen, og udføre optagelserne. Nogle repræsentative data præsenteres, og nogle almindelige problemer og mulige løsninger diskuteres der kan opstå, når du bruger denne metode.
Protocol
Følgende protokol følger alle retningslinjer for dyr pleje af University of Sheffield og Beijing Normal University.
1. Reagenser og udstyr Forberedelse
- Optagelse og Light Stimulation Opsætning af udstyr
- Vælg mindst 2,5 x 2,5 m optagelse område for at udføre elektrofysiologiske eksperimenter i et rum, der har aircondition med reguleret luftfugtighed og midler til at give mørke optageforholdene. Sikre, at dette område er stort nok til at komfortabelt passer en: (i) 1 x 1 m vibrationer-isolation tabel, der huser riggen [flyve stimulering og optegnelsesapparat], stereomikroskop og en kold lyskilde med to goose halse, alle er indesluttet i et store> 180 cm høj Faraday buret (Ii) en 38U redskabsholder til boliger en personlig computer med en flad LCD-skærm, mikroelektrode forstærker, LED drivere, filtre, temperatur kontrolenheder, oscilloskoper og andre nødvendige elektriske instrumenter; og (iii) enlille skrivebord og en stol til investigator.
- Placer riggen langt væk fra elektriske og mekaniske støjkilder, såsom køleskabe, centrifuger og elevatorer. Brug separate bølge beskyttere for at beskytte riggen elektriske apparater fra spændingsspidser der forekommer i lysnettet. Ideelt set tilslutte riggen til sin egen nødstrømsforsyning (UPS batteri) for at minimere støjen.
- Konstruér en konisk flue-indehaver af messing og sort plast (figur 2). Bor et lille tilspidsende hul igennem messing enhed med sin eksterne rand indsnævring til ~ 0,8 mm diameter (svarende til en typisk flyves thorax bredde).
Bemærk: Dette hul skal tilspidses mod spidsen af fly-holderen, så en større end gennemsnittet Drosophila, som projiceres fra neden af luftstrømmen, ville sidde fast skulder-dybt øverst rand. - Design og bygge en mekanisk robust, men alligevel præcis, flyve stimulering og registrerende apparat (figur 3). Construct ud of aluminium eller messing (høj ledningsevne metaller) en flue forberedelse platform stang og omkring det en Cardan-arm-system, med indlejret kuglelejer, at give glatte og præcise x, y-positionering og låsning af lyset stimulus.
Bemærk: Denne integrerede komposit design minimerer mekaniske vibrationer, som ellers kunne løsne optagelsen elektrodespidsen ud fra den undersøgte celle. Det kan endvidere omfatte en Peltier-element-baserede close-loop temperatur kontrolsystem, så efterforskerne at bruge temperaturfølsomme genetiske konstruktioner, såsom shibire TS, for at vurdere synaptiske kredsløb beregninger 9,30. Anodisere apparatet eller male det sort for at minimere lys stimulus scatter.- Fastgør fluen stimulering og optagelse apparater på den anti-vibration tabellens breadboard; for eksempel ved M6-bolte, ved hjælp af sine metriske skruehuller. Brug en sort breadboard eller dække det med sort stof for at minimere lysspredning ved forsøg.
- position og lås (ved hjælp af en låseskrue) en lodret justerbar flue forberedelse platform pol på midten af en Cardan-arm-systemet. Placer fly-præparat (i fly-holderen, se trin 2) på platformen pole således at lyskilden er fastgjort til Cardan-armen radialt peger på fluen hoved. Sørg for, at midten af flyve øjne er præcis på det skæringspunkt (0, 0) i Cardan-arms x- og y-akserne, da dette giver mulighed for præcise x, y-positionering af lys stimulus til et sted inden for flue synsfelt.
Bemærk: Denne funktion er nødvendig for at kortlægge respons egenskaberne af de enkelte celler til specifikke øjet steder, fx når de søger efter elektrofysiologisk bevis for strukturelle tilpasninger, såsom lyse eller akutte zoner, som ville vise stigende følsomhed eller opløsning, henholdsvis 31.
- Monter stereomikroskop bag fluen stimulering og optagelse apparat på den anti-vibration bord såat det giver komfortabel stor forstørrelse visning af flyve øjet.
- Monter kolde lyskilde på toppen af mikroskopet med den lyskilde dobbelte hoved halvstive svanehals lysledere peger ned mod indehaveren fluen forberedelse. Frit bevægeligt to beam belysning gør det lettere at visualisere optagelse elektrodespidsen ved kørsel gennem en lille åbning ind i flue øjet.
- Forsynes med en passende x, y, z-mikromanipulator sæt (grov & fint) til optagelsen elektrode og hoved-fase på den anti-vibration bord, på højre side af fluen stimulering og registrerende apparat, ved hjælp af M6-bolte eller magnetisk står.
Bemærk: I Juusola laboratoriet, er forskellige rigge udstyret med forskellige manipulatorer; for detaljer se tabellen i Materialer og reagenser. Disse alle levere høj kvalitet intracellulære optagelser. - Monter en lille manuel 3-akse mikromanipulator for indehaveren reference elektrode på lodret justerbar fly forberedelse platform pole. Orientere referenceelektroden, så den peger mod flue præparat.
- Konstruere en fritstående lys-afskærmet Faradays bur ud af stål-paneler rundt om anti-vibration bord, der omgiver fluen stimulering og optagelse apparater, for at forhindre udvendige elektromagnetiske forstyrrelser. Efterlad den forreste del af buret åben, hvilket giver adgang til transport fluen forberedelse til forsøgene. Vedhæft sort stof gardiner (med kobber- eller aluminium-mesh implanteret inde i dem for jordforbindelse) ved fronten for at beskytte ud støj og lys. Male det indvendige af buret sort for at minimere lysspredning og bolt frem til buret på gulvet for at forhindre vibrationer.
- Tilslut spænding og aktuelle udgange på høj impedans intracellulær mikroelektrode forstærker til indgangene på to separate lavpasfiltre (Bessel eller lignende) ved hjælp af BNC-kabler. Ligeledes forbinde filter output i de relevante kanaler af AD-stik bloCKS / bestyrelser dataindsamlingssystemet (DA / AD-kort). Slut DA / AD-kort (er) i en personlig computer af specialiserede kabler, ifølge leverandørens manualer.
- Installer passende erhvervelse software til datafangst system valg på den personlige computer. Sørg for, at datafangst drivere er kompatible med operativsystemet på den personlige computer.
- Ground elektrisk fluen stimulering og optagelse apparater, Faradays bur, kobber mesh (inden gardinerne), mikroskop, mikromanipulatorer, kold lyskilde, 38U redskabsholder med alle sine instrumenter (den intracellulære forstærker, filtre, temperatur kontrol enhed, PC og LCD-skærm etc.) til et enkelt centralt jorden punkt ved hjælp af udstyr jordledning og M6 crimp ring jordforbindelse ender. Brug en elektrisk multimeter til at teste, at alle dele er i det samme område.
Bemærk: For at opnå de bedst mulige støjsvag optageforhold, grundstødningen konfigurationer typisk varierer from en opsætning til en anden.- Hvis det er nødvendigt, at forbinde det centrale jorden punkt videre til bygningen jorden, og / eller mikroelektrode forstærkerens centrale jorden. Efter at have testet den fuldt fungerende systemet under reelle elektrofysiologiske eksperimenter, være parat til at ændre jordforbindelse konfiguration som er nødvendig for at minimere støj i optagelserne.
- Konfigurer software forstærkning (1 - 10X), signal-filtrering (typisk lav-pass filtre sat til 500 Hz, som er egnet til både R1-R6 og LMC data), og samplingfrekvens (mindst 1 kHz). Sørg for, at indstillingerne adlyder Nyquist-Shannon sampling teorem 32; for eksempel, når erhverve data, der er lav-pass-filtreret ved 500 Hz, skal du bruge en sampling frekvens på 1 kHz eller højere for at minimere aliasing effekter.
- Som karakteristiske spænding svarene fra R1-R6 fotoreceptorer er 40-65 mV, og de af LMC'er 20-45 mV, indstille forstærkning og display skaleres således at muliggøre høj opløsning sampling og data visualisering.
Figur 2. Konisk Fly-Indehaveren af fly-holderen er lavet af to stykker:. Den centrale messing enhed og dens koniske sort plast frakke. Den centrale hul inde i messing enhed tilspidses til en lille diameter, der knap nok lader fluen igennem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Oversigt over Elektrofysioloqisk Rig. Opstillingen indeholder en fritstående lysafskærmet Faradays bur, anti-vibration bord, fluen stimulering og registrerende apparat, og sorte stof gardiner med kobber- eller aluminium-mesh indvendig til jordforbinde. de instrument rack er elektrisk forbundet til den samme centrale jorden med alt det udstyr inde i Faradays bur. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Bearbejdning Mikroelektroder
- Træk henvisning mikroelektrode fra filamenteret borsilicat (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) rør med en pipette aftrækker instrument. Forsøge at opnå en kort gradvis tilspidsning.
Bemærk: De præcise indstillinger af pipette aftrækker program varierer fra instrument til instrument; flere detaljer i Tabel over Materialer og regenter. Porestørrelsen på spidsen er ikke afgørende, fordi spidsen af referenceelektroden vil blive brudt, før den bliver indsat i flue præparat. - Træk optagelsen mikroelektrode fra filamenteret borsilicat (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) rør med en pipette aftrækker instrument. Prøv at opnå en lang (10 - 15 mm) fine gradvis tilspidsning.
- Undersøg med et lysmikroskop, at optagelsen elektroder viser korrekt tilspidsning. Monter elektrode på en glasplade med formbart lim og bruge 40X luft målsætning at inspicere spidsen.
Bemærk: En god elektrode tilspidser jævnt indtil dens usynligt lille spids, omkring hvilken ubrudte parallelle mørkere og lysere interferensmønstre kan ses. Nogle aftrækker indstillinger generere høje modstand elektroder, som ikke kan give succesfulde celle gennemføringer fordi deres tip ligne "trompeter". Således visuel inspektion af elektroderne er vigtig. - Sæt elektroderne vandret på en stor Petri-skål med modellervoks (eller lignende formbare klæbemiddel) til opbevaring og transport til elektrofysiologi riggen. Sørg for, at elektrode tips enre altid i luften og ikke ved et uheld at røre noget.
- Back-fylde optagelse og reference elektroder lige før forsøget med den passende saltopløsning. Brug en lille 5 ml sprøjte forbundet til en lille partikel filter med en fin plast spids (såsom en microloader).
- For fotoreceptorer eksperimenter, fylde optagelsen elektrode indtil fuld (en dråbe former i sin store ende) med 3 M KCI da denne løsning minimerer effekten af flydende junction potentiale til det optagede spænding.
- For at undersøge histaminerge LMC'er, som reagerer på synaptisk input fra R1-R6 fotoreceptorer af chlorid-konduktans ændringer, fylde optagelsen elektroder med 3 M kaliumacetat og 0,5 mM KCI, da denne løsning har mindre effekt på cellens chlorid batteri. Fyld referenceelektrode med flue Ringer indeholdende i mM: 120 NaCl, 5 KCI, 10 TES (C6 H 15 NO 6 S), 1,5 CaCl2, 4 MgCl2, og 30 sucrose
- Test modstand af et nyligt trukket optagelse elektrode i registreringssystemet.
- Sørg for, at sølvtråde inde i elektrode-holdere er jævnt belagt med sølvchlorid (optræder lilla-grå - ikke skinnende sølvfarvede) for at minimere optagelse artefakter (såsom drift i krydset potentiale). Hvis ikke, erstatte dem med korrekt chloridized ledninger.
- Hvis det er nødvendigt, chloridize nye sølv ledninger. Rengør forsigtigt ledningerne (ved hurtigt at føre dem gennem en flamme), således at disse forekommer lyse sølv i farver. Undgå at berøre dem med fingrene, for at deponere på et jævnt lag af AgCl. Soak ledningerne i fuld styrke blegemiddel i 15 - 30 min, indtil de ser lilla-grå farve. Alternativt elektroplettere hver tråd (ved at gøre det positive med hensyn til en opløsning indeholdende 3 M KCI og lede en strøm gennem det med en hastighed på 1 mA / cm2 overfladeareal) for 10 - 15 sek indtil tilstrækkeligt overtrukket. Slut back-fyldte optagelse og reference elektroder til deres elektrode deltagere. Placer en lille Ringers opløsning bad på den vertikalt justerbare flyve forberedelse platform pol. Kør elektrodespidserne i Ringers opløsning og måle optagelsen elektrodens spids modstand.
Bemærk: Dette trin er kun nødvendigt, når du tester de resistive egenskaber elektroder, der er trukket fra et nyt parti af glas rør, eller når optimere mikroelektrode aftrækker instrument programmer via iteration. - Inden du udfører målingerne modstand, læse instruktionerne i forstærkerens fremstilling brugervejledning for de relevante måleindstillinger. For en god optagelse elektrode, har en spids modstand på ~ 100 - 220 MQ.
- Træk henvisning mikroelektrode fra filamenteret borsilicat (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ydre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) rør med en pipette aftrækker instrument. Forsøge at opnå en kort gradvis tilspidsning.
2. Drosophila Forberedelse
- Saml 5 - 10 dage gamle fluer (efter eclosion) og placere dem i et rent flue rør indeholdende stAndard mad. Det er muligt at opnå gode optagelser fra yngre flyver for, selv fra de "nyfødte"; men på grund af deres blødere øjne, skære en hornhinde åbning til optagelse elektrode er vanskeligere.
- Konstruer en flue fange rør og en flue forberedelse stå (figur 4). Se figur 4 for den generelle idé om, hvordan disse self-made værktøjer blev sat sammen.
- For at gøre en flue fange rør, afbrød spidsen af 50 ml plast centrifugerør s konisk bund. Indsæt derefter og lim den store ende af en ml pipettespids på denne nye åbning.
- Endelig skæres den lille ende af pipette til en størrelse, der let lader en flue til at gå igennem. Kontakt en mekanisk værksted til at samle en lille flue forberedelsesfasen, der muliggør 2-akserne rotation og låsning af fly-indehaveren til forskellige positioner.
Figure 4. Værktøj og Devises nødvendige for at træffe Fly Forberedelse. Fly fange rør er lavet ved at lime en 1 ml plastik pipette tip til en 50 ml plastik centrifugerør. Skræddersyede flue forberedelse holder gør det muligt frit rotation og låsning af flyve-indehaver i en foretrukken position for udarbejdelse af fluen. Fluen fastsat ved bivoks, ved hjælp af elektrisk voks-radiator. Vaselin påføres ved en lille applikator lavet ved at forbinde en tyk sort hår på et håndtag. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Saml en flue til eksperimentet i en 1 ml pipettespids, som knap nok giver en flue til at passe igennem. Fastgør flue fange rør, med pipettespidsen på det, til fluen røret. Ved at fange en flue, drage fordel af deres iboende tendens til at klatre opad (antigravitaxis) i pipettespidsen. Fortrinsvis vælge den største kvindelige, som størrelsen betydningsi elektrofysiologi.
Bemærk: Jo større flue, jo større dens celler og jo bedre er chancerne for høj kvalitet intracellulære optagelser. Mindre fluer (både kvinder og mænd) kan også give gode optagelser, men præparatet er sværere at gøre. Når fluen er fanget i et stort pipettespids, huske at lukke fluen rør til at stoppe andre fluer i at undslippe. - Tilslut en 100 ml sprøjte med en fleksibel plastslange til den større åbning af pipettespidsen - med fluen stadig i det.
- Anbring den smalle ende på den store pipettespids, der er forstørret bare at lade en Drosophila igennem, til åbningen i bunden af fly-holder og klemme en lille mængde luft fra sprøjten at udstøde flyve ind i fly-indehaveren .
- Kig gennem stereomikroskopet og forsigtigt administrere mere luft indtil fluen hoved stikker fra den koniske ende af fly-holderen. Sørg for, at fluen fast er fanget fra sin brystkasse til den lille åning på toppen af flyve-holderen.
- Brug en voks varmelegeme at fastgøre fluen med bivoks fra sine "skuldre" til fly-holderen. Juster temperaturen af voks varmelegeme til at være så lav som muligt endnu rent smeltning af voks.
Bemærk: Når temperaturen er korrekt, voks synes gennemsigtig. For høj en temperatur gør voks "brænde væk"; for lavt holder voks stiv. Ved fastsættelse fluen, være præcise og korte som længerevarende varme eksponering kan beskadige den. Brug lys-cured dental lim anbefales ikke her som dens anvendelse er for langsom.
Figur 5. Forberedelse af Fly for in vivo forsøg. Venstre, A Drosophila hoved er placeret lige i fly-holder og fast fra sin snabel, højre øje og skuldre til fly-holder med opvarmet beeswax. Højre, er en lille åbning skåret i den tykkeste del af øjet, lige over ækvator og kun få ommatidia væk fra bagsiden kutikula, med en skarp razor kant. Et stykke af hornhinden forsigtigt fjernes og hullet er forseglet med vaseline for at forhindre, at øjet tørrer op. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Immobilisere fluen hoved. Påfør bivoks til proboscis (figur 5) og hjørnet af det højre øje, undgå hornhinden, og fastgør hovedet fra disse punkter til fly-holderen.
- Fremstil en mikro-kniv. Klemme en ikke-rustfrit stål razorblade med to Blade-holdere / afbrydere (begge med fladt greb) og knække en lille stribe af sin skarpe kant. For sundhed og sikkerhed, brug beskyttelsesbriller til øjenbeskyttelse (selvom det er højst usandsynligt, at stykker ville Ricochet når skraberen er revnet). ideelt,producere en skarp barberkniv kant, der ligner et spir. Sørg for, at denne "spir" solidt fastgjort til klingen-holder, men vær omhyggelig med at undgå enhver skade på sig selv!
- Med micro-kniv, forberede en lille åbning størrelse på nogle få ommatidia i gylp venstre øje - på omkring 4. - 5. ommatidia fra den dorsale kutikula lige over øjets ækvator til tilvejebringelse af passage til optagelsen mikroelektrode. Udfør under et stereomikroskop, visning præparatet med stor forstørrelse.
Bemærk: Da fluen øjet føles elastisk og resistiv til sondering, hullet er bedst skåret med en "spir" -knife. Den skærende teknik er ganske udfordrende, så være meget opmærksom på video demonstration. Holde fluen-indehaveren i visse orienteringer (i fluen forberedelse stander) kan gøre dissektion lettere. I første omgang kan mikrokirurgi føler svært at lære, men når engageret, neurale tilpasninger gradvist forbedrer investigators 3D-opfattelse og fingerfærdighed. - ReFlyt omhyggeligt det lille stykke hornhinde fra åbningen, der lige er skåret, udsætter nethinden nedenunder. Hurtigt dække hullet i øjet med en lille klat vaseline ved hjælp af den fine hår af vaseline applikator.
Bemærk: Vaselin tjener flere roller her. Det forhindrer væv dehydrering og koagulation af hæmolymfe der ville bryde indsat elektrode. It også øvrigt frakker mikroelektrode mindske den intramuralt kapacitans. Dette kan forbedre frekvensgangen af registreringssystemet, og så den tidsmæssige opløsning af de optagne neurale signaler. At undgå udtværing vaseline over resten af øjet, da dette slører optikken.
3. Optagelse fra R1-R6 Fotoreceptorer eller LMC'er
- Altid være jordet ved betjening af mikroelektrode forstærker (f.eks ved at berøre metaloverflade på Faradays bur eller anti-vibration tabel), da dette udelukker en fra uheld levereing en statisk ladning til head-fase, som kan beskadige kredsløb.
- Oplys fluen forberedelse platform pole ovenfra af to gås-hals lysledere (Figur 6A) (med kold lyskilde inde i Faradays bur), således at fly-holderen kan placeres på stangen i den foretrukne position under tæt visuel kontrol .
Figur 6. Placering af Fly-holder og de Elektroder til de Eksperimenter (AB) Fluen-holderen er placeret på optagelsen platform, der også giver temperaturkontrol via et Peltier-element (A: hvid rund platform i midten).. The Cardan-arm muliggør præcis positionering af lyset stimulus lige langt (via x, y-rotation) omkring flue, med lyskilden (en væske eller kvarts fiberoptisk bundt ende) direkte peger på øjet. I mange af our rigge, er lys stimulation genereret af lysdioder (med lineære nuværende-drivere) eller af en monokromator. Således deres stimuli bære en bestemt (band-bestået) spektral indhold, udvalgt mellem 300-740 nm og dække 4 - 6 log intensitet enhed område (som svækket af separate neutralfiltre). (C) To mikroelektroder, styret af separate mikromanipulatorer, er anbragt i gylp hoved: referenceelektroden (ovenfor) gennem ocelli; registreringselektroden (venstre) gennem den lille åbning i venstre øje. (D) For at opnå et maksimalt antal fotoreceptor optagelser, er optagelsen mikroelektrode kørt ind i hullet, parallelt med snabel-ocellus akse. Når elektrodespidsen trænger og tætninger til en fotoreceptor, er frit drejelig lyskilde fastgjort til den position, hvor cellen producerer den maksimale spænding reaktion på en given lys stimulus. Dette punkt i rummet ligger i centrum af cellens receptive felt. Hvis hullet is tæt på kutikula, LMC gennemføringer kan yderligere opnås med denne samme elektrode vinkel (til venstre). Hvis hullet er længere fra neglebånd, til en anden nyttig elektrode tilgang vinkel opnå LMC optagelser vises også (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Monter flyve-holderen (med fluen i det!) On the fly forberedelse platform pol. Drej fly-holderen, så fluen venstre øje står direkte investigator (figur 6B).
- Sæt den stumpe referenceelektrode blidt gennem flue Occelli ind i hovedet kapsel med en lille grov mikromanipulator under iagttagelse forberedelse gennem stereomikroskop (figur 6C). Skub ikke elektroden for dybt, da dette kan beskadige flue hjernen.
- Alternativt, indsæt henvisning elektrode ind i bagsiden af brystkassen. Altid sikre, at fluen synes heathy (flytter sin antenner), og øjnene er intakte; ikke utilsigtet beskadiget. Hvis præparatet ser mindre end perfekt, udarbejde en ny flue til forsøgene.
- Kør den skarpe optagelse mikroelektrode i det venstre øje gennem vaseline dækkede lille åbning forberedt tidligere. Brug stor forstørrelse i stereomikroskop og flytte lysledere og brændplanet så elektroden spids placering viser sig i 3D af dens reflektans mønstre.
Bemærk: Figur 6D viser, hvordan fluen hoved skal være placeret lidt forskelligt (i forhold til den vinkel optagelsen mikroelektrode kommer ind i øjet) for fotoreceptor og LMC optagelser. Kørsel elektroden i øjet uden at bryde det er den vanskeligste fase af forsøget. Hvis elektrodespidsen savner den lille åbning i øjet, rammer hornhinden, det typisk bryder. - Tænd for mikroelektrode forstærkerennår begge elektroder er fast inde i forberedelse, i elektrisk kontakt med flyve kropsvæsker.
- Sluk koldt lyskilde (inde i Faradays bur) og tage stikket ud af stikkontakten. Tilslut sin stik til den centrale jorden for at minimere jord-loop induceret elektrisk støj, og flytte gås-hals lysledere væk, så at Cardan-arm-systemet kan frit flyttes rundt i farten. Sluk lyset i rummet for at sikre, at fluen forberedelse er nu i relativ mørke.
- Mål modstanden af optagelsen elektrode i øjet (som anvist i forstærkerens brugervejledningen). Brug kun optagelse elektroder, hvor modstanden er 100-250 MOhm.
Bemærk: Det er næsten umuligt at opnå en høj kvalitet intracellulære optagelser ved <70 MOhm elektrode. Hvis modstanden er <80 MQ, er det sandsynligt, at elektrodespidsen er brudt. I dette tilfælde, slukke for forstærkeren og ændre optagelsen elektroden.- Når elektrodenerstattes og i øjet, tænd forstærkeren at måle dens modstand. Nogle gange kan elektrodespidsen blive blokeret af nogle detritus når det kommer ind i vævet. Dette kan afhjælpes ved at bruge forstærkerens kapacitive buzz og aktuel puls funktioner, der typisk klare det ved hurtig resonation eller frastødning.
- Indstil forstærkeren til strøm-clamp (CC) eller bro optagefunktion. Annuller enhver vilkårlig spændingsforskel mellem optagelse og reference elektroder, som begge er nu hviler i den elektrisk forbundne ekstracellulære rum, ved at indstille signalet offset (optagelse spænding) til nul. Følg signal offset ændringer ved at forstærkerens display udlæsning eller et oscilloskop skærm.
- Vent 2-3 min for fluen øje til mørk-tilpasse sig.
- Drive optagelsen elektrodespidsen gradvist dybere ind i øjet med små 0,1 til 1 mikron trin. Gør dette med en x-aksen piezo-stepper af en fjernstyret mikromanipulator eller by forsigtigt dreje fine opløsning knop af en manuel manipulator.
- Stimulere fluen øje med kortvarig (1 - 10 msek) blinker som optagelsen elektroden bliver fremført i vævet.
Bemærk: Hvis optagelsen elektroden er placeret i nethinden og øjet fungerer normalt, vil hver lysglimt forårsage en kort og lille fald i spænding (0,2-5 mV hyperpolarisering), kaldet elektroretinogrammet (ERG). Denne ændring i det område potentiale ekstracellulære rum er forårsaget af de retinale celler kollektive respons på lys. Men når elektrodespidsen ind i lamina, lukning på LMC'er, ERG reverserer, viser depolariserende responser. - Flyt lyskilden omkring flue øjet ved hjælp af Cardan-armsystemet og finde den position, hvor lyset fremkalder den største ERG respons.
Bemærk: Denne position markerer mellem, i det visuelle rum, hvor fotoreceptorerne (eller LMC'er), som er placeret ved siden af spidsen af registreringselektroden, Prøve deres lys input. - Trænge ind i et celle med optagelsen elektrode.
Bemærk: penetration kan opstå spontant, eller når elektroden er mikro-trådte frem. Det kan yderligere lettes ved forsigtigt at banke på mikromanipulator systemet eller ved at bruge buzz-funktionen på forstærkeren; disse aktioner genklang elektrodespidsen i vævet. Når elektroden spidder fotoreceptor membran, indtastning af dens intracellulære rum, spændingsforskellen mellem registrerings- og referenceelektroden falder pludseligt fra 0 mV til ~ -65 mV (mellem -55 og -75 mV); mens under LMC gennemføringer, dette fald er typisk mindre (mellem -30 og -50 mV). Disse spændingsforskelle repræsenterer de negative hvilende potentialer de givne celler. Afhængigt af kvaliteten af optagelsen elektrode (skarpheden) og den cellulære proces det gennemtrænges, kan spændingen aflæste registreringselektroden stabilisere hurtigt eller gradvist til den hvilende potentiale, som cellemembranentætninger til det ydre lag af elektroden. Men hvis penetrationen kun er delvis eller dårlig, elektroden glider typisk ud af cellen, og den indspillede potentielle klatring tilbage mod nul. - Lokalisere centrum af den gennembrudte celles receptive felt, når elektroden vises forsegles korrekt, viser stabil membranpotentiale (mørk hvilende potentiale). Flyt blinkende lys stimulus omkring flue øjet, ved hjælp af Cardan-arm-system, for at finde det punkt i visuelle rum, hvor lyset flash fremkalder cellens maksimale spænding reaktion. Lås Cardan-armen, når lyset stimulus direkte ansigter (punkter) den receptive felt center.
Bemærk: I mørke, Drosophila fotoreceptorer reagerer på lyse lysimpulser med 40 - 65 mV depolariserende spænding reaktioner 4,5, mens stabile LMC optagelser viser 20 til 45 mV hyperpolarisering 9,10,14 svar. Glia gennemføringer kan ske sjældent, angivet med <-80 mV rastende potentialer og meget langsommereog mindre (~ 5 mV) mættet lysinducerede depolariseringer. Fotoreceptorer i Drosophila med forskellige øjet pigmentations, såsom hvid-eye 7 og cinnober, viser sammenlignelige respons størrelser til vildtype. - Brug af forstærkerens aktuelle-clamp (CC) mode, kompensere optagelsen elektrodens kapacitans ved at indsprøjte små 0,1 nA og korte (100-200 ms) strømpulser i den undersøgte celle for at minimere optagelse artefakter under sin membran opladning.
Bemærk: Dette vigtige procedure er forklaret i detaljer i forstærkerens brugermanual, og bør praktiseres med en elektrisk celle model før de faktiske eksperimenter. - Optag spænding reaktioner på lysimpulser og andre stimuli af interesse, der har varierende statistiske eller fysiske kvaliteter (såsom naturalistiske lysintensitet tidsserier eller tilfældige kontrast mønstre). Test, for eksempel, hvordan de optagne svar ændre sig med lys- eller mørk-tilpasning.
Bemærk: Man kan præcist liGHT-tilpasse den undersøgte celle ved kontinuerlig lys forvalgte intensitet ved at tilføje neutralfiltre på lysbanen 4,5. Alternativt, for langvarig mørk-tilpasning slukke lyset stimulus for en forudindstillet tid. På grund af den mekaniske stabilitet af registreringssystemet, den høje kvalitet af optagelsen elektroder og intakt af præparatet, stabile optageforhold kan undertiden vare i mange timer. Således på en god dag, er det muligt at opsamle en stor mængde data ved forskellige Tilpasning forhold fra en enkelt celle. Når elektroden glider ud af cellen, de optagede svar mindskes, og den gennemsnitlige spænding begynder at nærme sig nul. - Advance omhyggeligt registreringselektroden med det fine x-aksen kontrol af mikromanipulator indtil elektroden får kontakt og trænger den næste celle (dette er typisk den nærmeste neurale nabo). Flyt ikke elektroden langs y- eller z-aksen, da disse manøvrer ville gøre elektroden til "plough vævet "sidelæns, beskadige øjet strukturer!
Bemærk: Med en god elektrode og en sund tilberedning kan man optage høje responser kvalitet fra mange fotoreceptorer (men sjældent fra mange LMC'er) i den samme flue over en periode på flere timer; lejlighedsvis, over hele arbejdsdagen (> 8 timer) uden forringelse klart signal. - Gem datafiler periodisk med at identificere oplysninger, såsom dato, genotype, og den indspillede celletype. På grund af den store mængde data, der kan indsamles i en vellykket optagelse session, holde gode skriftlige optegnelser i et laboratorium-bog til analyse fremtidige data.
Representative Results
Den skarpe metode mikroelektrode optagelse, som tilpasset her for Drosophila øje, kan bruges til pålidelig kvantificering neurale information prøvetagning og behandling i nethinden og lamina celler, og kommunikationen mellem dem 4,5,7,8,10,33. Ved at bruge den til at studere kodning i forskellige vildtype bestande, mutanter eller gensplejsede flyve stammer, har metoden bevist sin værdi; ikke kun i kvantificering af virkningerne af en mutation, temperatur, kost eller udvalgte ekspression 3,4,6,9,10,14,30,34, men også afsløre mekanistiske grunde til ændrede visuelle effekter 14,34. Metoden er også let anvendes til andre insekt præparater 35,36, styrkelse neuroethological vision undersøgelser. Næste vi fremvise et par eksempler på sine ansøgninger.
Figur 7. SpændingResponser af en bananflue R1-R6 Lysmodtageren til en lysimpuls ved 20 og 25 ° C Fordi de skarpe mikroelektrode gennembrydninger er ofte meget stabile, er det muligt at registrere spænding responser af samme R1-R6 fotoreceptor til et givet let stimulus ved forskellige omgivelsestemperaturer ved opvarmning eller køling fluen. I vores set-ups, er fluen-indehaver placeres på et close-loop Peltier-element-baserede temperatur-styresystem. Det giver os mulighed for at ændre fluen hoved temperatur på få sekunder. Højere temperatur accelererer spændingen svarene og karakteristisk sænker hvilende potentiale af R1-R6 fotoreceptorer (som angivet med røde pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Undersøgelse af temperaturens betydning for Lysmodtageren Output
° C (figur 7). Som kvantificeret før 4,9, opvarmning sænker en fotoreceptor s hvile potentiale i mørke, og accelererer dens spænding svar.
Figur 8. Signaling Ydelse en Fruit Fly R1-R6 Lysmodtageren Forbedrer med Light Intensity (A) Lysmodtageren output til dim (nedenfor) og lyse. (Over; 10.000 gange klarere lys) gentagne naturalistiske lysintensitet tidsserier registreret af samme mikroelektrodei den samme celle ved 20 o C. Reaktionerne på lyse stimulus er større, fordi de integrerer flere prøver, elementære reaktioner (bump) til enkelte fotoner 4,5,7,8. (B) 20 på hinanden følgende en-anden-lange spænding responser overlejres. Individuelle reaktioner (lysegrå) blev taget efter de adaptive tendenser (pil i A) havde trukket sig tilbage (stiplet boks i A). De tilsvarende respons middel (de signaler) er de mørkere spor. Forskellen mellem signalet og de individuelle reaktioner er støjen. (C) Cellerne 'signalering ydeevne blev kvantificeret ved optagelserne' Signal-støj-forhold (SNR) ved hjælp af standardmetoder 4,5,7,8. Fotoreceptor output har omkring 64 Hz bredere vifte af pålidelige signalering på den lyse stimulation (SNR 'Bright ≥1, op til 84 Hz) end ved dim (SNR' Dim ≥1, op til 20 Hz), med signal-støjforhold forbedre stærkt; fra SNR Dim MAX = 87 til SNR Bright MAX = 1868. Klik her for at se en større version af dette tal.
Studere Tilpasning og Neural kodning af Gentagne Stimulation
Den noninvasiveness af fremgangsmåden forårsager relativt lidt skade på nethinden og lamina strukturer, gør den ideel til at studere signalering effektiviteten af individuelle celler til forskellige lysstimuli i deres nære naturlige fysiologiske tilstand in vivo. Figur 8 viser spænding responser af en R1- R6 fotoreceptor til et svagt og lyse gentagne naturalistisk lysintensitet tidsserier stimulus ved 20 ° C, mens figur 9 ° C De præ- og postsynaptiske optagelser blev foretaget separat fra to forskellige fluer, fordi samtidige intracellulære optagelser med to skarpe mikroelektroder i samme flue, en i nethinden og den anden i lamina, er for svært at være levedygtig 30.
Figur 9. Spænding Responses af en Fruit Fly R1-R6 Lysmodtageren og LMC til Gentagen Naturalistisk Stimulation ved 25 ° C (A) R1-R6 (grå) og LMC (sort) udgange registreres af forskellige mikroelektroder fra forskellige fluer. (B) Fuldt lys-tilpasset 20 på hinanden følgende præ- (ovenfor) og postsynaptiske (nedenfor) reaktioner på den samme naturalistiske stimulus mønster med individuelle reaktioner, vist i lysegrå end de tilsvarende respons midler (de signaler) som de mørkere spor. Forskellen mellem signalet og de individuelle reaktioner er støjen. (C) Cellerne 'signalering præstation blev kvantificeret af optagelserne' Signal-støj-forhold (SNR). LMC udgang har omkring 10 Hz bredere vifte af pålidelige signalering (SNR 'LMC ≥1, op til 104 Hz) end R1-R6 udgang (SNR' R ≥1, op til 94 Hz). Både signal-til-støj-forhold er høje (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), og som optagelsen støjen var lav, deres forskelle afspejler reelle kodning forskelle mellem cellerne. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Efter at stimulus onset, optagelserne typiskely viser hurtigt tilpasse tendenser, der i vid udstrækning stilne af i løbet 5-6 sek. Fra da af cellerne producere meget konsekvente svar på hver 1 sek lang stimulus præsentation (hver stiplede kasse omslutter 20 af disse). Den repeterbarheden af svarene bliver indlysende, når disse er overlejret (figur 8B og 9B). Individuelle reaktioner er de tynde grå spor, og deres betyde tykkere mørkere spor. Den gennemsnitlige respons tages som neurale signal, mens den neurale støj er forskellen mellem middelværdien og hvert enkelt svar 4,5,9,37,38. De respektive signal-til-støj-forhold i frekvensdomænet (figur 8C og fig 9C) blev opnået ved Fourier-transformation signal- og støjdata bidder til effektspektre, og dividere den gennemsnitlige signaleffekt spektrum med det tilsvarende gennemsnitlige støjeffekt spektrum 4, 5,9,37,38. Karakteristisk de maksimale signal-til-støj-forhold of de registrerede neurale udgange til naturalistiske stimulation er høje (100 - 1.000), og i de mest stabile præparater med meget lav optagelse støj kan nå værdier >> 1,000 (f.eks, figur 8C.). Bemærk også, at opvarmning udvider cellernes båndbredde på pålidelig signalering 4 (SNR 'Bright ≥ 1); for eksempel er den relative forskel mellem de to R1-R6S i figur 8 og 9, henholdsvis er 10 Hz (84 ved 20 ° C og 94 Hz ved 25 ° C).
Man kan endvidere estimere hver celle rytme i informationsoverførsel fra dens signal-til-støj-forhold ved hjælp af Shannon ligning 32, eller ved at beregne forskellen mellem de reaktioner 'entropi og støj entropi satser gennem den tredobbelte ekstrapoleringsmetoden 39. Flere detaljer om informations- teoretiske analyser, og deres anvendelse og begrænsningr specifikt med denne metode er givet i de tidligere udgivelser 7,8,39.
Figur 10. Spænding Responses af en Killer Fly R1-R6 Lysmodtageren og LMC til Gentagen Naturalistisk Stimulation ved 19 ° C. (A) R1-R6 (grå) og LMC (sort) udgange registreret af samme mikroelektrode fra samme flue; første postsynaptisk og senere præsynaptisk, som elektroden blev fremført i øjet. (B) 20 på hinanden følgende præ- (ovenfor) og postsynaptiske (nedenfor) responser (lysegrå spor) til samme naturalistiske stimulus mønster blev fanget efter indledende tilpasning (punkteret kasse i A). Deres midler er de signaler (de mørkere spor på toppen), mens deres respektive forskelle i forhold til de individuelle svar giver støj. (C) Den tilsvarende Signal-støj-forhold (SNR) blev beregnet som i fig 8C og 9C. LMC udgang har omkring en 100 Hz bredere vifte af pålidelig signalering (SNR 'LMC MAX ≥1, op til 234 Hz) end R1-R6 udgang (SNR' R MAX ≥1, op til 134 Hz). Både signal-til-støj-forhold er høje (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), og som den samme mikroelektrode blev anvendt i optagelserne, deres forskelle afspejler reelle forskelle i den præ- og postsynaptiske neurale udgange. Disse resultater indebærer, at registreringssystemet havde lav støj, og dens indflydelse på analyserne var marginal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Neuroethological Vision Studies Fremgangsmåden kan også anvendes til at registrere præ- og postsynaptiske spænding responser fra forbindelsen øjne forskellige insektarter 7,8,35,36 (figur 10), hvilket tillader sammenlignende neuroethological studier af visuel informationsbehandling. For det præsenterede optagelsessystem, den eneste påkrævede tilpasning er nye forberedelse deltagerne, hver med en passende størrelse åbning for de undersøgte arter. Disse eksemplariske optagelser er fra en kvindelig morder flyve (Coenosia attenuata). De viser intracellulære spænding responser af en R1-R6 fotoreceptor og LMC til identiske gentagne lys stimulation, som anvendes til Drosophila modparter i figur 9, men ved 19 ° C. I dette tilfælde blev både præ- og postsynaptiske data optaget fra samme flue; den ene efter den anden, med den samme elektrode (fyldt med 3 M KCI) først fremføring gennem den laterale lag før indtasteing den frontale nethinden. I sammenligning med de Drosophila-data ved 25 ° C, den Coenosia data - selv ved den lavere temperatur - viser responser med hurtigere dynamik; udvide udvalget af pålidelige signalering (signal-til-støj-forhold >> 1) over et bredere frekvensområde. Sådanne funktionelle tilpasninger i neurale kodning af naturalistiske stimuli er i overensstemmelse med Coenosia 's aggressiv livsstil 36, der kræver høj præcision Spatiotemporal oplysninger for at opnå hurtige aerial jagt adfærd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22 | Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand |
| Stereomicroscope in the intracellular set-up | · Olympus | Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22 | 30X eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye |
| Nikon microscope | Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7 | ||
| Anti-vibration Table | Melles Griot | With metric M6 holes on the breadboard | Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below |
| Newport | |||
| Micromanipulators | Narishige | Narishige NMN-21 | In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs. |
| Huxley Bertram | Huxley xyz-axis with fine manual control | ||
| Sensapex | Sensapex triple axis | ||
| Märzhäuser | Märzhäuser DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller | ||
| Magnetic Stands | Any magnetic base with on/off switch will do | For example, to manage cables inside the Faraday cage | |
| Electrode Holders | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3 - 0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders |
| Fiber Optic Light Source | Many different, including Olympus | ||
| Fiber Optic Bundles | UltraFine Technology | To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR) | |
| Thorn Labs | |||
| Fly Cathing Tube | P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs | Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it. | |
| Digital Acquisition System | National Instruments | ||
| Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier | npi SEC-10LX | http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html | Outstanding performer! |
| Head-stage | Standard (+/- 150 nA) | For npi SEC-10LX | |
| LED light sources and drivers | 2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK) | Many of our stimulus systems are in-house built | |
| Self-designed and constructed | |||
| Acquisition and Analyses Software | Many companies to choose from | Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory | |
| Personal Computer or Mac | Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software | ||
| Cardan arm system | Self-designed and constructed | Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli | |
| Peltier temperature control system | Self-designed and constructed | ||
| Faraday Cage | Self-constructed | Electromagnetic noise shielding | |
| Filamented Borosilicate Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Filamented Quartz Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller | For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs’ preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise. |
| Extracellular Ringer Solution for the reference electrode | Chemicals from Fisher Scientific | 10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose | See the recipe in the protocol section |
| 3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode | Salts from Fisher Scientific | 10010310, KCl | |
| Petroleum jelly | Vaselin | ||
| Non-stainless steel razor blades | |||
| Blade holder/breaker | Fine Science Tools By Dumont | 10053-09 | 9 cm |
| Blu-tack | Bostik | Alternatively, use molding clay | |
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
References
- Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
- Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
- Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
- Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
- Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
- Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
- Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
- Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
- Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
- Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
- Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
- Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
- Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
- Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
- Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
- Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
- Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
- Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
- Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
- Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
- Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
- Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
- Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
- Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
- Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
- Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
- Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
- Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
- Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
- Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
- Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
- Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173 (2008).
- Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
- Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
- Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
- Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
- Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
- Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
- Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
- Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
- Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
- Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
- Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
- Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
- Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
- Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
- Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
- Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
- French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
- Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
- Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).
