Introduction
Bananflue (Drosophila melanogaster) sammensatt øye er en stor modellsystem for å undersøke den funksjonelle organiseringen av fotoreseptorlidelser og Interneuron arrays for nevrale bilde prøvetaking og behandling, og for dyr visjon. Systemet har et komplett koblingsskjema 1,2 og er elskverdig genetiske manipulasjoner og nøyaktig nevral aktivitet overvåking (av høy signal-til-støy-forhold og tid-oppløsning) 3-10.
Den Drosophila øyet er modulbasert, inneholder ~ 750 tilsynelatende vanlige linse-capped strukturer kalt ommatidia, som til sammen gir de fly en panoramisk synsfelt som dekker nesten alle retninger rundt hodet. Øyets primærinformasjon prøvetaking enheter er dens rhabdomeric fotoreseptorene 7,8,11. Hver ommatidium inneholder åtte fotoreseptorcellene (R1-R8), som deler samme fasett objektiv, men er justert til syv forskjellige retninger. Mens de ytre fotoreseptorene R1-R6 are mest følsomme for blå-grønt lys, spektrale følsomheter for de indre cellene R7 og R8, som ligger på toppen av hverandre og peker i samme retning, oppviser tre distinkte undertyper: blek, gul og dorsal kantarealet (DRA) 12- 15.
Figur 1. funksjonelle organiseringen av Drosophila Eye. (A) De to første optiske ganglier, netthinnen og lamina, er uthevet i grått inni fly øyet. Retina R1-R6 fotoreseptorene og lamina Store monopolare celler (LMCs: L1-L3) er lett tilgjengelig in vivo til konvensjonelle skarpe microelectrode opptak. Skjematisk elektrode streker normal bane å spille inn fra R1-R6 i netthinnen. En sti å ta opp fra LMCs i lamina er å skifte parallelt elektroden til venstre. (B) Laminerte er en matrise av retinotopically organanskaffe patroner, som hver er fullpakket med nevroner som behandler informasjon fra et bestemt lite område i den visuelle plass. På grunn av nevrale superposisjon, seks fotoreseptorene fra forskjellige naboland ommatidia sender sine aksoner (R1-R6) til samme lamina patron, forming histaminerge utgang synapser til L1-L3 og en amacrine celle (Am). (C) Spredningen av nevrale informasjon mellom R1-R6 axon terminaler og de visuelle interneuroner (inkludert L4, L5, Lawf, C2, C3 og T1), inne i et lamina patron er kompleks. (D) R1-R6 fotoreseptorlidelser aksoner motta synaptiske tilbakemeldinger fra L2 og L4 monopolare celler. (B) og (C) endret fra Rivera-alba et al to. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Drosophila øye er av den nevrale superposisjon type 16. Dette betyr that nevrale signaler om åtte fotoreseptorer som tilhører sju nabo ommatidia, som ser på samme punkt i rommet, er samlet sammen på en nevral patron i de neste to neuropils: lamina og medulla. Mens de seks ytre fotoreseptorene R1-R6 prosjektet deres axon terminaler til nevrale kolonner i lamina (figur 1), R7 og R8 celler omgå dette laget og gjøre synaptiske kontakter med sine tilsvarende marg kolonne 17-19. Disse eksakte wirings produsere nevrale substrat for retinotopic kartlegging av fly tidlig visjon, hvorpå hver plate (figur 1A-C) og medulla kolonne (patron) representerer et enkelt punkt i rommet.
Direkte inngang fra R1-R6 fotoreseptorene blir mottatt av de store monopolare celler (LMCs: L1, L2 og L3) og Amacrine Cell (Am) i lamina 1,2,20. Ut av disse, L1 og L2 er de største cellene, som formidler store informasjons baner (figur 1D), WHIch svarer til på- og utenfor flytte kanter, og dermed danner beregnings grunnlag av bevegelsesdetektor 21,22. Behavioral eksperimenter tyder på at middels kontrast, de to banene lette bevegelse oppfatning av sin retning: back-to-front i L1 og frem og tilbake i L2 celler 23,24. Tilkobling innebærer videre at L4 neuroner kan spille avgjørende rolle i den laterale kommunikasjonen mellom nabopatroner 25,26. Gjensidige synapser ble funnet mellom L2 og L4 celler lokalisert i samme og to tilstøtende patroner. Nedstrøms, hver L2 cellen og tre tilknyttede L4 celler projisere sine aksoner til et felles mål, det Tm2 nervecellen i medulla, hvor innspill fra nabo patroner antas å bli integrert for behandling av front-to-back bevegelse 27. Selv L1 nevroner motta innspill fra samme kassett L2S via både gap veikryss og synapser, er de ikke direkte koblet til L4S og dermed tilstøtende lamina patroner.
Intracellulære spenning opptak fra enkelte fotoreseptorene og visuelle interneurons i nesten intakt Drosophila gi høy signal-til-støy-rasjo data på sub-millisekund oppløsning 3,5,7-10,29, noe som er nødvendig for å gjøre følelse av de raske nevrale beregninger mellom de tilkoblede nerveceller. Dette nivået av presisjon er umulig med dagens optiske avbildningsteknikker, som er betydelig mer støyende og vanligvis opererer på 10-100 msek oppløsning. Videre, fordi elektrodene har svært liten og skarpe spisser, idet fremgangsmåten ikke er begrenset til cellelegemene, men kan gi direkte opptak fra små aktive neurale strukturer; slik som LMCs 'dendrittiske trær eller fotoreseptorlidelser axoner, som ikke kan nås av mye større tips av patch-clamp elektroder. Viktigere, er metoden også strukturelt mindre invasiv og skadelig enn de fleste patch-clamp programmer og så påvirker mindre de studerte cellenes intracellulære miljø og informasjon prøvetaking. Dermed har konvensjonelle skarpe microelectrode teknikker bidratt, og holder på å bidra, grunnleggende oppdagelser og original innsikt i nevrale informasjon behandling på riktig tidspunkt skalaen; forbedre vår mekanistisk forståelse av visjonen 3-10.
Denne artikkelen forklarer hvordan in vivo intracellulære opptak fra Drosophila R1-R6 fotoreseptorene og LMCs utføres i Juusola laboratoriet. Denne protokollen vil beskrive hvordan du kan lage et passende elektrofysiologi rigg, forberede fly, og utføre innspillinger. Noen representative data er presentert, og noen vanlige problemer og mulige løsninger diskuteres som kan oppstå ved bruk av denne metoden.
Protocol
Følgende protokoll i samsvar med alle retningslinjene i The University of Sheffield og Beijing Normal University dyr omsorg.
1. reagenser og utstyr Forberedelse
- Opptak og lys stimulering Utstyr Setup
- Velg minst 2,5 x 2,5 m innspilling område for å utføre elektrofysiologiske eksperimenter i et rom som har klimaanlegg med regulert fuktighet og betyr å gi mørke opptaksforhold. Sørg for at dette området er stort nok til å passe behagelig a: (i) 1 x 1 m vibrasjonsisolasjon tabell som huser riggen [fly stimulering og apparater for opptak], stereomikroskop og en kald lyskilde med to gås hals, alt inni en store> 180 cm høy Faraday bur; (Ii) et 38U redskapsbeholder for boliger en personlig datamaskin med en flat LCD-skjerm, microelectrode forsterker, LED-drivere, filtre, temperatur styringsenheter, oscilloskop og andre nødvendige elektriske instrumenter; og (iii) etlite bord og en stol for etterforskeren.
- Plasser riggen langt borte fra elektriske og mekaniske støykilder, slik som kjøleskap, sentrifuger og heiser. Bruk separate overspenningsvern for å beskytte riggens elektriske enheter fra spenningsvariasjoner som oppstår i strømnettet. Ideelt koble riggen til sin egen avbruddsfri strømforsyning (UPS batteri) for å redusere støy.
- Konstruer en konisk fly-holderen ut av messing og sort plast (figur 2). Bor et lite nedtrapping hull gjennom messing enhet med sin ytre kant innsnevring til ~ 0,8 mm diameter (matche en typisk flue thorax bredde).
Merk: Dette hullet må smalne mot spissen av fly-holderen slik at en større enn gjennomsnittlig Drosophila, som er anslått fra nedenfor ved luftstrømmen, ville bli sittende fast skulder-dypt på toppen felgen. - Design og bygge en mekanisk robust, men likevel presis, fly stimulering og apparater for opptak (figur 3). Konstruer ut of aluminium eller messing (høy ledningsevne metaller) en flue forberedelse plattform pole og rundt det en Kardang-arm-systemet, med innebygde kulelager, for å gi jevne og presise x, y-posisjonering og låsing av lys stimulans.
Merk: Dette integrert kompositt konstruksjon minimerer mekaniske vibrasjoner, som ellers kunne løsne innspillingen elektrodespissen ut fra studert cellen. Det kan videre omfatte et Peltier-element-basert nær-loop temperaturkontroll system, slik at etterforskerne å bruke temperaturfølsomme genkonstruksjoner som shibire TS, for å vurdere synaptiske krets beregninger 9,30. Anodize apparatet eller male det svart for å minimere lys stimulans scatter.- Fest fly stimulering og apparater for opptak på antivibrasjons tabellens brødfjel; for eksempel ved M6-bolter, ved hjelp av sine metriske skruehullene. Bruk en sort brødfjel eller dekke den med svart stoff for å redusere lysspredning under forsøkene.
- posisjoneringn og lås (ved hjelp av en låseskrue) en vertikalt justerbar flue forberedelse plattform polet på midten av en Kardang-arm-systemet. Plasser fly-forberedelse (innenfor fly-holderen, se trinn 2) på plattformen polet slik at lyskilden er festet til Kardang-arm radialt peker på fly hode. Sørg for at sentrum av flue øyne er nøyaktig på skjæringspunktet (0, 0) av Kardang-armlengdes x- og y-aksen, da dette gjør det mulig nøyaktige x, y-posisjonering av lys stimulans til et punkt innenfor flua visuelle feltet.
Merk: Denne funksjonen er nødvendig for å kartlegge respons egenskapene til individuelle celler til bestemte øyen steder, for eksempel, når du søker etter elektrofysiologisk bevis for strukturelle tilpasninger, for eksempel lyse eller akutte soner, som ville vise økt følsomhet eller oppløsning, henholdsvis 31.
- Monter stereo bak flua stimulering og opptak apparat på antivibrasjonsbord såat det gir behagelig stor forstørrelse visning av flua øyet.
- Monter kaldt lyskilde på toppen av mikroskop med lyskildens dual head semi-rigid gooseneck lysledere peker ned mot fly forberedelse holderen. Fritt bevegelig to bjelke belysning gjør det lettere å visualisere opptakselektrodespissen når man kjører den gjennom en liten åpning i fly øyet.
- Feste en passende x, y, z-mikromanipulator sett (grov og fin) for opptak elektroden og head-fasen på den anti-vibrasjonsbord, på høyre side av fly stimulering og registreringsapparat, ved hjelp av M6-bolter eller magnetisk stands.
Merk: I Juusola laboratorium, ulike rigger utstyrt med forskjellige manipulatorer; for mer informasjon se tabellen for Materialer og reagenser. alle disse gir høykvalitets intracellulære opptak. - Monter en liten manuell 3-akse micromanipulator for referanseelektrodeholderen på vertikalt justerbar fly forberedelse plattform pol. Orientere referanseelektroden, slik at den peker mot flue fremstillingen.
- Konstruer en frittstående lys-skjermet Faraday-bur ut av stålplater rundt hele anti-vibrasjonsbord, som omgir fly stimulering og registreringsapparat, for å hindre utvendig elektromagnetisk interferens. La front av buret åpen, som gir adgang til transport av fly forberedelse for eksperimentene. Fest svart stoff gardiner (med kobber eller aluminium-mesh implantert inni dem for jording) foran å skjerme ut støy og lys. Maling innvendig av buret svart for å redusere lysspredning og bolt frem buret på gulvet for å hindre vibrasjoner.
- Koble spennings- og strøm utgangene fra høy-impedans intracellulær microelectrode forsterker med inngangene til to separate lav-pass filter (Bessel eller lignende) ved hjelp av BNC-kabler. Likeledes koble filter utgangene i de riktige kanalene til AD-kontakten blocks / styrene i datainnsamlingssystemet (DA / AD-kort). Koble DA / AD-kortet (s) i en personlig datamaskin av spesialiserte kabler, i henhold til leverandørens manualer.
- Installer den aktuelle oppkjøps programvare for datainnsamling system av valget på den personlige datamaskinen. Sørg for at datainnsamling driverne er kompatible med operativsystemet på den personlige datamaskinen.
- Ground elektrisk fly stimulering og apparater for opptak, Faraday bur, kobber mesh (innen gardinene), mikroskop, micromanipulators, kaldt lyskilde, 38U redskapsbeholder med alle sine virkemidler (den intracellulære forsterker, filtre, temperatur kontrollenhet, PC og LCD-skjerm etc.) til et sentralt jordingspunkt ved hjelp av utstyr jordledning og M6 crimp ring jordings ender. Bruk en elektrisk multimeter for å teste at alle delene er i samme bakken.
Merk: For å oppnå best mulig støysvak opptaksforhold, jording konfigurasjoner varierer typisk from en set-up til en annen.- Om nødvendig kobler den sentrale jordingspunkt videre til byggegrunn, og / eller microelectrode forsterkeren sentrale bakken. Etter å ha testet den fullt fungerende system under reelle elektrofysiologiske eksperimenter, være forberedt på å endre jord konfigurasjon som nødvendig for å redusere støy i opptakene.
- Konfigurere programvaren forsterkning (1 - 10X), signalfiltrering (typisk lav-pass filter satt til 500 Hz, som er egnet for både R1-R6 og LMC data), og samplingsfrekvens (minst 1 KHz). Påse at innstillingen adlyde Nyquist-Shannon sampling teoremet 32; for eksempel når anskaffe data som er lav-pass-filtrert ved 500 Hz, bruker en samplingsfrekvens på 1 kHz eller høyere for å minimere aliasing effekter.
- Som karakteristiske spenningsreaksjoner av R1-R6 fotoreseptorene er 40 - 65 mV, og de av LMCs 20 - 45 mV, sett forsterkning og skjermen skalerer tilsvarende for å muliggjøre høy oppløsning sampling og data visualisering.
Figur 2. Konisk Fly-Holder fly-holderen er laget av to stykker. Sentral messing enheten og dens konisk svart plast strøk. Den sentrale hull inne i messing enhet smalner til en liten diameter som knapt lar fly gjennom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Oversikt over Elektro Rig. Opplegget inneholder en frittstående lys skjermet Faraday bur, antivibrasjonsbord, fly stimulering og apparater for opptak, og svart stoff gardiner med kobber eller aluminium-mesh på innsiden for jording. instrument rack er elektrisk koblet til samme sentrale bakken med alt utstyret inne i Faraday bur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- fabrikere mikroelektroder
- Trekk referansen microelectrode fra filamented borosilikat (ytre diameter: 1,0 mm, indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglass (ytre diameter: 1,0 mm, indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) slange ved hjelp av en pipette avtrekker instrument. Prøv å oppnå en kort gradvis taper.
Merk: De eksakte innstillinger av pipetten avtrekker programmet varierer fra instrument til instrument; flere detaljer i Table of Materials og regenter. Porestørrelsen på tuppen er ikke avgjørende fordi spissen av referanseelektroden vil bli brutt før den legges inn i fly fremstillingen. - Trekk innspillingen microelectrode fra filamented borosilikat (ytre diameter: 1,0 mm; indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglass (ytre diameter: 1,0 mm, indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) rør ved hjelp av en pipette avtrekker instrument. Prøv å oppnå en lang (10-15 mm) fin gradvis taper.
- Inspiser med et lysmikroskop som opptaks elektrodene viser riktig avsmalning. Monter elektrode på en glassplate med moldable lim og bruke 40X luft mål å inspisere sin spiss.
Merk: En god elektrode smalner jevnt inntil den usynlig lite tips, rundt som kontinuerlig parallelt mørkere og lysere interferensmønstre kan sees. Noen avtrekkere innstillinger generere høy motstand elektroder, som ikke kan gi vellykkede celle gjennomføringer fordi deres tips ligne "trompeter". Således er visuell inspeksjon av elektrodene viktig. - Fest elektrodene horisontalt på en stor Petri-tallerken med modelleire (eller lignende formbar lim) for oppbevaring og transport til elektrofysiologi riggen. Kontroller at elektrode tips enre alltid i luften og ikke ved et uhell berøre noe.
- Back-fylle opptaks og referanseelektroder rett før eksperimentet med riktig saltløsning. Bruke en liten 5 ml sprøyte som er koblet til en liten partikkelfilter med en fin plastspiss (for eksempel en microloader).
- For fotoreseptorene eksperimenter, fyller opptaks elektroden til full (en dråpeformer i sin store enden) med 3 M KCl som denne løsningen minimerer effekten av flytende krysset potensial til den innspilte spenning.
- For å undersøke histaminerge LMCs, som reagerer på synaptiske-inngang fra R1-R6 fotoreseptorene av klorid-konduktans forandringer, fylle opptaks elektrodene med 3 M kaliumacetat og 0,5 mM KCl, da denne løsningen har mindre virkning på cellens kloridet batteri. Fyll referanseelektroden med flue Ringer, inneholdende i mM: 120 NaCl, 5 KCI, 10 TES (C 6 H 15 NO 6 S), 1,5 CaCl2, 4 MgCl2, og 30 sukrose
- Test motstanden av en nylig trakk opptak elektrode i opptakssystem.
- Pass på at sølvtråder inne i elektrodeeierne er jevnt belagt med sølv klorid (vises lilla-grå - ikke skinnende sølv) for å minimere opptak gjenstander (for eksempel drift i krysset potensiale). Hvis ikke, erstatte dem med riktig chloridized ledninger.
- Hvis det er nødvendig, chloridize nye sølvtråder. Rengjør forsiktig ledningene (ved raskt å føre dem gjennom en flamme), slik at disse vises lyse sølv i farge. Unngå å berøre dem med fingrene, for å avsette seg på et jevnt lag av AgCl. Sug ledningene i full styrke klorin i 15 - 30 minutter før de vises lilla-grå farge. Alternativt electro hver ledning (ved å gjøre den positiv i forhold til en løsning inneholdende 3 M KCl, og føring av en strøm gjennom den med en hastighet på 1 mA / cm2 overflateareal) i 10 - 15 sekunder til tilfredsstillende belagt. Koble tilbake fylte opptak og referanseelektroder til sine elektrodeholdere. Plasser en liten Ringer løsning bad i vertikalt justerbar flue forberedelse plattform pol. Kjør elektrodespissene inn i Ringers løsning og måle opptaket elektrode tips motstand.
Merk: Dette trinnet er bare nødvendig når du tester de resistive egenskapene til elektroder, som trekkes fra en ny gruppe med glass rør, eller når optimalisere microelectrode avtrekker instrument programmer gjennom iterasjon. - Før du utfører motstandsmålinger, lese instruksjonene i forsterkeren produksjon brukerhåndbok for de aktuelle måleinnstillingene. For en god innspilling elektrode, har et tips motstand av ~ 100-220 Megohm.
- Trekk referansen microelectrode fra filamented borosilikat (ytre diameter: 1,0 mm, indre diameter 0,6 mm) eller kvartsglass (ytre diameter: 1,0 mm, indre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) slange ved hjelp av en pipette avtrekker instrument. Prøv å oppnå en kort gradvis taper.
2. Drosophila Forberedelse
- Samle 5 - 10 dager gamle fluer (etter eklosjonshormon) og plassere dem på et rent flue rør som inneholder standard mat. Det er mulig å oppnå gode opptak fra yngre flyr også, selv fra "nyfødte"; men på grunn av deres mykere øyne, kutte en hornhinnen åpning for opptak elektrode er mer vanskelig.
- Konstruer en flue fanger rør og en flue forberedelse stå (figur 4). Se figur 4 for den generelle ideen om hvordan disse selvlagde verktøy ble satt sammen.
- For å gjøre en flue fanger tube, avskåret spissen av 50 ml plast sentrifugerør er konisk bunn. Deretter setter og lim den store enden av en ml pipette på denne nye åpningen.
- Til slutt, kuttet den lille enden av pipetten til en størrelse som lett lar en flue å gå gjennom. Ta kontakt med en mekanisk verksted for å sette sammen en liten flue forberedelse scenen som gjør at to-akser rotasjon og låsing av fly-holderen til forskjellige posisjoner.
FigurE 4. Verktøy og Devises som trengs for å Fly forberedelser. Fly fange røret er laget ved å lime en 1 ml plast pipette til en 50 ml plast sentrifugerør. Bespoke flue forberedelse stand åpner for fri rotasjon og låsing av fly-innehaveren i en foretrukket posisjon for å forberede fly. Flua er fast ved bivoks, ved hjelp av elektrisk voksvarmer. Vaselin er brukt av en liten applikator laget ved å koble en tykk sort hår på et håndtak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Samle en flue for forsøket i en 1 ml pipette, som knapt gjør en flue til å passe gjennom. Fest flue fanger røret, med pipettespissen på den, for å fly røret. I fanger en flue, dra nytte av deres iboende tendens til å klatre oppover (antigravitaxis) inn i pipetten spissen. Fortrinnsvis velge den største kvinnelige, som størrelsen noes i elektrofysiologi.
Merk: Jo større fly, jo større sine celler, og jo større er sjansene for høy kvalitet intracellulære opptak. Mindre fluer (både kvinner og menn) kan også gi gode opptak, men forberedelsene er vanskeligere å gjøre. Når flua er fanget i en stor pipette, må du huske å lukke fly røret for å stoppe andre fluer fra å rømme. - Koble til en 100 ml sprøyte med en fleksibel plastslange til større åpning av pipetten tips - med fly fortsatt i den.
- Plasser den smale enden på den store pipettespissen, som er forstørret bare for å la en Drosophila gjennom, til åpningen i bunnen av fly-holderen og presse et lite volum av luft fra sprøyten for å mate ut den flue i fly-holderen .
- Se gjennom stereomikroskopet og forsiktig administrere mer luft inntil et øyeblikk hode stikker ut fra den koniske ende av fly-holderen. Sørg for at flua sitter fanget fra sin thorax til den lille opening på toppen av fly-holderen.
- Bruk en voks varmeren for å feste flua med bivoks fra sin "skuldrene" til fly-holderen. Juster temperaturen voks varmeren for å være så lav som mulig, men rent smeltende voks.
Merk: Når temperaturen er riktig, vises voks gjennomsiktig. For høy temperatur gjør voks "brenne bort"; for lavt holder voks stiv. Ved fastsettelse av fly, være nøyaktig og kort som langvarig varmeeksponering kan skade den. Ved hjelp av lys-kurerte dental lim er ikke anbefalt her som sin søknad er for treg.
Figur 5. Klar Fly for in vivo-forsøk. Venstre, A Drosophila hode er plassert rett i fly-holderen og fast fra sin snabel, høyre øye og skuldre til fly-holderen med oppvarmet beeswax. Høyre, er en liten åpning kuttet i den tykkeste delen av øyet, like over ekvator, og bare noen få ommatidia bort fra baksiden cuticle med en skarp barberhøvel kanten. Et stykke av hornhinnen er forsiktig fjernet og hullet tettes med vaselin for å hindre at øyet tørker opp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Immobilisere flua hode. Påfør bivoks til snabel (figur 5) og hjørnet av høyre øye, unngå hornhinnen, og fikse hodet fra disse punktene til fly-holderen.
- Lag en mikro-kniv. Klem en ikke-rustfritt stål barberblad med to knivholdere / brytere (begge med flat grep) og knekke en liten stripe av sin skarpe kanten. For helse og sikkerhet, bruker briller for øyebeskyttelse (selv om det er svært lite sannsynlig at brikkene ville sprette når høvelen er sprukket). Ideelt sett,produsere en skarp barberhøvel kanten som ligner en spire. Sørg for at denne "spire" er godt festet til bladholderen, men vær forsiktig for å unngå selvskading!
- Ved hjelp av mikro-kniv, forberede en liten åpning størrelse på noen ommatidia i flue venstre øye - på ca 4-5 ommatidia fra ryggskjellaget like over øyet ekvator å gi passasje for opptak microelectrode. Opptre under et stereomikroskop, ser på forberedelse med høy forstørrelse.
Merk: Fordi fly øyet føles elastisk og motstandsdyktig mot sondering, er hullet beste kuttet med et "spir" -knife. Skjære teknikken er ganske utfordrende, så vær nøye med video demonstrasjon. Holde fly-holderen i visse retninger (i fly forberedelse stativ) kan gjøre disseksjon enklere. I utgangspunktet kan det mikro føler vanskelig å lære, men en gang begått, nevrale tilpasninger forbedrer gradvis etterforskeren 3D-oppfatning og fingerferdighet. - REDra nøye liten del av hornhinnen fra åpningen som bare ble kuttet, utsette netthinnen under. Raskt dekke hullet i øyet med en liten blob av petroleum gelé med fine hår av vaselin applikator.
Merk: Vaselin serverer flere roller her. Det forhindrer vev dehydrering og koagulering av hemolymfe som ville bryte opptaket elektrode er satt inn. Det også forresten strøk microelectrode, redusere sin egenutført kapasitans. Dette kan forbedre frekvensresponsen av registreringssystemet, og slik at tidsoppløsningen av de registrerte nevrale signaler. Unngå å smøre vaselin over resten av øyet som dette tåkelegger optikken.
3. Opptak fra R1-R6 Fotoreseptorer eller LMCs
- Alltid være jordet ved bruk av microelectrode forsterker (for eksempel ved å berøre metalloverflaten på Faraday bur eller antivibrasjonsbord), da dette utelukker en utilsiktet levereing en statisk ladning til head-scenen, som kan skade kretsene.
- Belyse fly forberedelse plattform pole ovenfra av to svanehals lysledere (Figur 6A) (med kaldt lyskilde inne i Faraday bur) slik at fly-holderen kan plasseres på polet i ønsket posisjon under tett visuell kontroll .
Figur 6. Plassering av Fly-holderen og Elektroder for eksperimentene (AB) Flua holderen er plassert på opptaket plattform som også gir temperaturkontroll via et Peltier element (A: hvit, rund plattform i midten).. Den Cardan-arm muliggjør nøyaktig posisjonering av lys stimulus på en lik avstand (via x, y-rotasjon) rundt fly, med lyskilden (en væske eller kvartsfiberoptisk bunt ende) peker direkte til dens øye. I mange av our rigger, er lys stimulering generert av lysdioder (med lineære current-drivere) eller ved en monokromator. Dermed sine stimuli bære en bestemt (band-bestått) spektrale innhold, valgt mellom 300-740 nm og dekker 4-6 log intensitet enhet område (som dempes med separate filtre nøytral tetthet). (C) To mikroelektroder, styrt av separate micromanipulators, er plassert i fly hode referanseelektroden (ovenfor) gjennom Ocelli; opptaket elektrode (venstre) gjennom den lille åpningen i det venstre øyet. (D) For å oppnå et maksimalt antall på fotoreseptoren opptak, er innspillingsmikroelektroden drives inn i hullet, parallelt med snabel-ocellus akse. Når elektrodespissen penetrerer og sel til en fotoreseptoren, er fritt dreibar lyskilden festet til den stilling hvor cellen produserer den maksimale spenningen som reaksjon på et gitt lys stimulus. Dette punkt i rommet ligger i sentrum av cellen er mottakelig felt. Hvis hullet is nær den skjellaget, LMC gjennomføringer kan videre oppnås med den samme elektrode vinkel (til venstre). Hvis hullet er lengre fra cuticle, til en annen nyttig elektrode angrepsvinkel få LMC opptak er også vist (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Monter fly-holderen (med fly i det!) På sparket forberedelse plattformen pol. Roter fly-holderen slik at flua venstre øye er direkte vendt etterforskeren (Figur 6B).
- Sett den butte referanseelektrode forsiktig gjennom flua Occelli inn i hodet kapselen med en liten grov micromanipulator mens observere forberedelse gjennom stereomikroskopet (figur 6C). Ikke skyv elektrode for dypt, da dette kan skade fly hjernen.
- Alternativt setter referanseelektrode inn på baksiden av thorax. Alltid sørge for at flua ser heathy (flytter sitt antenner) og dets øyne er intakt; ikke skadet ved et uhell. Dersom preparatet ser mindre enn ulastelig, utarbeide en ny flue for forsøkene.
- Kjør den skarpe opptak microelectrode inn i venstre øye gjennom vaselin dekket liten åpning forberedt tidligere. Bruke høy forstørrelse i stereomikroskopet og flytte lysledere og fokalplanet, slik at elektrodespissen stedet blir tydelig i 3D ved dets refleksjonsmønstre.
Merk: Figur 6D viser hvordan flue hode bør være plassert litt forskjellig (i forhold til vinkelen opptaket microelectrode kommer inn i øyet) for fotoreseptoren og LMC opptak. Kjøring av elektroden inn i øyet uten å bryte det er mest vanskelig fase av eksperimentet. Hvis elektrodespissen savner den lille åpningen i øyet, treffer hornhinnen, det vanligvis bryter. - Slå på microelectrode forsterkernår begge elektrodene er godt inne i forberedelsene, i elektrisk kontakt med fluekroppsvæsker.
- Slå av kaldtlyskilden (inne i Faraday bur) og koble den fra strømnettet. Koble støpselet til den sentrale bakken for å minimere banesløyfe indusert elektrisk støy, og flytte de svanehals lysledere bort slik at Kardang-arm-systemet kan fritt flyttes rundt i fly. Slå av lyset i rommet for å sikre at flua preparatet er nå i relativ mørke.
- Måle motstanden i opptaket elektrode i øyet (som beskrevet i forsterkerens bruksanvisningen). Bruk kun opptak elektroder der motstanden er 100-250 Megohm.
Merk: Det er nesten umulig å oppnå høy kvalitet intracellulære opptak av <70 Megohm elektrode. Hvis motstanden er <80 Megohm, er det sannsynlig at elektrodespissen er brutt. I dette tilfellet, slå av forsterkeren og endre opptaks elektroden.- Når elektrodenerstattes og i øyet, slå på forsterkeren for å måle dens motstand. Noen ganger kan elektrodespissen blir blokkert av noen avfallsproduktene når den går inn i vevet. Dette kan løses ved hjelp av forsterkerens kapasitive buzz og nåværende pulsfunksjoner som vanligvis klart det ved rask resonation eller frastøting.
- Sett forsterkeren til strøm klemme (CC) eller bro opptaksmodus. Avbryt ut noen vilkårlig spenningsforskjell mellom opptaks- og referanseelektroder, som begge er nå hviler i elektrisk sammenkoblet ekstracellulære rom, ved å sette offset (opptak spenning) til null. Følg signal utlignet endringene med forsterkerens displayutlesningen eller et oscilloskop skjermen.
- Vent 2-3 min for fly øye til mørk-tilpasse seg.
- Kjør innspillingen elektrodespissen gradvis dypere inn i øyet med små 0,1 til 1 micron trinn. Gjør dette med en x-aksen piezo-stepper av en fjernstyrt mikromanipulator eller by forsiktig rotere fin oppløsning knute av en manuell manipulator.
- Stimulere fly øyet med kort (1 - 10 millisekunder) lys blinker som opptaks elektroden føres fremover i vevet.
Merk: Hvis innspillingen elektroden er plassert i netthinnen og øyet fungerer normalt, vil hver lys flash føre til en kort og liten dråpe i spenning (0,2 til 5 mV hyperpolarization), kalt elektroretinogrammet (ERG). Denne endringen i feltet potensialet i det ekstracellulære rom er forårsaket av netthinneceller kollektive respons på lys. Men når elektrodespissen kommer inn i lamina, lukking på LMCs, ERG reverserer, viser depolariserende svar. - Flytt lyskilden rundt fly øyet ved hjelp av Kardang-arm-systemet og finne posisjonen der lyset fremkaller den største ERG respons.
Merk: Denne posisjonen markerer lite område i den visuelle plass hvor fotoreseptorene (eller LMCs), som er plassert ved siden av spissen av opptaket elektrodeSmake deres lys innspill. - Trenge en celle med innspillingen elektroden.
Merk: penetrasjon kan oppstå spontant, eller når elektroden er mikro gikk frem. Det kan videre lettes ved å banke mikromanipluatoren system eller ved hjelp av buzz-funksjonen til forsterkeren; disse handlingene resonere elektrodespissen i vevet. Når elektroden impales fotoreseptoren membranen, inn i sin intracellulære plass, spenningsforskjellen mellom opptak og referanseelektroden synker brått fra 0 mV til -65 mV ~ (mellom -55 og -75 mV); mens under LMC gjennomføringer, er denne reduksjonen vanligvis mindre (mellom -30 og -50 mV). Disse spenningsforskjeller representerer de negative hvile potensialene av de gitte celler. Avhengig av kvaliteten på innspillings elektrode (sin skarphet) og den cellulære prosess det trenges, kan spenningsavlesningen fra opptaks elektroden stabilisere seg raskt eller trinnvis til hvilepotensialet, som cellemembranensel til det ytre lag av elektroden. Men hvis penetrasjon er bare delvis eller dårlig, elektroden vanligvis glir ut av cellen med den innspilte potensial klatring tilbake mot null. - Lokalisere senteret av den penetrerte cellens mottakelig felt når elektroden virker riktig forseglet, som viser stabil membranpotensialet (mørk hvilepotensial). Beveg blinkende lys stimulans rundt flua øyet, ved hjelp av Cardan-arm-systemet, for å finne det punktet i visuell plass, der lyset blitsen fremkaller cellens maksimal spenning respons. Lås Kardang-arm når lyset stimulus direkte ansikter (peker på) mottakelig feltsenter.
Merk: I mørket, Drosophila fotoreseptorene svare på lyse lyspulser med 40 - 65 mV depolariserende spenningsreaksjoner 4,5, mens stabile LMC opptak viser 20 til 45 mV hyperpolariserer svar 9,10,14. Gliaceller gjennomføringer kan skje sjelden, indikert ved <-80 mV hvile potensialer og mye tregereog mindre (~ 5 mV) mettet lys-indusert depolarisering. Fotoreseptorene i Drosophila med forskjellige øyen pigmentations som hvitt-eye 7 og sinober, viser sammenlignbare respons størrelser til villtype. - Bruke modus forsterkerens strøm klemme (CC), kompensere innspillingen elektrodens kapasitans ved å injisere små 0,1 nA og kort (100-200 msek) strømpulser inn i studert cellen for å minimere opptak gjenstander under sin membran lading.
Merk: Denne viktige fremgangsmåten forklares i detalj i forsterkerens bruksanvisningen, og bør praktiseres med en elektrisk celle modellen før de egentlige eksperimenter. - Record spenningsreaksjoner til lyspulser og andre stimuli av interesse, som har varierende statistiske eller fysiske kvaliteter (for eksempel naturalis lysintensitet tidsserier eller tilfeldige kontrastmønster). Test, for eksempel, hvordan de registrerte svarene endres med lys- eller mørk-tilpasning.
Merk: Man kan nøyaktig likjempe-tilpasse studert cellen ved kontinuerlig lys av forhåndsvalgt intensitet ved å legge til tetthet filter nøytrale på lysbanen 4,5. Alternativt, for langvarig mørk tilpasning slå av lyset stimulans for en forhåndsbestemt tid. På grunn av den mekaniske stabiliteten i opptakssystem, den høye kvaliteten på opptak elektroder og intactness av preparatet, stabile opptaksforhold kan noen ganger vare i mange timer. Således, på en god dag, er det mulig å samle en stor mengde data ved forskjellige tilpasse betingelser fra en enkelt celle. Når elektroden glir ut av cellen, de registrerte responsene avta og middelspenningen begynner å nærme seg null. - Advance nøye opptaket elektroden med den fine x-aksen kontroll av mikromanipluatoren inntil elektroden får kontakt og trenger inn i den neste cellen (dette er vanligvis den nærmeste nabo neural). Ikke flytt elektroden langs y- eller z-aksen som disse manøvrene ville gjøre elektroden til "plough vevet "sidelengs, skade øyet strukturer!
Bemerk: Med en god elektrode og et sunt preparat, kan man ta opp høykvalitets responser fra mange fotoreseptorer (men sjelden fra mange LMCs) i samme fly over en periode på flere timer; av og til, over hele arbeidsdagen (> 8 timer) uten klart signal forringelse. - Lagre datafiler med jevne mellomrom med identifiserende informasjon, for eksempel dato, genotype, og den innspilte celletype. På grunn av den store mengden av data som kan samles i et vellykket opptak, beholde gode skriftlige kilder i en lab-bok for fremtidige dataanalyse.
Representative Results
Den skarpe microelectrode opptaksmetoden, som er tilpasset her for Drosophila øyet, kan brukes til å kvantifisere pålitelig nevrale informasjon sampling og behandling i retina og lamina celler, og kommunikasjon mellom dem 4,5,7,8,10,33. Ved å bruke den til å studere koding i ulike vill type aksjer, mutanter eller genmodifisert flue stammer, har metoden vist sin verdi; ikke bare i å kvantifisere effekten av en mutasjon, temperatur, kosthold eller valgt uttrykk 3,4,6,9,10,14,30,34, men også i å avsløre mekanistiske årsaker til endrede visuelle atferd 14,34. Metoden er også lett anvendelig til andre insektmidler 35,36, myndiggjøring neuroethological visjon studier. Neste vi presentere noen eksempler på sine vellykkede applikasjoner.
Figur 7. SpenningResponser av en bananflue R1-R6 fotoreseptoren til en lyspuls ved 20 og 25 ° C. På grunn av at skarpe microelectrode gjennomføringer er ofte svært stabile, er det mulig å registrere spenningsreaksjoner av den samme R1-R6 fotoreseptoren til en gitt lys stimulus ved forskjellige omgivelsestemperaturer ved oppvarming eller kjøling av fly. I vår set-ups, er fly-holderen plasseres på en nær-loop Peltier-element baserte temperaturkontroll system. Dette gjør oss i stand til å endre flua hode temperatur i løpet av sekunder. Høyere temperatur akselererer spenningsreaksjoner og karakteristisk senker hvilepotensialet av R1-R6 fotoreseptorer (som indikert av røde piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Studere effekten av temperatur på fotoreseptoren Utgang
o C (figur 7). Som kvantifisert før 4,9, senker oppvarming en fotoreseptoren hvilepotensialet i mørket, og akselererer sine spenningsreaksjoner.
Figur 8. Signadørs en bananflue R1-R6 fotoreseptorlidelser Forbedrer med lysintensitet (A) fotoreseptoren utgang til dim (under) og lyse. (Ovenfor; 10.000 ganger sterkere lys) gjentatt naturalis lysintensiteten tidsserier registrert av samme microelectrodei den samme cellen ved 20 ° C. Svar på den lyse stimulans er større, fordi de integrere flere prøver, elementær svar (humper) til enkelt fotoner 4,5,7,8. (B) 20 sammenhengende ett sekund lange spenningsreaksjoner lagres. Individuelle svar (lys grå) ble tatt etter den adaptive trender (pil i A) hadde trukket seg tilbake (stiplet boks i A). De tilsvarende responsanordning (signalene) er de mørkere trasene. Forskjellen mellom signalet og de individuelle responsene er støy. (C) Cellene 'signaliserer resultatene ble kvantifisert ved opptakene' Signal-til-støy-forhold (SNR) ved hjelp av standardmetoder 4,5,7,8. Fotoreseptoren produksjon har ca 64 Hz bredere spekter av pålitelig signal på den lyse stimulering (SNR 'Bright ≥1, opp til 84 Hz) enn ved dim (SNR' Dim ≥1, opp til 20 Hz), med signal-til-støy-forhold bedre sterkt; fra SNR Dim MAX = 87 til SNR Bright MAX = 1868. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Studerer Tilpasning og Neural Koding av Repetitive Stimulering
Den noninvasiveness av metoden, forårsaker relativt lite skade på netthinnen og lamina strukturer, gjør det ideelt for å studere signal utførelsen av individuelle celler til ulike lys stimuli i sine nære naturlige fysiologiske tilstand in vivo. Figur 8 viser spenningsreaksjoner av en R1- R6 fotoreseptoren til en dim og lyse gjentatt naturalis lysintensitet tidsserier stimulus ved 20 o C, mens figur 9 o C. Pre- og postsynaptiske opptakene ble utført separat fra to forskjellige fluer fordi samtidige intracellulære opptak av to skarpe mikroelektroder i samme fly, ett i netthinnen og den andre i lamina, er for vanskelig å være levedyktig 30.
Figur 9. Spenning Responses av en bananflue R1-R6 fotoreseptoren og LMC til Gjentatte Naturalis Stimulering ved 25 o C (A) R1-R6 (grå) og LMC (svart) utganger registrert av forskjellige mikroelektroder fra forskjellige fluer. (B) Fullt lys tilpassede 20 sammenhengende pre- (over) og postsynaptiske (under) svar til samme naturalistisk stimulans mønster med individuelle svar, vist i lys grå end de tilsvarende responsanordning (signalene) som mørkere trasene. Forskjellen mellom signalet og de individuelle responsene er støy. (C) Cellene 'signaliserer resultatene ble kvantifisert ved opptakene' Signal-til-støy-forhold (SNR). LMC produksjon har ca 10 Hz bredere spekter av pålitelig signal (SNR 'LMC ≥1, opp til 104 Hz) enn R1-R6 utgang (SNR' R ≥1, opp til 94 Hz). Begge signal-til-støy-forhold er høy (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), og som opptaks støyen var lav, deres forskjeller reflektere reelle koding forskjeller mellom cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter stimulus utbruddet, opptakene typiskly viser raskt tilpasse trender som i stor grad avta i løpet av 5-6 sekunder. Fra da av, cellene produsere svært konsekvente reaksjoner på hver 1 sek lang stimulus presentasjon (hver stiplet boks omslutter 20 av disse). Den repeterbarhet av svarene blir tydelig når disse er overlagret (figur 8B og figur 9B). Individuelle reaksjoner er de tynne grå spor, og deres bety tykkere mørkere spor. Den midlere respons tas som det nevrale signal, mens det nevrale støy er differansen mellom middelverdi og den enkelte reaksjon 4,5,9,37,38. De respektive signal-til-støy-forhold i frekvensdomenet (figur 8C og figur 9C) ble oppnådd ved å Fourier-transformere signalet og støy data biter inn i effektspektra, og å dividere den midlere signalenergispekteret med det tilsvarende midlere støyeffektspektrum 4, 5,9,37,38. Karakteristisk maksimalt signal-til-støy-forhold of de registrerte nevrale utganger til naturalistisk stimulering er høy (100 - 1000), og i de mest stabile preparater med svært lavt opptak støy kan komme opp i verdier >> 1000 (for eksempel figur 8C.). Legg også merke til at oppvarmingen utvider cellenes båndbredden pålitelig signale 4 (SNR 'Bright ≥ 1); for eksempel, den relative forskjell mellom de to gruppene R1-R6s i figurene 8 og 9, henholdsvis, er 10 Hz (84 ved 20 ° C og 94 Hz ved 25 ° C).
Man kan ytterligere estimere hver celle er frekvensen av informasjonsoverføringen fra sitt signal-til-støy-forholdet ved hjelp av Shannon ligning 32, eller ved å beregne forskjellen mellom responsene 'entropi og støy entropi priser gjennom trippelekstrapoleringsmetoden 39. Flere detaljer om informasjons teoretiske analyser, og deres bruk og begrensningers spesifikt med denne fremgangsmåten er gitt i de tidligere publikasjoner 7,8,39.
Figur 10. Spennings Responses av en Killer Fly R1-R6 fotoreseptoren og LMC til Gjentatte Naturalis Stimulering ved 19 o C (A) R1-R6 (grå) og LMC (svart) utganger registrert av samme microelectrode fra samme fly; første postsynaptisk og senere presynaptisk, da elektroden ble ført i øyet. (B) 20 år på rad pre- (over) og postsynaptiske (under) svar (lys grå spor) til samme naturalis stimulus mønster ble tatt til fange etter innledende tilpasning (stiplet boks i A). Deres hjelp er signalene (mørkere spor på toppen), mens deres respektive forskjeller på de enkelte svarene gi støy. (C) Det tilsvarende Signal-til-støy-forhold (SNR) ble beregnet som i figurene 8C og 9C. LMC produksjon har ca 100 Hz bredere spekter av pålitelig signal (SNR 'LMC MAX ≥1, opp til 234 Hz) enn R1-R6 utgang (SNR' R MAX ≥1, opp til 134 Hz). Både signal-til-støy-forhold er høy (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), og da den samme mikroelektroden ble anvendt i opptakene, deres forskjeller reflektere virkelige forskjeller i de pre- og postsynaptisk nevrale utganger. Disse resultatene antyder at opptakssystemet hadde lavt støynivå, og dens innflytelse på analysene var marginal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Neuroethological Vision Studier Fremgangsmåten kan også brukes til å registrere pre- og postsynaptisk spenningsreaksjoner fra forbindelsen øynene til forskjellige insektarter 7,8,35,36 (figur 10), hvilket tillater sammen neuroethological studier av visuell informasjon behandling. For presentopptakssystem, er det bare nødvendig tilpasning nye forberedelse-holdere, hver med en passende størrelse åpning for de studerte artene. Disse eksemplariske opptakene er fra en kvinnelig morder fly (Coenosia attenuata). De viser intracellulære spenningsreaksjoner av et R1-R6 fotoreseptoren og LMC til identisk repeterende lys stimulering, som brukes for Drosophila motstykker i figur 9, men ved 19 o C I dette tilfelle ble både pre- og postsynaptisk data registrert fra det samme fly; den ene etter den andre, med de samme opptaks elektrode (fylt med 3 M KCl) første fremme gjennom den laterale lamina før angiing frontal hinnen. I forhold til de Drosophila data ved 25 o C, den Coenosia data - selv på kjøligere temperatur - viser responser med raskere dynamikk; utvide omfanget av pålitelig signale (signal-til-støy-forhold >> 1) over et bredere frekvensområde. Slike funksjonelle tilpasninger i nevrale koding av naturalistiske stimuli er konsistente med Coenosia 's rov livsstil 36, som krever høy presisjon spatiotemporal informasjon for å oppnå raske antenne jakt atferd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22 | Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand |
| Stereomicroscope in the intracellular set-up | · Olympus | Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22 | 30X eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye |
| Nikon microscope | Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7 | ||
| Anti-vibration Table | Melles Griot | With metric M6 holes on the breadboard | Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below |
| Newport | |||
| Micromanipulators | Narishige | Narishige NMN-21 | In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs. |
| Huxley Bertram | Huxley xyz-axis with fine manual control | ||
| Sensapex | Sensapex triple axis | ||
| Märzhäuser | Märzhäuser DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller | ||
| Magnetic Stands | Any magnetic base with on/off switch will do | For example, to manage cables inside the Faraday cage | |
| Electrode Holders | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3 - 0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders |
| Fiber Optic Light Source | Many different, including Olympus | ||
| Fiber Optic Bundles | UltraFine Technology | To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR) | |
| Thorn Labs | |||
| Fly Cathing Tube | P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs | Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it. | |
| Digital Acquisition System | National Instruments | ||
| Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier | npi SEC-10LX | http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html | Outstanding performer! |
| Head-stage | Standard (+/- 150 nA) | For npi SEC-10LX | |
| LED light sources and drivers | 2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK) | Many of our stimulus systems are in-house built | |
| Self-designed and constructed | |||
| Acquisition and Analyses Software | Many companies to choose from | Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory | |
| Personal Computer or Mac | Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software | ||
| Cardan arm system | Self-designed and constructed | Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli | |
| Peltier temperature control system | Self-designed and constructed | ||
| Faraday Cage | Self-constructed | Electromagnetic noise shielding | |
| Filamented Borosilicate Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Filamented Quartz Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller | For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs’ preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise. |
| Extracellular Ringer Solution for the reference electrode | Chemicals from Fisher Scientific | 10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose | See the recipe in the protocol section |
| 3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode | Salts from Fisher Scientific | 10010310, KCl | |
| Petroleum jelly | Vaselin | ||
| Non-stainless steel razor blades | |||
| Blade holder/breaker | Fine Science Tools By Dumont | 10053-09 | 9 cm |
| Blu-tack | Bostik | Alternatively, use molding clay | |
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
References
- Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
- Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
- Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
- Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
- Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
- Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
- Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
- Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
- Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
- Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
- Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
- Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
- Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
- Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
- Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
- Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
- Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
- Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
- Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
- Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
- Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
- Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
- Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
- Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
- Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
- Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
- Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
- Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
- Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
- Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
- Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
- Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173 (2008).
- Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
- Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
- Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
- Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
- Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
- Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
- Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
- Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
- Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
- Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
- Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
- Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
- Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
- Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
- Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
- Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
- French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
- Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
- Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).
