Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod

Published: April 16, 2016 doi: 10.3791/54143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1,3, 1,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

Introduction

Flere platforme til sygdomsdiagnose er blevet udviklet baseret på nanoskala materialer 1,2 såsom nanotråde, 3 nanopartikler, 4 nanorør, 5 og nanofibre (NFS) 6-8. Disse nanomaterialer tilbyder fremragende udsigter i udformningen af ​​nye teknologier til meget følsomme bioassays grund af deres unikke fysisk-kemiske egenskaber. For eksempel har mesoporøse zinkoxid nanofibre blevet anvendt til femto-molære sensitiv påvisning af brystkræft biomarkører. 9 nylig nanomaterialer på basis af titandioxid (TiO2) er blevet udforsket for bioanalytiske applikationer 10 tilgodese deres kemiske stabilitet, 11 ubetydelig proteindenaturering , 12 og biokompatibilitet. 13 Endvidere hydroxylgrupperne på overfladen af TiO2 lette kemisk modifikation og den kovalente binding af biomolekyler. 14,15 Mønstrede TiO2 thin film 16 eller TiO2 nanorør 17 er blevet anvendt til at forbedre påvisningen følsomhed et målprotein ved at øge overfladearealet; imidlertid fremstillingsprocessen er temmelig kompleks og kræver dyrt udstyr. På den anden side er elektrospundne forbund modtager opmærksomhed på grund af deres høje overfladeareal samt ligetil og billig fremstillingsproces, 18,19 endnu, den skrøbelige eller løse karakteristisk for elektrospundne TiO2 NF måtten gør det vanskeligt at håndtere og integrere med mikrovæskeanordninger. 6,20 Derfor blev TiO 2 NF måtter sjældent anvendes i bioanalytiske anvendelser, især dem, der kræver barske vaskebetingelser.

I denne undersøgelse for at overvinde disse begrænsninger har vi udviklet en ny teknologi til at overføre elektrospindes NF-måtter på overfladen af ​​enhver mål-substratet ved anvendelse af en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) klæbelag. Furthermore, har vi med succes viste integrationen af elektrospundne TiO2 NF-måtter på en centrifugal mikrofluidanordning af polycarbonat (PC). Ved anvendelse af denne anordning, var en høj-følsom, fuldautomatisk, og integreret påvisning af C-reaktivt protein (CRP) samt kardial troponin I (cTnI) opnås inden for 30 min fra kun 10 pi helblod. 21 På grund af den kombinerede fordele ved egenskaberne af NFS og den centrifugale platform, assayet udviste et bredt dynamikområde på seks størrelsesordener fra 1 pg / ml (~ 8 FM) til 100 ng / ml (~ 0,8 pm) med en nedre detektionsgrænse på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og et dynamisk område fra 10 pg / ml (~ 0,4 pm) til 100 ng / ml (~ 4 nm) med en detektionsgrænse på 37 pg / ml (~ 1,5 pm) for cTnI. Disse detektionsgrænser er ~ 300 og ~ 20 gange lavere sammenlignet med deres tilsvarende konventionelle ELISA-resultater. Denne teknik kunne anvendes til påvisning af eventuelle målproteiner med passende antistoffer. Samlet set denne enhed could i høj grad bidrage til in vitro-diagnostik og biokemiske analyser, da det kan detektere sjældne mængder af målproteiner med stor følsomhed selv fra meget små mængder af biologiske prøver, fx 10 pi fuldblod. Selvom vi kun demonstreret serumproteinet påvisning ved ELISA i denne undersøgelse, kan overførslen og integration teknologi af elektrospundet NF'er med mikrofluidenheder være mere udstrakt anvendelse i andre biokemiske reaktioner, som kræver et stort overfladeareal til høj detekteringsfølsomhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Blod blev udtaget fra sunde individer og blev opsamlet i en blodopsamlingsrør. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle frivillige.

1. Fremstilling af TiO 2 NF Mat

  1. Fremstilling af precursor-opløsning 22
    1. Opløs 1,5 g titantetraisopropoxid (TTIP) i en blanding af ethanol (99,9%, 3 ml) og iseddikesyre (3 ml) og bland opløsningen ved stuetemperatur (25 ° C) i 30 minutter på en magnetomrører.
    2. Opløs 11 vægt-% af polyvinylpyrrolidon (PVP) i 3,64 g ethanol (99,9%) og omrør opløsningen ved 65 ° C i 1 time under anvendelse af en varmeplade magnetomrører.
    3. Kombiner og rør de to opløsninger ved 65 ° C i 4 timer på en varmeplade magnetomrører.
  2. elektrospinning
    1. Indlæse fremstillet opløsning ind i en sprøjte forbundet til en kanyle af rustfrit stål på 200 um indre Diameter. Hæld opløsningen direkte ind i sprøjten efter fjernelse af stemplet.
    2. Indføre opløsningen konstant ved en strømningshastighed på 0,3 ml / time i 10 minutter på en Si-wafer (2 cm x 2 cm) anbragt på en jordet substrat ved en høj jævnspænding (15 kV). Under elektrospinding, indstille afstanden mellem nålen og den jordede substrat til 10 cm.
  3. Brænding af NF måtten
    1. Placer NF måtten i en ovn og hæve temperaturen op til 500 ° C med en ramping hastighed på 3 ° C / min under højvakuum tilstand (5 x 10 -5 torr).
    2. Hold temperaturen ved 500 ° C i 3 timer. Køle ned temperaturen af ​​prøverne til RT (25 ° C) i ovnen.

2. Integration af TiO2 NF Mat til et Centrifugal Mikrofluid Disc

  1. Fremstilling af en disk
    1. Brug 3D designe software (f.eks, SolidWorks eller lignende) for at skildre kamre, kanaler, eller ventiler af hvert lag af disken. Konverter design filer til computer numerisk styring (CNC) kode ved hjælp af kode genererer software (f.eks Edgecam eller lignende). Brug software i henhold til brugsanvisningen 23,24. Bemærk: De typiske kanal dimensioner, der anvendes i denne enhed er 1,0 mm x 0,3 mm (bredde x dybde).
    2. Åbn operativsystemet software CNC fræsning maskine (f.eks., DeskCNC eller lignende) og indlæse CNC kode til operativsystemet software og klik på følgende i rækkefølge: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Vælg den genererede CNC-koden.
    3. Fastgør PC pladen på CNC-fræser: Brug 1 mm PC plader til det øverste lag og 5 mm PC-plader for disken lag. Kør CNC fræsning maskine til at skære hvert lag af disken ved at klikke på knappen "START".
  2. Overførsel af TiO2 NF mat på disken
    1. Placer et siliciumsubstrat og et lille petriskål indeholdende 40 pi (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorsilan i et vakuumkammer under vakuum i 30 minutter. Den fluorsilan fordamper og bliver overtrukket på substratet.
    2. Bland polydimethylsiloxan (PDMS) præpolymer med et hærdningsmiddel i en 10: 1 ratio og afgasses i et vakuumkammer. Spin-coate PDMS onto et siliciumsubstrat ved 650 rpm i 60 sek.
    3. Hærde PDMS belagt på silicium substrat i en ovn ved 65 ° C i 10 min for at opnå en vedhængende tilstand.
      BEMÆRK: Hærdning tid kan varieres afhængig af miljømæssige forhold, og vedhæftning kraft kan testes ved en tack test med et rheometer.
    4. Overfør TiO2 NF mat udarbejdet af elektrospinding og kalcinering på PDMS-belagt silicium ved hjælp af en pincet. Derefter manuelt anvende en konform pres på overførte TiO2 NF måtten med en flad genstand (f.eks., Objektglas) og fjern objektet. Sættedenne prøve i ovnen ved 65 ° C i 4 timer eller ved 80 ° C i 1 time for at hærde PDMS lag fuldstændigt.
    5. Coat bindende reaktionskamre i disken med 20 pi PDMS / hærdemiddel-blanding (10: 1), der virker som et klæbelag til at fastgøre TiO2 NF måtten på disken.
    6. Dispensere 50 pi ethanol (99,9%) på TiO2 NF måtte på PDMS lag, sender en NF måtten med en dorn hul af 6 mm diameter, og overføre snittet TiO2 NF måtten til de bindende reaktionskamre overtrukket med 20 pi af PDMS i det foregående trin.
      BEMÆRK: I dette trin, vil ethanol være nyttigt at frigøre snittet TiO2 NF mat fra Si substrat.
    7. Inkubér TiO2 NF mat integreret disk i ovnen ved 65 ° C i 4 timer eller ved 80 ° C i 1 time for at hærde PDMS fuldstændigt.
  3. Overfladebehandling af TiO2 NF mat på disken
    1. PRepare 1% volumen / volumen opløsning af (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxy silan (GPDES) i ethanol (99,9%).
    2. Behandl TiO2 NF mat integreret disk med ilt plasma ved 140 W, 50 SCCM ilt flow for 180 sek. Dispenseres 100 pi GPDES opløsning på hver nanofiber måtten og inkuberes ved stuetemperatur (25 ° C) i 2 timer.
    3. Vask substrater kortvarigt ved dispensering ethanol (99,9%) med en vaskeflaske, derefter fjernes ethanolen fuldstændigt ved at vende disken og duppe den mod en ren klud. Hærde ved 80 ° C i 1 time. Vask to gange med ethanol (99,9%) på samme måde som nævnt ovenfor, til fjernelse af de fysisk adsorberede og ubundne GPDES molekyler.
    4. Blæs tørt med en nitrogenstrøm, tør under vakuum.
      BEMÆRK: Disken kan opbevares i en forseglet beholder ved stuetemperatur (25 ° C) indtil anvendelse.
  4. Immobilisering af antistoffer på overfladen
    1. Lav en opløsning af 200 pg / ml af capture-antistoffer (monoklonalt muse-antihuman hsCRP eller monoklonalt muse-anti-cTnI) ved fortynding antistofferne med en phosphatbufret saltvand (PBS) (pH 7,4). Dispenser 5 ul af opløsningen på hver NF mat i en disk ved hjælp af en mikropipette. Se materialer liste for mere information om antistofferne.
    2. Opbevar diskene i et fugtigt kammer og inkuber ved 37 ° C i 4 timer. Vask antistofferne coatede NF måtte med 0,1% BSA-PBS-buffer. Fylde kammeret med 100 pi vaskebuffer Med en mikropipette fjernes bufferen ved sugning eller dekantering. Endelig vendes disken og duppes den mod en ren tørre, og derefter samle disken.
  5. pladekonstruktion
    1. Tegn udformningen af disken på dobbelt-side tape under anvendelse af et CAD-program (f.eks AutoCAD eller lignende). Læg CAD design til skæring plotter.
    2. Skær dobbelt-side tape ved hjælp af skærende plotter. Træk den ene beskyttelseslag af dobbeltklæbende tape og fastgør jegt oven på disken lag. Skrælle anden beskyttelse lag og fastgøre det øverste lag på disken lag.
    3. Læg den foreløbigt samlet disk i trykke maskinen og præcist tilpasse top / klæbende / disc lag anvender Juster mærker i hvert lag for at forbinde hver ventil, kanal, og kamre. Påfør konform tryk ved anvendelse af pressemaskine.

3. Immunoassay

  1. Fyld kamre med 1% BSA-PBS-buffer under anvendelse af en mikropipette og inkuber disken ved 37 ° C i 1 time. Fjern bufferen ved aspiration ved anvendelse af en mikropipette. Udfør dette trin for at blokere un-reagerede steder og for at reducere ikke-specifik adsorption af protein i en disk.
  2. Vask to gange med 0,1% BSA-PBS ved fyldning og opsugning kamrene under anvendelse af en mikropipette.
    BEMÆRK: I denne fase disken kan opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
  3. Belastning 10 pi af antigen-spiked fuldblod eller CRP-fri serum til CRP detektion på disken ved hjælp af en micropipette. For at gøre kalibrering grafer, bruge koncentrationer af CRP fra 1 pg / ml til 100 ng / ml; og cTnI fra 10 pg / ml til 100 ng / ml.
    BEMÆRK: På grund af de højere niveauer af CRP i fuldblod, som er normalt i uM området, blev CRP-frit serum anvendt til at demonstrere lav detektionsgrænse for indretningen.
  4. Spin disken ved 3.600 rpm (391 x g) i 60 sek for at adskille de røde blodlegemer.
  5. Åbn ventilen # 1 ved hjælp af laser bestråling, og overførsel 4 pi af supernatanten plasma til kammer, der indeholder 8 pi påvisning af antistoffer konjugeret med HRP ved at dreje skiven ved 2.400 rpm i 3 sek.
    BEMÆRK:. De generelle processer for ventil aktivering og visualisering af disk operation er beskrevet i detaljer i en tidligere rapport 21
  6. Anvende en blanding mode (15 Hz s -1, 15 °) i 5 sekunder for binding af proteinet og detektionsantistoffer.
  7. Åben ventil nr 2, og overføre blandingen fremstillet i trin 6 til bindingsreaktionen kammer (2.400 rpm, 3 sek). Derefter anvende en blanding mode (60 Hz s -1, 2 °) i 20 minutter for at opnå en immunreaktion mellem blandingen og de ​​bindende antistoffer på TiO 2 NFS. Efter reaktionen åben ventil nr 3 og overføre den resterende blanding til spildkammeret (2.400 rpm, 10 sec).
  8. Overfør vaskebuffer (600 pi) til det bindende reaktionskammeret ved at åbne ventilen # 4 og spinding disken (2.400 rpm, 4 sek). Derefter anvende en blanding mode (30 Hz s -1, 30 °) i 120 sek til vaske TiO2 forbund i kammeret.
  9. Vask de TiO 2 forbund to gange mere ved at følge samme betingelse i trin 3.8, og fjern den resterende vaskebuffer fuldstændigt ved spinding disken ved 2.400 rpm i 20 sek. Derefter lukke ventilen # 5.
  10. For den kemiluminescerende reaktion, anvende en blanding mode (30 Hz s -1, 2 °) i 1 min efter overførsel af kemiluminescerende substrat løsning på bindingsreaktionen kammeret ved at åbne ventilen # 6 og spindingdisken ved 2.400 rpm i 10 sek senere.
  11. Overfør den omsatte substratopløsning med henblik på påvisning kamre ved at åbne ventilen # 7 og spinding disken ved 2.400 rpm i 10 sek.
  12. Måle kemiluminescens signaler fra den omsatte substrat opløsning under anvendelse et fotomultiplikatorrør (PMT) modul udstyret detektionssystem.
    BEMÆRK: detection system er en specialbygget maskine ved hjælp af følgende dele: trins motor, optomekaniske komponenter, oversættelse etaper, og kommercielt tilgængelige PMT. De optomekaniske dele og stepmotor er samlet at holde enheden, og motoren kan rotere disken. Detekteringen udføres ved PMT fikseret på de optomekaniske dele, og det er placeret over detekteringsorganerne kamre i enheden. Ved at manipulere stepmotoren, er detekteringsorganerne kamre justeret lige under påvisningszonen af ​​PMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved anvendelse af denne protokol, et fuldt automatiseret centrifugal mikrofluidanordning for protein detektion fra fuldblod med høj følsomhed blev fremstillet. De TiO 2 NF måtter fremstillet ved processer elektrospinning og kalcinering. For at fremstille NFS af ønskede diameter, morfologi og tykkelse, elektrospinding tilstande såsom strømningshastighed, spænding, og spinding tid blev optimeret. Når betingelserne ikke var optimeret, kvaliteten af ​​NFS dannede var dårlig. Især blev forbund ikke spundet ud fra polymeropløsningen ved lav spænding (5 kV), og var brudt, når spændingen var høj (> 20 kV). Tilsvarende spinning tid var kritisk for fremstilling af NF'er med passende tæthed, ikke også sparse (1 min) eller for tæt (30 min). For endvidere at undgå bead dannelse forårsaget af høje strømningshastigheder, blev strømningshastigheden manipuleret. Så en påtrykt spænding på 15 kV, 10 min elektrospinding tid og en strømningshastighed på 0,3 ml time (figur 1).

TiO2 NF mat blev succesfuldt overført til mål-substratet ved anvendelse af et klæbemiddel PDMS lag, som blev fremstillet ved spin-coating PDMS på en silaniseret siliciumsubstrat og pre-hærdning i en ovn ved 65 ° C. Tiden for pre-hærdning af PDMS lag blev optimeret ved at kontrollere vedhæftning kraft, ved hjælp af en tack test (figur 2A). Figur 2B viser virkningen af hærdetider nanofiber vedhæftet fil. Hvis PDMS blev opvarmet i 3 minutter, er der ingen vedhæftning kraft PDMS var stadig uhærdede og forbliver som en væske og NFS fik indlejret i PDMS lag. Når det opvarmes i 30 minutter, vedhængningskraften er meget svag som PDMS bliver stramt og mister sin klæbrig egenskab og NFS blev ikke tilknyttet på den. Når PDMS blev opvarmet for 10 min, viste PDMS stærk friktion kraft og NFS var tilknyttet kraftigt. Ud fra resultaterne konkluderes det, at det optimale tidspunkt for pre-hærdning PDMS for stærk tilknytning er 10 min.

Efter disc samling blev immunoassay udført på TiO2 NF mat integreret disk ved at følge en række disk drift processer som anført i tabel 1. Til bestemmelse af CRP og cTnI koncentrationer i ukendte prøver, blev kalibrering grafer for hver fremstillet ved at plotte de relative lysenheder (RLU) versus CRP eller cTnl koncentration (figur 3). I figur 3A og 3B, blev assay-resultaterne på-disk sammenlignet med konventionel ELISA på en 96-brønds plade til CRP og cTnI hhv. Analyserne viste en bred lineær dynamisk område med en detektionsgrænse på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og 37 pg / ml (1,5 pm) for cTnI på en disk, derer omkring 300 gange højere for CRP og 20 gange højere for cTnI forhold til deres respektive konventionelle ELISA-resultater (286 pg / ml, 2,3 pm til CRP; 824 pg / ml, 32 pm til cTnI).

figur 1

Figur 1. Optimering af elektrospinning betingelser. SEM billeder på hver betingelse viser morfologi forbund dannet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Tack test af klæbemiddel PDMS lag og SEM-billeder af overførte TiO2 NF måtten. (A) adhæsionskraft af klæbemidletPDMS lag, forhærdet i flere længder af tid, (B) SEM billeder af nanofibre fastgjort på PDMS hærdet i forskellige længder af tid. Dette tal er blevet ændret fra ref. 21. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Kalibrering grafer til påvisning af CRP og cTnI hjælp lab-on-a-skive og plade med 96 brønde. Påvisning af CRP spiked i CRP-free serum (A) og cTnI spiket i fuldblod (B) blev udført. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen af ​​mindst tre uafhængige målinger. Detektionsgrænsen (LOD) blev beregnet ved 3 gange af standardafvigelsen af ​​de negative kontroldata målt med CRP-fri serum eller fuldblod uden cTnI spiking forCRP og cTnI henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Spin No. Hastighed (rpm) Valve No. (Sek) Operation
1 3600 60 adskillelse blod
2 2400 1 3 åbne ventil for at overføre plasmaet i kammeret indeholdende 8 pi påvisning af antistoffer konjugeret med HRP
3 15 Hz, 15 ° 5 mix plasma og påvisning af antistoffer
4 </ Td> 2400 2 3 åbne ventil til at overføre blandingen til bindingsreaktion kammer
5 60 Hz, 2 ° 1.200 mix capture-antistoffer på TiO2 NF mat og plasma-påvisning af antistoffer blanding
6 2400 3 10 åbne ventil til fjernelse af blandingen
7 2400 4 4 åbne ventil til at overføre vaskebuffer
8 30 Hz, 30 ° 120 blande vaskebuffer og vask TiO2 NF mat
9 2400 4 overførsel vaskebuffer
10 30 Hz, 30 ° 120 TiO2 NF mat
11 2400 4 overførsel vaskebuffer
12 30 Hz, 30 ° 120 blande vaskebuffer og vask TiO2 NF mat
13 2400 4 overførsel vaskebuffer
14 30 Hz, 30 ° 120 blande vaskebuffer og vask TiO2 NF mat
15 2400 20 fjerne det resterende vaskebuffer
16 5 tæt ventil
17 2400 6 10 åben valve og overføre kemiluminescerende substrat
18 30 Hz, 2 ° 60 blande substrat og de ​​immunoreagenser på TiO 2 NF mat
19 2400 7 10 åbne ventilen og overføre det omsatte substrat til detekteringskammeret
Samlet tid ~ 30 min

Tabel 1. Betjening program for immunoassay i en disk. Denne tabel er blevet ændret fra ref. 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assayet på TiO2 NF integreret disk er en hurtig, billig og bekvem teknik til ultrasensitiv påvisning af lave rigelige proteiner til stede i meget lave blodvolumen. Denne teknik har den fordel at bruge små prøvevolumener (10 pi) og er modtagelig for analyse af flere prøver samtidigt. Dette tilvejebringer et stort potentiale som en multiplexing immunoassay enhed. Indretningen har den fordel, at det ikke kræver prøveforbehandling trin som plasma separation, som er nødvendige i konventionelle ELISA'er. Desuden kan enheden udføre hele immunoassay procedurer (f.eks, blanding, vask, binding etc.) automatisk på grund af pre-designede kamre, kanaler og ventiler. Derudover bruger kommercialiserede disc fremstillingsmetoder (fx sprøjtestøbning, UV / ultralyd / termisk binding) i stedet for fræsning og manuel montage ved hjælp af lim, kan hele proceduren fra enhed fabrikation til analyse væreautomatiseret.

Også overførsel-trykmetode præsenteret her viser en simpel og nem overførsel af elektrospundet NF fra donor til målsubstrat ved at anvende et tyndt klæbende PDMS lag. I almindelighed er de TiO 2 forbund opnået efter calcineringsprocessen er skøre og nemt skrælle fra det jordforbundne substrat grund af svag adhæsion. 25 På grund af sin karakteristiske sprødhed integrere de TiO 2 NF måtter med andre enheder er vanskelig. For at løse dette, er rapporteret mange metoder. For eksempel, hot-press 26 og solvens-damp 27 teknikker viste forbedring af vedhæftningen mellem TiO2 forbund mat og måloverflade før kalcinering proces. Selv om disse fremgangsmåder øget adhæsion, TiO2 NF måtter var ikke intakt på grund af den høje mekaniske tryk eller opløsningsmidlet anvendt under de respektive teknikker. På grund af kalcineringstrinet, integration af TiO 2 </ Sub> NF måtter med disse metoder kan kun anvendes for begrænsede mål overflader.

Så vidt vi ved, er dette den første teknik til at vise overførsel-trykning af NF måtter på en indretning fremstillet af termoplast, bevarer de hidtil ukendte egenskaber af NF'er også efter overdragelsen. For bedre ydelse af enheden, er fremstilling af høj kvalitet NFS og optimering af præ-hærdende betingelser ønskes. Som nævnt i protokollen, den nødvendige tid til pre-hærdning kan variere efter miljøforholdene; derfor, pre-hærdende betingelser skal optimeres ved at måle vedhæftning kraft under anvendelse af en tack-test.

Desuden protokollen præsenteres her, giver dygtige guider til det fuldautomatiske ELISA proces på en disk. Protokollen indfører ikke kun fremstilling af disken, men også automatiseringen af ​​alle de processer, som et ELISA, herunder separation af fuldblod, måling, blanding, vask og detektion.Hvert trin er optimeret med centrifugeringshastigheden, blanding frekvens, og driftstid. Baseret på denne operation guide, kan reagenserne læsset på en disk overføres udnytte en enkelt motor. Da enheden udførte fremragende afsløring følsomhed med meget lav volumen af ​​blod, det giver et stort potentiale for diagnostiske applikationer ved screening af biomarkører på et tidligt stadium af sygdommen. Enheden vil have mulighed for at opdage eventuelle biomarkør afhængigt af tilgængeligheden af ​​sine specifikke antistoffer.

Selvom enheden med TiO 2 NF måtter opnået stærkt forøget følsomhed på grund af det store overfladeareal af måtterne, kunne en af de tilbageværende udfordring af denne teknik være i masseproduktion af ensartede NF måtter. Fordi følsomheden af ​​ELISA er stærkt påvirket af overfladearealet af den nanofiber måtten, er det afgørende at opnå ikke blot et stort overfladeareal, men også en reproducerbar og ensartet overfladeareal i forskellige batches af masseproduktion. Sammenfattende har vi vist en enkel metode til at integrere et sprødt NF måtten til en funktionel indretning til ultrasensitiv detektion protein. Fordelene ved denne fremgangsmåde er som følger: 1) tidligere elektrospindes TiO 2 forbund kunne fremstilles kun på ledende og termisk stabile overflader; her har vi vist, at de kan overføres til en hvilken som helst substrat, inklusive ikke-ledende og plastmaterialer; 2) de TiO2 NF måtter kan modstå tryk og forbliver stabil under vasketrin grund af den høje friktion kraft PDMS lag; 3) det giver et relativt højere overfladeareal for bioassays; og 4) antistofferne kan være kovalent bundet til TiO2 forbund grund af de intakte overfladeegenskaber på NFS. Denne teknik har stort potentiale til at blive anvendt til integration af nanofibrous materialer i indretninger til forskellige anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation Korea (NRF) tilskud (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), et tilskud fra den koreanske Health Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed og Velfærd (A121994) og IBS-R020-D1 finansieret af den koreanske regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer LG SILTRON Polished Wafer, test grade Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)  Daedong Plastic PCS#6900 Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%, Sigma-Aldrich 205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 Sigma-Aldrich 437190
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Anhydrous ethanol Sigma-Aldrich 459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma-Aldrich 448931
PDMS and curing agent Dow Corning SYLGARD 184
GPDES Gelest Inc SIG5832.0 
Ethanol J T Baker
FE-SEM FEI Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy ThermoFisher K-alpha
3D modeling machine M&I CNC Lab, Korea CNC milling machine
Wax-dispensing machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Double-sided adhesive tape FLEXcon, USA DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter Graphtec Corporation, Japan Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater MIDAS SPIN-3000D
Furnace (calcination) R. D. WEBB COMPANY WEBB 99
Rheometer (Tack test) Thermo Scientific Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system FEMTO CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP Hytest Ltd., Finland 4C28 (clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI Hytest Ltd., Finland 4T21 (clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP Abcam plc., MA ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI Abcam plc., MA ab24460 (clone # 16A11)
hsCRP Abcam plc., MA ab111647
cTnI Fitzgerald, MA 30-AT43
Bovine Albumin Sigma-Aldrich A7906
PBS Amresco Inc E404
Blood collection tubes BD vacutainer 367844 K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femto Invitrogen 37074
Modular multilabel plate reader Perkin Elmer Envision 2104
Disc operating machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Photomultiplier tube (PMT) Hamamatsu Photonics H1189-210
AutoCAD AutoDesk Version 2012 Design software
SolidWorks 3D CAD software  SOLIDWORKS Corp. Version 2013 3D Design software,
Edgecam Vero software version 2009.01.06928 Code generating software
DeskCNC Carken Co. version 2.0.2.18 CNC milling machine software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
  2. Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
  3. Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
  4. Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
  5. Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
  6. Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
  7. Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
  8. Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
  9. Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
  10. Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
  11. Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
  12. Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
  13. Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
  14. Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
  15. Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
  16. Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
  17. Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
  18. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  19. Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
  20. Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
  21. Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
  22. Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
  23. Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
  24. Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
  25. Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
  26. Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
  27. Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).

Tags

Bioengineering lab-on-a-disc elektrospinning TiO immunoassay fuld automatisering overførsel-print on-disc afsløring lav volumen assay hel blod ultrafølsom
Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y.,… More

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y., Lee, W. S., Han, J. R., Cho, Y. K. Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood. J. Vis. Exp. (110), e54143, doi:10.3791/54143 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter