Introduction
Meerdere platforms voor ziektediagnose ontwikkeld gebaseerd op nanoschaal materialen zoals 1,2 nanodraden, nanodeeltjes 3, 4 nanobuisjes, 5 en nanovezels (NFS) 6-8. Deze nanomaterialen bieden uitstekende vooruitzichten bij het ontwerpen van nieuwe technologieën voor zeer gevoelige bioassays vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Zo hebben mesoporeuze zinkoxide nanovezels gebruikt voor de femto-molaire gevoelige detectie van borstkanker biomarkers. 9 Recentelijk nanomaterialen basis van titaandioxide (TiO 2) zijn onderzocht voor bioanalytische toepassingen 10 gezien hun chemische stabiliteit, 11 verwaarloosbaar eiwitdenaturatie , 12 en biocompatibiliteit. 13 Bovendien zijn de hydroxylgroepen op het oppervlak van TiO 2 vergemakkelijken chemische modificatie en de covalente hechting van biomoleculen. 14,15 gevormde TiO 2 thin films 16 of TiO 2 nanobuizen 17 zijn gebruikt om de detectiegevoeligheid van een doeleiwit bevorderen door de oppervlakte; echter, het fabricageproces nogal complex en vereist dure apparatuur. Anderzijds worden electrospun NFS ontvangen op door hun hoge oppervlaktegebied en eenvoudig en goedkoop fabricageproces, 18,19 toch de breekbare of losse kenmerk van de electrospun TiO 2 NF mat maakt het moeilijk te hanteren en geïntegreerd microfluïdische inrichtingen. 6,20 Daarom werden de TiO 2 NF matten zelden gebruikt in bioanalytische toepassingen, vooral diegenen die zware wasomstandigheden.
In deze studie, om deze beperkingen te overwinnen, wij hebben een nieuwe techniek ontwikkeld voor het overbrengen van de electrospun NF matten op het oppervlak van een target substraat met behulp van een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) kleeflaag. Furthermore, hebben we met succes toonde de integratie van electrospun TiO 2 NF matten op een centrifugale microfluïdische inrichting bestaande uit polycarbonaat (PC). Gebruik van dit apparaat een hooggevoelige volledig geautomatiseerde en geïntegreerde detectie van C-reactief proteïne (CRP) en cardiaal troponine I (cTnI) werd binnen 30 min van slechts 10 pl volbloed. 21 Door de gecombineerde voordelen van de eigenschappen van de NF en centrifugale platform, de test vertoonde een breed dynamisch bereik van zes orden van grootte van 1 pg / ml (~ 8 fM) tot 100 ng / ml (~ 12:08) met een onderste detectielimiet van 0,8 pg / ml (~ 6 fM) voor CRP en een dynamisch bereik van 10 pg / ml (~ 12:04) tot 100 ng / ml (~ 4 nM) met een detectiegrens van 37 pg / ml (~ 13:05) voor cTnI. De detectielimieten zijn ~ 300 en ~ 20-voudig lager in vergelijking met hun overeenkomstige conventionele ELISA resultaten. Deze techniek kan worden toegepast voor de detectie van elke doeleiwitten met geschikte antilichamen. Kortom, dit apparaat coULD dragen sterk in-vitro diagnostica en biochemische assays omdat het zeldzaam hoeveelheden doeleiwitten zelfs zeer kleine hoeveelheden biologische monsters te detecteren met grote gevoeligheid, bijvoorbeeld 10 pl volbloed. Hoewel we alleen aangetoond serumproteïnen detectie middels ELISA in deze studie kan de overdracht en integratietechnologie van electrospun NF met microfluïdische inrichtingen ruimer worden toegepast in andere biochemische reacties die een groot oppervlak voor hoge detectiegevoeligheid vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Bloed werd van gezonde individuen en werd opgevangen in een bloedafname. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrijwilligers.
1. Fabricage van TiO 2 NF Mat
- Bereiding van precursor oplossing 22
- Los op 1,5 g titaantetraisopropoxide (TTIP) in een mengsel van ethanol (99,9%, 3 ml) en ijsazijn (3 ml) en meng de oplossing bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 30 minuten op een magnetische roerder.
- Oplossen 11 gew% polyvinylpyrrolidon (PVP) in 3,64 g ethanol (99,9%) en roer de oplossing bij 65 ° C gedurende 1 uur met een hete plaat magnetische roerder.
- Combineer en roer de twee oplossingen bij 65 ° C gedurende 4 uur op een hete plaat magnetische roerder.
- electrospinning
- Laad de bereide oplossing in een spuit verbonden met een roestvrijstalen naald van 200 micrometer innerlijke Diameter. Giet de oplossing direct in de spuit na het verwijderen van de plunjer.
- Introduceren van de oplossing continu met een stroomsnelheid van 0,3 ml / uur gedurende 10 minuten op een Si-wafer (2 cm x 2 cm) geplaatst op een geaard substraat bij een hoge gelijkspanning (15 kV). Tijdens de electrospinning, stel dan de afstand tussen de naald en de geaarde substraat 10 cm.
- Branden van de NF mat
- Plaats de NF mat in een oven en verhoog de temperatuur tot 500 ° C met een ramping snelheid van 3 ° C / min onder hoog-vacuüm conditie (5 x 10 -5 Torr).
- Handhaaf de temperatuur op 500 ° C gedurende 3 uur. Afkoelen de temperatuur van de monsters naar de kamertemperatuur (25 ° C) in de oven.
2. Integratie van TiO 2 NF Mat in een centrifugale microfluïdische Disc
- Vervaardiging van een schijf
- Gebruik de 3D-ontwerpen van software (bijv SolidWorks of iets dergelijks) aan de kamers, kanalen, of kleppen van elke laag van de schijf weer te geven. Converteren het ontwerp bestanden naar Computer Numerical Control (CNC) code met behulp van code genereren van software (bijv Edgecam of iets dergelijks). Gebruik de software volgens de handleiding 23,24. Let op: De typische kanaal afmetingen die in dit apparaat is 1,0 mm x 0,3 mm (breedte x diepte).
- Open de besturingssoftware van CNC-freesmachine (bijv., DeskCNC of iets dergelijks) en de belasting CNC code om de besturingssoftware en klik op de volgende in deze volgorde: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Selecteer de gegenereerde CNC code.
- Bevestig de PC plaat op de CNC-freesmachine: gebruik 1 mm PC platen voor de toplaag en 5 mm PC platen voor de disc laag. Voer de CNC-freesmachine om elke laag van de schijf te snijden door te klikken op de "START" knop.
- Overdracht van TiO 2 NF mat op de disc
- Plaats een siliciumsubstraat en een petrischaaltje met 40 pl (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichloorsilaan in een vacuümkamer onder vacuüm gedurende 30 min. De fluorosilane verdampt en wordt aangebracht op het substraat.
- Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer met een hardingsmiddel in een 10: 1 verhouding en ontgast in een vacuümkamer. Spin-coat het PDMS op een siliciumsubstraat bij 650 tpm gedurende 60 sec.
- Hard de PDMS bekleed siliciumsubstraat in een oven bij 65 ° C gedurende 10 minuten om een hechtende toestand te bereiken.
LET OP: Het genezen van tijd kan worden gevarieerd afhankelijk van de omgeving, en adhesie kracht kan worden getest door een tack-test met behulp van een rheometer. - Breng de TiO 2 NF mat bereid door elektrospinnen en calcineren op de PDMS-gecoate silicium met behulp van een pincet. Vervolgens handmatig een conforme druk op de overgedragen TiO 2 NF mat van toepassing met een plat voorwerp (bijv., Glasplaatje) en verwijder het object. LeggenDit monster in de oven bij 65 ° C gedurende 4 uur of bij 80 ° C gedurende 1 uur om de PDMS laag volledig genezen.
- Coat binding reactiekamers in de schijf met 20 ul de PDMS / verharder mengsel (10: 1), die fungeert als een hechtmiddellaag voor bevestiging TiO 2 NF mat op de schijf.
- Doseer 50 pi ethanol (99,9%) van de TiO 2 NF mat op de PDMS laag, snijd de NF mat met een punch gat met een diameter van 6 mm, en de overdracht van de snede TiO 2 NF mat aan de bindende reactiekamers gecoat met 20 ui van de PDMS in de vorige stap.
Opmerking: In deze stap wordt ethanol nuttig zijn om de snede TiO 2 NF mat losmaken van het Si-substraat. - Incubeer de TiO 2 NF mat geïntegreerd schijf in de oven bij 65 ° C gedurende 4 uur of bij 80 ° C gedurende 1 uur om het PDMS volledig uitharden.
- Oppervlaktemodificatie van de TiO 2 NF mat op de disc
- Prepareren 1% v / v oplossing van (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxy silaan (GPDES) in ethanol (99,9%).
- Behandel de TiO 2 NF mat geïntegreerde disc met zuurstof plasma bij 140 W, 50 SCCM zuurstoftoevoer voor 180 sec. Verdeel 100 ul GPDES oplossing op elke nanovezel mat en incubeer bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 2 uur.
- Was de substraten kort door het afgeven van ethanol (99,9%) met behulp van een spuitfles en verwijder de ethanol volledig door het omkeren van de schijf en blotting het tegen een schoon doekje. Harden bij 80 ° C gedurende 1 uur. Was tweemaal met ethanol (99,9%) op dezelfde wijze zoals hierboven vermeld, de fysisch geadsorbeerd en ongebonden moleculen GPDES verwijderen.
- Blaas droog met een stikstofstroom, droog onder vacuüm.
OPMERKING: De schijf kan worden opgeslagen in een afgesloten houder bij kamertemperatuur (25 ° C) tot gebruik.
- Immobilisatie van antilichamen op het oppervlak
- Voeg een oplossing van 200 ug / ml capture antilichamen (monoklonaal muizen antimenselijke hsCRP of monoklonale muizen anti-cTnI) door verdunning van de antilichamen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (pH 7,4). Doseer 5 ul van de oplossing op elk NF mat in een schijf met behulp van een micropipet. Zie materialen lijst voor meer informatie over de antilichamen.
- Houd de schijven in een bevochtigde kamer en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur. Was de antilichamen gecoat NF mat met 0,1% BSA-PBS-buffer. Vul de kamer met 100 ul van wasbuffer met behulp van een micropipet, verwijder de buffer door opzuigen of decanteren. Tot slot, draai de disc en dep het tegen een schoon te vegen, en vervolgens monteer de disc.
- disc assemblage
- Teken de vormgeving van de schijf op dubbelzijdig plakband met een CAD-programma (bijvoorbeeld AutoCAD of soortgelijke). Laad de CAD-ontwerp van de snij-plotter.
- Snij de double-plakband met behulp van de snij-plotter. Schil van een beschermlaag van dubbele plakband en bevestig it boven op de schijflaag. Trek het andere beschermlaag en bevestig de bovenste laag op de schijf laag.
- Laad de voorlopig gemonteerde schijf in de persmachine en nauwkeurig af te stemmen top / lijm / disc lagen met behulp align merken in elke laag op elke klep, kanaal, en kamers aan te sluiten. Solliciteer conforme druk met behulp van de persmachine.
3. Immunoassay
- Vul de kamers met 1% BSA-PBS-buffer met behulp van een micropipet en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de buffer door afzuigen met een micropipet. Voer deze stap om de niet-gereageerde sites te blokkeren en om niet-specifieke adsorptie van proteïne verminderen disc.
- Was tweemaal met 0,1% BSA-PBS vult en aspireren de kamers met een micropipet.
Opmerking: In dit stadium kan de schijf worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik. - Load 10 pl-antigeen spiked volbloed of CRP-vrij serum voor CRP detectie op de schijf met behulp van een micropipette. Voor het maken van de ijkgrafieken Gebruik CRP concentraties van 1 pg / ml tot 100 ng / ml; en troponine van 10 pg / ml tot 100 ng / ml.
Opmerking: Door de hogere niveaus van CRP in volbloed, dat meestal uM bereik werd CRP-vrij serum gebruikt om de lage detectielimiet van de inrichting demonstreren. - Spin de schijf met 3600 rpm (391 xg) voor 60 seconden om de rode bloedcellen te scheiden.
- Open klep # 1 door laser-bestraling, en de overdracht 4 pl van de bovenstaande plasma aan de kamer met 8 ul van de opsporing van antilichamen geconjugeerd met HRP door het draaien van de schijf bij 2.400 tpm gedurende 3 sec.
Opmerking. De algemene werkwijzen voor klepbediening en visualisatie schijfwerking worden uitvoerig beschreven in een vorig rapport 21 - Breng een meng- stand (15 Hz s -1, 15 °) gedurende 5 sec voor binding van het eiwit en detectie-antilichamen.
- Open valve # 2, en breng het mengsel bereid in stap 6 de binding reactiekamer (2400 rpm3 sec). Breng daarna een meng modus (60 Hz s -1, 2 °) gedurende 20 minuten om een immuunreactie tussen het mengsel en de bindende antilichamen de TiO 2 NFs bereiken. Na de reactie geopende afsluiter # 3 en breng de resterende mengsel de afvalkamer (2400 rpm, 10 seconden).
- Breng de wasbuffer (600 pl) aan de bindende reactiekamer door kraan # 4 en draaien van de schijf (2400 rpm, 4 sec). Breng dan een meng- stand (30 Hz s-1, 30 °) gedurende 120 seconden naar de TiO 2 NF's wassen in de kamer.
- Was de TiO 2 NFs nog twee keer door het volgen van dezelfde staat van stap 3.8, en volledig verwijderen van de resterende wasbuffer door het draaien van de schijf bij 2.400 tpm gedurende 20 sec. Dan sluit de klep # 5.
- Voor de chemiluminescente reactie Breng een meng modus (30 Hz s -1, 2 °) gedurende 1 min na het overbrengen van de chemiluminescente substraatoplossing het bindende reactiekamer door kraan # 6 en spinnende schijf bij 2400 rpm gedurende 10 seconden later.
- Breng de gereageerde substraatoplossing de detectiekamers door kraan # 7 en het draaien van de schijf bij 2400 tpm gedurende 10 sec.
- Meet chemiluminescentie signalen van de gereageerde substraatoplossing met een fotomultiplicatorbuis (PMT) detectiesysteem module voorzien.
LET OP: Het detectiesysteem is een custom-built machine met behulp van de volgende onderdelen: stappenmotor, microscopen componenten, vertaling podia en in de handel verkrijgbaar PMT. De microscopen onderdelen en stappenmotor worden geassembleerd om het apparaat te houden, en de motor kan de schijf draaien. De detectie wordt uitgevoerd door PMT vastgesteld op optomechanische onderdelen, en bevindt zich boven de detectiekamers van het apparaat. Door het manipuleren van de stappenmotor worden de detectiekamers uitgelijnd direct onder de detectiezone van PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met dit protocol, een volautomatische centrifugale microfluïdische inrichting voor eiwitdetectie uit vol bloed met hoge gevoeligheid bereid. De TiO 2 NF matten werden bereid door processen van elektrospinproces en calcineren. Om de NF van gewenste diameter, morfologie en dikte fabriceren, electospinning aandoeningen zoals debiet, spanning en spinnen tijd geoptimaliseerd. Wanneer de omstandigheden niet geoptimaliseerd, de kwaliteit van de gevormde NFs was slecht. Met name werden NFS niet gesponnen uit de polymeeroplossing bij laag voltage (5 kV), en werden verbroken wanneer de spanning hoog was (> 20 kV). Evenzo spinning tijd was kritisch voor de vervaardiging van NFs met geschikte dichtheid, niet te dun (1 min) of te dicht (30 min). Ook aan korrelvorming veroorzaakt door hoge stroomsnelheden te vermijden, werd de stroomsnelheid gemanipuleerd. Dus, een toegepaste voltage van 15 kV, 10 min elektrospinnen tijd en een stroomsnelheid van 0,3 ml hr
De TiO 2 NF mat is succesvol overgebracht op het bedoelde substraat met een klevende laag PDMS, die werd bereid door middel van spin-coating PDMS op een gesilaniseerde siliciumsubstraat en pre-uitharding in een oven bij 65 ° C. De tijd voor pre-harden van de PDMS-laag werd geoptimaliseerd door eerst de kleefkracht, met een tack-test (Figuur 2A). Figuur 2B toont het effect van uithardingstijd op nanovezel attachment. Als de PDMS gedurende 3 min verwarmd, er geen adhesiekracht als PDMS nog ongeharde en blijft als een vloeistof en de NFs werd ingebed in de PDMS-laag. Wanneer het wordt gedurende 30 min, de kleefkracht is zeer zwak de PDMS stijf en verliest het plakkerige eigenschap en NFS werden niet verbonden op. Wanneer de PDMS werd verhit for 10 min, de PDMS liet een sterke kleefkracht en de NFS werden sterk gehecht. Uit de resultaten wordt geconcludeerd dat de optimale tijd voor het pre-uithardende PDMS sterke hechting is 10 minuten.
Na schijfsamenstel werd de immunoassay uitgevoerd op de TiO 2 NF mat geïntegreerde disc na een reeks schijfwerking werkwijzen zoals vermeld in tabel 1. Voor de bepaling van CRP en cTnI concentraties in onbekende monsters werden ijkgrafieken voor elk gemaakt door het uitzetten de relatieve lichteenheden (RLU) versus de CRP of troponine concentratie (Figuur 3). In figuur 3A en 3B werden de on-disc testresultaten in vergelijking met conventionele ELISA op een 96-wells plaat respectievelijk CRP en cTnI. De assays vertoonde een breed lineair dynamisch bereik met een detectiegrens van 0,8 pg / ml (~ 6 fM) voor CRP en 37 pg / ml (1:05) voor cTnI- op een schijf, dieongeveer 300 keer hoger voor CRP en 20 keer hoger voor cTnI vergelijking met hun gebruikelijke ELISA resultaten (286 pg / ml, 14:03 voor CRP, 824 pg / ml, 32 pM voor cTnI).
Figuur 1. Optimalisatie van elektrospinproces omstandigheden. SEM afbeeldingen in elke conditie tonen de morfologie van NFs gevormd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Tack test van lijm PDMS laag en SEM beelden van de overgedragen TiO 2 NF mat. (A) Adhesie kracht van de lijmPDMS laag pre-uitgehard gedurende verschillende tijdsperioden, (B) SEM beelden van nanovezels bevestigd aan PDMS gehard gedurende verschillende tijdsperioden. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Ref. 21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. ijkgrafieken voor de detectie van CRP en cTnI behulp van lab-on-a-schijf en 96-putjesplaat. De detectie van CRP spiked in CRP-vrij serum (A) en cTnI- spiked in volbloed (B) uitgevoerd. De foutbalken geven de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke metingen. De detectiegrens (LOD) werd berekend door 3 keer de standaardafwijking van de negatieve controles gemeten met CRP-vrij serum of bloed zonder cTnI spiking voorCRP en cTnI, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Spin No. | Snelheid (rpm) | Valve No. | Time (sec) | operatie | |||
| 1 | 3600 | 60 | scheiding bloed | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | geopende afsluiter om het plasma te zetten in de kamer die 8 pl detecteren antilichamen geconjugeerd met HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | meng plasma en het detecteren van antilichamen | ||||
| 4 </ Td> | 2400 | 2 | 3 | geopende afsluiter aan het mengsel zetten in bindende reactiekamer | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1200 | mengen capture antilichamen op TiO 2 NF mat en plasma detecteren van antilichamen mengsel | ||||
| 6 | 2400 | 3 | 10 | geopende afsluiter aan het mengsel te verwijderen | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | geopende klep wasbuffer overdragen | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | meng wasbuffer en was TiO 2 NF mat | ||||
| 9 | 2400 | 4 | overdracht wasbuffer | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | 2 NF mat | ||||
| 11 | 2400 | 4 | overdracht wasbuffer | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | meng wasbuffer en was TiO 2 NF mat | ||||
| 13 | 2400 | 4 | overdracht wasbuffer | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | meng wasbuffer en was TiO 2 NF mat | ||||
| 15 | 2400 | 20 | Verwijder de resterende wasbuffer | ||||
| 16 | 5 | sluit klep | |||||
| 17 | 2400 | 6 | 10 | Open vKlep en breng de chemiluminescentiesubstraat | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | Meng substraat en de immunoreagentia op TiO 2 NF mat | ||||
| 19 | 2400 | 7 | 10 | geopend ventiel en breng het gereageerde substraat om de detectiekamer | |||
| Totale tijd | ~ 30 min | ||||||
Tabel 1. Operation programma voor de immunoassay op een disc. Deze tabel is gewijzigd ten opzichte van Ref. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De test op TiO 2 NF geïntegreerde schijf is een snelle, goedkope en gemakkelijke techniek voor de ultragevoelige detectie van lage overvloedige eiwitten in zeer lage hoeveelheid bloed. Deze techniek heeft het voordeel dat kleine monstervolumes (10 ui) en is vatbaar voor de analyse van meerdere monsters tegelijk. Dit verschaft een groot potentieel als multiplexing immuunanalysemedium. De inrichting heeft het voordeel dat het geen monstervoorbereiding stappen zoals plasmascheiding, die nodig zijn gebruikelijke ELISA vereist. Bovendien kan de inrichting geheel immunotest procedures (bijvoorbeeld mengen, wassen, binding etc.) automatisch door vooraf ontworpen kamers, kanalen en kleppen voeren. Bovendien zou het gebruik gecommercialiseerd schijf fabricagemethoden (bijvoorbeeld spuitgieten, UV / ultrasone / thermische binding) plaats frezen en handmatige assemblage middels lijmen, kan de hele procedure van apparaat fabricage tot analysegeautomatiseerd.
Ook de transfer-drukwerkwijze hier gepresenteerde toont een eenvoudige en gemakkelijke overdracht van electrospun NF van donor tot substraat richten met behulp van een dunne hechtende laag PDMS. In het algemeen, de TiO 2 NF verkregen na het calcineringsproces broos en gemakkelijk loslaten van de geaarde substraat door zwakke hechting. 25 Door de kenmerkende brosheid integratie van TiO 2 NF matten met andere apparaten moeilijk. Om dit op te lossen, zijn vele methoden gerapporteerd. Bijvoorbeeld, hete pers 26 en oplosmiddel-damp 27 technieken toonde de verbetering van de hechting tussen TiO 2 NF mat en doeloppervlak voor calcineringsproces. Hoewel deze werkwijzen de hechting verhoogd, de TiO 2 NF matten niet intact vanwege de hoge mechanische druk of oplosmiddel toegepast tijdens de desbetreffende technieken. Mede vanwege de calcineringsstap, integratie van de TiO 2 </ Sub> NF matten met behulp van deze methoden kunnen alleen worden toegepast voor een beperkte doelgroep oppervlakken.
Voor zover ons bekend is dit de eerste techniek aan de transfer-printen van NF matten toon een inrichting bestaande uit thermoplasten, behouden de nieuwe eigenschappen van NF zelfs na overdracht. Voor een betere prestatie van de inrichting, fabricage van hoogwaardige NF en optimalisatie van pre-uithardingsomstandigheden gewenst. Zoals in het protocol, de tijd vereist voor pre-harden is afhankelijk van de omgevingsomstandigheden; Daarom, pre-curing condities worden geoptimaliseerd door het meten van de kleefkracht met een tack test.
Bovendien is het protocol hier wordt gepresenteerd, biedt bekwame gidsen voor de volledig geautomatiseerde ELISA-proces op een disc. Het protocol stelt niet alleen de vervaardiging van de schijf, maar ook de automatisering van de processen die nodig zijn ELISA, zoals scheiding van volbloed, meten, mengen, wassen en detectie.Elke stap is geoptimaliseerd met centrifugetoerental, het mengen van de frequentie, en de exploitatie tijd. Op basis van deze operatie gids, kan de reagentia geladen op een schijf worden overgebracht met behulp van een enkele motor. Aangezien het apparaat uitgevoerd uitstekende detectiegevoeligheid met een zeer geringe hoeveelheid bloed, biedt een groot potentieel voor diagnostische toepassingen door het screenen van biomarkers in een vroeg stadium van de ziekte. De inrichting kunnen volledig elke biomarker detecteren, afhankelijk van de beschikbaarheid van de specifieke antilichamen.
Hoewel het apparaat met TiO 2 NF matten bereikt werden sterk verbeterde gevoeligheid vanwege het grote oppervlak van de matten, zou een van de overblijvende uitdaging van deze techniek in de massaproductie van uniforme NF matten. Vanwege de gevoeligheid van de ELISA sterk wordt beïnvloed door het oppervlak van de nanovezel mat, is het essentieel om niet alleen een hoog specifiek oppervlak, maar ook een reproduceerbare en gelijkmatige oppervlak in verschillende batches massa productie. Concluderend, hebben wij aangetoond een eenvoudige methode om een brosse NF mat integreren in een functionele inrichting voor ultragevoelige eiwitdetectie. De voordelen van deze werkwijze zijn: 1) eerder electrospun TiO 2 NF kan worden bereid alleen geleidende en thermisch stabiele oppervlakken; Hier hebben we aangetoond dat ze op elk substraat dat niet-geleidend en kunststoffen kunnen worden overgedragen; 2) de TiO 2 NF matten druk te weerstaan en stabiel blijven tijdens wasstappen vanwege de hoge adhesiekracht van PDMS laag; 3) het een relatief hogere oppervlakte voor bioassays; en 4) de antilichamen covalent worden bevestigd aan de TiO 2 NF door het intacte oppervlakte-eigenschappen op NF. Deze techniek heeft een groot potentieel om gebruikt te worden voor de integratie van nanofibrous materialen in inrichtingen voor uiteenlopende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation Korea (NRF) subsidies (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), een subsidie van de Koreaanse Health Technology R & D Project, ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (A121994) en IBS-R020-D1 gefinancierd door de Koreaanse regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
