Introduction
Plusieurs plates - formes pour le diagnostic de la maladie ont été élaborés à base de matériaux à l' échelle nanométrique 1,2 tels que des nanofils, 3 nanoparticules, 4 nanotubes, 5 et nanofibres (SNF) 6-8. Ces nanomatériaux offrent d'excellentes perspectives dans la conception de nouvelles technologies pour les essais biologiques très sensibles en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Par exemple, les nanofibres d'oxyde de zinc mésoporeuse ont été utilisées pour la femtoseconde molaire détection sensible des marqueurs biologiques du cancer du sein. 9 Récemment, des nanomatériaux à base de dioxyde de titane (TiO 2) ont été étudiées pour des applications bioanalytiques 10 compte tenu de leur stabilité chimique, 11 négligeable dénaturation des protéines 12 et de la biocompatibilité. 13 En outre, les groupes hydroxyle sur la surface de TiO 2 faciliter la modification chimique et la liaison covalente de biomolécules. 14,15 modelée TiO2 thin films 16 ou 17 nanotubes de TiO 2 ont été utilisés pour améliorer la sensibilité de la détection d'une protéine cible en augmentant la zone de surface; Cependant, le procédé de fabrication est relativement complexe et nécessite un équipement coûteux. D'autre part, FNs électrofilées bénéficient d'une attention en raison de leur grande surface ainsi que processus simple et la fabrication à faible coût; 18,19 encore, la caractéristique fragile ou lâche du électrofilés TiO 2 mat NF rend difficile à manipuler et intégrer avec des dispositifs microfluidiques. 6,20 par conséquent, les TiO 2 tapis NF ont rarement été utilisés dans des applications bioanalytiques, en particulier celles qui nécessitent des conditions de lavage difficiles.
Dans cette étude, pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle technologie pour le transfert du électrofilés NF Tapis sur la surface d'un substrat cible en utilisant un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche adhésive. Furthermore, nous avons démontré avec succès l'intégration de électrofilée TiO2 NF mats sur un dispositif microfluidique centrifuge en polycarbonate (PC). En utilisant ce dispositif, une détection de haute sensibilité, entièrement automatisé et intégré de la protéine C-réactive (CRP), ainsi que la troponine I cardiaque (cTnI) a été réalisée dans les 30 minutes à partir de seulement 10 pi de sang total. 21 En raison de la combinaison avantages des propriétés de la FN et la plate-forme centrifuge, l'essai ont montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur de 1 pg / ml (~ 8 fM) à 100 ng / ml (~ 0,8 pM) avec une limite inférieure de détection de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) pour CRP et une gamme dynamique de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) à 100 ng / ml (~ 4 nM) avec une limite de détection de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) pour cTnI. Ces limites de détection sont ~ 300 et ~ 20 fois plus faible par rapport à leurs résultats ELISA classiques correspondants. Cette technique pourrait être appliquée à la détection de toutes les protéines cibles, avec des anticorps appropriés. Dans l'ensemble, cette coopération de l'appareilULD contribuent grandement au diagnostic in vitro et des essais biochimiques , car il peut détecter des quantités rares de protéines cibles avec une grande sensibilité même de très petites quantités d'échantillons biologiques, par exemple, 10 pl de sang total. Bien que nous ne démontré la détection des protéines sériques par ELISA dans cette étude, la technologie de transfert et l'intégration des électrofilés FNs avec des dispositifs microfluidiques pourrait être appliquée plus largement dans d'autres réactions biochimiques qui nécessitent une grande surface pour une sensibilité de détection élevée.
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Protocol
REMARQUE: On prélève du sang d'individus sains et a été recueilli dans un tube de collecte de sang. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les bénévoles.
1. Fabrication de TiO 2 Mat NF
- Préparation de la solution de précurseur 22
- Dissoudre 1,5 g de tétraisopropylate de titane (TTIP) dans un mélange d'éthanol (99,9%, 3 ml) et de l'acide acétique glacial (3 ml) et mélanger la solution à la température ambiante (25 ° C) pendant 30 min sur un agitateur magnétique.
- Dissoudre 11% en poids de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans 3,64 g d'éthanol (99,9%) et agiter la solution à 65 ° C pendant 1 heure en utilisant un agitateur magnétique à plaque chauffante.
- Combiner et mélanger les deux solutions à 65 ° C pendant 4 heures sur un agitateur magnétique à plaque chauffante.
- électrofilage
- Chargez la solution préparée dans une seringue reliée à une aiguille de 200 um Diame intérieure en acier inoxydableter. Verser la solution directement dans la seringue après le retrait du piston.
- Introduire la solution constamment à un débit de 0,3 ml / h pendant 10 min sur une tranche de silicium (2 cm x 2 cm) placées sur un substrat mis à la terre à une tension continue élevée (15 kV). Au cours de l'électrofilage, régler la distance entre l'aiguille et le substrat à la terre à 10 cm.
- Calcination du tapis NF
- Placer le tapis NF dans un four et à augmenter la température jusqu'à 500 ° C avec une vitesse de montée en puissance de 3 ° C / min dans des conditions de haut vide (5 x 10 -5 Torr).
- Maintenir la température à 500 ° C pendant 3 h. Refroidir la température des échantillons à la température ambiante (25 ° C) dans le four.
2. Intégration de TiO 2 Mat NF dans un centrifuge microfluidique Disc
- Fabrication d'un disque
- Utilisez le logiciel de conception 3D (par exemple, SolidWorks ou similaire) pour dépeindre les chambres, canaux ou soupapes de chaque couche de disque. Convertir les fichiers de conception à commande numérique par ordinateur (CNC) en utilisant le code de génération de code logiciel (par exemple, Edgecam ou similaire). Utilisez les logiciels selon le manuel d' instruction 23,24 Note:. Les dimensions typiques des canaux utilisés dans ce dispositif sont de 1,0 mm x 0,3 mm (largeur x profondeur).
- Ouvrez le logiciel d'exploitation de la machine de fraisage CNC (par ex., DeskCNC ou similaire) et charger le code CNC pour le logiciel d'exploitation et cliquez sur les éléments suivants dans l'ordre: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Sélectionnez le code CNC généré.
- Fixez la plaque de PC sur la machine de fraisage CNC: utiliser 1 plaques mm PC pour la couche supérieure et des plaques de PC de 5 mm pour la couche de disque. Exécutez la machine de fraisage CNC pour couper chaque couche du disque en cliquant sur le bouton "START".
- Transfert de TiO 2 mat NF sur le disque
- Placer un substrat de silicium et une petite boîte de Pétri contenant 40 ul de (tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl) -1-trichlorosilane dans une chambre à vide sous vide pendant 30 min. Fluorosilane se vaporise et enduit sur le substrat.
- Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) de pré-polymère avec un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 et dégazer dans une chambre à vide. Spin-coat les PDMS sur un substrat de silicium à 650 rpm pendant 60 secondes.
- Durcir les PDMS revêtus sur un substrat de silicium dans un four à 65 ° C pendant 10 minutes pour atteindre un état adhérent.
NOTE: Le durcissement du temps peut varier en fonction des conditions environnementales, et la force d'adhérence peut être testée par un test d'adhérence à l'aide d'un rhéomètre. - Transférez le tapis TiO 2 NF préparé par électrofilage et calcination sur le silicium PDMS revêtu en utilisant une pince à épiler. Ensuite, appliquer manuellement une pression conformationnelle sur le TiO 2 mat NF transféré avec un objet plat (par exemple., Lame de verre) et retirer l'objet. Mettrecet échantillon dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour faire durcir la couche de PDMS complètement.
- Manteau de liaison des chambres de réaction dans le disque avec 20 ul du / de mélange de l' agent de durcissement PDMS (10: 1), qui agit comme une couche adhésive pour fixer le TiO 2 mat NF sur le disque.
- Distribuer 50 pi d'éthanol (99,9%) sur le tapis TiO 2 NF sur la couche PDMS, couper le tapis NF avec un trou de perforation de 6 mm de diamètre, et transférer la coupe TiO 2 mat NF aux chambres de réaction de liaison revêtues de 20 pl du PDMS à l'étape précédente.
NOTE: Dans cette étape, l' éthanol sera utile pour détacher la coupe TiO 2 mat NF du substrat Si. - Incuber le TiO 2 mat NF disque intégré dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour guérir les PDMS complètement.
- La modification de surface du tapis de TiO 2 sur le disque NF
- PRepare solution à 1% v / v de (3-glycidoxypropyl) silane méthyldiéthoxy (GPDES) dans l'éthanol (99,9%).
- Traiter le disque intégré TiO 2 mat NF avec un plasma d'oxygène à 140 W, débit d'oxygène de 50 sccm pendant 180 sec. Distribuer 100 pl de solution GPDES sur chaque tapis de nanofibres et laisser incuber à la température ambiante (25 ° C) pendant 2 heures.
- Laver les substrats brièvement en distribuant de l'éthanol (99,9%) en utilisant une bouteille de lavage, puis retirer l'éthanol complètement en inversant le disque et il buvard contre un propre lingette. Cure à 80 ° C pendant 1 heure. Laver deux fois avec de l'éthanol (99,9%) de la même manière que celle indiquée ci-dessus, pour éliminer les physiquement adsorbées et non liée GPDES molécules.
- Séchez avec un courant d'azote sec sous vide.
REMARQUE: Le disque peut être stocké dans un récipient fermé à la température ambiante (25 ° C) jusqu'à utilisation.
- Immobilisation d'anticorps sur la surface
- Préparer une solution de 200 ug / ml d'anticorps de capture (anticorps monoclonal de souris anti-hsCRP humain ou de souris monoclonal anti-cTnI) en diluant les anticorps avec un tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4). Distribuer 5 ul de la solution sur chaque tapis NF dans un disque à l'aide d'une micropipette. Voir la liste des matériaux pour plus d'informations sur les anticorps.
- Maintenir les disques dans une chambre humidifiée et incuber à 37 ° C pendant 4 heures. Laver les anticorps revêtus mat NF avec un tampon BSA-PBS 0,1%. Remplir la chambre avec 100 pi de tampon de lavage à l'aide d'une micropipette, retirez le tampon par aspiration ou par décantation. Enfin, inverser le disque et épongez contre un nettoyage lingette, puis assembler le disque.
- Ensemble de disque
- Dessinez la conception du disque sur un ruban adhésif double face en utilisant un programme de CAO (par exemple, AutoCAD ou similaire). Chargez le dessin CAO au traceur de découpe.
- Couper le ruban adhésif double face en utilisant le traceur de découpe. Décoller une couche de protection de ruban adhésif double et fixer it au-dessus de la couche de disque. Décoller l'autre couche de protection et fixer la couche supérieure sur la couche du disque.
- Chargez le disque préalablement assemblé dans la machine de pressage et d'aligner précisément les couches supérieure / adhésives / disque à l'aide des marques d'alignement dans chaque couche pour connecter chaque vanne, le canal, et les chambres. Appliquer une pression conformationnelle en utilisant la machine de pressage.
3. Immunoassay
- Remplir les chambres avec du tampon BSA-PBS à 1% en utilisant une micro-pipette et laisser incuber le disque à 37 ° C pendant 1 heure. Retirer le tampon par aspiration à l'aide d'une micropipette. Effectuez cette étape pour bloquer les sites ayant pas réagi et de réduire l'adsorption non-spécifique de la protéine dans un disque.
- Laver deux fois avec 0,1% de BSA-PBS et en remplissant les chambres d'aspiration en utilisant une micropipette.
Remarque: À ce stade, le disque peut être stocké à 4 ° C jusqu'à utilisation. - Charge 10 pi de sang total de l'antigène enrichi ou sans sérum CRP-pour la détection de la CRP sur le disque en utilisant un micropipette. Pour effectuer les graphiques d'étalonnage, en utilisant des concentrations de CRP de 1 pg / ml à 100 ng / ml; et cTnI de 10 pg / ml à 100 ng / ml.
NOTE: En raison des niveaux plus élevés de CRP dans le sang total, qui est habituellement dans la gamme uM, sans sérum CRP a été utilisée pour démontrer la faible limite de détection de l'appareil. - Faire tourner le disque à 3 600 tours par minute (391 x g) pendant 60 secondes pour séparer les globules rouges.
- vanne ouverte n ° 1 par une irradiation laser, et un transfert de 4 pi du surnageant de plasma dans la chambre contenant 8 pi de détection d'anticorps conjugués à la HRP en faisant tourner le disque à 2400 tours par minute pendant 3 secondes.
NOTE:. Les processus généraux d'actionnement de la vanne et la visualisation de fonctionnement du disque sont décrits en détail dans un précédent rapport 21 - Appliquer un mode de mélange (1, 15 ° de la 15 s Hz) pendant 5 secondes pour la liaison des anticorps de la protéine et de détection.
- Ouvrez la vanne n ° 2, et transférer le mélange préparé à l'étape 6 à la chambre de réaction de liaison (2400 rpm, 3 sec). Ensuite, appliquer un mode de mélange (1, 2 ° C de 60 Hz) pendant 20 minutes pour réaliser une réaction immunologique entre le mélange et les anticorps se liant sur le TiO2 FNs. Après la réaction, la vanne ouverte n ° 3 et transférer le mélange résiduel dans la chambre de déchets (2400 rpm, 10 secondes).
- Transférer le tampon de lavage (600 pi) à la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 4 et faire tourner le disque (2400 tpm, 4 secondes). Ensuite , appliquez un mode de mélange (-1, 30 ° de la de 30 Hz) pendant 120 secondes pour se laver les TiO 2 FNs dans la chambre.
- Laver les TiO 2 FNs deux fois en suivant même état de l' étape 3.8, et retirer le tampon de lavage résiduel complètement en faisant tourner le disque à 2400 rpm pendant 20 sec. Ensuite, fermez le robinet # 5.
- Pour la réaction de chimiluminescence, appliquer un mode de mélange (1, 2 ° C de 30 Hz) pendant 1 min après le transfert de la solution de substrat chimioluminescent dans la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 6 et le filagele disque à 2400 rpm pendant 10 secondes par la suite.
- Transférer la solution de substrat ayant réagi à la chambre de détection en ouvrant la vanne 7 et faire tourner le disque à 2400 tpm pendant 10 secondes.
- Mesurer les signaux de chimioluminescence de la solution de substrat ayant réagi en utilisant un tube photomultiplicateur (PMT), le module de système de détection équipé.
NOTE: Le système de détection est une machine construite sur mesure en utilisant les éléments suivants: moteur pas à pas, les composants mécaniques, les stades de la traduction, et disponible dans le commerce PMT. Les parties optomécaniques et moteur pas à pas sont assemblés pour maintenir le dispositif, et le moteur peut tourner le disque. La détection est réalisée par VPM fixe sur les pièces mécaniques, et il est situé au-dessus des chambres de détection du dispositif. En manipulant le moteur pas à pas, les chambres de détection sont alignés à droite en dessous de la zone de détection du TRE.
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Representative Results
En utilisant ce protocole, un dispositif microfluidique centrifuge entièrement automatisé pour la détection des protéines du sang entier avec une sensibilité élevée a été préparé. Les TiO 2 tapis NF ont été préparés par des procédés de électrofilage et calcination. Afin de fabriquer le FNs de diamètre désiré, la morphologie et l'épaisseur, des conditions telles que le débit, la tension et le temps filer électrofilage ont été optimisés. Lorsque les conditions ne sont pas optimisés, la qualité des FNs formés était pauvre. En particulier, les FN sont filées à partir de la solution de polymère à basse tension (5 kV) et ont été rompus lorsque la tension est élevée (> 20 kV). De même, le temps de filage était critique pour la fabrication de FNs avec une densité appropriée, pas trop clairsemée (1 min) ou trop dense (30 min). En outre, pour éviter la formation de billes provoquée par des débits importants, le débit a été manipulé. Ainsi, une tension appliquée de 15 kV, 10 min électrofilage et un taux de 0,3 ml h de débit
TiO2 mat NF a été transféré avec succès sur le substrat cible en utilisant une couche d'adhésif PDMS, qui a été préparé par PDMS spin-coating sur un substrat de silicium silanisé et de pré-cuisson dans un four à 65 ° C. Le temps de pré-durcissement de la couche de PDMS a été optimisé en contrôlant la force d'adhérence, à l' aide d' un test d'adhérence (figure 2A). La figure 2B montre l'effet du temps de durcissement sur la fixation de nanofibres. Si le PDMS a été chauffé pendant 3 minutes, il n'y a pas de force d'adhérence en tant que PDMS était encore non durci et reste sous forme liquide et le FN a obtenu noyée dans la couche PDMS. Quand il est chauffé pendant 30 min, la force d'adhérence est très faible que le PDMS devient rigide et perd sa propriété collante et les FN ont pas été fixé sur elle. Quand on chauffe le PDMS for 10 min, le PDMS a montré la force d'adhérence forte et les FN étaient attachés fortement. D'après les résultats, il est conclu que le moment optimal pour PDMS de pré-durcissement pour une fixation solide est de 10 min.
Après le montage du disque, le test immunologique a été réalisée sur le TiO 2 NF disque intégré mat en suivant une série de processus de fonctionnement du disque , comme indiqué dans le Tableau 1. Pour la détermination des concentrations de CRP et de cTnI dans des échantillons inconnus, les graphiques d'étalonnage pour chacun ont été faites en traçant les unités relatives de lumière (RLU) par rapport à la CRP ou de la concentration cTnI (figure 3). Sur la figure 3A et 3B, les résultats sur le disque essai ont été comparés avec ELISA classique sur une plaque à 96 puits pour la CRP et cTnI , respectivement. Les essais ont montré une large gamme dynamique linéaire avec une limite de détection de 0,8 pg / ml (~ 6 FM) pour CRP et 37 pg / ml (1,5 pM) pour cTnI sur un disque, quiest environ 300 fois plus élevé pour les CRP et 20 fois plus élevé pour cTnI par rapport à leurs résultats respectifs classiques ELISA (286 pg / ml, 2,3 pM pour CRP, 824 pg / ml, 32 pM pour cTnI).
Figure 1. Optimisation des conditions de électrofilage. Images MEB à chaque condition montrent la morphologie des FN formés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Test de Tack de la couche adhésive PDMS et images MEB du TiO 2 mat NF transférés. (A) la force d'adhérence de l'adhésifCouche PDMS, pré-durcie pendant plusieurs longueurs de temps, (B) images MEB de nanofibres attachés sur PDMS durcis pendant des durées différentes. Ce chiffre a été modifié depuis Ref. 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. graphiques d'étalonnage pour la détection de la CRP et cTnI utilisant lab-on-a-disque et plaque de 96 puits. La détection des CRP dopés dans le sérum libre CRP (A) et cTnI dopés dans le sang total (B) ont été réalisées. Les barres d'erreur indiquent l'écart-type d'au moins trois mesures indépendantes. La limite de détection (LDD) a été calculée par 3 fois l'écart type des données de contrôle négatif mesuré avec du sérum dépourvu de CRP ou de sang entier sans dopage pour la cTnICRP et cTnI, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Spin No. | Vitesse (rpm) | Valve No. | Temps (s) | Opération | |||
| 1 | 3.600 | 60 | la séparation du sang | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | vanne ouverte pour transférer le plasma dans la chambre contenant de 8 pi de détection d'anticorps conjugué à HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | plasma et la détection d'anticorps mélanger | ||||
| 4 </ Td> | 2400 | 2 | 3 | vanne ouverte pour transférer le mélange dans la chambre de réaction de liaison | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1200 | mélanger des anticorps de capture sur le mélange de mat TiO 2 NF et des anticorps plasmatiques de détection | ||||
| 6 | 2400 | 3 | dix | vanne ouverte pour enlever le mélange | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | vanne ouverte pour transférer le tampon de lavage | |||
| 8 | 30 Hz, 30 °, | 120 | mélanger le tampon de lavage et laver mat TiO 2 NF | ||||
| 9 | 2400 | 4 | un tampon de lavage de transfert | ||||
| dix | 30 Hz, 30 °, | 120 | 2 mat NF | ||||
| 11 | 2400 | 4 | un tampon de lavage de transfert | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 °, | 120 | mélanger le tampon de lavage et laver mat TiO 2 NF | ||||
| 13 | 2400 | 4 | un tampon de lavage de transfert | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 °, | 120 | mélanger le tampon de lavage et laver mat TiO 2 NF | ||||
| 15 | 2400 | 20 | retirer le tampon de lavage restant | ||||
| 16 | 5 | fermer le robinet | |||||
| 17 | 2400 | 6 | dix | ouverte valve et transférer le substrat chimioluminescent | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | substrat et les immunoréactifs sur le tapis TiO 2 NF mix | ||||
| 19 | 2400 | 7 | dix | ouvrir la soupape et à transférer le substrat ayant réagi dans la chambre de détection | |||
| Temps total | ~ 30 min | ||||||
Tableau 1. Programme d'utilisation pour le dosage immunologique dans un disque. Ce tableau a été modifié depuis Ref. 21.
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Discussion
Le dosage de TiO 2 NF disque intégré est une technique rapide, économique et pratique pour la détection ultrasensible de faible abondance des protéines présentes dans un volume très faible de sang. Cette technique présente l'avantage d'utiliser des volumes d'échantillons de petite taille (10 pi) et se prête à l'analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cela fournit un grand potentiel en tant que dispositif de multiplexage de dosage immunologique. Le dispositif a l'avantage qu'il ne nécessite pas d'étapes de prétraitement échantillons comme la séparation du plasma, qui sont nécessaires dans les tests ELISA classiques. En outre, le dispositif peut effectuer des procédures de dosage immunologique entiers (par exemple, le mélange, le lavage, la reliure , etc.) automatiquement en raison de chambres pré-conçus, des canaux et des vannes. En outre, en utilisant des procédés de fabrication de disques commercialisés (par exemple, le moulage par injection, UV / ultrasons / de liaison thermique) au lieu de fraisage et un assemblage manuel à l' aide d' adhésifs, toute la procédure de fabrication du dispositif d'analyse peut êtreautomatisé.
En outre, la méthode d'impression par transfert présentée ici montre un transfert simple et facile de électrofilés NF du donneur au substrat cible en utilisant une couche adhésive PDMS mince. En général, les TiO 2 FNs obtenus après le processus de calcination sont fragiles et facilement décoller du substrat à la terre en raison de la faible adhérence. 25 En raison de sa fragilité caractéristique, l' intégration des TiO 2 tapis NF avec d' autres appareils est difficile. Pour résoudre ce problème, de nombreux procédés ont été rapportés. Par exemple, par pressage à chaud 26 et solvant-vapeur 27 techniques ont montré l'amélioration de l'adhérence entre TiO 2 mat FNs et la surface cible avant que le processus de calcination. Même si ces procédés ont augmenté l'adhérence, TiO 2 tapis NF ne sont pas intacts en raison de la pression mécanique élevée ou le solvant appliqué pendant les techniques respectives. En outre, en raison de l'étape de calcination, l' intégration du TiO 2 </ Sub> tapis NF utilisant ces méthodes peut être appliquée que pour les surfaces cibles limitées.
Au meilleur de notre connaissance, ceci est la première technique pour montrer l'impression par transfert de tapis NF sur un dispositif constitué de thermoplastiques, en conservant les propriétés nouvelles de FNs même après le transfert. Pour de meilleures performances de l'appareil, la fabrication de haute qualité FNs et l'optimisation des conditions de pré-durcissement sont souhaitées. Comme il est mentionné dans le protocole, le temps nécessaire pour le pré-durcissement peut varier en fonction des conditions environnementales; Par conséquent, les conditions de pré-durcissement doivent être optimisées en mesurant la force d'adhérence à l'aide d'un essai non collant.
En outre, le protocole présenté ici, fournit des guides habiles pour le processus ELISA entièrement automatisé sur un disque. Le protocole introduit non seulement la fabrication du disque, mais aussi l'automatisation de tous les processus requis pour ELISA, y compris la séparation du sang total, le dosage, le mélange, le lavage et la détection.Chaque étape est optimisée avec la vitesse de rotation, la fréquence de mélange, et la durée de l'opération. Sur la base de ce guide d'utilisation, les réactifs chargés sur un disque peuvent être transférées en utilisant un seul moteur. Puisque le dispositif effectue une excellente sensibilité de détection à très faible volume de sang, il offre un grand potentiel pour des applications de diagnostic par le dépistage des biomarqueurs à un stade précoce de la maladie. Le dispositif pourrait être activé pour détecter les marqueurs biologiques en fonction de la disponibilité des anticorps spécifiques.
Bien que le dispositif avec des tapis TiO 2 NF obtenus hautement améliorée sensibilité en raison de la grande surface du tapis, l' un des défis restants de cette technique pourrait être dans la production de masse de tapis NF uniformes. Étant donné que la sensibilité du test ELISA est fortement affectée par la surface du matelas de nanofibres, il est essentiel d'assurer non seulement une grande surface spécifique, mais aussi une surface reproductible et uniforme dans les différents lots de production de masse. En conclusion, nous avons montré une méthode simple d'intégrer un tapis NF fragile dans un dispositif fonctionnel pour la détection de la protéine ultrasensible. Les avantages de cette méthode sont les suivantes: 1) préalablement électrofilage de TiO 2 FNs peuvent être préparés uniquement sur des surfaces conductrices et thermiquement stables; Ici, nous avons montré qu'ils peuvent être transférés sur un substrat quelconque, y compris des matériaux non conducteurs et plastiques; 2) les tapis TiO 2 NF peuvent résister à la pression et rester stable au cours des étapes de lavage en raison de la force d'adhérence élevée de la couche PDMS; 3) elle fournit une zone de surface relativement plus élevée pour les essais biologiques; et 4) les anticorps peuvent être fixés de façon covalente TiO2 FNs en raison des propriétés de surface intactes sur FNs. Cette technique a un grand potentiel pour être utilisé pour l'intégration des matériaux nanofibrous dans des dispositifs pour diverses applications.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Research Foundation de Corée (NRF) subventions (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), une subvention de la Korean Health Technology R & D Project, Ministère de la Santé et Bien-être (A121994) et IBS-R020-D1 financé par le gouvernement coréen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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