Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

Published: April 16, 2016 doi: 10.3791/54143

Introduction

מספר פלטפורמות לאבחון המחלה פותחו על בסיס חומרים ננומטריים 1,2 כגון ננו-חוטים, 3 חלקיקים, 4 צינורות, 5 ו nanofibers (NFS) 6-8. ננו אלה מציעים סיכויים מצוינים בעיצוב של טכנולוגיות חדשות עבור bioassays רגיש מאוד בשל המאפיינים physicochemical הייחודיים שלהם. לדוגמא, nanofibers תחמוצת אבץ mesoporous שמש לצורך זיהוי פמטו-הטוחנת הרגיש של סמנים לסרטן השד. 9 לאחרונה, ננו מבוסס על תחמוצת טיטניום (Tio 2) נחקר עבור יישומי bioanalytical 10 בהתחשב היציבות הכימית שלהם, 11 denaturation חלבון זניח , 12 ו biocompatibility. 13 בנוסף, קבוצות הידרוקסיל על פני השטח של Tio 2 להקל שינוי כימי ואת הקובץ המצורף קוולנטי של מולקולות ביולוגיות. 14,15 2 Patterned TIO תיn סרטים 16 או Tio 2 צינורות 17 כבר נוצלו כדי לשפר את רגישות הזיהוי של חלבון המטרה על ידי הגדלת שטח הפנים; עם זאת, תהליך הייצור הוא מורכב למדי ודורש ציוד יקר. מצד השני, NFS electrospun מקבל תשומת לב בגלל שטח הפנים הגבוה שלהם, כמו גם תהליך ייצור פשוט בעלות נמוך; 18,19 עדיין, המאפיין השביר או רופף של מזרן NF electrospun Tio 2 המקשה לטפל לשלב עם מכשירי microfluidic. 6,20 לכן, מחצלות Tio 2 NF נוצלו לעתים רחוקות ביישומי bioanalytical, במיוחד אלה הדורשים תנאי כביסה קשים.

במחקר זה, כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו טכנולוגיה חדשה להעברת electrospun NF מחצלות על פני השטח של כל המצע היעד על ידי ניצול שכבת דבק דקה polydimethylsiloxane (PDMS). Furthermore, יש לנו בהצלחה הראה שילוב של טיו electrospun 2 NF מחצלות על גבי מכשיר microfluidic צנטריפוגלי פוליקרבונט (PC). שימוש במכשיר זה, זיהוי גבוה רגיש, אוטומטי לחלוטין, ומשולב של C-reactive protein (CRP) כמו גם טרופונין הלבבי אני (cTnI) הושג תוך 30 דקות מן רק 10 μL של דם מלא. 21 בשל בשילוב יתרונות של המאפיינים של NFS ואת פלטפורמת צנטריפוגלי, assay הציג טווח דינמי רחב של שישה סדרי הגודל מ 1 pg / ml (~ 8 FM) עד 100 ng / ml (~ 0.8 pM) עם גבול תחתון של זיהוי של 0.8 pg / ml (~ 6 FM) עבור CRP ומגוון דינמי מ -10 pg / ml (~ 0.4 pM) עד 100 ng / ml (~ 4 ננומטר) עם גבול הגילוי של 37 pg / ml (~ 1.5 pM) עבור cTnI. מגבלות זיהוי אלה ~ 300 ו ~ 20-לקפל תחתון בהשוואה לתוצאות ELISA הקונבנציונליות המתאימות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של כל חלבוני יעד, עם נוגדנים מתאימים. בסך הכל, שיתוף המכשיר הזהULD לתרום רבות חוץ גופית אבחון מבחני ביוכימיים כי הוא מסוגל לגלות כמויות נדירות של חלבונים היעד ברגישות רבה גם מכמויות קטנות מאוד של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, 10 μl של דם מלא. למרות שאנחנו רק הוכחנו את זיהוי סרום חלבון באמצעות ELISA במחקר זה, טכנולוגית ההעברה והאינטגרציה של electrospun NFS עם מכשירי microfluidic יכולה להיות מיושמת באופן נרחב יותר בתגובות ביוכימיות אחרות הדורשים שטח פנים גדול עבור רגישות זיהוי גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: דם נמשך מיחידים בריאים נאסף צינור איסוף דם. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המתנדבים.

ייצור 1. של 2 Tio NF Mat

  1. הכנת מבשר פתרון 22
    1. ממיסים 1.5 גרם של טיטניום tetraisopropoxide (TTIP) בתערובת של אתנול (99.9%, 3 מ"ל) וחומצה אצטית קרחונית (3 מ"ל) ומערבבים את הפתרון ב RT (25 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות על stirrer מגנטי.
    2. ממיסים 11% WT של פוליוויניל pyrrolidone (PVP) ב 3.64 גרם של אתנול (99.9%) ומערבבים הפתרון על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באמצעות בוחש מגנטי חם צלחת.
    3. מערבבים ומערבבים שני הפתרונות על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות על בוחש מגנטי חם צלחת.
  2. electrospinning
    1. טענתי את הפתרון המוכן לתוך מזרק מחובר מחט נירוסטה של ​​200 מיקרומטר diame הפנימיter. יוצקים את הפתרון ישירות לתוך המזרק לאחר הסרת הבוכנה.
    2. הציגו את פתרון כל הזמן בקצב זרימה של 0.3 מ"ל / שעה למשך 10 דקות על גבי פרוסות Si (2 ס"מ X 2 ס"מ) שהונחו על מצע מוארק במתח גבוה DC (15 ק). במהלך electrospinning, לקבוע את המרחק בין המחט ואת המצע מקורקע עד 10 ס"מ.
  3. Calcination של המזרן NF
    1. מניחים את מחצלת NF בכבשן ולהגדיל את הטמפרטורה ל 500 מעלות צלזיוס עם שיעור ramping של 3 מעלות צלזיוס / min בתנאי ואקום גבוה (5 x 10 -5 גוה).
    2. לשמור על טמפרטורה של 500 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לקרר את הטמפרטורה של דגימות RT (25 מעלות צלזיוס) בכבשן.

2. שילוב של Tio 2 NF Mat לתוך דיסק Microfluidic צנטריפוגלי

  1. המצאה של דיסק
    1. השתמש בתוכנת עיצוב 3D (למשל, סולidWorks או דומה) לתאר תאים, ערוצים, או שסתומים של כל שכבה של דיסק. המר קבצי תכנון ועד שליטה מספרית מחשב (CNC) קוד באמצעות תוכנת יצירת קוד (למשל, Edgecam או דומה). השתמש תוכנות בהתאם להוראות במדריך 23,24 הערה:. ממדי הערוץ האופייניים בשימוש במכשיר זה הם 1.0 מ"מ x 0.3 מ"מ (עומק x רוחב).
    2. פתח את תוכנת ההפעלה של מכונת כרסום CNC (למשל., DeskCNC או דומה) ולטעון קוד CNC לתוכנת ההפעלה ולחץ על הבא כדי: "AUTO" -> "OPEN G CODE" -> בחר את קוד CNC שנוצר.
    3. צרף הצלחת PC על מכונת כרסום CNC: להשתמש 1 צלחות PC מ"מ עבור השכבה העליונה וצלחות PC 5 מ"מ עבור שכבת דיסק. הפעל את מכונת כרסום CNC לחתוך כל שכבה של הדיסק על ידי לחיצה על כפתור "התחל".
  2. העברת מחצלת Tio 2 NF על גבי דיסק
    1. מניחים מצע סיליקון בצלחת פטרי קטן המכיל 40 μL של (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorosilane בתא ואקום תחת ואקום במשך 30 דקות. Fluorosilane מאדה ומקבלת מצופה על פני המצע.
    2. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מראש פולימר עם סוכן ריפוי בתוך 10: יחס 1 דגה בתא ואקום. ספין מעיל PDMS על מצע סיליקון ב 650 סל"ד במשך 60 שניות.
    3. לרפא את PDMS מצופה על מצע סיליקון בתנור על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשיג מדינה חסידה.
      הערה: זמן אשפרה יכול להיות מגוון בהתאם לתנאי סביבה, וכוח ההדבקה ניתן לבדוק על ידי בדיקת כיוון באמצעות rheometer.
    4. מעבירים את מחצלת Tio 2 NF שהכין electrospinning ו calcination על סיליקון PDMS מצופה באמצעות פינצטה. ואז, באופן ידני להחיל לחץ קונפורמי על מזרן Tio 2 NF הועבר באמצעות חפץ שטוח (למשל., שקופיות זכוכית) להסיר את האובייקט. לָשִׂיםמדגם זה בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לרפא שכבת PDMS לחלוטין.
    5. תאי התגובה מחייב המעיל את הדיסק עם 20 μl תערובת סוכן PDMS / ריפוי (10: 1), אשר משמש שכבת דבק לצרף מחצלת NF Tio 2 על גבי דיסק.
    6. לוותר 50 μl של אתנול (99.9%) על המזרן NF Tio 2 על שכבת PDMS, לחתוך את מחצלת NF עם חור אגרוף של קוטר 6 מ"מ, ולהעביר את החתך Tio 2 מחצלת NF אל תאי התגובה מחייב מצופה 20 μl של PDMS בשלב הקודם.
      הערה: בשלב זה, אתנול יהיה מועיל לנתק את החתך Tio 2 NF מחצלת מהמצע Si.
    7. דגירה דיסק משולב מחצלת Tio 2 NF בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לרפא את PDMS לחלוטין.
  3. שינוי פני שטח של מזרן NF Tio 2 על הדיסק
    1. Prepare 1% v / v פתרון של (3-glycidoxypropyl) silane methyldiethoxy (GPDES) באתנול (99.9%).
    2. פנק את הדיסק משולב מחצלת Tio 2 NF עם פלזמת חמצן ב 140 W, 50 זרימת חמצן SCCM עבור 180 שניות. לוותר 100 μl של פתרון GPDES על כל מחצלת nanofiber דגירה ב RT (25 מעלות צלזיוס) במשך שעה 2.
    3. שטפו את בקצרה מצעים ידי מחלק אתנול (99.9%) באמצעות בקבוק לשטוף, ואז להסיר את אתנול לחלוטין על ידי היפוך הדיסק סופג אותו כנגד נקו. Cure על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. פעמים לשטוף עם אתנול (99.9%), באותו אופן כאמור לעיל, כדי להסיר את מולקולות GPDES adsorbed ו מאוגדות הפיסיים.
    4. מכה יבשה עם זרם חנקן, יבש תחת ואקום.
      הערה: דיסק ניתן לאחסן במיכל אטום ב RT (25 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.
  4. קיבוע של נוגדנים על פני השטח
    1. בצע פתרון של 200 מיקרוגרם / מיליליטר של נוגדנים לכידים (אנטי עכבר חד שבטיhsCRP אדם או עכבר חד שבטי-cTnI אנטי) על ידי דילול הנוגדנים עם בופר פוספט (PBS) חיץ (pH 7.4). לוותר 5 μl של הפתרון על כל מחצלת NF ב דיסק באמצעות micropipette. ראה רשימת חומרים לקבלת מידע נוסף על הנוגדנים.
    2. שמור על דיסקים בתא humidified לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. שטפו את הנוגדנים מצופה מחצלת NF עם חיץ 0.1% BSA-PBS. ממלאים את החדר עם 100 μl של חיץ לשטוף באמצעות micropipette, להסיר את החיץ ידי aspirating או decanting. לבסוף, להפוך את הדיסק למחוק את זה נגד נקי לנגב, ולאחר מכן להרכיב את הדיסק.
  5. הרכבת דיסק
    1. צייר את העיצוב של הדיסק על נייר דבק דו-לוואי באמצעות תוכנית CAD (למשל, AutoCAD או דומה). טען את עיצוב CAD אל תואי חיתוך.
    2. חותכים את נייר דבק דו-לוואי באמצעות פלוטר חיתוך. לקלף שכבת מגן אחד של נייר דבק כפול ולצרף it על גבי שכבת דיסק. לקלף את שכבת מגן האחרת ולצרף את השכבה העליונה על שכבת הדיסק.
    3. טען את הדיסק התאסף מקדמים במכונת הלחיצה בדיוק ליישר שכבות עליונות / דבק / דיסק באמצעות סימני align בכל שכבה לחיבור כל שסתום, ערוץ, ותאי. החל לחץ קונפורמי באמצעות מכונת הגיהוץ.

3. Immunoassay

  1. מלא את התאים עם 1% חיץ BSA-PBS באמצעות micropipette דגירת הדיסק ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את החוצץ על ידי שאיפה באמצעות micropipette. בצע פעולה זו כדי לחסום את האתרים בלתי הגיב להפחית ספיחה הלא ספציפית של חלבון דיסק.
  2. שטפו פעמיים עם 0.1% BSA-PBS על ידי מילוי aspirating לתאי באמצעות micropipette.
    הערה: בשלב זה את הדיסק יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. טען 10 μl של דם מלא-ממוסמר אנטיגן או סרום ללא CRP לגילוי CRP על דיסק באמצעות micropipettדואר. להכנת גרפי הכיול, השתמשו ריכוזי CRP מ 1 pg / ml 100 ng / ml; ו cTnI מ -10 pg / ml 100 ng / ml.
    הערה: בשל הרמות הגבוהות של CRP בדם כולו, שהיא בדרך כלל בטווח מיקרומטר, CRP בסרום ללא שמש כדי להדגים את גבול הגילוי הנמוך של המכשיר.
  4. מסובבים את הדיסק ב -3,600 סל"ד (391 XG) במשך 60 שניות כדי להפריד את תאי הדם האדומים.
  5. שסתום להרחיב # 1 על ידי הקרנה לייזר, והעברת 4 μl של הפלזמה supernatant לתא המכיל 8 μl של גילוי נוגדנים מצומדות עם HRP על ידי ספינינג דיסק ב- 2400 סל"ד במשך 3 שניות.
    הערה:. התהליכים הכלליים עבור השסתום actuation וויזואליזציה של מבצע דיסק מתוארים בפירוט בדו"ח קודם 21
  6. החלת מצב ערבוב (15 הרץ s -1, 15 °) במשך 5 שניות לכריכה של נוגדנים לחלבון וזיהוי.
  7. # 2 שסתום פתוח, ולהעביר את התערובת מוכנה בשלב 6 לתא התגובה המחייב (סל"ד 2,400, 3 שניות). לאחר מכן, החל מצב ערבוב (60 רץ s -1, 2 מעלות) במשך 20 דקות כדי להשיג immunoreaction בין התערובת לבין הנוגדנים מחייבים על NFS 2 Tio. לאחר התגובה, # שסתום פתוח 3 ולהעביר את התערובת שיורית לתא פסולת (2,400 סל"ד, 10 שניות).
  8. מעבירים את חיץ כביסה (600 μl) לתא התגובה מחייב ידי פתיחת שסתום # 4 ויסובב את הדיסק (2,400 סל"ד, 4 שניות). ואז להחיל מצב ערבוב (30 הרץ s -1, 30 °) עבור 120 שניות לשטוף את Tio 2 NFS בתא.
  9. שטפו את 2 Tio NFS עוד פעמיים על ידי ביצוע אותו מצב של שלב 3.8, ולהסיר את חיץ כביסה שיורית על ידי ספינינג דיסק לחלוטין ב- 2400 סל"ד במשך 20 שניות. לאחר מכן, סגור את שסתום # 5.
  10. עבור התגובה chemiluminescent, להחיל מצב ערבוב (30 הרץ s -1, 2 °) 1 דקות לאחר העברת הפתרון המצע chemiluminescent לתא התגובה מחייב ידי פתיחת שסתום # 6 וספינינגהדיסק ב- 2400 סל"ד במשך 10 שניות לאחר מכן.
  11. מעביר את פתרון המצע הגיב לתאי זיהוי על ידי פתיחת שסתום # 7 ותסובבו את הדיסק ב- 2400 סל"ד במשך 10 שניות.
  12. מדוד אותות chemiluminescence מפתרון המצע הגיבו באמצעות צינור מכפיל (PMT) מודול מערכת איתור מאובזר.
    הערה: מערכת זיהוי הוא מכונה שהותקן באמצעות החלקים הבאים: צעד מנוע, רכיבים ומכאניים, בשלבי תרגום, זמינה מסחרי PMT. החלקים והמכאניים ומוטורי צעד מורכבים להחזיק את המכשיר, ואת המנוע יכול לסובב את הדיסק. הגילוי מתבצע על ידי PMT נעוצות חלקים ומכניים, והיא ממוקמת מעל תאי זיהוי של המכשיר. על ידי מניפולציה של מנוע צעד, לתאי זיהוי מיושרים ממש מתחת לאזור זיהוי של PMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש בפרוטוקול זה, מכשיר microfluidic צנטריפוגלי אוטומטי לחלוטין לגילוי חלבון מן הדם כולו עם רגישות גבוהה הוכנה. מחצלות Tio 2 NF הוכנו על ידי תהליכים של electrospinning ו calcination. כדי לפברק את NFS של בקוטר הרצוי, מורפולוגיה, ועובי, electrospinning תנאים כגון קצב הזרימה, מתח, וספינינג זמן היו אופטימיזציה. כאשר התנאים לא היו אופטימיזציה, איכות NFS יצר הייתה עניה. בפרט, NFS לא היו סובב את מפתרון פולימר במתח נמוך (5 kV), ו נשברו כאשר המתח היה גבוה (> 20 ק). באופן דומה, הפעם ספינינג היה קריטי עבור ייצור של NFS עם צפיפות המתאים, לא דלילה מדי (1 דקות) או צפוף מדי (30 דק '). כמו כן, כדי להימנע חרוז תצורה כתוצאת ספיקה גבוהה, קצב זרימת מניפולציות. אז, מתח מיושם של 15 קילו וולט, 10 דק 'זמן electrospinning ו בקצב זרימה של 0.3 מ"ל hr (איור 1).

מחצלת Tio 2 NF הועברה בהצלחה על גבי מצע היעד באמצעות שכבת PDMS דבקה, אשר הוכנה על ידי PDMS-ציפוי ספין על מצע סיליקון silanized מראש לרפא אותו בתנור על 65 מעלות צלזיוס. השעה עבור טרום לרפא את שכבת PDMS היה מותאם על ידי בדיקת כוח הידבקות, באמצעות מבחן טקטיקה (איור 2 א). איור 2B מראה את ההשפעה של ריפוי הזמן בדבר עיקול nanofiber. אם PDMS חומם במשך 3 דקות, אין כוח הידבקות כמו PDMS היה עדיין דפוקה ונשאר כנוזל ואת NFS יש מוטבע לתוך שכבת PDMS. כאשר הוא מחומם למשך 30 דקות, הכח הדבק חלש מאוד כמו PDMS הופך נוקשה ומאבד הרכוש הדביק שלה ואת NFS לא צורף על זה. כאשר PDMS חומם FOr 10 דקות, PDMS הראו כוח הדבקה חזק ואת NFS צורף בחום. מהתוצאות, הוא הגיע למסקנה כי הזמן האופטימלי עבור טרום ריפוי PDMS עבור התקשרות חזקה הוא 10 דקות.

אחרי הדיסק הרכבה, immunoassay נערך על דיסק Tio 2 NF מחצלת משולב על ידי ביצוע שורה של תהליכי תפעול דיסק כמפורט בטבלה 1. לקביעת ריכוזי CRP ו cTnI בדגימות ידוע, גרפים כיול עבור כל נעשו על ידי התוויית יחידות אור יחסי (RLU) מול CRP או ריכוז cTnI (איור 3). באיור 3 א ו 3 ב, התוצאות assay על-דיסק הושוו ELISA המקובלת על צלחת 96-גם עבור CRP ו cTnI בהתאמה. המבחנים הציגו טווח דינמי רחב ליניארי עם גבול גילוי של 0.8 pg / ml (~ 6 FM) עבור CRP ו -37 pg / ml (1.5 PM) עבור cTnI על דיסק, אשרגבוה פי 300 על עבור CRP ו -20 פעמים גבוהות יותר עבור cTnI בהשוואה לתוצאות ELISA הקונבנציונליים שלהם (286 pg / ml, 2.3 PM עבור CRP; 824 pg / ml, 32 PM עבור cTnI).

איור 1

איור 1. אופטימיזציה של תנאי electrospinning. SEM תמונות בכל מצב להראות את המורפולוגיה של NFS נוצר. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Tack במבחן שכבת דבק PDMS ותמונות SEM של המזרן NF Tio 2 שהועברו. (א) כוח הדבקה של דבקשכבת PDMS, מראש נרפא במשך כמה אורכים זמן, (ב) SEM תמונות של nanofibers המצורפת על PDMS נרפא עבור אורכים שונים של זמן. נתון זה יש הבדל בין Ref. 21. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. גרפים כיול לצורך זיהוי של CRP לבין cTnI באמצעות מעבדה-על-דיסק צלחת 96-היטב. איתור של CRP ממוסמר בסרום CRP-חינם (א) ו cTnI ממוסמר בדם שלם (ב) נערכו. הברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של שלוש מדידות עצמאיות לפחות. המגבלה של זיהוי (לוד) חושבה על ידי 3 פעמים של סטיית התקן של נתונים בקרה שלילית נמדדת עם סרום CRP-חינם או דם שלם בלי cTnI spiking עבורCRP ו cTnI, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מס 'ספין מהירות (סל"ד) Valve מס זמן (שניות) מבצע
1 3,600 60 הפרדת דם
2 2,400 1 3 שסתום פתוח להעביר הפלזמה לתוך תא המכיל 8 μl של גילוי נוגדנים מצומדות עם HRP
3 15 הרץ, 15 ° 5 לערבב נוגדנים פלזמה גילוי
4 </ Td> 2,400 2 3 שסתום פתוח ולהעביר את התערובת לתוך תא תגובה מחייב
5 60 הרץ, 2 ° 1,200 לערבב נוגדנים לכידים על תערובת מחצלת Tio 2 NF ונוגדני גילוי-פלזמה
6 2,400 3 10 שסתום פתוח כדי להסיר את התערובת
7 2,400 4 4 שסתום פתוח להעביר חיץ כביסה
8 30 הרץ, 30 ° 120 לערבב חיץ כביסה ולשטוף מחצלת Tio 2 NF
9 2,400 4 כביסה חיץ העברה
10 30 הרץ, 30 ° 120 2 Tio NF מחצלת
11 2,400 4 כביסה חיץ העברה
12 30 הרץ, 30 ° 120 לערבב חיץ כביסה ולשטוף מחצלת Tio 2 NF
13 2,400 4 כביסה חיץ העברה
14 30 הרץ, 30 ° 120 לערבב חיץ כביסה ולשטוף מחצלת Tio 2 NF
15 2,400 20 להסיר את חיץ כביסה הנותר
16 5 שסתום קרוב
17 2,400 6 10 v פתוחalve ולהעביר את המצע chemiluminescent
18 30 הרץ, 2 ° 60 לערבב המצע לבין immunoreagents על מחצלת Tio 2 NF
19 2,400 7 10 לפתוח שסתומים ולהעביר את המצע הגיב לתא זיהוי
זמן כולל ~ 30 דק '

תוכנית מבצע בטבלה 1. עבור immunoassay ב דיסק. טבלה זו יש הבדל בין Ref. 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

את assay על דיסק משולב Tio 2 NF הוא טכניקה מהירה, זולה ונוחה לאיתור הרגיש של חלבונים נמוכים בשפע נוכחים נפח נמוך מאוד של דם. טכניקה זו יש את היתרון של שימוש כרכים מדגם קטן (10 μl) ו ניתנת לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית. זה מספק פוטנציאל גדול כהתקן immunoassay ריבוב. המכשיר כולל היתרון הנוסף כי היא אינה דורשת צעדים מקדימים מדגמים כמו הפרדת פלזמה, אשר נדרשות ELISAs הקונבנציונלי. יתר על כן, המכשיר יכול לבצע הליכי immunoassay שלמים (למשל, ערבוב, כביסה, מחייב וכו ') באופן אוטומטי בשל תאים תוכננו מראש, ערוצים, שסתום. בנוסף, באמצעות שיטות ייצור דיסק ממוסחרים (למשל, הזרקה, UV / קולי / מגע תרמי) במקום כרסום והרכבה ידנית באמצעות דבקים, ההליך כולו מן ייצור המכשיר כדי ניתוח יכול להיותאוטומטי.

כמו כן, שיטת העברת ההדפסה שהוצגה כאן מראה העברה פשוטה וקלה של electrospun NF מתורם למקד מצע על ידי ניצול שכבת PDMS הדבק דקה. באופן כללי, NFS 2 Tio המתקבל לאחר תהליך השריפה הם פריך בקלות לקלף מן המצע המקורקע עקב הידבקות חלשה. 25 בשל השבירות שלה מאפיין, שילוב מחצלות NF Tio 2 עם התקנים אחרים קשים. כדי לפתור זאת, שיטות רבות דווחו. לדוגמא, חמה-עיתונות 26 ממס אדים 27 טכניקות הראו השיפור של ההדבקה בין מחצלת Tio 2 NFS ו- משטח היעד לפני תהליך השריפה. למרות שיטות אלה הגדילו את ההידבקות, מחצלות Tio 2 NF לא היו שלמות עקב הלחץ המכאני הגבוה או הממס מיושם במהלך הטכניקות בהתאמה. יתר על כן, בגלל הצעד calcination, שילוב של 2 Tio <תת /> מחצלות NF באמצעות שיטות אלה ניתן ליישם רק על משטחי יעד מוגבלים.

למיטב ידיעתנו, זוהי הטכניקה הראשונה שהראתה העברת ההדפסה של מחצלות NF על להתקן עשוי תרמופלסטיים, שמירה על מאפייני הרומן של NFS גם לאחר ההעברה. לקבלת ביצועים טובים יותר של המכשיר, ייצור של באיכות גבוהה NFS ואופטימיזציה של תנאים מוקדם ריפוי הם רצויות. כאמור בפרוטוקול, הזמן הדרוש ריפוי מראש עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הסביבה; ולכן, מראש בתנאים ריפוי הם להיות מותאם על ידי מדידת הכוח הדבקה באמצעות מבחן טקטיקה.

יתר על כן, הפרוטוקול מובא כאן, מספק מדריכים מיומנים לתהליך ELISA האוטומטי לחלוטין על דיסק. פרוטוקול מציגה לא המצאה רק של הדיסק אלא גם אוטומציה של כל ההליכים הנדרשים ELISA, כולל הפרדה של דם מלא, מדידה, ערבוב, כביסה וזיהוי.כל צעד הוא מותאם עם מהירות סחיטה, תדירות ערבוב, וזמן פעולה. בהתבסס על מדריך המבצע הזה, ריאגנטים טעונים על דיסק ניתן להעביר ניצול מנוע יחיד. מאז המכשיר בצע רגישות גילוי מעולה עם נפח נמוך מאוד של דם, הוא מספק פוטנציאל גדול עבור יישומים אבחוניים ידי הקרנה ביומרקרים בשלב מוקדם של מחלה. המכשיר יהיה מופעל כדי לאתר את כל סמן ביולוגי תלויים בזמינות של הנוגדנים הספציפיים שלה.

למרות שהמכשיר עם מחצלות Tio 2 NF מושגת משופר מאוד רגישות בשל שטח הפנים הגדול של המחצלות, אחד האתגר הנותר של טכניקה זו יכולה להיות בייצור ההמוני של מחצלות NF אחידות. בגלל הרגישות של ELISA מושפע מאוד את שטח הפנים של המזרן nanofiber, היא קריטית כדי להשיג לא רק שטח פנים גבוה אלא גם שטח פנים לשחזור אחיד בקבוצות שונות של ייצור המוני. לסיכום, הראינו שיטה פשוטה לשלב מחצלת NF שבירה לתוך מכשיר פונקציונלי לגילוי חלבון רגיש. יתרונותיה של שיטה זו הם כדלקמן: 1) electrospun בעבר NFS Tio 2 יכול להיות מוכן רק על משטחים מוליכים יציבות תרמית; כאן, אנו הראינו כי הם יכולים להיות מועברים על גבי מצע כלשהו, ​​כגון חומרי בניין שאינו מוליך פלסטיק; 2) מחצלות Tio 2 NF יכול לעמוד בלחץ ולהישאר יציבים במהלך שלבי כביסה בשל כוח ההדבקה הגבוה של שכבת PDMS; 3) שהיא מספקת שטח פנים גבוה יחסית עבור bioassays; ו -4) את הנוגדנים ניתן לחבר קוולנטית אל Tio 2 NFS בשל מאפייני משטח השלמים על NFS. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשמש לשילוב של חומרי nanofibrous לתוך מכשירים ליישומים מגוונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי National Research Foundation של קוריאה (NRF) מענקים (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), מענק מטעם R בריאות הטכנולוגיה הקוריאני & D פרויקט, משרד הבריאות והרווחה (A121994) ו IBS-R020-D1 הממומן על ידי ממשלת קוריאה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer LG SILTRON Polished Wafer, test grade Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)  Daedong Plastic PCS#6900 Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%, Sigma-Aldrich 205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 Sigma-Aldrich 437190
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Anhydrous ethanol Sigma-Aldrich 459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma-Aldrich 448931
PDMS and curing agent Dow Corning SYLGARD 184
GPDES Gelest Inc SIG5832.0 
Ethanol J T Baker
FE-SEM FEI Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy ThermoFisher K-alpha
3D modeling machine M&I CNC Lab, Korea CNC milling machine
Wax-dispensing machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Double-sided adhesive tape FLEXcon, USA DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter Graphtec Corporation, Japan Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater MIDAS SPIN-3000D
Furnace (calcination) R. D. WEBB COMPANY WEBB 99
Rheometer (Tack test) Thermo Scientific Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system FEMTO CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP Hytest Ltd., Finland 4C28 (clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI Hytest Ltd., Finland 4T21 (clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP Abcam plc., MA ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI Abcam plc., MA ab24460 (clone # 16A11)
hsCRP Abcam plc., MA ab111647
cTnI Fitzgerald, MA 30-AT43
Bovine Albumin Sigma-Aldrich A7906
PBS Amresco Inc E404
Blood collection tubes BD vacutainer 367844 K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femto Invitrogen 37074
Modular multilabel plate reader Perkin Elmer Envision 2104
Disc operating machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Photomultiplier tube (PMT) Hamamatsu Photonics H1189-210
AutoCAD AutoDesk Version 2012 Design software
SolidWorks 3D CAD software  SOLIDWORKS Corp. Version 2013 3D Design software,
Edgecam Vero software version 2009.01.06928 Code generating software
DeskCNC Carken Co. version 2.0.2.18 CNC milling machine software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
  2. Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
  3. Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
  4. Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
  5. Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
  6. Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
  7. Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
  8. Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
  9. Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
  10. Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
  11. Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
  12. Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
  13. Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
  14. Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
  15. Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
  16. Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
  17. Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
  18. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  19. Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
  20. Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
  21. Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
  22. Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
  23. Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
  24. Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
  25. Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
  26. Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
  27. Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).

Tags

Bioengineering גיליון 110 מעבדה-על-דיסק electrospinning דוד immunoassay אוטומציה מלאה העברת הדפסה על-דיסק זיהוי assay בנפח נמוך כולו דם רגיש
האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y.,More

Park, Y. S., Sunkara, V., Kim, Y., Lee, W. S., Han, J. R., Cho, Y. K. Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood. J. Vis. Exp. (110), e54143, doi:10.3791/54143 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter