Introduction
질병 진단을위한 여러 플랫폼 1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 (3), (4) 나노 튜브 (5)와 나노 파이버 (NFS) 6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. 구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 10 탐구되었다 티탄 (TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 11 무시할 단백질 변성 12 및 또한 생체 적합성.도 13은 이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. 14,15 무늬 이산화 티탄 생N 막 16 이산화 티탄 (17) 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이 다소 복잡하고 값 비싼 장비를 필요로한다. 한편, 전기 방사 NFS가 간단하고 저렴한 제조 공정뿐만 아니라 그들의 높은 표면적 주목 받고; 18,19 아직 상기 전기 방사 이산화 티탄 NF 매트 취약한 느슨한 특성 다루기가 어렵고 미세 유체 장치와 통합 할 수 있습니다. 6,20을 따라서, 이산화 티탄 NF 매트는 거의, 생체 시료 응용 프로그램에서 거친 세척 조건을 필요로 특히 활용되지 않았다.
본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 접착제 층을 이용하여 임의의 피 처리 기판의 표면에 매트 NF는 전기 방사를 전송하는 새로운 기술을 개발 하였다. 작고에hermore, 우리는 성공적으로 폴리 카보네이트 (PC)로 이루어진 원심 미세 유체 소자로 전기 방사 티오 NF는 매트 (2)의 적분을 보여왔다. 이 장치를 사용하여, C 반응성 단백질의 민감한 높은 완전 자동화 된, 통합 검색 (CRP)뿐만 아니라 심장 트로포 닌 I (cTnI는)는 전체 혈액의 10 μL에서 30 분 이내에 달성 하였다. (21)로 인해 결합에 는 NFS와 원심 플랫폼의 특성의 장점은 분석은 검출 하한 100 ng를 / ㎖ (0.8 ~ PM) 1 pg / ml 인 (~ 8 FM)에서 크기의 여섯 주문의 넓은 동적 범위를 전시 CRP (37) PG / ㎖ (~ 오후 1시 5분)의 검출 한계 100ng의 / ㎖ (~ 4 ㎚) 10 pg / ml 인 (0.4 ~ PM)의 동적 범위의 0.8 pg / ml이다 (~ 6 FM)의 cTnI는합니다. 이러한 검출 한계는 300 ~되고, 20 배, 대응하는 종래의 ELISA 결과와 비교하여 낮은. 이 기술은 적절한 항체 모든 표적 단백질의 검출에 적용될 수있다. 전반적으로,이 장치 공동예를 들면, 전혈을 10 μl를 그것은 생물학적 샘플의 극소량에서조차 좋은 감도로 표적 단백질의 드문 양을 검출 할 수 있기 때문에 ULD은 체외 진단 및 생화학 적 분석에 크게 기여한다. 우리는이 연구에서 ELISA를 사용하여 혈청 단백질 검출을 증명하지만, 미세 유체 소자와 전기 방사의 NFS 전사 통합 기술은 더 광범위하게 높은 검출 감도를위한 큰 표면적을 필요로하는 다른 생화학 적 반응에 적용될 수있다.
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Protocol
주 : 혈액 건강한 사람에서 도출하고, 혈액 수집 튜브에 수집 하였다. 서면 동의서는 모든 자원 봉사자들로부터 얻은 것입니다.
이산화 티탄 NF 매트 1. 제작
- 전구체 용액 (22)의 제조
- 에탄올 (99.9 %, 3 ml) 및 빙초산 (3 mL)을 혼합하여 티타늄 테트라 이소 프로 폭 사이드 (TTIP) 1.5 g을 용해시키고, 자기 교반기에서 30 분 동안 RT에서의 수용액 (25 ° C)을 혼합한다.
- 에탄올 (99.9 %)의 3.64 g의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)의 11 중량 %를 용해시키고, 핫 플레이트, 자기 교반기를 사용하여 1 시간 동안 65 ° C에서 상기 용액을 교반한다.
- 결합 및 핫 플레이트 자석 교반기 4 시간 동안 65 ° C에서 두 솔루션을 저어.
- 전기 방사
- 200 μm의 내측 diame의 스테인리스 바늘에 연결된 주사기로 제조 된 용액을로드터. 플런저를 제거한 후, 주사기에 직접 용액을 붓는다.
- 높은 DC 전압 (15 kV로)에 접지 된 기판 상에 배치 된 실리콘 웨이퍼 상에 10 분 동안 0.3 ml / hr의 유량 (2cm X 2cm)에 항상 용액을 소개한다. 전기 방사 중에 니들 10cm에 접지 기판 사이의 거리를 설정한다.
- NF 개의 매트의 하소
- 노에서 NF 매트를 놓고 고진공 조건 (5 × 10-5 토르)하에 3 ℃ / 분으로 램핑 속도로 500 ℃까지 온도를 증가시킨다.
- 3 시간 동안 500 ° C의 온도를 유지한다. 노의 RT (25 °의 C)로 샘플의 온도를 냉각.
원심 미세 유체 디스크에 티오 2. 통합이 NF 매트
- 디스크의 제조
- 3 차원 설계 소프트웨어 (예를 들면, 솔을 사용하여idWorks 또는) 유사한 디스크의 각 층의 챔버, 채널 또는 밸브를 묘사한다. 코드 생성 소프트웨어 (예를 들어, Edgecam 또는 유사)를 사용하여 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 코드 설계 파일을 변환합니다. 상기 명령에 따라 소프트웨어를 사용 설명서 23,24 참고.이 장치에 사용되는 일반적인 채널 치수 X 0.3 mm (폭 X 깊이) 1.0 mm이다.
- (CNC 밀링 머신의 운영 소프트웨어를 열고 예., DeskCNC 또는 이와 유사한 것) 및 운영 소프트웨어 CNC 코드를로드하고 순서대로 다음을 클릭합니다 : "AUTO"-> "G CODE OPEN을"-> 생성 된 CNC 코드를 선택합니다.
- CNC에 밀링 머신의 PC 판을 부착 : 디스크 층에 대한 상위 계층과 5mm의 PC 판을위한 1mm의 PC 판을 사용합니다. "시작"버튼을 클릭하여 디스크의 각 층을 절단하는 CNC 밀링 머신을 실행합니다.
- 디스크 상에 이산화 티탄 NF 매트의 전송
- 실리콘 기판 40 μL (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydrooctyl)에서 30 분 동안 진공 하에서 진공 챔버 -1- 트리클로로 실란을 함유하는 작은 페트리 접시를 놓는다. 플루오로 실란이 증발하여 기판에 도포 얻는다.
- 진공 챔버에서 탈기 한 비율 10 : 경화제로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 예비 중합체를 혼합한다. 스핀 코트를 60 초 동안 650 rpm으로 실리콘 기판 상에 PDMS.
- 10 분 점착성 상태를 달성하기 위해 65 ° C의 오븐에서 실리콘 기판 상에 코팅 된 PDMS 큐어.
주 : 경화 시간은 환경 조건에 따라 변화 될 수 있고, 접착력은 레오 미터를 사용하여 점착성 시험에 의해 시험 될 수있다. - 트위터를 사용하여 PDMS 코팅 된 실리콘에 전기 방사 및 소성에 의해 제조 된 이산화 티탄 NF 매트를 전송합니다. 그런 다음, 수동 (유리 슬라이드, 예.) 평면 객체에 전송 된 이산화 티탄 NF 매트에 균일 한 압력을 적용하고 개체를 제거합니다. 놓다4 시간 동안 65 ℃에서 또는 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 샘플이 완전히 PDMS 층을 경화한다.
- 20 μL를 PDMS / 경화제 혼합물과 디스크에 코트 결합 반응 챔버 (10 : 1), 접착제 층 역할을하는 디스크에 이산화 티탄 NF 매트를 부착합니다.
- PDMS의 층에 이산화 티탄 NF 매트에 에탄올 (99.9 %)의 50 μL를 분배 6 mm 직경의 펀치 구멍과 NF 매트를 절단하고, 20 μL로 코팅 된 결합 반응 챔버 이산화 티탄 NF 매트를 절단 전송 이전 단계에서 PDMS의.
참고 :이 단계에서, 에탄올 Si 기판에서 절단 이산화 티탄 NF 매트를 분리하는 데 도움이 될 것입니다. - 1 시간 완전 경화 PDMS를 4 시간 동안 80 ° C에서 65 ° C의 오븐에서 이산화 티탄 NF 매트 내장형 디스크 부화.
- 디스크상의 이산화 티탄 NF 매트의 표면 개질
- 피에탄올 (3- 글리시 독시) methyldiethoxy 실란 (GPDES)의 repare 1 % v / V를 용액 (99.9 %).
- 140 W, 180 초 동안 50 sccm의 산소 흐름에 산소 플라즈마와 이산화 티탄 NF 매트 통합 된 디스크를 취급합니다. 각각의 나노 섬유 매트에 GPDES 용액 100 μl를 분배하고 2 시간 동안 RT (25 °에 C)에 품어.
- 세척 병을 사용하여 에탄올 (99.9 %)을 분배하여 기판 간단히 세척 한 후 디스크를 반전하고 깨끗한 대해 그것을 닦아 블로 팅에 의해 완전히 에탄올을 제거합니다. 1 시간 동안 80 ℃에서 경화. 상술 한 바와 같이 물리적으로 흡착 바운드 GPDES 분자를 제거하고, 동일한 방식으로 에탄올 (99.9 %)로 두 번 세척 하였다.
- 건식 진공 상태에서, 질소 기류로 바람을 불어 건조.
주 : 디스크를 사용할 때까지 실온 (25 ℃)에서 밀폐 용기에 저장 될 수있다.
- 표면에 항체의 고정화
- 포획 항체 200 μg의 / ㎖의 용액 (마우스 모노클로 날 항 만들기인간 hsCRP 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 완충액 (pH 7.4)로 항체를 희석하여 단일 클론 마우스 항 cTnI는). 마이크로 피펫을 사용하여 디스크의 각 NF 매트 상 용액 5 μL를 분배. 항체에 대한 자세한 내용은 자료의 목록을 참조하십시오.
- 가습 실에서 디스크를 유지하고 4 시간 동안 37 ° C에서 품어. 0.1 % BSA-PBS 버퍼와 NF 매트 코팅 된 항체를 씻으십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 세척 완충액 100 ㎕와 챔버를 채우기, 흡입 또는 경사에 의해 버퍼를 제거합니다. 마지막으로, 디스크를 반전하고 깨끗한 닦아에 대해 그것을 가릴 다음 디스크를 조립한다.
- 디스크 어셈블리
- 캐드 프로그램 (예 AutoCAD의 또는 유사한)를 사용하여 양면 접착 테이프, 디스크의 디자인을 그린다. 커팅 플로터에 CAD 설계를 넣습니다.
- 커팅 플로터를 사용하여 양면 접착 테이프를 잘라. 이중 접착 테이프의 한 보호 층을 벗겨과 내가 첨부디스크 층의 상단에 t. 다른 보호 층을 벗겨 디스크 상에 상부 층을 연결합니다.
- 프레스 기계에 미리 조립 된 디스크를로드하고 정확하게 각 밸브, 채널 및 챔버를 연결하는 각 층에 정렬 마크를 사용하여 상단 / 접착제 / 디스크 층을 맞 춥니 다. 프레스 기계를 사용하여 균일 한 압력을 적용합니다.
3. 면역
- 마이크로 피펫을 이용하여 1 % BSA-PBS 완충액 챔버를 채우고, 1 시간 동안 37 ° C에서 디스크를 배양한다. 마이크로 피펫을 사용하여 흡인하여 버퍼를 제거합니다. 미 반응 사이트를 차단하고, 디스크에 단백질의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해이 단계를 수행한다.
- 충전 및 마이크로 피펫을 사용하여 실을 흡입하여 0.1 % BSA-PBS로 두 번 세척 하였다.
참고 :이 단계에서 디스크를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. - micropipett을 사용하여 디스크에 CRP 검출을위한 항원 아군 전체 혈액 또는 CRP 무 혈청로드 10 μL이자형. 교정 그래프를 만들기 위해, 100ng의 / ㎖ 1 pg / ml이다에서 CRP 농도를 사용한다; cTnI는 10 pg / ml 인 내지 100 ng / ml이되게 준비 하였다.
참고 μM의 범위이다 전혈에서 CRP의 높은 수준으로 인해 CRP 무 혈청 장치의 낮은 검출 한계를 보여주기 위해 사용되었다. - 적혈구를 분리하는 60 초 동안 3600 RPM (XG 391)에서 디스크를 스핀.
- 개방 밸브 레이저 조사에 의해 1 번, 그리고 전사 3 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 HRP가 결합 된 항체를 검출 8 μL를 포함하는 챔버에 뜨는 플라즈마 4 μL.
주 :. 밸브 활성화 및 디스크 동작의 시각화를위한 일반적인 프로세스는 이전의 보고서에 상세히 설명 21 - 단백질 검출 항체의 결합을 5 초 동안 혼합 모드 (15 Hz에서의 -1, 15 °)를 적용합니다.
- 오픈 밸브 # 2, 결합 반응 챔버 6 단계에서 제조 된 혼합물을 트랜스퍼 (2,400 RPM3 초). 이어서, 혼합물을 이산화 티탄 연맹에 결합하는 항체 사이의 면역 반응을 달성하기 위해 20 분 동안 혼합 모드 (60 Hz에서의 -1,2- °)을 적용한다. 상기 반응 개방 밸브 # 3 후 폐 챔버 (2400 RPM, 10 초)에 잔류 혼합물을 옮긴다.
- 밸브 # 4를 열고 디스크 (2400 rpm으로 4 초)을 회전시켜 결합 반응 챔버의 세정 완충액 (600 μL)를 옮긴다. 이어서 챔버 내의 이산화 티탄 연맹 씻어 120 초 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1, 30 °)를 적용한다.
- 단계 3.8의 동일한 조건에 따라 두 번 더 이산화 티탄 연맹을 세척하고, 20 초 동안 2,400 rpm에서 디스크를 회전시켜 완전히 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 그리고, 밸브 # 5를 닫는다.
- 화학 발광 반응을위한 밸브 # 6 및 방사를 개방함으로써 결합 반응 챔버에 화학 발광 기질 용액을 전송 한 후 1 분 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1,2- °)를 적용이후 10 초 동안 2,400 rpm에서 디스크.
- 밸브를 개방 # 7, 10 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 상기 검출 챔버로 반응 기질 용액을 전송.
- 광전자 증 배관 (PMT) 모듈을 갖춘 검출 시스템을 사용하여 반응 기질 용액에서 화학 발광 신호를 측정한다.
주 : 스텝 모터, 현미경 성분 변환 단계, 및 상업적으로 입수 한 PMT : 검출 계는 다음과 같은 부품을 사용하여 맞춤형 기계이다. 현미경 부품, 스텝 모터 장치를 유지하도록 조립되고, 모터는 디스크를 회전시킬 수있다. 검출은 현미경 부에 고정 된 PMT에 의해 수행되고, 이는 상기 장치의 검출 챔버 위에 배치된다. 스텝 모터를 조작함으로써, 검출 챔버 바로 PMT의 검출 영역 아래에 정렬된다.
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Representative Results
이 프로토콜, 높은 감도를 제조 하였다으로 전체 혈액에서 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치를 사용. 이산화 티탄 NF 매트는 전기 방사 및 소성 공정에 의해 제조 하였다. 이러한 유량, 전압 및 회전 시간 등의 조건을 전기 방사 원하는 직경, 형태 및 두께는 NFS를 제조하기 위해 최적화되었다. 조건이 최적화되지 않은 경우는 NFS 형성의 질이 저하되었다. 특히 연맹은 낮은 전압 (kV의 5)의 고분자 용액으로부터 방사되지하였고, 전압이 높을 때 (> 20 kV로)을 세분화 하였다. 마찬가지로, 회전 시간은 적절한 밀도, 너무 희소하지 (1 분) 또는 너무 조밀 한 (30 분)와 연맹의 제조에 중요했다. 또한, 높은 유속에 의한 비드의 형성을 방지하기 위해 유속을 조작 하였다. 그래서, 1-15 kV의인가 전압의 10 분 전기 방사 시간 및 0.3 ml의 용 hr의 유량
이산화 티탄 NF 매트 성공적으로 실란, 실리콘 기판과 65 ° C의 오븐에서 미리 경화에 스핀 코팅 PDMS에 의해 제조 된 접착제 PDMS 층을 이용하여 피 처리 기판 상에 옮겼다. 예비 경화 PDMS 층의 시간의 접착력을 검사 압정 시험 (도 2A)를 사용하여 최적화되었다.도 2b는 나노 섬유에 부착 경화 시간의 효과를 나타낸다. PDMS의 3 분 동안 가열하면 PDMS가 아직 미 경화이며, 액체로 남아는 NFS는 PDMS 층에 매립했기 때문에, 더 접착력이 없다. 이를 30 분 동안 가열하면 PDMS 딱딱 해지고 그 접착 특성을 상실하고 NFS가 그 위에 부착되지 않은 바와 같이, 접착력은 매우 약하다. PDMS의이 fo를 가열 할 때R 10 분은 PDMS 강한 접착력을 보여는 NFS 강하게 부착되었다. 결과로부터, 강한 부착 PDMS 미리 치료를위한 최적의 시간을 10 분이라고 결론이다.
디스크 조립체 후 면역이 표 1에 나와있는 디스크 동작 일련의 처리를 수행하여 이산화 티탄 NF 매트 내장형 디스크 하였다. 미지 샘플의 CRP cTnI는 농도의 측정은, 각각의 캘리브레이션 그래프를 플롯 팅하여 만들었다 CRP 또는 cTnI는 농도에 비해 상대적 광 단위 (RLU) (그림 3). 도 3a 및도 3b에서, 디스크상의 분석 결과를 각각 CRP cTnI는 용 96- 웰 플레이트 ELISA 종래와 비교 하였다. 분석법은 디스크 cTnI는 0.8 CRP위한 PG / ㎖ (~ 6 FM), 37 pg / ml 인 (1.5 PM)의 검출 한계를 가진 넓은 선형 동적 범위를 나타내 어느CRP에 대한 약 300 배와 각각 기존의 ELISA 결과 (; 824 pg / ml 인, cTnI는 32 μM의 286 pg / ml 인, CRP 2.3 PM)에 비해 cTnI는 20 배 이상이다.
그림 전기 방사 조건 1. 최적화. 각 조건에서의 SEM 이미지를 형성 연맹의 형태를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
접착제 PDMS 층과 전사 이산화 티탄 NF 매트의 SEM 화상도 2 압정 시험. (A), 접착제의 접착력여러 시간 길이 (B)의 시간 길이가 다른 경화 PDMS에 부착 된 나노 파이버의 SEM 이미지에 대한 사전 경화 된 PDMS 층. 이 수치는 참고 문헌에서 수정되었습니다. 21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
온 - 디스크 실험실과 96 웰 플레이트를 사용하여 CRP cTnI는 검출 그림 3. 교정 그래프. CRP의 검출은 CRP 무 혈청 (A)에서 아군 cTnI는이 실시되었다 전혈 (B)에서 아군. 오차 막대는 적어도 세 독립적 인 측정의 표준 편차를 나타낸다. 검출 한계 (LOD)는 cTnI는가 급상승하지 CRP 무 혈청 또는 전혈 측정 네거티브 제어 데이터의 표준 편차의 3 배 계산CRP cTnI는 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 스핀 호 | 속도 (rpm) | 밸브 호 | 시간 (초) | 조작 | |||
| 1 | 3,600 | (60) | 혈액 분리 | ||||
| 이 | 2,400 | 1 | 삼 | 개방 밸브는 HRP가 결합 된 항체를 검출 8 μL를 포함하는 챔버 내에 플라즈마를 전송할 | |||
| 삼 | 15 Hz에서 15 ° | (5) | 플라즈마 및 검출 항체를 혼합 | ||||
| 4 </ TD> | 2,400 | 이 | 삼 | 개방 밸브 결합 반응 챔버에 혼합물을 전송할 | |||
| (5) | 60 Hz에서, 2 ° | 1,200 | 이산화 티탄 NF 매트와 플라즈마 검출 항체 혼합물에 캡처 항체를 혼합 | ||||
| 6 | 2,400 | 삼 | (10) | 개방 밸브는 혼합물을 제거하는 방법 | |||
| (7) | 2,400 | 4 | 4 | 개방 밸브 세척 버퍼를 전송합니다 | |||
| 8 | 30 Hz에서 30 ° | (120) | 세척 버퍼를 혼합하여 이산화 티탄 NF 매트를 세척 | ||||
| 9 | 2,400 | 4 | 전송 세척 버퍼 | ||||
| (10) | 30 Hz에서 30 ° | (120) | 이산화 티탄 NF 매트 | ||||
| (11) | 2,400 | 4 | 전송 세척 버퍼 | ||||
| (12) | 30 Hz에서 30 ° | (120) | 세척 버퍼를 혼합하여 이산화 티탄 NF 매트를 세척 | ||||
| (13) | 2,400 | 4 | 전송 세척 버퍼 | ||||
| (14) | 30 Hz에서 30 ° | (120) | 세척 버퍼를 혼합하여 이산화 티탄 NF 매트를 세척 | ||||
| (15) | 2,400 | (20) | 남아있는 세척 완충액을 제거 | ||||
| (16) | (5) | 개폐 밸브 | |||||
| (17) | 2,400 | 6 | (10) | 열린 Valve 및 화학 발광 기판을 이송 | |||
| (18) | 30 Hz에서, 2 ° | (60) | 기판과 이산화 티탄 NF 매트에 immunoreagents를 혼합 | ||||
| (19) | 2,400 | (7) | (10) | 밸브를 개방하고 상기 검출 챔버로 기판을 이송 반응 | |||
| 총 시간 | ~ 30 분 | ||||||
디스크의 면역 표 1. 동작 프로그램.이 테이블은 참조로 수정되었다. 21.
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Discussion
이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리 단계를 필요로하지 않는 추가적인 이점을 갖는다. 또한, 상기 장치로 인해 미리 설계된 챔버, 채널, 밸브 전체 면역 절차 (예를 들면, 혼합, 세척, 결합 등)을 자동으로 수행 할 수있다. 접착제를 사용하는 대신 제분 수동 조립 또한 상용화 디스크의 제조 방법을 이용하여 (예를 들어, 사출 성형, UV / 초음파 / 열 접착) 분석 디바이스의 제조의 전체 공정은 수 있습니다자동화.
또한, 여기에 제시된 전사 인쇄 방법은, 얇은 접착제 PDMS 층을 이용하여 기판을 대상으로 전기 방사 공여자 NF의 간단하고 쉬운 전달을 나타낸다. 일반적으로, 소성 공정 후에 얻어지는 이산화 티탄 NFS가 깨지기 쉽고 인해 약한 접착력으로 접지 된 기판으로부터 벗겨. 25 인해 특성 취성에, 다른 장치와 이산화 티탄 NF 매트 통합이 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 방법이보고되어있다. 예를 들어, 핫 프레스 (26) 및 용매 증기 (27)의 기술은, 소성 공정 전에 이산화 티탄의 NFS 매트와 대상 표면 사이의 밀착성의 향상을 보여 주었다. 이러한 방법은 밀착성이 증가한 경우에도 이산화 티탄 NF 매트 인하여 높은 기계적 압력으로 손상되지 않았거나, 용매를 각각 기술하는 동안 적용 하였다. 또한 때문에 소성 단계는 이산화 티탄의 통합 </ 서브>는 이러한 방법을 사용하여 NF 매트 제한된 타겟 표면에 적용될 수있다.
우리가 아는 한, 심지어 전송 후에 연맹의 새로운 속성을 유지, 열가소성 수지로 만들어진 장치에 NF 매트의 전송 인쇄를 표시하는 최초의 기술이다. 디바이스의 성능 향상을 위해 고품질의 NFS 제조 및 예비 경화 조건의 최적화가 요구된다. 프로토콜에서 언급 된 바와 같이, 시간은 환경 조건에 따라 달라질 수 예비 경화에 필요한; 따라서, 예비 경화 조건은 점착성 시험을 사용하여 접착력 측정을 최적화하여야한다.
또한, 프로토콜은 여기에 제시된, 디스크의 완전 자동화 된 ELISA 프로세스에 대한 숙련 된 가이드를 제공합니다. 프로토콜뿐만 아니라 디스크의 제조뿐만 아니라 전체 혈액의 분리, 계량, 혼합, 세척 및 검출을 포함하여 ELISA에 필요한 모든 프로세스의 자동화를 소개합니다.각 단계는 회전 속도, 혼합 주파수 및 동작 시간이 최적화된다. 이 작업 설명서에 기초하여, 디스크에 장착 된 시약은 하나의 모터를 이용하여 전송 될 수있다. 장치는 혈액의 매우 낮은 양 우수한 검출 감도를 수행하기 때문에,이 질환의 초기 단계에서의 바이오 마커를 선별함으로써 진단 애플리케이션을위한 잠재력을 제공한다. 디바이스는 그것의 특정 항체의 가용성에 따라 임의의 바이오 마커를 검출하는 것이 가능하게 될 것이다.
이산화 티탄 매트 NF로 인해 장치가 높은 매트의 넓은 표면적에 감도를 개선하여 달성되지만,이 기술의 도전 나머지 하나는 균일 NF 매트의 대량 생산 될 수있다. 엘리사의 감도가 크게 나노 섬유 매트의 표면 영역에 의해 영향을 받으므로, 높은 표면적은 물론, 대량 생산의 다른 배치의 재현성과 균일 한 표면 영역뿐만 아니라 달성하기 위해 중요하다. 결론적으로 고감도 단백질을 검출하는 기능 소자에 취성 NF 매트를 통합하기위한 간단한 방법을 보여준다. 다음과 같이이 방법의 장점은 다음과 같습니다 1) 이전에 전기 방사 이산화 티탄 연맹에만 전도성 및 열적으로 안정한 표면에 제조 될 수있다; 여기서, 우리는 그들이 비도 전성 플라스틱 재료를 포함하는 임의의 기판 상에 전사 될 수 있음을 보여 주었다; 2) 이산화 티탄 NF 매트 압력을 견딜 의한 PDMS 층의 높은 접착력 세척 단계 중에 안정적으로 유지 될 수있다; 3) 바이오 분석법 비교적 높은 표면적을 제공한다; 4) 항체는 공유로 인해 연맹에 그대로 표면 특성에 이산화 티탄 연맹에 부착 될 수있다. 이 기술은 다양한 애플리케이션을위한 장치로 나노 섬유 재료의 통합을위한 큰 잠재력 사용되어야한다.
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Acknowledgments
이 작품은 한국 연구 재단 (NRF) 보조금 (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), 한국 정부에 의해 투자 한국의 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (A121994)와 IBS-R020-D1의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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