Introduction
وقد وضعت عدة برامج لتشخيص المرض استنادا إلى المواد النانومترية الحجم 1،2 مثل أسلاك، 3 النانوية، 4 الأنابيب النانوية و 5 و ألياف النانو (NFS) 6-8. هذه المواد النانوية آفاقا ممتازة في تصميم التقنيات الجديدة لاختبارات بيولوجية حساسة للغاية نظرا لخصائص الفيزيائية الفريدة. على سبيل المثال، تم استخدام ألياف النانو أكسيد الزنك mesoporous للفيمتو-الرحى كشف حساسة من المؤشرات الحيوية سرطان الثدي. 9 في الآونة الأخيرة، المواد متناهية الصغر على أساس ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) تم التنقيب فيها عن تطبيقات bioanalytical 10 النظر في الاستقرار الكيميائي، 11 يذكر تمسخ البروتين و 12 و توافق مع الحياة. 13 وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعة الهيدروكسيل على سطح تيو 2 تسهل تعديل الكيميائية ومرفق التساهمية الجزيئات الحيوية. 14،15 منقوشة تيو 2 ثين الأفلام 16 أو تيو 2 نانوتيوب 17 استخدمت لتعزيز حساسية الكشف عن البروتين المستهدف من خلال زيادة مساحة السطح. ومع ذلك، فإن عملية تصنيع معقدة نوعا ما، وتتطلب معدات باهظة الثمن. من ناحية أخرى، NFS electrospun تحظى باهتمام بسبب مساحة عالية وكذلك عملية مباشرة وتلفيق تكلفة منخفضة؛ 18،19 بعد، فإن السمة الهشة أو فضفاضة من electrospun تيو 2 NF حصيرة يجعل من الصعب التعامل معها و تتكامل مع أجهزة ميكروفلويديك. 6،20 لذلك، نادرا ما تستخدم في تيو 2 NF الحصير في تطبيقات bioanalytical، ولا سيما تلك التي تتطلب الظروف القاسية الغسيل.
في هذه الدراسة، للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير تقنية جديدة لنقل electrospun NF الحصير على سطح أي الركيزة الهدف من خلال الاستفادة من طبقة لاصقة ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة (PDMS). Furthermore، لقد أظهرت بنجاح دمج electrospun تيو 2 NF الحصير على جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي المصنوعة من البولي (PC). باستخدام هذا الجهاز، تم التوصل إلى كشف عالية حساسة، مؤتمتة بالكامل، ومتكاملة من البروتين سي التفاعلي (CRP)، وكذلك التروبونين القلبي الأول (cTnI) في غضون 30 دقيقة من فقط 10 ميكرولتر من الدم الكامل. 21 نظرا لمجتمعة مزايا خصائص NFS ومنصة الطرد المركزي، أظهر فحص مجموعة واسعة ديناميكية من ستة أوامر من حجم من 1 غ / مل (~ 8 FM) إلى 100 نانوغرام / مل (~ 12:08) مع الحد الأدنى من الكشف 0.8 غ / مل (~ 6 FM) لCRP ومجموعة ديناميكية من 10 جزء من الغرام / مل (~ 12:04) إلى 100 نانوغرام / مل (~ 4 نانومتر) مع حد الكشف عن 37 جزء من الغرام / مل (~ 01:05) لcTnI. هذه الحدود هي كشف ~ 300 و~ 20 أضعاف أقل مقارنة نتائجها ELISA التقليدية المقابلة. ويمكن تطبيق هذه التقنية للكشف عن أي البروتينات المستهدفة، مع الأجسام المضادة المناسبة. عموما، هذا الجهاز المشتركيونيتبول تسهم إلى حد كبير في في المختبر تشخيص وفحوصات الكيمياء الحيوية نظرا لأنه يمكن الكشف عن كميات نادرة من البروتينات المستهدفة مع حساسية كبيرة حتى من كميات صغيرة جدا من العينات البيولوجية، على سبيل المثال، 10 ميكرولتر من الدم الكامل. على الرغم من أننا تظاهر فقط الكشف عن بروتين مصل باستخدام الاليزا في هذه الدراسة، ونقل ودمج التكنولوجيا من electrospun NFS مع أجهزة ميكروفلويديك يمكن تطبيقها على نطاق أوسع في التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى التي تحتاج إلى مساحة كبيرة لحساسية الكشف عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ولفت الدم من أشخاص أصحاء وجمعت في أنبوب جمع الدم: ملاحظة. تم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من جميع المتطوعين.
1. تصنيع تيو 2 NF حصير
- إعداد الحل السلائف 22
- حل 1.5 غرام من tetraisopropoxide التيتانيوم (TTIP) في خليط من الإيثانول (99.9٪، 3 مل)، وحامض الخليك الجليدي (3 مل)، ومزيج الحل في RT (25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة على محرك مغناطيسي.
- حل 11٪ بالوزن من pyrrolidone البولي فينيل (PVP) في 3.64 غرام من الإيثانول (99.9٪) ويحرك الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة باستخدام محرك مغناطيسي الساخنة لوحة.
- الجمع بين ويقلب الحلين عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على النمام المغناطيسي الساخنة لوحة.
- العزل الكهربائي
- تحميل الحل أعد إلى حقنة متصلة إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ 200 ميكرون ديامي الداخليثالثا. من أجل حل مباشرة في حقنة بعد إزالة المكبس.
- تقديم الحل باستمرار بمعدل تدفق 0.3 مل / ساعة لمدة 10 دقيقة على وسي ويفر (2 سم × 2 سم) وضعت على ركيزة أساس في الجهد العاصمة عالية (15 كيلو فولت). خلال العزل الكهربائي، تعيين المسافة بين الإبرة والركيزة الارض الى 10 سم.
- تكليس من حصيرة NF
- وضع حصيرة NF في الفرن وزيادة درجة حرارة تصل إلى 500 درجة مئوية مع نسبة التعلية من 3 ° C / دقيقة تحت ظروف عالية فراغ (5 × 10 -5 عربة).
- الحفاظ على درجة حرارة 500 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. تهدئة درجة حرارة العينات إلى RT (25 درجة مئوية) في الفرن.
2. دمج تيو 2 NF حصيرة إلى الطرد المركزي ميكروفلويديك القرص
- تصنيع قرص
- استخدام برنامج تصميم 3D (على سبيل المثال، سولidWorks أو ما شابه ذلك) لتصوير غرف، قنوات، أو صمامات لكل طبقة من القرص. تحويل ملفات تصميم إلى رمز كمبيوتر التحكم العددي (CNC) باستخدام رمز توليد البرمجيات (على سبيل المثال، Edgecam أو ما شابه ذلك). استخدام البرمجيات وفقا لتعليمات دليل 23،24 ملاحظة: أبعاد قناة المعتادة المستخدمة في هذا الجهاز هي 1.0 مم × 0.3 مم (العرض × العمق).
- فتح برنامج تشغيل آلة الطحن CNC (على سبيل المثال، DeskCNC أو ما شابه ذلك) وتحميل كود التصنيع باستخدام الحاسب الآلي لبرنامج التشغيل وانقر على التالية بالترتيب: "AUTO" -> "G CODE فتح" -> اختر رمز التصنيع باستخدام الحاسب الآلي ولدت.
- نعلق لوحة الكمبيوتر على آلة طحن التصنيع باستخدام الحاسب الآلي: استخدام 1 ملم لوحات الكمبيوتر للطبقة العليا ولوحات الكمبيوتر 5 مم للطبقة القرص. تشغيل آلة الطحن CNC لقطع كل طبقة من القرص عن طريق النقر على زر "ستارت".
- نقل تيو 2 NF حصيرة على القرص
- وضع الركيزة السيليكون وطبق بتري صغيرة تحتوي على 40 ميكرولتر من (tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorosilane في فراغ الغرفة في ظل فراغ لمدة 30 دقيقة. وfluorosilane يبخر ويحصل المغلفة على الركيزة.
- مزيج ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) قبل البوليمر مع وكيل علاج في نسبة 10: 1 وديغا في فراغ الغرفة. تدور معطف PDMS على ركيزة السيليكون في 650 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.
- علاج PDMS المغلفة على الركيزة السيليكون في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتحقيق دولة ملتصقة.
ملاحظة: علاج الوقت يمكن أن تختلف تبعا للظروف البيئية، وقوة التصاق يمكن اختباره من قبل اختبار تك باستخدام مقياس غلفاني. - نقل حصيرة تيو 2 NF بواسطة العزل الكهربائي والتكليس أعدت على السليكون مغلفة PDMS باستخدام منتاش. ثم، يدويا تطبيق الضغط امتثالي على نقل تيو 2 NF حصيرة مع كائن شقة (على سبيل المثال، شريحة زجاجية) وإزالة الكائن. ضعهذه العينة في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لعلاج طبقة PDMS تماما.
- معطف غرف رد فعل ملزمة في القرص مع 20 ميكرولتر من PDMS / علاج خليط عامل (10: 1)، الذي يعمل بمثابة طبقة لاصقة إرفاق تيو 2 NF حصيرة على القرص.
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من الإيثانول (99.9٪) على تيو 2 NF حصيرة على طبقة PDMS، وقطع حصيرة NF مع وجود ثقب لكمة من قطر 6 مم، ونقل قطع تيو 2 NF حصيرة إلى غرف رد فعل ملزمة المغلفة مع 20 ميكرولتر من PDMS في الخطوة السابقة.
ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف الإيثانول تكون مفيدة لفصل قطع تيو 2 NF حصيرة من الركيزة سي. - احتضان تيو 2 NF حصيرة القرص متكامل في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لعلاج PDMS تماما.
- تعديل سطح تيو 2 NF حصيرة على القرص
- Prepare 1٪ حل ت / ت من (3-glycidoxypropyl) سيلاني methyldiethoxy (GPDES) في الإيثانول (99.9٪).
- علاج القرص متكامل تيو 2 NF حصيرة مع البلازما الأكسجين في 140 W، وتدفق الأكسجين 50 SCCM لمدة 180 ثانية. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من حل GPDES على كل حصيرة ألياف نانوية واحتضانها في RT (25 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
- غسل ركائز لفترة وجيزة قبل الاستغناء الإيثانول (99.9٪) باستخدام زجاجة غسل، ثم إزالة الايثانول تماما من قلب القرص والنشاف ضد نظيفة يمسح. علاج على 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يغسل مرتين مع الإيثانول (99.9٪) بنفس الطريقة كما هو مذكور أعلاه، لإزالة كثف جسديا وغير منضم GPDES الجزيئات.
- ضربة الجافة مع تيار النيتروجين وجافة في ظل فراغ.
ملاحظة: يمكن تخزين القرص في حاوية مغلقة في RT (25 درجة مئوية) حتى الاستخدام.
- تجميد الأجسام المضادة على السطح
- جعل حل من 200 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة القبض على (وحيدة النسيلة الماوس المضادةهسكرب البشري أو الماوس وحيدة النسيلة المضادة للcTnI) عن طريق تمييع الأجسام المضادة مع العازلة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة). الاستغناء عن 5 ميكرولتر من الحل على كل حصيرة NF في القرص باستخدام micropipette. انظر قائمة المواد لمزيد من المعلومات حول الأجسام المضادة.
- حافظ على الأقراص في غرفة ترطيب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. غسل الأجسام المضادة المغلفة NF حصيرة مع 0.1٪ عازلة BSA-برنامج تلفزيوني. تملأ الغرفة مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة باستخدام micropipette، وإزالة العازلة الشفط أو الصب. وأخيرا، عكس القرص وصمة عار ضد نظيفة يمسح، ومن ثم تجميع القرص.
- التجمع القرص
- رسم تصميم القرص على الجانب شريط لاصق مزدوج باستخدام برنامج CAD (على سبيل المثال، أوتوكاد أو ما شابه ذلك). تحميل تصميم CAD إلى القطع المخطط.
- قطع شريط لاصق مزدوج الجانب باستخدام القطع المخطط. تقشر طبقة حماية واحدة من شريط لاصق مزدوج وإرفاق طر على أعلى طبقة القرص. تقشر طبقة حماية أخرى ونعلق الطبقة العليا على طبقة القرص.
- تحميل القرص تجميعها مبدئيا في آلة الضغط ومحاذاة بالضبط طبقات أعلى / لاصق / القرص باستخدام علامات محاذاة في كل طبقة لربط كل صمام، قناة، وغرف. الضغط امتثالي باستخدام آلة الضغط.
3. المناعية
- ملء الغرف مع 1٪ عازلة BSA-PBS باستخدام micropipette واحتضان القرص عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إزالة المنطقة العازلة التي كتبها طموح باستخدام micropipette. تنفيذ هذه الخطوة لمنع المواقع كان رد فعل الامم المتحدة والحد من امتصاص غير محدد من البروتين في القرص.
- يغسل مرتين مع 0.1٪ BSA-برنامج تلفزيوني عن طريق ملء والشفط الدوائر باستخدام micropipette.
ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن تخزين القرص في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. - تحميل 10 ميكرولتر من-ارتفعت مستضد الدم الكامل أو المصل خالية من بروتين سي التفاعلي للكشف عن البروتين على القرص باستخدام micropipettه. لجعل الرسوم البيانية المعايرة، واستخدام تركيزات بروتين سي التفاعلي من 1 غ / مل إلى 100 نانوغرام / مل. وcTnI من 10 جزء من الغرام / مل إلى 100 نانوغرام / مل.
ملاحظة: نظرا لارتفاع مستويات بروتين سي التفاعلي في الدم الكامل، الذي يكون عادة في نطاق ميكرومتر، وكان يستخدم المصل خالية من بروتين سي التفاعلي للتدليل على حد الكشف المنخفض للجهاز. - تدور القرص في 3600 دورة في الدقيقة (391 x ج) لمدة 60 ثانية لفصل خلايا الدم الحمراء.
- فتح صمام # 1 بواسطة أشعة الليزر، ونقل 4 ميكرولتر من البلازما طاف إلى الغرفة التي تحتوي على 8 ميكرولتر من الكشف عن الأجسام المضادة مترافق مع HRP قبل الغزل القرص في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 3 ثانية.
ملاحظة: يتم وصف العمليات العامة للتشغيل صمام وتصور عملية القرص بالتفصيل في التقرير السابق 21 - تطبيق طريقة الخلط (15 هرتز ق -1، 15 درجة) لمدة 5 ثانية لربط البروتين والكشف عن الأجسام المضادة.
- فتح صمام رقم 2، ونقل الخليط المعد في الخطوة 6 إلى دائرة رد الفعل ملزمة (2400 دورة في الدقيقة، 3 ثانية). ثم، وتطبيق طريقة الخلط (60 هرتز ق -1 و 2 درجة) لمدة 20 دقيقة لتحقيق تفاعل مناعي بين الخليط والأجسام المضادة ملزمة للNFS تيو 2. بعد رد الفعل، وفتح صمام # 3 ونقل الخليط المتبقي إلى غرفة النفايات (2400 دورة في الدقيقة، 10 ثانية).
- نقل غسل العازلة (600 ميكرولتر) إلى دائرة رد الفعل ملزم عن طريق فتح صمام رقم 4 والغزل القرص (2400 دورة في الدقيقة، 4 ثانية). ثم تطبيق طريقة الخلط (30 هرتز ق -1 و 30 درجة مئوية) لمدة 120 ثانية لغسل تيو 2 NFS في الغرفة.
- غسل تيو 2 NFS مرتين أكثر باتباع نفس الحالة الخطوة 3.8، وإزالة غسل العازلة المتبقية بالكامل من قبل الغزل القرص في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. ثم، أغلق صمام # 5.
- للتفاعل chemiluminescent، وتطبيق طريقة الخلط (30 هرتز ق -1 و 2 درجة) لمدة 1 دقيقة بعد نقل الحل الركيزة chemiluminescent إلى دائرة رد الفعل ملزمة بفتح صمام # 6 و الغزلالقرص في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية في وقت لاحق.
- نقل الحل الركيزة رد على غرف الكشف عن طريق فتح صمام # 7 والغزل القرص في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية.
- قياس إشارات التوهج من حل الركيزة رد باستخدام أنبوب مضخم (PMT) وحدة نظام الكشف التجهيز.
ملاحظة: نظام الكشف آلة بنيت خصيصا باستخدام الأجزاء التالية: خطوة المحركات والمكونات الميكانيكية، مراحل الترجمة، وPMT متاحة تجاريا. يتم تجميع الأجزاء الميكانيكية والسيارات خطوة لوضع الجهاز، والمحرك يستطيع تدوير القرص. يتم تنفيذ الكشف عن طريق PMT ثابتة على الأجزاء الميكانيكية، ويقع فوق غرف الكشف عن الجهاز. عن طريق التلاعب في محرك الخطوة، يتم محاذاة غرف الكشف الحق تحت منطقة كشف PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي مؤتمتة بالكامل للكشف عن البروتين من الدم الكامل مع أعد حساسية عالية. وقبل عمليات العزل الكهربائي والتكليس أعدت تيو 2 الحصير NF. من أجل افتعال NFS من القطر المطلوب، التشكل، وسمك، العزل الكهربائي ظروف مثل معدل التدفق، والجهد، والوقت الغزل والأمثل. عندما لا أمثل الظروف، وكانت نوعية NFS شكلت الفقيرة. على وجه الخصوص، لم نسج NFS الخروج من حل البوليمر في الجهد المنخفض (5 كيلو فولت)، وكسرت عندما كان الجهد العالي (> 20 كيلو فولت). وبالمثل، كان الوقت الحرج الغزل لتصنيع NFS مع الكثافة المناسبة، وليس ضئيلة جدا (1 دقيقة) أو كثيفة جدا (30 دقيقة). أيضا، لتجنب تشكيل حبة الناجمة عن معدلات تدفق عالية، والتلاعب معدل التدفق. لذلك، وهو الجهد المطبق من 15 كيلو فولت و 10 دقيقة وقت العزل الكهربائي ومعدل تدفق ساعة 0.3 مل
تم نقل NF حصيرة تيو 2 بنجاح على الركيزة الهدف باستخدام PDMS طبقة لاصقة، والذي تم إعداده من قبل PDMS تدور طلاء على الركيزة السيليكون silanized وقبل علاجه في فرن عند 65 درجة مئوية. وكان محسن وقت ما قبل علاج طبقة PDMS عن طريق التحقق من قوة التصاق، وذلك باستخدام اختبار تك (الشكل 2A). ويبين الشكل 2B تأثير علاج الوقت على التعلق ألياف نانوية. إذا تم تسخين PDMS لمدة 3 دقائق، وليس هناك قوة التصاق كما كان PDMS لا يزال غير مخمر، حيث لا تزال السائل وNFS حصلت جزءا لا يتجزأ في طبقة PDMS. عند تسخينه لمدة 30 دقيقة، وقوة التصاق ضعيفة جدا حيث يصبح PDMS قاسية ويفقد خاصيته لزجة ولم يعلق NFS على ذلك. عندما تم تسخين PDMS FOص 10 دقيقة، أظهرت PDMS قوة التصاق قوية وكانت تعلق NFS بقوة. من النتائج، خلص إلى أن الوقت الأمثل لما قبل علاج PDMS عن التعلق القوي هو 10 دقيقة.
بعد التجميع القرص، أجريت المناعية على تيو 2 NF حصيرة قرص مدمج باتباع سلسلة من عمليات تشغيل القرص كما هو موضح في الجدول رقم 1. ولتحديد تركيزات بروتين سي التفاعلي وcTnI في عينات غير معروفة، أدلى الرسوم البيانية المعايرة لكل من التآمر وحدات النسبية الخفيفة (RLU) مقابل CRP أو تركيز cTnI (الشكل 3). في الشكل 3A و 3B، وتمت مقارنة نتائج فحص على القرص مع إليسا التقليدي على لوحة 96-جيدا للبروتين سي التفاعلي وcTnI على التوالي. أظهرت فحوصات مجموعة ديناميكية الخطية واسع مع حد الكشف عن 0.8 غ / مل (~ 6 FM) لCRP و 37 جزء من الغرام / مل (01:05) لcTnI على قرص، التيأعلى حوالي 300 مرة عن CRP وأعلى 20 مرات لcTnI مقارنة بنتائج كل منهما التقليدية ELISA (286 غ / مل، 14:03 لCRP، 824 غ / مل، 32 مساء لcTnI).
الشكل 1. تحسين ظروف العزل الكهربائي. الصور ووزارة شؤون المرأة في كل حالة تظهر مورفولوجية NFS تشكيلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم اختبار 2. المسمار من طبقة لاصقة PDMS والصور ووزارة شؤون المرأة من نقل تيو 2 NF حصيرة. (A) قوة التصاق لاصقةطبقة PDMS، قبل علاجه لعدة فترات زمنية، (ب) الصور ووزارة شؤون المرأة من ألياف النانو تعلق على PDMS الشفاء لفترات مختلفة من الزمن. تم تعديل هذا الرقم من الرقم. 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الرسوم البيانية المعايرة للكشف عن البروتين وcTnI باستخدام المختبر على واحد في القرص ولوحة 96-جيدا. الكشف عن بروتين سي التفاعلي ارتفعت في مصل الدم خالية من بروتين سي التفاعلي (A) وارتفعت cTnI في الدم الكامل (B) أجريت. وتشير أشرطة الخطأ والانحراف المعياري لا يقل عن ثلاثة قياسات مستقلة. تم احتساب الحد من الكشف (اللد) بنسبة 3 مرات من الانحراف المعياري للبيانات المراقبة السلبية يقاس مع المصل خالية من البروتين أو الدم الكامل دون cTnI ارتفاعه لCRP وcTnI، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تدور رقم | السرعة (دورة في الدقيقة) | صمام رقم | الوقت (ثانية) | عملية | |||
| 1 | 3600 | 60 | فصل الدم | ||||
| 2 | 2400 | 1 | 3 | فتح صمام لنقل البلازما إلى الغرفة التي تحتوي على 8 ميكرولتر من الكشف عن الأجسام المضادة مترافق مع HRP | |||
| 3 | 15 هرتز، 15 ° | 5 | مزيج البلازما والأجسام المضادة كشف | ||||
| 4 </ td> | 2400 | 2 | 3 | فتح صمام لنقل الخليط في دائرة رد الفعل ملزمة | |||
| 5 | 60 هرتز، 2 ° | 1200 | مزيج الأجسام المضادة القبض على تيو 2 NF حصيرة والأجسام المضادة للكشف عن بلازما خليط | ||||
| 6 | 2400 | 3 | 10 | فتح صمام لإزالة الخليط | |||
| 7 | 2400 | 4 | 4 | فتح صمام لنقل غسل العازلة | |||
| 8 | 30 هرتز، 30 ° | 120 | مزيج غسل العازلة وغسل تيو 2 NF حصيرة | ||||
| 9 | 2400 | 4 | غسل العازلة نقل | ||||
| 10 | 30 هرتز، 30 ° | 120 | 2 NF حصيرة | ||||
| 11 | 2400 | 4 | غسل العازلة نقل | ||||
| 12 | 30 هرتز، 30 ° | 120 | مزيج غسل العازلة وغسل تيو 2 NF حصيرة | ||||
| 13 | 2400 | 4 | غسل العازلة نقل | ||||
| 14 | 30 هرتز، 30 ° | 120 | مزيج غسل العازلة وغسل تيو 2 NF حصيرة | ||||
| 15 | 2400 | 20 | إزالة غسل العازلة المتبقية | ||||
| 16 | 5 | صمام قريب | |||||
| 17 | 2400 | 6 | 10 | ضد مفتوحةALVE ونقل الركيزة chemiluminescent | |||
| 18 | 30 هرتز، 2 ° | 60 | مزيج الركيزة وimmunoreagents على تيو 2 NF حصيرة | ||||
| 19 | 2400 | 7 | 10 | فتح صمام ونقل الركيزة ردت إلى غرفة الكشف | |||
| الوقت الكلي | ~ 30 دقيقة | ||||||
الجدول 1. برنامج التشغيل لالمناعية في القرص. لقد تم تعديل هذا الجدول من المرجع. 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفحص على تيو 2 NF قرص مدمج هي تقنية سريعة وغير مكلفة وسهلة للكشف عن فائق الحساسية من بروتينات وفيرة المنخفضة الحالية في حجم منخفض جدا من الدم. هذا الأسلوب له ميزة استخدام كميات عينة صغيرة (10 ميكرولتر)، وهي قابلة للتحليل عينات متعددة في وقت واحد. وهذا يوفر إمكانات كبيرة كجهاز مضاعفة المناعية. الجهاز لديه ميزة إضافية أنه لا يتطلب خطوات المعالجة عينة مثل فصل البلازما، وهي مطلوبة في ELISAs التقليدية. وعلاوة على ذلك، يمكن للجهاز إجراء العمليات المناعية كلها (على سبيل المثال، والاختلاط، والغسيل، ملزمة الخ) تلقائيا نظرا لغرف المصممة مسبقا، والقنوات، والصمامات. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام أساليب تصنيع القرص تجاريا (على سبيل المثال، حقن صب، الأشعة فوق البنفسجية / بالموجات فوق الصوتية / ارتباط حراري) بدلا من الطحن والتجميع اليدوي باستخدام مواد لاصقة، فإن الإجراء كله من صنع جهاز لتحليل يمكن أن يكونالآلية.
أيضا، وطريقة نقل الطباعة المعروضة هنا يظهر نقل بسيطة وسهلة من electrospun NF من الجهات المانحة لاستهداف الركيزة عن طريق استخدام رقيقة طبقة لاصقة PDMS. وبصفة عامة، NFS تيو 2 تم الحصول عليها بعد عملية التكليس هشة وبسهولة تقشر من الركيزة على الارض بسبب ضعف التصاق 25 نظرا لهشاشة تتميز به، ودمج تيو 2 الحصير NF مع الأجهزة الأخرى أمر صعب. لحل هذه المشكلة، تم الإبلاغ عن العديد من الأساليب. على سبيل المثال، أظهر الساخنة الصحافة 26 و المذيبات البخار 27 تقنيات لتعزيز التصاق بين تيو 2 NFS حصيرة وسطح الهدف قبل عملية التكليس. على الرغم من أن هذه الأساليب زادت التصاق، كانت تيو 2 NF الحصير لا تزال سليمة نظرا لضغط ميكانيكية عالية أو المذيب تطبيقها خلال تقنيات منها. وعلاوة على ذلك، بسبب الخطوة التكليس، والتكامل من تيو 2 </ دون> الحصير NF باستخدام هذه الأساليب يمكن أن تطبق فقط لمحدودية الأسطح الهدف.
إلى علمنا، وهذا هو أول تقنية لإظهار نقل الطباعة من الحصير NF الدخول إلى جهاز مصنوعة من اللدائن الحرارية، والإبقاء على خصائص جديدة للNFS حتى بعد انتقال. للحصول على أداء أفضل للجهاز، والمطلوب تصنيع ذات جودة عالية NFS وتحسين ظروف ما قبل المعالجة. كما ورد في البروتوكول، والوقت اللازم لمرحلة ما قبل المعالجة قد تختلف تبعا للظروف البيئية؛ وبالتالي، وظروف ما قبل المعالجة هي أن يكون الأمثل عن طريق قياس قوة التصاق باستخدام تك-الاختبار.
وعلاوة على ذلك، قدم بروتوكول هنا، يوفر أدلة ماهرا لعملية ELISA مؤتمتة بالكامل على القرص. يدخل البروتوكول ليس تلفيق الوحيد من القرص ولكن أيضا أتمتة كافة العمليات المطلوبة لإليسا، بما في ذلك فصل الدم الكامل، والقياس، والاختلاط، وغسل والكشف.هو الأمثل كل خطوة مع سرعة الدوران، وتواتر الاختلاط، ووقت العملية. وبناء على هذا الدليل العملية، والكواشف تحميلها على قرص يمكن نقلها باستخدام محرك واحد. منذ الجهاز أداء حساسية الكشف ممتازة مع حجم منخفض جدا من الدم، فإنه يوفر إمكانات كبيرة للتطبيقات التشخيص عن طريق فحص المؤشرات الحيوية في مرحلة مبكرة من المرض. سيتم تمكين الجهاز للكشف عن أي العلامات البيولوجية اعتمادا على توافر الأجسام المضادة الخاصة.
على الرغم من أن الجهاز مع الحصير تيو 2 NF حققت عززت غاية الحساسية نظرا لمساحة كبيرة من الحصير، ويمكن للمرء أن التحدي المتبقي من هذه التقنية تكون في الإنتاج الضخم من الحصير NF موحدة. لأن حساسية ELISA يتأثر بقوة المساحة السطحية للحصيرة ألياف نانوية، فمن الأهمية بمكان لتحقيق ليس فقط مساحة عالية ولكن أيضا مساحة استنساخه وموحدة على دفعات مختلفة من الإنتاج الضخم. في الختام، لقد أظهرنا طريقة بسيطة لدمج NF حصيرة هشة في جهاز وظيفي للكشف عن البروتين فائق الحساسية. مزايا هذه الطريقة هي كما يلي: 1) أن يكون مستعدا electrospun سابقا تيو 2 NFS فقط على السطوح الموصلة ومستقرة حراريا. هنا، لقد أظهرنا أنه يمكن نقلها إلى أي ركيزة بما في ذلك المواد غير موصل والبلاستيك. 2) يمكن للالحصير تيو 2 NF تحمل الضغط وتبقى مستقرة أثناء الغسل الخطوات نظرا لقوة التصاق عالية من طبقة PDMS. 3) أنه يوفر مساحة أكبر نسبيا لاختبارات بيولوجية. و4) الأجسام المضادة يمكن أن تعلق تساهمي إلى تيو 2 NFS نظرا لخصائص سطح سليمة على NFS. وقد إمكانيات كبيرة يمكن استخدام هذه التقنية لتحقيق التكامل بين المواد nanofibrous إلى أجهزة لتطبيقات متنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث الوطني الكوري (جبهة الخلاص الوطني) منح (2013R1A2A2A05004314، 2012R1A1A2043747)، منحة من كوريا صحة التكنولوجيا R & مشروع التطوير، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (A121994) وIBS-R020-D1 بتمويل من الحكومة الكورية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , Science Publishers. 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. SolidWorks 2013 BIBLE. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).
- Tickoo, S. EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
